CN114853887B - 一种特异性结合α-突触核蛋白的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一方面公开了一种单克隆抗体或其抗原结合部分，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分能特异性结合α‑突触核蛋白的中部区域，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种检测产品，所述产品包括权利要求1‑5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。该单克隆抗体具有特异性好、亲和力好的优点，可以用于α‑突触核蛋白的检测以及检测产品的开发。

Description

一种特异性结合α-突触核蛋白的抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异性结合α-突触核蛋白的抗体及其应用。
背景技术
α-突触核蛋白(Alpha-synuclein)是一种在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质，它与帕金森病的发病机制和相关功能障碍密切相关，是路易小体的主要成分。它的结构很大程度上依赖于其所处的细胞内环境，并且会表现出不同的结构如单体、寡聚体、原纤维和纤维等，病理状态下的突触核蛋白容易聚集形成不溶性的纤维蛋白沉淀，最终导致神经细胞死亡。人类基因学的研究证明了α-突触核蛋白基因突变在家族性的帕金森病中的主要致病地位，并且α-突触核蛋白的聚集有类似朊蛋白样的在细胞间传播的特点。
α-突触核蛋白的功能多样，可能参与到突触结构的维持、神经的可塑性、学习、记忆、发生、细胞粘附、磷酸化、细胞分化以及多巴胺的摄取调控等许多方面。病理状态下的α-突触核蛋白形成β片层样结构加速聚集，并且抵抗泛素化蛋白酶体的降解，因此对α-突触核蛋白的结构和功能的研究对理解帕金森等神经突触核蛋白病的发病机制将会有很大的帮助。
α-突触核蛋白是位于4q21-22SNCA基因编码的一个小分子蛋白质，分子量为19kDa,，由140个氨基酸构成，可以分成三个部分。氨基端：(aa1～60)包含了5个家族性帕金森病的突变位点以及高度保守的11个氨基酸中组成的KTKEGV7模体重复序列，易形成两性α螺旋类似载脂蛋白的脂质结合区域，是介导α-突触核蛋白与脂质膜结合的区域；中部：NAC区(aa61～95)的疏水区域易形成β片层结构，在体外极易聚集且可促进全长α-突触核蛋白的聚集；羧基末端(aa96～140)：富含酸性氨基酸和脯氨酸，带有大量负电荷，具有较强的亲水性，其中有三个保守的酪氨酸残基被认为是α、β突触核蛋白的标志。生理状态下的α-突触核蛋白通常被认为是舒展的可溶性结构，Burre等发现重组的和小鼠脑中分离出的α-突触核蛋白为无固定结构的单体，并且有自发聚集的倾向；而Bartels发现在非变性条件下从神经和非神经细胞中分离出来的内源性α-突触核蛋白大部分为大约58kDa的四聚体折叠结构。
为进一步研究α-突触核蛋白在生理和病理状态下的表达和作用，急需开发一种诊断α-突触核蛋白的抗体。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目在于提供一种能特异性结合α-突触核蛋白的中部区域的单克隆抗体及其应用。
因此，本发明一方面公开了一种单克隆抗体或其抗原结合部分，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分能特异性结合α-突触核蛋白的aa61～90，所述的α-突触核蛋白的aa61～90的氨基酸序列为EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA；所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列分别为：
CDR-H1：NYCMN；
CDR-H2：AIKTNTGEPICAECFCG；
CDR-H3：DFRSWYFDY。
优选地，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区序列包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列分别为：
CDR-L1：RASSSVSYIH；
CDR-L2：ATSNLAS；
CDR-L3：QQWSGNPLT。
优选地，本发明所述的所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列还包含FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，所述的重链可变区的FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4的序列分别为：
FR-H1：QSGQEFCKPGERVKNSCKASVDTFT；
FR-H2：WVKQAPGKGLKWMG；
FR-H3：RFVFSLETSASTAILQINNLKNEDTATYFCAC；
FR-H4：WGTGTTVTVSS。
优选地，本发明所述的所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区序列还包含FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述的轻链可变区的FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4的序列分别为：
FR-L1：DIQLTQSPILSASPGEKVSMTC；
FR-L2：WYQQKPGSSPKPWIY；
FR-L3：GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC；
FR-L4：FGAGTKLEIK。
另一方面，本发明还公开了一种检测产品，所述产品包括权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
优选地，本发明所述产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体结合的产品。
