CN115298215A - 特异性地结合与原发性免疫缺陷：维斯科特-奥尔德里奇综合征和x连锁无丙种球蛋白血症相关的肽的抗体 - Google Patents

特异性地结合与原发性免疫缺陷：维斯科特-奥尔德里奇综合征和x连锁无丙种球蛋白血症相关的肽的抗体 Download PDF

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Abstract

本公开提供了结合至与原发性免疫缺陷病症(PIDD)、维斯科特‑奥尔德里奇综合征(WAS)和X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)相关的肽的抗体。所述抗体可被用于与选择性反应监测质谱耦合的肽免疫亲和富集(免疫‑SRM)测定，以用于WAS和XLA的临床诊断和新生儿筛查以及其他用途。

Description

特异性地结合与原发性免疫缺陷：维斯科特-奥尔德里奇综合 征和X连锁无丙种球蛋白血症相关的肽的抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月2日提交的美国临时专利申请第63/004,415号的优先权，所述美国临时专利申请如同在本文中完全阐述一样以引用的方式整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是根据国家卫生研究院颁发的AI123135在政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本专利说明书中。含有序列表的文本文件的名称是2GV8205_ST25.txt。文本文件是59KB，于2021年4月2日创建，并且经由EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本公开提供了结合至与原发性免疫缺陷病症(PIDD)相关的肽的抗体，所述原发性免疫缺陷病症包括维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich Syndrome，WAS)和X连锁无丙种球蛋白血症(X-linked agammaglobulinem，XLA)。该抗体可用于WAS和XLA的临床诊断和新生儿筛查，以及其他用途。
发明背景
有许多疾病可以得到有效的治疗。然而，对于这些疾病中的许多疾病，一旦出现症状，该疾病就已经致命或导致不可逆转的损伤。此类疾病的实例包括原发性免疫缺陷病症(PIDD)。
原发性免疫缺陷病症(PIDD)，也称为先天性免疫缺陷(inborn errors ofimmunity，IEI)，是一组超过416种罕见的遗传病症，其中免疫系统的组成部分缺失或功能不正常。PIDD的实例包括维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)和X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)。PIDD的早期检测对于控制和预防可能危及生命的感染和慢性后遗症极为重要。
如果可在临床症状出现之前做出诊断，则将显著增强PIDD的治疗。新生儿筛查(NBS)是针对美国每年出生的400万婴儿的标准公共预防性强制性筛查测试。NBS通常涉及在出生后24至48小时进行的血液测试。筛查使用沉积在滤纸上的几滴来自新生儿脚后跟的血液。含有干血斑(DBS)的纸张可储存，直到进行测试为止。
为了进行NBS评估，从DBS取出干血冲孔，并且进行实验室测试以检测血液中是否存在特定物质(称为标志物或生物标志物)，所述物质指示出生时不明显但在以后的生活中导致严重健康问题的病症。尽管所筛查的病症因国家而异，但大多数国家筛查苯丙酮尿症、原发性先天性甲状腺功能减退症、囊性纤维化和镰状细胞病。NBS已被证明在改善患者结果和避免受影响个体的长期残疾方面非常有效，同时降低医疗费用。
国际申请号PCT/US2019/054856描述了可用于筛查新生儿的严重联合免疫缺陷(SCID)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)、X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、胱氨酸病和威尔逊病(WD)的多重测定的开发。通过在毁灭性的且经常致命性的临床症状出现之前可靠地诊断这些病症，所述测定可显著改善受影响个体的结果。所述测定可使用已经作为现有新生儿筛查(NBS)程序的一部分常规收集的干血斑(DBS)来检测与这些病症相关的标志物的存在或不存在。PCT/US2019/054856中描述的多重测定利用与选择性反应监测质谱耦合的肽免疫亲和富集(免疫-SRM)。
发明内容
本公开提供了特异性地结合与原发性免疫缺陷病症(PIDD)：维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich Syndrome，WAS)和X连锁无丙种球蛋白血症(X-linkedagammaglobulinem，XLA)相关的特征肽的抗体。
具体的实施方案包含与WAS(SEQ ID NO:1)的WASp 289特征肽结合的抗体或其抗原结合片段，并且包含：重链可变(VH)结构域，该重链可变(VH)结构域包含SEQ ID NO:3的CDRH1：SEQ ID NO:4的CDRH2和SEQ ID NO:5的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，该轻链可变(VL)结构域包含：SEQ ID NO:6的CDRL1、SEQ ID NO:7的CDRL2和SEQ ID NO:8的CDRL3。在特定实施方案中，与WASp289特征肽结合的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:15的VH结构域。在特定实施方案中，与WASp 289特征肽结合的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:16的VL结构域。在特定实施方案中，与WASp 289特征肽结合的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:17的重链。在特定实施方案中，与WASp 289特征肽结合的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:18的轻链。在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重组抗体或其抗原结合片段。
具体实施方案包含与XLA(SEQ ID NO:2)的BTK 545特征肽结合的抗体或其抗原结合片段，并且包含：重链可变(VH)结构域，该重链可变(VH)结构域包含SEQ ID NO:9的CDRH1、SEQ ID NO:10的CDRH2和SEQ ID NO:11的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，该轻链可变(VL)结构域包含SEQ ID NO:12的CDRL1、SEQ ID NO:13的CDRL2和SEQ ID NO：14的CDRL3。在特定实施方案中，与BTK 545特征肽结合的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQID NO:23的VH结构域。在特定实施方案中，与BTK 545特征肽结合的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:24的VL结构域。在特定实施方案中，与BTK 545特征肽结合的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:25的重链。在特定实施方案中，与BTK545特征肽结合的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:26的轻链。在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重组抗体或其抗原结合片段。
在特定实施方案中，本公开的抗体可用在用于临床诊断WAS和XLA的测定中。具体实施方案提供了在利用干血斑(DBS)作为样本的测定中使用本公开的抗体对新生儿进行WAS和XLA的筛查。在特定实施方案中，本公开的抗体可用在与选择性反应监测质谱耦合的肽免疫亲和富集(免疫-SRM)测定中。在特定实施方案中，所述测定可以利用颊拭子、外周血单个核细胞(PBMC)和白血细胞(WBC)作为样本。通过在毁灭性的且经常致命性的临床症状出现之前可靠地诊断这些病症，包括所述抗体的所述测定可显著改善受影响个体的结果。所述抗体也可被用于作为其他疾病筛查组的一部分的多重免疫SRM测定。
在特定实施方案中，本公开的抗体可被用于包括免疫测定在内的其他方法。
附图说明
图1.用于与选择性反应监测质谱耦合的肽免疫亲和富集(免疫-SRM-MS)以诊断维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)和X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的蛋白质靶标和肽序列。还示出总质量、母离子质量和子离子质量。++表示双电荷母离子。子离子的离子类型在括号中。
图2A、2B.使用针对WASp 289和BTK 545的多克隆抗体通过多重免疫多反应监测(MRM)测定测量的肽的反应曲线。当在单次质谱(MS)运行中监测多种母离子时，这种类型的分析被称为多反应监测(MRM)。使用MRM分析，可在单次质谱运行中监测多种蛋白质和蛋白质的多个区域(特征肽)。反应曲线绘制在从干血斑(DBS)提取的消化蛋白质的背景基质中测量的随重链肽浓度变化的重链:轻链峰面积比。所述曲线允许确定测定的线性范围和灵敏度。每个数据点被绘制为灰色框，并且线性回归被绘制为线。回归拟合参数报告在每个图的角落。每个图的权重是1/x。(图2A)WASp 289；(图2B)BTK 545。
图3A、3B.内部标准物(左图)和内源性(右图)特征肽：(图3A)WASp 289、(图3B)BTK545的MRM迹线。使用了结合WASp 289和BTK 545的多克隆抗体。
图4A、4B.正常对照(n＝40)和患者(Pt)中的特征肽浓度。(图4A)WASp 289、(图4B)BTK 545(WAS:n＝11，BTK:n＝26)。****p<0.0001，*p<0.05。使用了结合WASp 289和BTK 545的多克隆抗体。
图5.来自盲法队列研究的正常对照和患者中的ATP7B 1056特征肽浓度以及临床诊断和基因型。
图6.来自盲法队列研究的正常对照中的特征肽的定量。使用了结合WASp 289和BTK 545的多克隆抗体。
