CN116003615A - 一种抗卡利普多的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一些实施例提供了一种能结合卡利普多的抗体或其抗原结合片段及其应用。所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包括：如SEQ ID NO:1所示的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ IDNO:2所示的CDRH2的氨基酸序列RAN、如SEQ ID NO:3所示的CDRH3的氨基酸序列；所述轻链可变区包括：如SEQ ID NO:4所示的CDRL1的氨基酸序列、CDRL2的氨基酸序列、如SEQ ID NO:6所示的CDRL3的氨基酸序列。

Description

一种抗卡利普多的单克隆抗体及其应用

技术领域

本说明书涉及生物工程技术领域，特别涉及一种抗卡利普多的单克隆抗体或其抗原结合片段及相关应用。

背景技术

卡利普多(Carisoprodol)是一种肌肉松弛剂类药物，主要用于治疗慢性背痛等症状，亦有镇静及抗焦虑作用。卡利普多在治疗背痛方面被证明很有效，但卡利普多也被认为是一种潜在的可能被滥用的药物。一些服用卡利普多的病人产生了明显的药物依赖性，甚至有成瘾倾向。调查发现，许多病人实际服用卡利普多的用量超过了医生推荐的用量。近年来，过量服用卡利普多导致中毒的事件频发，令医学界担忧。因此，需要提供一种能够特异性结合卡利普多的抗体和使用该抗体检测样品中卡利普多含量的方法。

发明内容

本说明书一些实施例提供了一种能结合卡利普多的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包括：如SEQ ID NO:1所示的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的CDRH2的氨基酸序列RAN、如SEQ ID NO:3所示的CDRH3的氨基酸序列；所述轻链可变区包括：如SEQ ID NO:4所示的CDRL1的氨基酸序列、CDRL2的氨基酸序列、如SEQ ID NO:6所示的CDRL3的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述重链可变区由以下任一项组成：如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；以及与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述轻链可变区由以下任一项组成：如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；以及与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

本说明书一些实施例还提供了一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码前述抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，以及编码所述轻链可变区的如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

本说明书一些实施例还提供了一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如前述核酸分子。

本说明书一些实施例还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括前述表达载体。

本说明书一些实施例还提供了一种用于检测卡利普多的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括前述抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，所述试剂盒是用于免疫胶体金法的试剂盒。

在一些实施例中，所述试剂盒检测所述卡利普多的最低检测限为200ng/mL。

本说明书一些实施例还提供了前述抗体或其抗原结合片段在制备用于检测卡利普多的试剂盒中的用途。

本说明书一些实施例还提供了一种检测卡利普多的方法，其特征在于，包括使用前述试剂盒检测样品中卡里普多的含量。

本发明运用卡利普多免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过特异性的高通量筛选得到具有高度特异性的杂交瘤细胞，通过培养和再免疫获得大量小鼠腹水，再经多步分离及纯化获得高纯度、高灵敏度和高特异性的抗卡利普多的单克隆抗体，为开发检测卡利普多的试剂盒提供了所需的原料。本发明提供的抗卡利普多的单克隆抗体经验证具有良好的特异性结合能力。可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测。

具体实施方式

如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。

除另有定义外，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

术语“约”和“左右”可描述在某个值的一定取值范围内，例如加上或减去该值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％等。例如，术语“约10mL”可以包括9mL至11mL。

如本文所用，术语“抗体”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。例如，抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(又称为互补决定区(CDR))。通常每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。抗体可以具有不同的类型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如scFv)、嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体的多肽。抗体的抗原结合片段可从给定抗体(例如，在本申请中提供的抗卡利普多的单克隆抗体)通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学切割方法)获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选特异性。

术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。

以下将对本说明书实施例所涉及的方法进行详细说明。值得注意的是，以下实施例仅仅用以解释本说明书，并不构成对本说明书的限定。

本说明书一些实施例提供了一种能结合卡利普多的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包括：CDRH1、CDRH2和CDRH3；所述轻链可变区包括：CDRL1、CDRL2和CDRL3。其中，CDRH是指重链可变区中的互补决定区；CDRL是指轻链可变区中的互补决定区。

在一些实施例中，CDRH1的氨基酸序列为：GFTFSNYW(SEQ ID NO:1)。CDRH2的氨基酸序列为：IRLKFNNYAT(SEQ ID NO:2)。CDRH3的氨基酸序列为：TSLLWLRRDWYFDV(SEQ IDNO:3)。