再一方面，本发明还公开了一种所述的单克隆抗体或其抗原结合部分、所述的产品在检测α-突触核蛋白中的应用。
再一方面，本发明还公开了一种单克隆抗体或其抗原结合部分、所述的产品在制备诊断α-突触核蛋白病的试剂中的应用。
本发明基于α-突触核蛋白的序列和结构，选择α-突触核蛋白的中部序列作为本发明的抗原表位多肽，即NAC区(aa61～95)，该区域的疏水区域易形成β片层结构，在体外极易聚集且可促进全长α-突触核蛋白的聚集。现有研究表明，α-突触核蛋白的聚集是产生疾病的重要原因之一。将此抗原表位多肽免疫小鼠筛选了一株单克隆抗体。该单克隆抗体具有特异性好、亲和力好的优点，可以用于α-突触核蛋白的检测以及检测产品的开发。所述检测产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体结合的产品。
使用本发明的抗原表位多肽制备单克隆抗体还具有如下优点：1)制备的单克隆抗体只针对该表位，提高筛选特定表位单克隆抗体的成功率；2)可以提高单克隆抗体的特异性(抗原表位为高度特异性的抗原位点)。
附图说明
图1 Werstern blot试验结果，其中1是样品检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明中，“抗体”(antibody)是指一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。同一抗体分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。通过分析不同抗体重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将抗体轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)，包括CDRl、CDR2和CDR3，其中，CDR3变化程度更高。VH的3个高变区分别位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而VL的3个高变区分别位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。VH和VL的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)抗体的CL长度基本一致，但是不同类抗体的CH长度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
本发明中，“抗原结合部分”(CN 113912716 A)指一个或多个保留了与抗原特异性结合的能力的抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段行使。抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段，由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH由分开的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成的接头将它们连接，从而使它们能够制备成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)。此类单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可使用本领域技术人员公知的常规技术获得，可以以与完整抗体相同的方式对片段筛选功用。
实施例1：α-突触核蛋白抗原表位多肽的设计与合成
为了制备只针对α-突触核蛋白中部区域的单抗隆抗体或其抗原结合部分。我们通过对α-突触核蛋白进行分析，选择其中一段作为α-突触核蛋白的抗原表位多肽，并交公司合成多肽，以用于后续试验。该多肽位于NAC区(aa61～95)，该区域的疏水区域易形成β片层结构，在体外极易聚集且可促进全长α-突触核蛋白的聚集；α-突触核蛋白的聚集是导致疾病的关键原因。经过设计，抗原表位多肽序列为：
抗原表位多肽(aa61～90)：EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA。
实施例2：抗α-突触核蛋白抗原表位多肽单克隆抗体的制备
使用常规的杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体，具体步骤参照CN 113607952 A，简述如下：将实施例1制备的抗原表位多肽作为抗原，对8周龄左右BALB/c雌性小鼠进行3次免疫，三免后3天后取脾细胞与骨髓瘤Sp2/0进行细胞融合。用间接ELISA方法对培养上清进行检测，筛选阳性杂交瘤细胞，对阳性杂交瘤细胞进行有限稀释法细胞克隆，获得1株杂交瘤细胞，命名为2A1。经传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
取8周龄左右BALB/c雌性小鼠经腹腔注射降植烷，0.3～0.5ml/只，7日后每只小鼠注射杂交瘤细胞1×106个。注射后7～10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，4℃8000rpm离心3min，收集上清液，即为单抗腹水。使用ProteinG亲和层析柱纯化单克隆抗体，将抗体分别分装成0.5mL/管，-70℃以下保存备用。
实施例3：单克隆抗体的序列测定
提取对数生长期的杂交瘤细胞的总RNA并进行逆转录，将获得的cDNA保存于-15℃以下待用。设计特异性的巢式PCR引物，采用常规PCR方法扩增目的基因。其中，引物序列的设计按照文献(CN 111393525 B)进行。经过测序，单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。对单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列进行分析，分别得到单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列的CDR序列和FR序列，具体见表1所示：
表1单克隆抗体可变区序列信息
Figure BDA0003535810400000061
实施例4：单克隆抗体的鉴定和应用
