JP7366411B2 - ヒトαディフェンシンHD5を検出する方法及びキット、並びにこれらにおいて用いられる抗体 - Google Patents
ヒトαディフェンシンHD5を検出する方法及びキット、並びにこれらにおいて用いられる抗体 Download PDFInfo
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Description
a)CDR1として配列番号1のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号2のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号4のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号5のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
b)CDR1として配列番号7のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号8のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号10のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号11のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
(2)a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、
配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号13のアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号14のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、又は又は配列番号14のアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を有し、かつ
b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、
配列番号15のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号15のアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号16のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、又は又は配列番号16のアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を有する、(1)に記載の方法。
(3)a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が捕捉抗体として、b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が検出抗体として用いられる、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が固相化された担体に検体を添加する工程、前記担体に標識化されたb)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を添加する工程、及び分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に結合したb)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程を含む、(1)~(3)のいずれか一項に記載の方法。
(5)検体が、ヒトの凍結乾燥糞便破砕物の水性媒体抽出液である、(1)~(4)のいずれか一項に記載の方法。
(6)下記a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び下記b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5をサンドイッチ法によって免疫学的に検出するためのキット。
a)CDR1として配列番号1のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号2のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号4のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号5のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
b)CDR1として配列番号7のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号8のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号10のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号11のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
(7)a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が捕捉抗体として、b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が検出抗体として用いられる、(6)に記載のキット。
(8)a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が担体に固相化されており、b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が標識化されている、(7)に記載のキット。
(9)CDR1として配列番号1のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号2のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号4のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号5のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
(10)CDR1として配列番号7のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号8のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号10のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号11のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
(11)(9)又は(10)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードする核酸。
(12)(11)に記載の核酸を含むベクター。
(13)(11)に記載の核酸を含む宿主細胞。
a)CDR1として配列番号1のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号2のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号4のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号5のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、ox-HD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
b)CDR1として配列番号7のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号8のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号10のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号11のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、ox-HD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
ヒトのαディフェンシンには、HD5とHD6の2つのアイソフォームが存在する。HD5(DEFA5、ディフェンシンα5とも呼ばれる)は、N末端側1-19位のシグナルペプチドを含む全長94アミノ酸残基のプレペプチドpre-HD5(配列番号17)として翻訳される。次いでpre-HD5からシグナルペプチドが切断されてプロペプチドpro-HD5(75アミノ酸)を生じ、さらにN末端側の43アミノ酸残基が切断されることで、成熟体のHD5(32アミノ酸、配列番号18)が生成する。成熟体HD5のアミノ酸配列には6個のシステイン残基が含まれ、これらが3つの分子内ジスルフィド結合を形成することによってox-HD5となる。ox-HD5のアミノ酸配列及び分子内ジスルフィド結合の位置を図1に示す。
本発明において用いられる上記a)及びb)の抗ox-HD5モノクローナル抗体は、ox-HD5、すなわち分子内に3個のジスルフィド結合を有するHD5に特異的に結合する抗体である。ox-HD5に特異的に結合するとは、例えば分子内ジスルフィド結合を有さない還元型HD5等の非標的タンパク質よりもox-HD5に優先的に結合することを意味し、非標的タンパク質に全く結合しないことを意味するものではない。ox-HD5に特異的に結合する抗体は、ox-HD5に高い結合親和性を有する抗体と表すこともでき、非標的タンパク質とのアフィニティーよりも少なくとも2倍強い、好ましくは少なくとも10倍強い、より好ましくは少なくとも20倍強い、最も好ましくは少なくとも100倍強いアフィニティーを有して、ox-HD5に結合することができる。抗体がox-HD5の存在を、望まれない結果、典型的には偽陽性又は偽陰性等を生じることなく検出することができるならば、当該抗体はox-HD5に特異的に結合する抗体であると考えられる。
本発明における抗ox-HD5モノクローナル抗体及びその抗原結合性断片は、いずれもox-HD5に特異的に結合することから、ox-HD5の免疫学的検出やox-HD5に対するアフィニティーカラム等において利用することができる。
1)ox-HD5の調製
Thermo Fisher社に委託して化学合成した成熟体のHD5(配列番号18)を0.1%酢酸に溶解し、10%水酸化アンモニウムでpHを8.4~8.8に調整し、4℃で18時間、穏やかに撹拌することで酸化処理を行った。その後、透析膜にて5%酢酸に置換し、真空凍結乾燥にて溶液を除去した。得られた試料を0.1%トリフルオロ酢酸に溶解し、逆相クロマトグラフィー(C-18カラム)に供してポリペプチド画分を回収した。
常法に従ってアジュバントを注射した自己免疫疾患マウス(C3H/HeJJmsSlc-lpr/lprを日本エスエルシーより入手)にox-HD5を3回腹腔内注射(0.2 mg/回)して免疫を行った。その後、常法に従って、免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、50%ポリエチレングリコール1500(Sigma-Aldrich社)を用いてマウスミエローマ細胞株P3U1と融合させてハイブリドーマを作製した。各ハイブリドーマクローンを間接ELISAでスクリーニングし、限界希釈法により4回サブクローニングした。
1)イムノアッセイ用抗体の選択
以下の手順で5種類のモノクローナル抗体を捕捉抗体又は検出抗体のいずれかとして用いたサンドイッチELISAを行い、イムノアッセイに適した抗体の組み合わせを選択した。
捕捉抗体12-1、検出抗体39E-7の組み合わせについて、それぞれの抗体の最適濃度を検討した。まず検出抗体39E-7の濃度を0.5 mg/mlに、捕捉抗体12-1の濃度を0.1、0.5、1、5又は10 mg/mlに設定して上記1)と同様にサンドイッチELISAを行い、濃度0~30 ng/mlのox-HD5に対する標準曲線を作成した(n=3)。統計解析はStudentのt検定で行い、P値<0.05を統計学的に有意とした。