在一些实施例中，CDRL1的氨基酸序列为：QDINGY(SEQ ID NO:4)。CDRL2的氨基酸序列为：RAN。CDRL3的氨基酸序列为：LQSDEFPYT(SEQ ID NO:6)。

在一些实施例中，所述重链可变区包括如下序列：

EVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAE

IRLKFNNYATHYSESVKGRFIISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTSLLWLRRDWYFDVWGAGTTVT(SEQ ID NO:7)。

在一些实施例中，所述轻链可变区包括如下序列：

TQSPSSMYASLGERVTLTCKASQDINGYLSWFQQKPGKPPKTLIYRANRLVD GVPSRFSVSGSGQDYSLTISSLEYEDLGIYYCLQSDEFPYTFGGGTK(SEQ IDNO:8)。

在一些实施例中，上述重链可变区或轻链可变区中可以含有不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。如本文所用，术语“保守取代”是指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质的氨基酸取代。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。

在一些实施例中，所述重链可变区包括与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述重链可变区包括与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述轻链可变区包括与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述轻链可变区包括与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些实施例中，可以根据上述重链可变区、轻链可变区和/或CDR区的序列，得到抗卡利普多抗体的抗原结合片段(或功能性片段)。例如，所述抗卡利普多抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如scFv)等。还可以利用这些抗原结合片段，设计嵌合抗体、双特异型抗体、多特异性抗体等。

本说明书一些实施例还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，所述核酸分子可以包括编码所述重链可变区中的CDRH1的核苷酸序列：GGATTCACTTTCAGTAACTACTGG(SEQ ID NO:5)。所述核酸分子可以包括编码所述重链可变区中的CDRH2的核苷酸序列：ATTAGATTGAAATTTAATAATTATGCAACA(SEQ ID NO:11)。所述核酸分子可以包括编码所述重链可变区中的CDRH3的核苷酸序列：ACCAGTCTACTATGGTTACGACGGGACTGGTACTTCGATGTC(SEQ ID NO:12)。

在一些实施例中，所述核酸分子可以包括编码所述轻链可变区中的CDRL1的核苷酸序列：CAGGACATTAATGGCTAT(SEQ ID NO:13)。所述核酸分子可以包括编码所述轻链可变区中的CDRL2的核苷酸序列：CGTGCAAAC。所述核酸分子可以包括编码所述轻链可变区中的CDRL3的核苷酸序列：CTACAGTCTGATGAGTTTCCGTACACG(SEQ ID NO:14)。

在一些实施例中，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的如下核苷酸序列:

GAGGTGAAACTGCAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGAT

CCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGA

TGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGACTTGAGTGGGTTGCTGAA

ATTAGATTGAAATTTAATAATTATGCAACACATTATTCGGAGTCTGTGAA

AGGGAGGTTCATCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGC

AAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGT

CTACTATGGTTACGACGGGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGAACCACGGTCACC(SEQ IDNO:9)。

在一些实施例中，所述核酸分子包括编码所述轻链可变区的如下核苷酸序列：

ACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTCTC

ACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATGGCTATTTAAGTTGGTTCCAGCA

GAAACCAGGGAAACCTCCTAAGACCCTGATTTATCGTGCAAACAGATTGG

TAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGTCAGTGGATCTGGACAAGATTAT

TCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATTTGGGAATTTATTATTGTCTACAGTCTGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAG(SEQ IDNO:10)。

本说明书一些实施例还提供了一种表达载体，所述表达载体包括前述包含如SEQID NO:9所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的核酸分子。在一些实施例中，可以使用例如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法，将前述核酸分子插入一个或多个表达载体中，使得所述基因可操作地连接于转录和翻译调节序列。在此上下文中，术语“可操作地连接”意在表示将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能，从而表达本发明所提供的抗卡利普多抗体。

本说明书一些实施例还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括前述表达载体。所述宿主细胞包括但不限于微生物细胞、动物细胞等。例如，当将含有编码本发明所提供的抗卡利普多抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞，可以得到所述抗卡利普多抗体或其抗原结合片段。通过类似方法，可以批量生产本发明所提供的抗卡利普多抗体或其抗原结合片段。

本说明书一些实施例还提供了一种用于检测卡利普多的试剂盒，所述试剂盒包括前述抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，所述试剂盒可以是胶体金检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、酶免检测试剂盒、化学发光试剂盒、免疫比浊检测试剂盒等。本发明对此不作限制。