以临床的α-突触核蛋白(来源于广东某医院检验科)作为样品，以制备的单克隆抗体作为一抗(原始浓度1mg/ml，5000倍稀释)，以HRP标记的羊抗鼠IgG二抗作为二抗(购自北京索莱宝生物科技有限公司，5000倍稀释)，做Werstern blot试验。结果显示，制备的单克隆抗体能与临床的α-突触核蛋白发生特异性反应(如图1所示，在19kDa处有特异性条带)。
以重组人α-突触核蛋白(购自abcam公司，货号ab51189)作为抗原，包被ELISA板(0.5μg/ml)，以制备的单克隆抗体作为一抗进行梯度稀释(原始浓度1mg/ml，1000倍开始稀释)，以HRP标记的羊抗鼠IgG二抗作为二抗(购自北京索莱宝生物科技有限公司，5000倍稀释)，做间接ELISA试验。结果显示，制备的单克隆抗体能与重组人α-突触核蛋白特异性结合，且其最低稀释度最少能到32000倍(如表2所示，以P/N值大于3.0为阳性)。
表2单克隆抗体ELISA检测结果
Figure BDA0003535810400000062
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州乐康生物医药科技有限公司
<120> 一种特异性结合α-突触核蛋白的抗体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaaaaaaac tgcagagcgg ccaggaattt tgcaaaccgg gcgaacgcgt gaaaaacagc 60
tgcaaagcga gcgtggatac ctttaccaac tattgcatga actgggtgaa acaggcgccg 120
ggcaaaggcc tgaaatggat gggcgcgatt aaaaccaaca ccggcgaacc gatttgcgcg 180
gaatgctttt gcggccgctt tgtgtttagc ctggaaacca gcgcgagcac cgcgattctg 240
cagattaaca acctgaaaaa cgaagatacc gcgacctatt tttgcgcgtg cgattttcgc 300
agctggtatt ttgattattg gggcaccggc accaccgtga ccgtgagcag c 351
<210> 2
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatattcagc tgacccagag cccgattctg agcgcgagcc cgggcgaaaa agtgagcatg 60
acctgccgcg cgagcagcag cgtgagctat attcattggt atcagcagaa accgggcagc 120
agcccgaaac cgtggattta tgcgaccagc aacctggcga gcggcgtgcc ggtgcgcttt 180
agcggcagcg gcagcggcac cagctatagc ctgaccatta gccgcgtgga agcggaagat 240
gcggcgacct attattgcca gcagtggagc ggcaacccgc tgacctttgg cgcgggcacc 300
aaactggaaa ttaaa 315

Claims (8)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分能特异性结合α-突触核蛋白的aa61~90，所述的α-突触核蛋白的aa61~90的氨基酸序列为EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA；所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区序列如SEQID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列分别为：
CDR-H1：NYCMN；
CDR-H2：AIKTNTGEPICAECFCG；
CDR-H3：DFRSWYFDY。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区序列包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列分别为：
CDR-L1：RASSSVSYIH；
CDR-L2：ATSNLAS；
CDR-L3：QQWSGNPLT。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列还包含FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，所述的重链可变区的FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4的序列分别为：
FR-H1：QSGQEFCKPGERVKNSCKASVDTFT；
FR-H2：WVKQAPGKGLKWMG；
FR-H3：RFVFSLETSASTAILQINNLKNEDTATYFCAC；
FR-H4：WGTGTTVTVSS。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区序列还包含FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述的轻链可变区的FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4的序列分别为：
FR-L1：DIQLTQSPILSASPGEKVSMTC；
FR-L2：WYQQKPGSSPKPWIY；
FR-L3：GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC；
FR-L4：FGAGTKLEIK。
6.一种检测产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体结合的产品。
8.一种如权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分、权利要求6或7所述的产品在制备检测α-突触核蛋白试剂中的应用。
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