图7.来自盲法队列研究的患者中的特征肽的浓度以及临床诊断和基因型。使用了结合WASp 289和BTK 545的多克隆抗体。
图8A、8B.接受者操作特征(ROC)图示出免疫-SRM对PIDD的诊断性能。(图8A)WASp289和BTK 545的ROC图。针对越来越严格的截断值，绘制真阳性和假阳性率。同一线(lineof identity)表示不能将患者与对照区分开的测试。(图8B)图8A中所示的肽的曲线下面积(AUC)值和p值。使用了结合WASp 289和BTK 545的多克隆抗体。
图9.从华盛顿州新生儿筛查实验室获得的新生儿DBS中的特征肽水平。使用了结合WASp 289和BTK 545的多克隆抗体。
图10.在盲法队列研究中特征肽与ATP7B肽的比率和患者诊断。使用了结合WASp289和BTK 545的多克隆抗体。
图11A、11B.在正常对照干血斑中测量的单克隆抗体(BTK 545，n＝55；WASp 289，n＝50)和多克隆抗体(n＝40)之间的肽差异。
图12.WASp 289单克隆抗体的正常对照(n＝50)范围。
图13.XLA患者(n＝8)中BTK 545单克隆抗体和BTK 545值的正常对照(n＝55)范围。
图14.本公开的示例性序列。
具体实施方式
有许多疾病可以得到有效的治疗。然而，对于这些疾病中的许多疾病，一旦出现症状，该疾病就已经致命或导致不可逆转的损伤。原发性免疫缺陷病症(PIDD)就是这种情况的一个很好的实例。
原发性免疫缺陷病症(PIDD)，也称为先天性免疫缺陷(inborn errors ofimmunity，IEI)，是一组超过416种罕见的遗传病症，其中免疫系统的组成部分缺失或功能不正常。尽管个别罕见，但PIDD的合并发病率估计为约1200分之一(Tangye等人，Journalof Clinical Immunology，2020，出版中；McCusker，C.，J.Upton和R.Warrington，Primaryimmunodeficiency.Allergy，asthma，and clinical immunology:official journal ofthe Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology，2018.14(Suppl 2)：第61-61页；Kobrynski等人，J Clin Immunol，2014.34(8):第954-961页)。一旦得到适当的诊断和治疗，患者往往可以过上相对正常的生活(Kaveri等人Clin Exp Immunol，2011.164Suppl 2:第2-5页；Raje，N.和C.Dinakar，Immunology and allergy Clinics ofNorth America，2015.35(4)：第599-623页)。根据病症，也可以利用造血干细胞移植(HSCT)、酶替代疗法(ERT)或基因疗法进行治愈性治疗(Raje，N.和C.Dinakar，Immunologyand allergy Clinics of North America，2015.35(4)：第599-623页；Aydin等人，JClinImmunol，2015.35(2)：第189-198页；Gaspar等人，Blood，2009.114(17)：第3524-3532页；Moratto等人，Blood，2011.118(6):第1675-1684页；Parta等人，Journal of ClinicalImmunology，2017.37(6):第548-558页；Staal等人，Frontiers in Pediatrics，2019.7(443)；Ferrua等人，Lancet Haematol，2019.6(5):第e239页-第e253页)。几乎无处不在，PIDD的早期检测对于控制和预防可能危及生命的感染和慢性后遗症极为重要(Grunebaum等人，JAMA，2006.295(5)：第508-18页；Kanariou等人，Curr Opin Hematol，2018.25(1)：第7-12页)。
早期干预受到临床上诊断PIDD的困难和缺乏直接的人群筛查工具的限制。实验室评估通常由复发和/或慢性感染的证据引起。在临床评估之后，诊断确认所需的实验室测试常常涉及技术要求高的分析，包括免疫细胞亚群分析、蛋白质表达和/或患者白血细胞中的酶活性(Bonilla等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology，2015.136(5):第1186-1205.e78页)。
WAS是特征在于血小板数量和大小的减小的免疫缺陷。WAS是由产生WAS蛋白(WASp)的WAS基因中的突变引起的，并且常常被认为是具有两种其他病症：X连锁血小板减少症和严重先天性中性粒细胞减少症的疾病谱的一部分。这些疾患具有重叠的体征和症状以及相同的遗传原因。
与WAS相关的血小板数量和大小的减小导致形成血凝块的能力降低。这导致容易瘀伤以及在轻微创伤后长期出血的发作，这在一些情况下是危及生命的。患有WAS的个体对感染、自身免疫性病症(例如，湿疹)和某些癌症(例如，淋巴瘤)的易感性也增加。一旦确诊，就可用针对WAS的治疗。示例性治疗包括免疫球蛋白输注、抗生素和干细胞移植。基因疗法也正在被探索作为WAS的治疗选择。
XLA是阻止B细胞正常发育的遗传性免疫缺陷。XLA是由称为布鲁顿(Bruton)酪氨酸激酶(BTK)的基因中的突变引起的。XLA导致不能产生防御细菌、病毒和其他异物所需的抗体。患有XLA的儿童通常在出生后的前1或2个月是健康的，因为他们受到出生前获得的母体抗体的保护。然而，在这段时间之后，母体抗体从体内被清除，并且受影响的儿童发展反复感染。反复感染可导致器官损伤。一旦被诊断，就可采用抗体输注和抗生素形式的治疗来治疗XLA。
由于大多数先天性PIDD会导致特定蛋白质的减少或缺乏，因此直接定量这些靶蛋白代表了一种有吸引力的潜在筛查工具，特别是在新生儿中，这样可以及早诊断PIDD并进行适当的治疗。
为了进行新生儿筛查(NBS)评估，对干血斑(DBS)进行实验室测试，以检测血液中是否存在特定物质(称为标记物或生物标记物)。尽管所筛查的病症因国家而异，但大多数国家筛查苯丙酮尿症、原发性先天性甲状腺功能减退症、囊性纤维化和镰状细胞病。NBS已被证明在改善患者结果和避免受影响个体的长期残疾方面非常有效，同时降低医疗费用。不幸的是，检测常常受限于血细胞中极低的蛋白质浓度和DBS中存在的有限血量。
国际申请号PCT/US2019/054856描述了允许从复杂的生物样本(诸如DBS)中鉴定出受WAS和XLA影响的患者的稳健测定和方法。该测定使用抗肽抗体来从DBS中纯化和富集目标肽，然后在质谱仪中对该肽进行定量。该目标肽称为特征肽，是受WAS或XLA影响的个体缺乏或缺少的蛋白质的化学计量替代物。与选择性反应监测质谱耦合的肽免疫亲和富集(免疫--SRM)测定法允许以高重现性对血液中以低皮摩尔浓度存在的蛋白质进行定量(Collins等人，Frontiers in Immunology，2018.9(2756))。
特征肽标记物和与其结合的抗体也已被开发用于使用免疫-SRM诊断其他PIDD，诸如X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)、X连锁淋巴组织增生综合征(XLP1；SH2D1A缺乏症)、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症2(FHL2)、共济失调毛细血管扩张症(AT)、常见可变性免疫缺陷(CVID；B细胞功能障碍)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症和细胞质分裂付出蛋白8(DOCK8)缺乏症，以及检测血小板(CD42)和自然杀伤细胞(CD56)的细胞特异性标志物(PCT/US2021/020679；Collins等人，Frontiers in Immunology，2020.11(464))。
本公开提供了抗体及其抗原结合片段，其可用于免疫-SRM方法以(例如在新生儿中)可靠地诊断WAS和XLA。抗肽抗体及其抗原结合片段可进一步被用于作为其他疾病筛查组的一部分的多重免疫SRM测定。
现在更详细地描述本公开的以下方面：(i)生物样本的收集和加工；(ii)WAS和XLA的肽标记；(iii)结合WAS和XLA的肽标记物的抗体；(iv)变体；(v)抗肽抗体的免疫缀合物；(vi)本公开的重组蛋白的生产；(vii)使用方法；(viii)试剂盒；(ix)示例性实施方案；(x)实验实施例；和(xi)结尾段落。
(i)生物样本的收集和加工。在特定实施方案中，可用于本公开的免疫-SRM测定的生物样本包括源自血液或细胞的样本。在特定实施方案中，在本公开的方法中使用的样本是DBS。在特定实施方案中，可通过将血液置于滤纸卡上并让血液干燥来制备来自受试者的全血。
在特定实施方案中，可以将来自受试者的全血收集在任何抗凝剂中。在特定实施方案中，可以将来自受试者的全血收集在肝素中。可通过将50-100μL(例如，70μL)血液/斑吸移到滤纸卡(例如，Protein SaverTM
Figure BDA0003843047680000091
卡，Whatman Inc，Piscataway，NJ)上且使其在室温下干燥来制备DBS。在特定实施方案中，让血液在滤纸卡上干燥过夜。可将DBS例如在-80℃下储存在密封塑料袋中直到使用。在特定实施方案中，整个DBS可用于本公开的免疫-SRM测定中。在特定实施方案中，来自DBS的一个或多个3mm冲孔可用于本公开的免疫-SRM测定中。在特定实施方案中，DBS可用0.1％的在50mM碳酸氢铵中的Triton X-100溶解。
在特定实施方案中，用于本公开的免疫-SRM测定的样本包括从颊拭子或粘膜样本获得的细胞。在特定实施方案中，粘膜样本包括口腔、鼻腔、生殖器和直肠样本(Espinosa-de Aquino等人(2017)Methods in Ecology and Evolution 8:370-378)。在特定实施方案中，颊拭子样本包含来自脸颊或嘴巴的细胞。在特定实施方案中，颊拭子样本可以按照以下描述的方案从受试者获得：CHLA(2016年4月4日).Buccal Swab CollectionProcedure.CHLA-Clinical Pathology；(2016年7月27日).Buccal DNA CollectionInstructions.Pathway Genomics；(2017年12月14日).Instruction for Buccal SwabSample Collection.Otogenetics；PDXL PDXL.(2017年11月28日).Buccal Swabcollection procedure–PersonalizedDx Labs[Video].YouTube.见万维网上的youtu.be/3ftvHkfM71o？t＝146；以及Centers of Disease Control and Prevention(CDC).(2020年7月8日).Interim Guidelines for collecting，handling，and testing clinicalspecimens for Covid-19.见万维网上的cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/guidelines-clinical-specimens.html。