仅作为示例，所述试剂盒可以是用于免疫胶体金法的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒检测所述卡利普多的最低检测限为200ng/mL。

本说明书一些实施例还提供了前述抗体或其抗原结合片段在制备用于检测卡利普多的试剂盒中的用途。

本说明书一些实施例还提供了一种检测卡利普多的方法，包括使用前述试剂盒检测样品中卡里普多的含量。在一些实施例中，所述样品可以是来自受试者的体液样品，例如尿液、血液等。所述受试者可以是人类或其他动物。通过检测样品中卡利普多的含量，可以判断受试者是否存在过量服用卡利普多的情况。在一些实施例中，所述样品可以是提纯卡利普多后产生的废液，所述检测卡利普多的方法可以用于检测废液中卡利普多的含量，从而对提纯工艺进行评价、改进等。在一些实施例中，所述检测卡利普多的方法还可以用于科学研究等目的，例如用于卡利普多药物动力学方面的研究，本发明对此不作限制。

实施例

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，若无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1抗卡利普多单克隆抗体的制备

一、抗原

表1抗原相关信息

本实施例中所使用的抗原为以卡利普多为原料合成的人工抗原，通过酰胺N上交联臂再与具有免疫原性的蛋白质偶联，以此来获得具有反应原性和免疫原性的完全抗原，其具有如下所示的结构：

其中BSA为牛血清白蛋白。更多关于该抗原及其合成方法的描述，可以参见申请号为202010736865.X的中国专利申请。

二、单克隆抗体的制备

选用6-8周龄Balb/c健康雌性小鼠，按照预先指定的免疫方案进行免疫注射。将免疫BALB/c小鼠作为免疫原,从中提取免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞,通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经过二轮亚克隆筛选后获得稳定分泌抗卡利普多的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,从而获得抗卡利普多的单克隆抗体。

利用合成的抗原卡利普多，进行动物免疫实验。

动物免疫实验具体步骤包括：

1、将体重、周龄均值一致的Balb/c小鼠随机分为2组，加铝佐剂(氢氧化铝佐剂)组和不加铝佐剂组。

2、实验开始前，小鼠各收集免疫前血清(第五天收集免疫前血清，通过眼球取血，适量取血，保证小鼠正常状态)，收集好的血清存于-80℃。

3、加铝佐剂(氢氧化铝佐剂)组配制方式：免疫前，每一抗原在75μL PBS中分别稀释至对应剂量(75μg/只小鼠)，并与明矾佐剂(1mg/只小鼠)混合，按照体积抗原:佐剂＝3:1(即75μl免疫原稀释液中加入25μl佐剂)；佐剂使用前摇匀，将注射佐剂(25μl)缓慢滴加至免疫原溶液中；佐剂与免疫原稀释液充分混合后，两者充分混合30分钟。使佐剂有效吸附抗原；后续根据免疫动物实验操作进行。

4、不加铝佐剂组：抗原在100μL PBS中分别稀释至上述表中的对应剂量(75μg/只小鼠)，100μL的免疫原，后续根据免疫动物实验操作进行。

5、以2周的间隔皮下注射：实验设计为3次免疫方式，但分别在每一次免疫注射7天后眼球取血，离心法获得部分小鼠上清，先进行血清滴度检测，最后一次免疫结束7天后，心脏取血取最大血量，离心获得上清，存于-80℃。

6、检测血清效价。

(1)免疫了4只小鼠，小鼠编号依次为A0，A1，A2，A3。3次免疫结束后，检测血清效价。检测数据如下表2所示。

表2血清效价检测数据

在人体中卡利普多由CYP2C19酶通过N-脱烷基作用(N-dealkylation)转化为其活性代谢物氨甲丙二酯(眠尔通,安宁，meprobamate)，其代谢产物为小分子卡利普多carisoprodol。分别用卡利普多原型meprobamate和小分子代谢物carisoprodol做抗原竞争检测，用卡利普多-BSA作包被抗原进行间接ELISA和竞争ELISA检测免疫小鼠血清效价，间接ELISA法酶标板每孔加1μg/ml的用包被液稀释的包被抗原50μl，4℃包被过夜后，用洗涤液(PBST)洗板3次(下同)，每孔加入封闭液200μl(5％脱脂奶粉)，于37℃温箱中放置2h，取出洗涤后，每孔再加入稀释的血清50μl，再在37℃温箱中反应30min，洗涤后，加入羊抗鼠IgG-HRP溶液50μl，37℃温箱中反应30min。洗涤后加入底物液100μl，37℃温箱中避光显色10min，最后加2mol/L H2SO4,50μL终止反应，于酶标仪读取A450值。4只小鼠的三免后眼眶血效价均>62500。