上記1)及び2)で構築したアッセイ系の特異性を検討するために、r-HD5、HD5のアイソフォームであるHD6(配列番号19)の還元型(r-HD6)、2種のマウスαディフェンシン(Crp1、Crp4)の酸化型及び還元型(ox-Crp1、r-Crp1、ox-Crp4、r-Crp4)に対する反応性を調べた。これらのペプチドはいずれもThermo Fisher社に委託して化学合成した。Crp1及びCrp4の酸化型は、既報(K. Nakamura et al., Analytical biochemistry. 2013, 443(2), 124-131)に従って調製した。捕捉抗体12-1の濃度を1 mg/mlに、検出抗体39E-7の濃度を0.5 mg/mlに設定して同様にサンドイッチELISAを行い、0~60 ng/mlの各抗原に対する標準曲線を作成した。
SMART cDNAライブラリー作製キット(タカラバイオ株式会社)を用いて、モノクローナル抗体12-1及び39E-7のCDR配列を解析した。具体的には、ハイブリドーマクローン12-1及び39E-7から全RNAを抽出し、これを鋳型として3'末端側IgG1重鎖特異的プライマー、IgG2a重鎖特異的プライマー又はκ軽鎖特異的プライマーを用いてcDNAを作製した。このcDNAを鋳型とし、フォワードプライマーとしてキットに添付の5’末端側特異的プライマーを、リバースプライマーとして3’末端側IgG1重鎖特異的プライマー、IgG2a重鎖特異的プライマー又はκ軽鎖特異的プライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅されたDNA断片の核酸配列をDNAシーケンサーを用いて解析し、得られた配列情報をIgBLASTデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)上で検索した。その結果、モノクローナル抗体12-1及び39E-7はいずれも新規なCDR配列の組み合わせを有することが確認された。それぞれの抗体の重鎖CDR1~3及び可変領域のアミノ酸配列を表2に、軽鎖CDR1~3及び可変領域のアミノ酸配列を表3に示す。
健常者のボランティア(30~80歳、計5名)から血清及び糞便を採取した。糞便を16時間凍結乾燥し、ステンレスビーズを加えてビーズビーター型ホモジナイザー(Beads Crusher μT-12)を用いて粉砕した。糞便粉末50 mgあたりPBS (-) 500 μLを加えて16時間振とう後、遠心分離(20,400 G、10min、4℃)して回収した上清を測定試料とした。サンドイッチELISAは、実施例2で決定した最適条件で実施した。
配列番号2 モノクローナル抗体12-1の重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号3 モノクローナル抗体12-1の重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号4 モノクローナル抗体12-1の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号5 モノクローナル抗体12-1の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号6 モノクローナル抗体12-1の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号7 モノクローナル抗体39E-7の重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号8 モノクローナル抗体39E-7の重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号9 モノクローナル抗体39E-7の重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号10 モノクローナル抗体39E-7の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号11 モノクローナル抗体39E-7の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号12 モノクローナル抗体39E-7の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号13 モノクローナル抗体12-1の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号14 モノクローナル抗体12-1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号15 モノクローナル抗体39E-7の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号16 モノクローナル抗体39E-7の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号17 HD5のプレ体のアミノ酸配列
配列番号18 HD5の成熟体のアミノ酸配列
配列番号19 HD6の成熟体のアミノ酸配列
Claims (13)
- 検体中の分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5を、下記a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び下記b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いてサンドイッチ法によって検出することを含む、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5を免疫学的に検出する方法。
a)CDR1として配列番号1のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号2のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号4のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号5のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
b)CDR1として配列番号7のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号8のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号10のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号11のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片 - a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、
配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号13のアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号14のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、又は又は配列番号14のアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を有し、かつ
b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、
配列番号15のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号15のアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号16のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、又は又は配列番号16のアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を有する、請求項1に記載の方法。 - a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が捕捉抗体として、b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が検出抗体として用いられる、請求項1又は2に記載の方法。
- a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が固相化された担体に検体を添加する工程、前記担体に標識化されたb)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を添加する工程、及び分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に結合したb)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 検体が、ヒトの凍結乾燥糞便破砕物の水性媒体抽出液である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 下記a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び下記b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5をサンドイッチ法によって免疫学的に検出するためのキット。
a)CDR1として配列番号1のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号2のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号4のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号5のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
b)CDR1として配列番号7のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号8のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号10のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号11のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片 - a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が捕捉抗体として、b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が検出抗体として用いられる、請求項6に記載のキット。
- a)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が担体に固相化されており、b)のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が標識化されている、請求項7に記載のキット。
- CDR1として配列番号1のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号2のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号4のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号5のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- CDR1として配列番号7のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号8のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1として配列番号10のアミノ酸配列を、CDR2として配列番号11のアミノ酸配列を、及びCDR3として配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、分子内ジスルフィド結合を有するヒトαディフェンシンHD5に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- 請求項9又は10に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードする核酸。
- 請求項11に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項11に記載の核酸を含む宿主細胞。
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