在特定实施方案中，颊拭子样本可以通过以下方案从受试者获得。在样本采集之前，患者至少30分钟不吸烟、不吃、不喝、不嚼口香糖或刷牙。小心地从包装中取出拭子，确保尖端不接触任何物体或表面。将拭子插入位于嘴的一侧在脸颊、牙齿和上牙龈之间的颊腔中。将拭子的尖端压在一侧脸颊内侧，并以圆周运动的方式来回、上下摩擦。在摩擦过程中旋转手柄，以使来自脸颊的细胞覆盖整个尖端。在采集过程中，不允许尖端接触牙齿、牙龈和嘴唇。不允许拭子被唾液过度饱和。采集后，在不接触牙齿、牙龈或嘴唇的情况下将拭子从嘴中取出。让拭子在室温下风干至少30分钟。去除手柄后的拭子可储存在低温小瓶中。可以用第二根拭子在另一侧脸颊上重复这些步骤。颊拭子样本采集后可在2-8℃下储存长达72小时，如果超过72小时，可在-80℃或更低温度的冰箱中储存。在特定实施方案中，用颊拭子采集细胞可以持续至少30秒。在特定实施方案中，用颊拭子采集细胞可以从最大粘膜表面采集。在特定实施方案中，可以为每个受试者采集一到五个颊拭子样本。在特定实施方案中，可将颊拭子样本在无菌表面上风干至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟或更长时间。在特定实施方案中，受试者可以在样本采集之前用清水冲洗他们的嘴。在特定实施方案中，样本采集区域可以使用单独的拭子用生理盐水润湿。在特定实施方案中，可将颊拭子样本在25℃、20℃、15℃、10℃、5℃、0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃或更低温度下储存。在特定实施方案中，颊拭子样本可以在-20℃下储存一到两周。在特定实施方案中，可以从水和/或漱口水而不是拭子采集颊样本(Michalczyk等人(2004)BioTechniques 37(2)：262-269)。
在特定实施方案中，来自颊拭子样本的细胞可用0.1％的在50mM碳酸氢铵中的Triton X-100溶解。在特定的实施方案中，可以按照Espinosa-de Aquino等人(2017)描述的方案从颊拭子样本中分离出蛋白质。在特定实施方案中，来自颊拭子样本的细胞可以用合适的缓冲液诸如TRIzol(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)提取，并且核酸沉淀后的上清液可以被用于蛋白质提取。在特定的实施方案中，可以用丙酮沉淀蛋白质，可以将蛋白质沉淀重悬于合适的缓冲液(例如，盐酸胍在95％的补加有2.5％甘油的乙醇中的溶液)中，可以通过超声分散沉淀，可以将沉淀离心并且洗涤，可以干燥沉淀，并且可以将沉淀溶解在合适的缓冲液(例如，PBS和十二烷基硫酸钠)中。在特定实施方案中，可将经溶解的沉淀在100℃加热，然后离心以获得上清液以供使用。
在特定实施方案中，在本公开的方法中使用的样本包含外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC来自外周血，并且来源于驻存在骨髓中的造血干细胞(HSC)。PBMC是具有圆形细胞核的血细胞，并且可以包括许多类型的细胞，包括单核细胞、淋巴细胞(包括T细胞、B细胞和NK细胞)、树突细胞和干细胞。PBMC可以通过包括密度离心(例如，使用Ficoll-Paque)在内的本领域已知的任何技术分离。密度梯度离心按细胞密度分离细胞。在特定的实施方案中，全血或血沉棕黄层可在密度介质之上或之下分层，而不将两层混合，然后进行离心。在特定实施方案中，PBMC在血浆和密度梯度介质之间的界面处呈现为薄的白色层。在特定实施方案中，可以使用含有Ficoll-Hypaque和将Ficoll溶液与待抽取血液分离的凝胶塞的
Figure BDA0003843047680000121
采血管(细胞制备管CPTTM，BD Biosciences，San Jose，CA；Puleo等人(2017)Bio-protocol7(2):e2103)。在特定实施方案中，可以使用被设计成具有用于防止密度梯度介质和样本在离心之前混合的插入件的SepMateTM管(STEMCELLTM Technologies，Vancouver，CA)。(Kerfoot等人，Proteomics Clin Appl，2012.6(7-8):394-402；Grievink等人，Biopreserv Biobank.2016Oct；14(5):410-415；Corkum等人(2015)BMC Immunol.16:48；Jia等人(2018)Biopreserv Biobank 16(2):82-91)。在特定实施方案中，PBMC可以通过白细胞分离法分离。白细胞分离机是一种自动化设备，该设备从供体采集全血，并使用高速离心分离出目标PBMC级分，同时使血液的包含血浆、红细胞和粒细胞的剩余部分返回至供体。在特定实施方案中，分离的PBMC可用0.1％的在50mM碳酸氢铵中的Triton X-100溶解。
在特定实施方案中，用于本公开的免疫-SRM测定的样本包括白血细胞(WBC；白细胞)。WBC是免疫系统的一部分，并且可以保护身体免受感染和外来入侵者的侵害。在特定实施方案中，WBC包括粒细胞(多形核细胞)、淋巴细胞(单个核细胞)和单核细胞(单个核细胞)。在特定实施方案中，WBC包括淋巴细胞和单核细胞，但不包括粒细胞。可以通过本领域已知的任何技术分离和任选地富集WBC，该技术包括：密度梯度离心(Boyum(1968)Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.Isolation ofmononuclear cells by one centrifugation and of granulocytes by combiningcentrifugation and sedimentation at 1g.Scand.J.Clin.Lab Invest.增刊97:77；Boyum(1977)Lymphology，10(2):71-76)；通过渗透休克溶解红细胞(Morgensen和Cantrell(1977)Pharm Therap.1:369-383)；RosetteSepTM (STEMCELLTM Technologies，Vancouver，CA)，包括抗体介导的不需要的细胞与红细胞的结合以及通过密度梯度分离进行的去除(Beeton和Chandy(2007)J Vis Exp.(8):326)；用于细胞富集或耗尽的磁珠(Brocks等人(2006)In vivo 20(2):239)；补体介导的裂解以富集B和/或NK细胞(Faguet和Agee(1993)JImm Meth 165(2):217)；和淘选以去除不需要的细胞，包括通过粘附到抗体包被的板上来富集或耗尽细胞(Brousso等人(1997)Immunol Let 59(2):85).对于有关WBC的分离和富集方案的综述，参见Dagur和McCoy(2015)Curr Protoc Cytom.73:5.1.1-5.1.16。
(ii)WAS和XLA的肽标记物。有许多来自靶蛋白的理论蛋白水解肽可以成为单克隆抗体生产的潜在候选者。在特定实施方案中，最佳的潜在候选肽是在通过MS/MS筛查它们的特征之后选择的。选择具有最高灵敏度和特异性的那些特征肽以开发相应的单克隆抗体，并使用临床样本对这些特征肽进行验证。
通常，选择目标蛋白质所特有的并且在MS实验中始终观察到的一种或两种特征蛋白水解肽以化学计量地代表目标蛋白质(Mallick等人，Nat Biotechnol 2007；25:125-131)。可通过先前MS实验中的检测、用于预测最有可能通过MS观察到的肽的计算工具的使用，或两者的组合来选择特征肽。在特定实施方案中，可选择具有中等疏水性的长度为5-22个氨基酸的胰蛋白酶肽。由于HPLC中的保留时间变化和表面的损失，非常亲水且非常疏水的肽可能不稳定。在特定实施方案中，甲硫氨酸残基(氧化)、N末端谷氨酰胺(环化)、后面接着甘氨酸或脯氨酸的天冬酰胺(易于脱酰胺)，以及二元末端(dibasic termini)(例如相邻的赖氨酸或精氨酸残基，如KK、KR、RR、RK具有可变消化效率的潜力)可能是不希望的(Whiteaker和Paulovich，Clin Lab Med.2011；31(3):385-396)。较短的肽和含有脯氨酸残基的那些肽可能是SRM的更好靶标(Lange等人，Molecular Systems Biology 2008；4:222)。
在特定实施方案中，该肽是可以作为用于诊断个体是否患有WAS和/或XLA的生物标志物的特征肽。缺乏或缺少该特征肽生物标志物表明个体患有WAS和/或XLA。在特定实施方案中，该肽包括WASp和/或BTK的部分。在特定实施方案中，该肽包括表1中的SEQ ID NO:1和2。
表1.被本公开的抗肽抗体结合的蛋白质靶标和相应的肽序列
Figure BDA0003843047680000141
(iii)结合WAS和XLA的肽标记物的抗体。提供了与本公开的特征肽生物标志物结合的抗体及其抗原结合片段。在特定实施方案中，针对WAS和XLA中减少或不存在的蛋白质的肽产生的抗肽抗体及其抗原结合片段可被用于免疫-SRM方法以可靠地诊断WAS和XLA。在特定实施方案中，本公开的抗体及其抗原结合片段包括重组抗体及其抗原结合片段。
在特定实施方案中，本公开的抗体及其抗原结合片段包括表2和3中所示的互补决定区(CDR)、可变重结构域(VH)、可变轻结构域(VL)、重链和轻链。
表2.结合WASp 289和BTK 545的抗体的CDR的示例性序列
Figure BDA0003843047680000142
Figure BDA0003843047680000151
表3.结合WASp 289和BTK 545的抗体的VH、VL、重链和轻链的示例性氨基酸序列
Figure BDA0003843047680000152
Figure BDA0003843047680000161
Figure BDA0003843047680000171
Figure BDA0003843047680000181