间接竞争ELISA的过程与间接ELISA过程大部分相同，不同之处在于用封闭液封闭，洗酶标板之后，加入稀释的meprobamate和carisoprodol标准液50μl，再加入稀释的抗体50μl，其余的步骤相同。50ng/ml小分子代谢物carisoprodol竞争检测，在1:12500时均能达到50％以上，可以安排融合。

免疫脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0细胞融合，通过HAT选择培养基(HAT选择培养基含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)筛选融合细胞，并对融合细胞进行ELISA阳性筛选及亚克隆；筛选出的阳性单克隆，取腹水，用ProteinA/G抗体纯化柱纯化抗体，经检测纯化后的抗体纯度>90％。

实施例2酶联反应ELISA检测识别卡利普多的结合活性

1、IgG抗体滴度检测方式

(1)底板包被：将所用抗原用包被稀释液稀释到3μg/ml，每孔各加入配好的包被液100μl，置4℃冰箱，放置24h。

(2)24h后，从冰箱取出后置于37℃平衡30min，之后弃去孔中液体；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(3)封闭酶标反应孔：每孔加入200μl 5％小牛血清后置37℃封闭90min.封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(4)加入待检测样品：将样本按照需要的比例进行稀释，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μl，置于37℃，90min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(5)加入酶标抗体：按照说明书加入适宜浓度的二抗(HRP标记的羊抗小鼠的二抗)；37℃，90min之间，每孔加100μl洗涤同前。

(6)加入底物液：底物加入量每孔100μl，置37℃避光放置15～30min。

(7)终止反应：每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果。

使用实施例1得到的纯化后的抗体按照上述步骤进行ELISA效价检测，得到的结果为ELISA效价>1:128,000。

实施例3检测单克隆抗体识别卡利普多的结合活性

(1)、细胞融合和克隆筛选

小鼠编号依次为A0，A1，A2，A3，共完成了四轮融合。

A0小鼠融合筛选共挑出16个阳性孔进行亚克隆，最终完全了4个细胞株，经融合筛选，共挑选出72个OD450值>2.2以上的阳性克隆进行倍比稀释检测效价，再进行第二次亚克隆筛选。得到4个细胞株，分别命名为A0-1到A0-4。

A1小鼠融合筛选共挑出4个阳性孔进行亚克隆，经融合筛选，共挑选出4个OD450值>2.1以上的阳性孔进行倍比稀释检测效价，再进行第二次和第三次亚克隆筛选，最终完全了1个细胞株，分别命名为A1-1。

A2小鼠融合筛选共挑出20个阳性孔进行亚克隆，再进行第二次和第三次亚克隆筛选，最终完全了4个细胞株，分别命名为A2-1到A2-4。

A3小鼠融合筛选共挑出8个阳性孔进行亚克隆，再进行第二次和第三次亚克隆筛选，最终完全了1个细胞株，分别命名为A3-1。

四次细胞融合后总共得到10个细胞株。

(2)、腹水制备和检测数据

每个完全细胞株分别打3只F1小鼠，共制备了10个腹水，所有腹水检测效价数据如下表3所示：

表3腹水检测效价

(3)、抗体纯化条件摸索和检测数据

以上腹水经3.3％正辛酸-硫胺沉淀法纯化，共得到10个抗体，所有抗体的效价检测数据见下表:

表4抗体效价检测

以上数据显示10个细胞株的单克隆抗体对卡利普多抗原具有良好的特异性结合能力，carisoprodol胶体金产品检测的是尿液样本，所以用小分子代谢物carisoprodol做竞争实验，结果发现A0-1和A3-1号抗体对卡利普多的小分子代谢物carisoprodol有竞争效果，因此，将A0-1和A3-1号抗体用于卡利普多胶体金产品的测试。

实施例4单克隆抗体在试剂盒中的应用

本实施例以免疫胶体金检测法为例，通过免疫胶体金平台对卡利普多抗体A0-1和A3-1号抗体进行验证。

具体的，实验组为使用上述实验得到的卡利普多抗体A0-1和A3-1对杭州安旭生物科技有限公司的卡利普多标准品carisoprodol进行检测。阴性对照为尿液样本。将上述试剂进行加样，之后使用杭州安旭生物科技有限公司的POCT检测仪器ACG1000(ID-A003)对结果进行检测，实验数据结果见表5。