在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括含有由SEQ ID NO:31编码的前导序列的抗WASp 289VH结构域。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括含有由SEQ ID NO:32编码的前导序列的抗WASp 289VL结构域。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括含有由SEQ ID NO:33编码的前导序列的抗WASp 289重链。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括含有由SEQ ID NO:34编码的前导序列的抗WASp 289轻链。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括含有由SEQ IDNO:35编码的前导序列的抗BTK 545VH结构域。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括含有由SEQ ID NO:36编码的前导序列的抗BTK 545VL结构域。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括含有由SEQ ID NO:37编码的前导序列的抗BTK 545重链。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括含有由SEQ ID NO:38编码的前导序列的抗BTK 545轻链。
在特定实施方案中，示例性抗体或抗原结合片段包括不含由SEQ ID NO:62编码的前导序列的抗WASp 289VH结构域。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括不含由SEQ ID NO:63编码的前导序列的抗WASp 289VL结构域。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括不含由SEQ ID NO:64编码的前导序列的抗WASp 289重链。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括不含由SEQ ID NO:65编码的前导序列的抗WASp 289轻链。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括不含由SEQ IDNO:66编码的前导序列的抗BTK 545VH结构域。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括不含由SEQ ID NO:67编码的前导序列的抗BTK 545VL结构域。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括不含由SEQ ID NO:68编码的前导序列的抗BTK 545重链。在特定实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括不含由SEQ ID NO:69编码的前导序列的抗BTK 545轻链。
抗体包含基本上由一种或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，无论是天然的还是部分或全部合成产生的。抗体特异性地(或选择性地)结合并识别表位(例如，抗原)。抗体可包括具有与免疫球蛋白结合结构域同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE等。识别的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因，α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。抗体的“Fc”部分是指免疫球蛋白重链的包含一个或多个重链恒定区结构域CH1、CH2和CH3、但不包含重链可变区的部分。
完整抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链均由重链可变区(本文中缩写为VH或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。
抗体片段包括抗体的小于全长的任何衍生物或部分。在特定实施方案中，抗体片段保留全长抗体作为结合配偶体的特异性结合能力的至少大部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、Fab'-SH、F(ab′)2、单链可变片段(scFv)、Fv、dsFv双抗体和Fd片段和/或免疫球蛋白的与本文所述的表位特异性地结合的任何生物学有效片段。抗体或抗体片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微型抗体和线性抗体的全部或一部分。
单链可变片段(scFv)是用短接头肽连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的融合蛋白。Fv片段包括抗体的单臂的VL和VH结构域。虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但它们可使用例如重组方法通过合成接头加以接合，所述合成接头使它们能够以单一蛋白链形式制得，在该单一蛋白链中，VL区和VH区配对从而形成单价分子(单链Fv(scFv))。有关Fv和scFv的另外信息，参见例如，Bird等人，Science 242(1988)423-426；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883；Plueckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore(编)，Springer-Verlag，New York)，(1994)269-315；WO1993/16185；美国专利号5,571,894；以及美国专利号5,587,458。
Fab片段是包含VL、VH、CL和CH1结构域的单价抗体片段。F(ab')2片段是包含通过铰链区处的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段。对于具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双抗体包含两个可以是二价的表位结合位点。参见例如，EP 0404097；WO1993/01161；以及Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。也可使用双重亲和力重靶向抗体(DARTTM；基于双抗体形式，但具有C末端二硫桥键以获得额外的稳定(Moore等人，Blood 117，4542-51(2011))。抗体片段也可包括分离的CDR。对于抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.9(2003)129-134。
可通过任何方式产生抗体片段。例如，抗体片段可通过完整抗体的片段化酶促或化学产生，或者它可从编码部分抗体序列的基因重组产生。可替代地，抗体片段可全部或部分合成产生。抗体片段可包括单链抗体片段。在另一个实施方案中，片段可包含例如通过二硫键联连接在一起的多个链。片段还可包含多分子复合物。功能性抗体片段通常可包含至少50个氨基酸，并且更通常将包含至少200个氨基酸。
在特定实施方案中，可产生重组免疫球蛋白。参见，Cabilly，US 4,816,567和Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA，86:10029-10033(1989)。
“分离的抗体”是这样的抗体，该抗体已经与其天然环境的组分分离。在特定实施方案中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相高效液相色谱法(HPLC))所确定，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度。对于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等，(2007)Chromatogr.B 848:79-87。
如所指出的，在特定实施方案中，经工程改造的抗体或抗原结合片段的结合结构域可通过接头接合。接头是这样的氨基酸序列，该氨基酸序列可为经工程改造的抗体或抗原结合片段的结合结构域之间的构象运动提供柔性和空间。可使用任何适当的接头。接头的实例可在Chen等人，Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10):1357–1369中找到。接头可以是柔性的、刚性的或半刚性的，这取决于所需功能结构域向靶标的呈递。常用的柔性接头包括Gly-Ser接头，如GGSGGGSGGSG(SEQ ID NO:39)、GGSGGGSGSG(SEQ ID NO:40)和GGSGGGSG(SEQ ID NO:41)。另外的实例包括：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:42)、GGGSGGGS(SEQID NO:43)和GGSGGS(SEQ ID NO:44)。也可使用包含一个或多个抗体铰链区和/或免疫球蛋白重链恒定区的接头，如单独的CH3或CH2CH3序列。
本领域普通技术人员还将理解，抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺的变化。
单克隆抗体包括从大致上均质的抗体群体获得的抗体，即除在产生单克隆抗体期间可出现的可能变体(此类变体一般以少量存在)之外，构成所述群体的各个抗体是同一的并且/或者结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。这种类型的抗体是由单个产生抗体的杂交瘤的子细胞产生的。单克隆抗体通常对与其结合的任何表位展现单一结合亲和力。
修饰语“单克隆”指示从均质抗体群体获得的抗体的特性并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体仅识别一种类型的抗原。本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列是同一或同源的，而所述一条或多条链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列是同一或同源的。用于产生抗体的技术在本领域中是众所周知的，并且描述于例如Harlow和Lane“Antibodies，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Harlow和Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press，1999；Tickle等人，JALA:Journal of the Association forLaboratory Automation.2009；14(5):303-307；Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996；93:7843-7848；以及US 5,627,052中。
“人抗体”是包含对应于由人或人细胞所产生的抗体的氨基酸序列或来源于利用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源的氨基酸序列的抗体。
“人共有框架”是代表在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最通常存在的氨基酸残基的框架。一般地，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚组中选择的。该序列的亚组可以是如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，NIH出版91-3242，Bethesda Md(1991)，第1-3卷中的亚组。在特定实施方案中，对于VL，该亚组是如Kabat等人(同上)中的亚组kI。在特定实施方案中，对于VH，该亚组是如Kabat等人(同上)中的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个以及通常两个可变结构域，其中所有的或者基本上所有的CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有的或者基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。
人源化抗体和它们的制备方法综述于例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633，2008中，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature332:323-329，1988；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033，1989；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34，2005(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28:489-498，1991(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60,2005(描述“FR改组(shuffling)”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68，2005和Klimka等人，Br.J.Cancer，83:252-260，2000(描述FR改组的“导向选择(guided selection)”方法)。EP-B-0239400提供了对“CDR-移植”的附加描述，其中第一抗体的一个或多个CDR序列被置于非该抗体的，例如另一个抗体的序列框架内。
可以用于人源化的人框架区包括：使用“最适(best-fit)”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等，J.Immunol.151:2296，1993)；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285，1992；和Presta et al.，J.Immunol.，151:2623，1993)；人成熟(体细胞突变(somaticallymutated))框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633，2008)；和筛查FR文库得到的框架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684，1997；和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618，1996年)。
在特定实施方案中，“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体与肽)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(KD)或缔合常数(KA)表示。可通过本领域已知的常用方法测量亲和力。在特定实施方案中，可以使用放射性标记的抗原结合测定(RIA)或表面等离子共振测定来表征KD。
在特定实施方案中，“结合”是指抗体的结合结构域与其靶肽缔合的解离常数(KD)为10-8M或更低、在特定实施方案中为10-5M至10-13M、在特定实施方案中10-5M至10-10M、在特定实施方案中10-5M至10-7M、在特定实施方案至10-8M至10-13M或在特定实施方案中10-9M至10-13M。所述术语可进一步用于指示结合结构域不结合至存在的其他生物分子(例如，它以10-4M或更高、在特定实施方案中10-4M至1M的解离常数(KD)结合至其他生物分子)。
在特定实施方案中，“结合”是指抗体的结合结构域与其靶肽缔合的亲和常数(即，缔合常数，KA)为107M-1或更高、在特定实施方案中105M-1至1013M-1、在特定实施方案中105M-1至1010M-1、在特定实施方案中105M-1至108M-1、在特定实施方案中107M-1至1013M-1或在特定实施方案中107M-1至108M-1。所述术语可进一步用于指示结合结构域不结合至存在的其他生物分子(例如，它以104M-1或更低、在特定实施方案中104M-1至1M-1的缔合常数(KA)结合至其他生物分子)。
与如本文公开的抗体结合相同表位的抗体是指在竞争测定中将本文公开的抗体与其相应肽的结合阻断了阻断50％或更高百分比的抗体，并且相反地，本文公开的抗体在竞争测定中将该抗体与其抗原的结合阻断了50％或更高百分比。在示例性竞争测定中，将固定的WASp 289或BTK 545肽在溶液中孵育，该溶液包含与WASp 289或BTK 545肽结合的第一经标记的抗体和正被测试与抗WASp 289或抗BTK 545竞争着分别与WASp 289或BTK 545肽结合的能力的第二未经标记的抗体。作为对照，将固定的WASp 289或BTK 545肽在包含与WASp 289或BTK 545肽结合的第一经标记的抗体但不包含第二未经标记的抗体的溶液中孵育。在允许抗WASp 289或抗BTK 545与其相应肽结合的条件下孵育后，去除多余的未被结合的抗体，并测量与固定的WASp 289或BTK 545肽缔合的标记的量。如果测试样本中与固定的WASp 289或BTK 545肽缔合的标记的量与对照样本相比实质性降低，则表明第二抗体正在与抗WASp 289或抗BTK 545竞争着分别与WASp 289或BTK 545肽结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)。
(iv)变体。还包括本文所述的抗体的变体。抗体的变体可包括具有一个或多个保守氨基酸取代或一个或多个非保守取代的变体，所述取代不会不利地影响蛋白质的结合。
在特定实施方案中，保守氨基酸取代可能不会实质性地改变参考序列的结构特征(例如，取代氨基酸不应破坏抗体/肽结合)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton编，W.H.Freeman andCompany，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden&J.Tooze编，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；以及Thornton等人，Nature，354:105(1991)。
天然存在的氨基酸通常分为以下保守性取代家族：第1组：丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)；第2组：(酸性)：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；第3组：(酸性；也分类为极性带负电的残基及其酰胺)：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、Asp和Glu；第4组：Gln和Asn；第5组：(碱性；也分类为极性带正电的残基)：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；第6组(大的脂族非极性残基)：异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)和半胱氨酸(Cys)；第7组(不带电的极性)：酪氨酸(Tyr)、Gly、Asn、Gln、Cys、Ser和Thr、第8组(大的芳族残基)：苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和Tyr；第9组(非极性)：脯氨酸(Pro)、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met和Trp；第11组(脂族)：Gly、Ala、Val、Leu和Ile；第10组(小的脂族非极性或弱极性残基)：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；以及第12组(含硫)：Met和Cys。另外的信息可见于Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman and Company。
在制作此类变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数。本领域中通常了解亲水性氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982，J.Mol.Biol.157(1)，105-32)。已基于每种氨基酸的疏水性和电荷特征对每种氨基酸指定亲水性指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些值为：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；Gln(-3.5)；天门冬氨酸(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。