表5抗体A0-1/A3-1在免疫胶体金法中的初评结果

注：G4-G8表示试纸条的条带颜色深浅的级别，数值越高，表示颜色越深，+/-表示比该级别的颜色稍深或稍浅。加入卡利普多标准品carisoprodol数值变低说明小分子有竞争作用，抗体可以和小分子代谢物carisoprodol结合。

结果显示，A0-1抗体梯度较好，可用于卡利普多产品中，cut-off值做到200ng/ml，之后做A0-1号抗体的稳定性评估，制备3个批次的抗体小样，评估结果如下表：

表6抗体A0-1稳定性评估结果

根据产品的评估结果将A0-1号抗体命名为anti-carisoprodol-mab1，该抗体可以用于卡利普多抗原检测试剂盒的检测。

实施例5单克隆抗体anti-carisoprodol-mab1重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)序列分析

扩增重链V区(VH)及轻链V区(VL)基因的引物如下：

重链可变区正向引物(VH-FOR):

GGGAATTCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG(SEQ ID NO:15)

重链可变区反向引物(VH-BACK):

GGAAGGTGTGCACACCGCTGGAC(SEQ ID NO:16)

轻链可变区正向引物(VL-FOR):GATGGTGGGAAGATGGATACAGTT(SEQ ID NO:17)

轻链可变区反向引物(VL-BACK):ATGGAATCACAGRCYCWGGT(SEQ ID NO:18)

取anti-carisoprodol-mab1对数生长期的杂交瘤细胞株(约107个细胞)，按照Trizol RNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA，以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链，以上述扩增产物为模板PCR扩增抗体的VH/VL基因。

回收anti-carisoprodol-mab1的重链VH(约360bp)、轻链VL(约300bp)片段，送公司测序。

然后分析VH/VL基因序列:

所得序列如下：

重链的可变区序列：

anti-carisoprodol-mab1-VH:360bp

GAGGTGAAACTGCAGCAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGA GGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGACTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATTTAATAATTATGCAACACATTATTCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCATCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGTCTACTATGGTTACGACGGGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGAACCACGGTCACC(SEQ ID NO:9)

anti-carisoprodol-mab1 protein：120aa

EVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLE WVAEIRLKFNNYATHYSESVKGRFIISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYC TSLLWLRRDWYFDVWGAGTTVT(SEQ ID NO:7)

轻链的可变区序列：

anti-carisoprodol-mab1LVκ：297bp

ACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCA CTCTCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATGGCTATTTAAGTTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAACCTCCTAAGACCCTGATTTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGTCAGTGGATCTGGACAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATTTGGGAATTTATTATTGTCTACAGTCTGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAG(SEQ ID NO:10)

anti-carisoprodol-mab1LVκprotein:99aa

TQSPSSMYASLGERVTLTCKASQDINGYLSWFQQKPGKPPKTLIYRAN RLVDGVPSRFSVSGSGQDYSLTISSLEYEDLGIYYCLQSDEFPYTFGGGTK(SE Q ID NO:8)

本发明所披露的一种抗卡利普多的单克隆抗体或其抗原结合片段及相关应用，带来的有益效果包括但不限于：(1)本发明提供的抗卡利普多的新型单克隆抗体具有高效价和高特异性；(2)本发明所提供的抗卡利普多单克隆抗体可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，例如可用于通过胶体金检测平台，检测样本中卡利普多的含量，最低检测限为约200ng/mL，检测灵敏度高。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。

本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种能结合卡利普多的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中：

所述重链可变区包括：如SEQ ID NO:1所示的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的CDRH2的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的CDRH3的氨基酸序列；

所述轻链可变区包括：如SEQ ID NO:4所示的CDRL1的氨基酸序列、CDRL2的氨基酸序列RAN、如SEQ ID NO:6所示的CDRL3的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区由以下任一项组成：

如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；以及

与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区由以下任一项组成：

如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；以及

与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体对于所述卡利普多的结合能力的ELISA效价大于1:128,000。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

6.如权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，以及编码所述轻链可变区的如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求5所述的核酸分子。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求7所述的表达载体。

9.一种用于检测卡利普多的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于免疫胶体金法的试剂盒。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测所述卡利普多的最低检测限为200ng/mL。

12.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测卡利普多的试剂盒中的用途。

13.一种检测卡利普多的方法，其特征在于，包括使用如权利要求9所述的试剂盒检测样品中卡里普多的含量。