本领域已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物活性的蛋白质，即，仍然获得生物学功能等效的蛋白质。在制作此类变化时，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，亲水指数在±1以内的氨基酸的取代是特别优选的，并且亲水指数在±0.5以内的氨基酸的取代是甚至更特别优选的。在本领域中还应了解，可基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。
如US 4,554,101中所详述，以下亲水性值已被指定给氨基酸残基：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Thr(-0.4)；Pro(-0.5±1)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；Trp(-3.4)。应理解，氨基酸可被取代成具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等效的且特别是免疫学上等效的蛋白质。在此类变化中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，亲水性值在±1以内的氨基酸的取代是特别优选的，亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代是甚至更特别优选的。
如上所概述的，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。
在特定实施方案中，VL区可以源自或基于公开的VL并且在与所公开的VL相比时，可以包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10)个插入、一个或多个多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10)个缺失、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)，或上面指出的变化的组合。插入、缺失或取代可以位于VL区的任何地方，包括位于该区的氨基端或羧基端或这两个末端，条件是每个CDR均包括零个变化或最多一个、两个或三个变化，并且包含经修饰的VL区的抗体仍然可以以与野生型结合结构域相似的亲和力特异性地结合其靶表位。
在特定实施方案中，VH区可以源自或基于公开的VH并且在与本文公开的VH相比时，可以包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10)个插入、一个或多个多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10)个缺失、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)，或上面指出的变化的组合。插入、缺失或取代可以位于VH区的任何地方，包括位于该区的氨基端或羧基端或这两个末端，条件是每个CDR均包括零个变化或最多一个、两个或三个变化，并且包含经修饰的VH区的抗体仍然可以以与野生型结合结构域相似的亲和力特异性地结合其靶表位。
在特定实施方案中，变体包括或是与本文公开的抗体序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％序列同一性的序列。在特定实施方案中，变体包括或是与轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)或两者具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％序列同一性的序列，其中每个CDR均包括与本文公开的抗体或它的与WASp或BTK特征肽特异性地结合的片段或衍生物相比的零个变化，或最多一个、两个或三个变化。
在特定实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入到抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在特定实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，被取代的残基存在于抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点处，并且可以被用于将抗体与其它部分缀合，如下文进一步所描述。可以如例如美国专利号7,521,541所述的那样生成经半胱氨酸工程改造的抗体。
在特定实施方案中，经修饰抗体包括其中一个或多个氨基酸已被非氨基酸组分取代，或者其中该氨基酸已与官能团缀合或者官能团已以其他方式与氨基酸缔合的那些经修饰抗体。经修饰氨基酸可以是例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸，或与有机衍生剂缀合的氨基酸。一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，在重组生产期间被共翻译或翻译后修饰(例如，在哺乳动物细胞中表达期间在NXS/T基序处的N-连接糖基化)或通过合成方式被修饰。经修饰氨基酸可以在序列内或在序列的末端处。修饰还包括亚硝酸化构建体。
在特定实施方案中，变体包括糖基化变体，其中与参考序列的氨基酸序列相比，糖基化位点的数量和/或类型已经改变。在特定实施方案中，糖基化变体包括比参考序列更多或更少数量的N-连接糖基化位点。N-连接糖基化位点的特征在于序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸外的任何氨基酸残基。用于创建这个序列的氨基酸残基取代为N连接碳水化合物链的添加提供了潜在的新位点。可替代地，消除这个序列的取代将去除现有的N连接碳水化合物链。还提供了N-连接碳水化合物链的重排，其中一个或多个N-连接糖基化位点(例如，天然存在的那些)被消除并创建了一个或多个新的N-连接位点。另外的抗体变体包括这样的半胱氨酸变体，其中一个或多个半胱氨酸残基从参考序列中缺失，或者与参考序列相比，被另一个氨基酸(例如，丝氨酸)取代。当抗体必须重新折叠成具有生物活性的构象时(诸如在分离不溶性包涵体之后)，这些半胱氨酸变体可能是有用的。这些半胱氨酸变体一般具有比参考序列更少的半胱氨酸残基，并且通常具有偶数以最小化由未配对半胱氨酸引起的相互作用。
聚乙二醇化特别是聚乙二醇(PEG)聚合物链与其他分子(如蛋白质)共价缀合的过程。文献中已经报道了几种聚乙二醇化蛋白质的方法。例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG被用于PEG化赖氨酸残基的游离胺基和蛋白质N末端；带有醛基的PEG已被用于在还原剂存在下对蛋白质的氨基端进行PEG化；具有马来酰亚胺官能团的PEG已被用于选择性地PEG化蛋白质中半胱氨酸残基的游离硫醇基团；并且可以执行乙酰苯丙氨酸残基的位点特异性聚乙二醇化。
“序列同一性％”是指如通过比较序列所确定的两个或更多个序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还意指如通过此类序列串之间的匹配所确定的蛋白质、核酸或基因序列之间的序列相关性程度。“同一性”(经常称为“相似性”)可通过已知方法来容易地计算，所述方法包括(但不限于)在以下中描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.,编辑)Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing:Informatics andGenome Projects(Smith，D.W.，编辑)Academic Press，NY(1994)；Computer Analysis ofSequence Data，Part I(Griffin，A.M.,和Griffin，H.G.,编辑)Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(Von Heijne，G.，编辑)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)OxfordUniversity Press，NY(1992)。设计确定同一性的优选方法以得到所测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法编写于可公开获得的计算机程序中。序列比对和同一性％计算可使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR，Inc.，Madison，Wisconsin)的Megalign程序来执行。序列的多重比对还可使用Clustal比对方法(Higgins和SharpCABIOS，5，151-153(1989)以默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)来执行。相关程序还包括GCG程序套件(威斯康星软件包9.0版，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))；DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，Wisconsin)；以及并入Smith-Waterman算法的FASTA程序(Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.出版商：Plenum，New York，N.Y.]。在本公开的上下文内，将了解在将序列分析软件用于分析的情况下，分析的结果是基于所引用的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将意指在首次初始化时用软件最初加载的值或参数的任何集合。
(v)抗肽抗体的免疫缀合物。所公开的抗体及其抗原结合片段可以是免疫缀合物。在特定实施方案中，免疫缀合物是与一种或多种异源分子(包括标记)缀合的抗体。
标记可以包括亲和标签。亲和标签可以包括例如His标签(SEQ ID NO:45)、Flag标签(SEQ ID NO:46-48)、Xpress标签(SEQ ID NO:49)、Avi标签(SEQ ID NO:50)、钙调蛋白结合肽(CBP)标签(SEQ ID NO:51)、聚谷氨酸标签(SEQ ID NO:52)、HA标签(SEQ ID NO:53-55)、Myc标签(SEQ ID NO:56)，Strep标签(其指原始的
Figure BDA0003843047680000311
标签(SEQ ID NO:57)，
Figure BDA0003843047680000312
标签II(SEQ ID NO:58)(IBAInstitut fur Bioanalytik，Germany)；参见，例如，US 7,981,632)、Softag 1(SEQ ID NO:59)、Softag 3(SEQ ID NO:60)和V5标签(SEQ IDNO:61)。
标记可以包括检测部分。可与本公开的抗体或其抗原结合片段缀合的检测部分包括有色颗粒；金纳米粒子；胶体；化学发光标签；放射性同位素；荧光标签，包括异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、若丹明红(Rhodamine Red)TM(例如，来自Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)、花青荧光团、德克萨斯红
Figure BDA0003843047680000313
(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)、藻红蛋白(PE)、R-藻红蛋白、别藻蓝蛋白(APC)、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白、DyLightTM(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)、Alexa
Figure BDA0003843047680000321
(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)、Atto染料或荧光蛋白如GFP；和酶报告基因，包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶。在特定实施方案中，酶报告标记与比色、荧光或化学发光底物结合用于可视化。
本公开的抗体或其抗原结合片段与异源分子的缀合或者对异源分子的标记可以使用本领域已知的任何方法，包括使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳-14标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂(WO94/11026)。
在特定实施方案中，免疫缀合物可以用交联剂试剂来制备，该交联剂试剂包括N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-ε-马来酰亚胺基己酰基-氧基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双乙烯基砜(HBVS)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酰肼(MPBH)、琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯)(SBAP)、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基6-((β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、N-κ-马来酰亚胺基十一酰基-氧基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-KMUS)、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，它们是可商购获得的(例如，可从Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL商购获得)。
在特定实施方案中，接头可以是“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，CancerRes.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
(vi)本公开的重组蛋白的生产。根据本公开的多肽(例如，抗体或抗体的部分)可以通过本领域已知的任何方式产生。在特定实施方案中，使用重组DNA技术产生多肽。可以通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛查、聚合酶链反应(PCR)、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scFv文库、定向诱变等)制备编码多肽的核酸序列并将其组装成完整的编码序列。所得编码区可被插入到表达载体中并被用于转化合适的表达细胞系。
术语“基因”是指编码多肽的核酸序列(可与多核苷酸或核苷酸序列互换使用)。此定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体，其中此类改变不实质性地影响编码的多肽的功能。术语“基因”不仅可包括编码序列，而且包括调控区，如启动子、增强子和终止区。所述术语可进一步包括从mRNA转录物剪接的所有内含子和其他DNA序列，连同由可变剪接位点产生的变体。编码多肽的基因序列可以是指导多肽表达的DNA或RNA。这些核酸序列可以是转录成RNA的DNA链序列或翻译成多肽的RNA序列。核酸序列包括全长核酸序列以及源自全长多肽的非全长序列两者。所述序列还可包括天然序列的简并密码子或可被引入以在特定细胞类型中提供密码子偏好的序列。
“编码”是指基因中特定核苷酸序列(诸如互补DNA(cDNA)或信使RNA(mRNA))用作合成其他大分子(诸如已确定的氨基酸序列)的模板的特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生多肽，则该基因编码多肽。“编码多肽的基因序列”包括所有这样的核苷酸序列，该核苷酸序列是彼此的简并形式并且编码相同的氨基酸序列或具有基本相似的形式和功能的氨基酸序列。
编码多肽的多核苷酸基因序列可以与相关调控序列可操作地连接。例如，调节序列和外源核酸序列之间可能存在功能连键(functional linkage)，该功能连键导致外源核酸序列的表达。对于另一个实例，当第一核酸序列被置于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列可以与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接至该编码序列。
在本公开中采用的示例性核酸构建体(多核苷酸)中，启动子与编码本公开的抗体或衍生自本公开的抗体的多肽的核酸序列可操作地连接，即该启动子和核酸酸序列被定位成促进mRNA从编码多肽的DNA转录。该启动子可以是基因组来源的或合成产生的。该启动子可以与或不与增强子缔合，其中该增强子可以与特定启动子天然地缔合或者与不同的启动子缔合。可以使用允许组成型或诱导型表达的启动子，其中可以根据靶宿主、所需的表达水平、靶宿主的性质等来控制表达。
任选地，信号序列可以存在于多核苷酸的5'末端，以使多肽正确靶向到细胞位置或从细胞分泌。
可以在多核苷酸的3'末端使用终止区以正确地终止转录。在特定实施方案中，终止区可以包括多腺苷酸化信号。可以在不对表达产生不利影响的情况下使用多种多样的终止区域。
本公开进一步提供了一种包含本公开的多核苷酸的载体。如本文所用的术语“载体”是指许多这样的核酸中的任一种，该核酸中可具有可例如通过限制和连接插入以在不同遗传环境之间运输或以在宿主细胞中表达的期望序列。核酸载体可以是DNA或RNA。载体包括质粒、噬菌体、噬菌粒、细菌基因组和病毒基因组。克隆载体是可以在宿主细胞中复制的载体，其特征进一步在于一个或多个核酸内切酶限制性位点，该载体可以在该位点处以可确定的方式被切割，并且可以将所需的DNA序列连接到该位点中，以使得新的重组载体保留它在宿主细胞中复制的能力。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制。其它载体在被引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起被复制。表达载体能够表达本公开的多肽，即载体序列含有多肽的转录和翻译所需的调控序列，包括启动子、操纵子、转录终止位点、核糖体结合位点等。
载体-宿主系统包括诸如细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞系统之类的系统，无论是在体内(例如，在动物中)还是在体外(例如，在细菌中或在细胞培养物中)。根据本文的教导，对合适的宿主的选择被认为在本领域技术人员的技术范围内。在某些实施方案中，宿主细胞是细菌，例如大肠杆菌。
宿主细胞用本公开的载体进行基因工程改造(感染、转导、转化或转染)。在特定实施方案中，宿主细胞包括包含本公开的多核苷酸的载体。可将经工程改造的宿主细胞在经过适当修改的常规营养培养基中培养，以激活启动子、选择转化体或扩增多核苷酸。培养条件，诸如温度、pH等，是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员来说是显而易见的。
(vii)使用方法。本公开的抗体及其抗原结合片段可被用于本文所述的特征肽的免疫亲和富集。随后可以在SRM测定中检测富集的特征肽，以诊断WAS和XLA。特征肽包括WASp 289和BTK 545。
在特定实施方案中，对特征肽的富集包括将来自经消化的生物样本的肽片段混合物与识别特征肽的一个或多个本公开的结合抗体及其抗原结合片段接触。在特定实施方案中，生物样本包括DBS、颊拭子、PBMC和WBC。
在特定实施方案中，包含SEQ ID NO：3-8和15-22的抗体被用于富集包含SEQ IDNO：1的WASp肽。
在特定实施方案中，包含SEQ ID NO：9-14和23-30的抗体被用于富集包含SEQ IDNO：2的BTK肽。
SRM之前所需肽靶标的富集可通过本领域已知的任何方法来完成。许多富集程序是可用的，这些程序包括来自样本的丰富蛋白质物质的基于免疫吸附的耗减、沉淀、色谱法、电泳、溶剂分配、免疫沉淀、免疫电泳和免疫色谱法。在特定实施方案中，可使用用于从样本的消化物中特异性地基于抗体捕获单独胰蛋白酶肽的SISCAPA方法。Anderson等人，J.Proteome Research 2004；3:235-244；US 7,632,686。
在特定实施方案中，结合肽标志物的抗体(如本文公开的抗体)可连接至固体载体。特定实施方案使用亲和柱，其中抗体与色谱介质共价偶联。在特定实施方案中，POROS(Applied Biosystems，Foster City，CA)纳米柱可用于SISCAPA富集中，并且特征是高结合能力、允许快速富集靶肽的相对较高的抗体浓度以及制备具有多种官能化基团的色谱柱的能力。可替代地，抗体可附着于珠粒、磁珠或其他固体颗粒上。一种附着方式是抗体与包被在珠粒上的蛋白质的缀合。例如，蛋白G包被的颗粒以优选的取向提供抗体的结合。可使用其他附着方式，如用抗体直接包被珠粒。磁性颗粒具有广泛的化学性质，从而允许与抗体偶联。附着至颗粒上的抗体的富集可允许样本的并行加工。磁性颗粒加工已在用于SISCAPA富集步骤的96孔板中自动化，在所述板中具有洗脱液用于通过质谱进行分析。其他特定实施方案使用新颖的珠粒捕集装置，所述装置被开发来执行与纳流色谱系统一致的珠粒处理步骤。Anderson等人Mol Cell Proteomics 2009；8(5):995-1005。这样可使洗脱与分析步骤之间肽在容器中的损失最小化。也可通过将抗肽抗体固定在移液管尖端中来实现肽富集。Nelson等人Anal Chem.1995；67(7):1153-1158。将抗体结合的肽与游离肽分离后，可洗脱结合的肽。可使用任何洗脱方法。已发现有效的一种洗脱方式是5％乙酸/3％乙腈。对于特定的肽有效的是，可使用其他洗脱方式，包括其他酸和其他浓度的乙酸。
在特定实施方案中，表2和3中公开的结合同源特征肽的抗WASp 289和/或抗BTK545抗体可被用于筛查WAS和/或XLA。在特定实施方案中，表2和3中公开的结合同源特征肽的抗WASp 289和/或抗BTK 545抗体可被用于筛查WAS和/或XLA的群体。
本公开的抗体及其抗原结合片段可被用于检测生物样本中本文所述的WASp 289肽、BTK 545肽和/或其相应蛋白质的水平。在特定实施方案中，该方法包括：在允许将抗WASp 289和/或抗BTK 545抗体或其抗原结合片段与其各自的肽或蛋白质结合的条件下，将生物样本与如本文所述的抗WASp 289和/或抗BTK 545抗体或其抗原结合片段接触，以及检测抗WASp 289抗体或其抗原结合片段与WASp289肽或其相应蛋白质之间或者抗BTK 545抗体或其抗原结合片段与BTK 545肽或其相应蛋白质之间是否形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在特定实施方案中，生物样本包括全血、DBS、血清、血浆、其他血液级分、细胞、组织和来自受试者的测试样本。
在特定实施方案中，包含SEQ ID NO:3-8和15-22的抗体被用于检测包含SEQ IDNO:1的WASp肽。
在特定实施方案中，包含SEQ ID NO：9-14和23-30的抗体被用于检测包含SEQ IDNO：2的BTK肽。
在特定实施方案中，执行使用抗WASp 289和/或抗BTK 545抗体或其抗原结合片段对WASp 289肽、BTK 545肽和/或其相应蛋白质的水平的检测，作为本领域技术人员已知的测定(包括免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、蛋白质印迹、斑点印迹、放射免疫测定(RIA)；夹心式测定；流式细胞术；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；免疫电泳；免疫沉淀和免疫荧光)的一部分。
本文公开的实施方案还可以利用液相色谱和/或质谱分析。在特定实施方案中，在SRM-MS之前执行一个或多个LC纯化步骤。可使富集肽的混合物(流动相)通过填充有材料(固定相)的色谱柱，以基于肽的重量和对柱的流动相和固定相的亲和力来使所述肽分离。传统的LC分析依赖于样本组分与色谱柱填充材料之间的化学相互作用，其中样本通过柱的层流是从测试样本中分离出目标分析物的基础。熟练技术人员将理解，在这种柱中的分离是扩散过程。多种柱填充材料可用于样本的色谱分离，并且适当分离方案的选择是取决于样本特性、目标分析物、存在的干扰物质及其特性等的经验过程。可根据需要(例如，所纯化的化合物的结构、极性和溶解性)使用各种填充化学物质。在特定实施方案中，所述柱是极性柱、离子交换柱(阳离子和阴离子两者)、疏水相互作用柱、苯基柱、C-2柱、C-8柱、C-18柱、多孔聚合物上的极性涂层或可商购的其他柱。在色谱过程中，材料的分离受变量如洗脱液(也称为“流动相”)的选择、梯度洗脱的选择以及梯度条件、温度等的影响。在特定实施方案中，分析物可通过在柱填充材料可逆地保留目标分析物而不保留一种或多种其他材料的条件下，将样本施加到柱上来进行纯化。在这些实施方案中，可使用第一流动相条件，在所述第一流动相条件下目标分析物被柱保留，并且一旦将未保留的材料洗涤通过，就可随后使用第二流动相条件从柱中除去所保留的材料。可替代地，可通过在流动相条件下将样本施加到柱上来纯化分析物，在所述流动相条件下，与一种或多种其他材料相比，目标分析物以不同的速率被洗脱。如上所讨论，相对于样本的一种或多种其他组分，此类程序可富集一种或多种目标分析物的量。在特定实施方案中，LC是微流LC(微LC)。在微流LC中，色谱分离是使用每分钟低微升范围内的流速执行的。在特定实施方案中，LC是纳流LC(纳LC)。在纳流LC(纳LC)中，使用300纳升/分钟的流速执行色谱分离。由于这类色谱法提供了高浓缩效率，因此减慢的流速导致高分析灵敏度(Cutillas，Current Nanoscience，2005；1：65-71)。
质谱仪包括测量可转变为气相离子的质荷(m/z)比的参数的气相离子谱仪。质谱法是指使用质谱仪检测气相离子。质谱仪通常包括离子源和质量分析仪。质谱仪的实例是飞行时间(TOF)、磁性扇区、四极过滤器、离子阱、离子回旋共振、静电扇区分析仪以及这些的杂合体。激光解吸质谱仪包括使用激光能量作为解吸、挥发和电离分析物的手段的质谱仪。串联质谱仪包括能够执行两个连续阶段的基于m/z的离子(包括离子混合物中的离子)辨别或测量的任何质谱仪。所述短语包括具有两个质量分析仪的质谱仪，所述质量分析仪能够执行两个连续阶段的基于m/z的空间串联离子辨别或测量。所述短语进一步包括具有单个质量分析仪的质谱仪，所述质量分析仪能够执行两个连续阶段的基于m/z的时间串联离子辨别或测量。因此，所述短语明确地包括Qq-TOF质谱仪、离子阱质谱仪、离子阱-TOF质谱仪、TOF-TOF质谱仪、傅立叶变换离子回旋共振质谱仪、静电扇区-磁性扇区质谱仪、三重四极质谱仪以及它们的组合。
质谱中的电离包括将样本中的分析物电离的过程。此类分析物可能变成用于进一步分析的带电分子。例如，样本电离可通过电喷射电离(ESI)、激光喷射电离(LSI)、大气压化学电离(APCI)、光致电离、电子电离、快速原子轰击(FAB)/液相次级电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场致电离、场解吸、热喷射/等离子体喷射电离以及粒子束电离来进行。熟练技术人员将理解可基于待测量的分析物、样本类型、检测器类型、正负模式的选择等确定电离方法的选择。
质量分析仪包括质谱仪的部件，所述部件吸收离子化的质量，并根据m/z比将它们分离，并且将它们输出至检测器，在检测器中对它们进行检测，然后转换为数字输出。用于确定m/z比的合适质量分析仪包括四极质量分析仪、飞行时间(TOF)质量分析仪、磁性或静电扇区质量分析仪和离子阱(例如离子回旋共振)质量分析仪。
选择反应性监测(SRM)-MS测定靶向针对给定目标蛋白质的一组预定肽。SRM是串联质谱模式，其中在串联质谱的第一阶段中选择特定质量的离子(母离子或前体离子)，然后在第二质谱检测阶段中选择前体离子的片段化反应的离子产物。与选定的前体离子和碎片离子相关的特定对的m/z值称为跃迁。对于每种特征肽，鉴定提供最佳信号强度并将目标肽与样本中存在的其他种类区分开的那些碎片离子。优化的跃迁有助于有效的SRM测定。随时间推移监测几个这样的跃迁(前体/碎片离子对)，从而生成一组色谱迹线，其中特定跃迁的保留时间和信号强度作为坐标。特征肽的SRM-MS分析通常在三重四极质谱仪(QQQ-MS)上进行，所述质谱仪是能够选择性地分离对应于特征肽的m/z的前体离子并选择性地监测肽特异性碎片离子的仪器。在SRM分析中，特异性取决于多个质量分析仪(质量过滤器)。第一个四极用于选择所需的母离子或前体离子。第三个四极用于监测(一种或多种)碎片离子。碎片离子是通过第二个四极中的碰撞诱导解离产生的。两个级别的质量选择允许高选择性，因为共洗脱背景离子非常有效地被滤出。与调查样本中的所有分析物的常规串联质谱(MS/MS)实验不同，SRM分析选择性地靶向(过滤)特定分析物，这意味着与常规的“全扫描”技术相比，灵敏度提高一个或两个数量级。此外，SRM在高达五个数量级的宽动态范围内提供线性响应。这样使得能够检测高度复杂混合物中的低丰度蛋白质。因此，SRM是具有低背景干扰的高度特异性检测/监测方法。当在单次MS运行中监测多种母离子时，这种类型的分析被称为多反应监测(MRM)。使用MRM分析，可在单次质谱运行中监测多种蛋白质和蛋白质的多个区域(特征肽)。选择反应性监测/多反应监测质谱(SRM/MRM-MS)描述于例如US 8,383,417、WO 2013/106603和US 2013/105684中。
在特定实施方案中，以下参数可用于指定在特定LC-SRM-MS系统下蛋白质的LC-SRM-MS测定：(1)给定蛋白质的富集的胰蛋白酶肽；(2)肽在LC柱上的保留时间(RT)；(3)肽前体离子的m/z值；(4)用于使前体离子电离的去簇电位；(5)由肽前体离子产生的碎片离子的m/z值；以及(6)用于使针对特定肽而优化的肽前体离子碎裂的碰撞能量(CE)。RT包括分析物的注入与洗脱之间经过的时间。去簇电位(DP)包括溶解和解离离子簇的电压电位。取决于制造商，它也被称为“碎裂电压”或“离子转移毛细管偏移电压”。碰撞能量(CE)包括前体离子在它们加速进入碰撞池时所接收的能量的量。
为了通过本文公开的方法促进肽的准确定量，可将已知量的一组目标同位素标记的合成型式的肽添加到样本中，以用作内部标准物。由于同位素标记的肽具有与相应的替代肽同一的物理和化学性质，因此它们从色谱柱共洗脱，并容易在所得质谱图中鉴定(Gerber等人，Proc.Natl.Asso.Sci.2003；100:6940-6945；Kirkpatrick等人Methods2005；35:265-273)。可用来标记给定肽中的氨基酸的同位素包括13C、2H、15N、17O、18O和34S。在特定实施方案中，用13C和/或15N重同位素标记肽。标记的标准物的添加可在蛋白水解消化之前或之后进行。在特定实施方案中，在蛋白水解消化后加入标记的内部标准物肽。合成同位素标记的肽的方法是本领域技术人员已知的。因此，在特定实施方案中，实验样本含有内部标准物肽。在特定实施方案中，内部标准物肽包括参考特征肽。在特定实施方案中，可通过组合以下来确定特征肽浓度：(i)通过比较特征肽的峰面积与从LC-MRM-MS测定获得的其相应的参考特征肽的峰面积而计算的比率，和(ii)参考特征肽的已知浓度。被选择作为参考标准并适合于定量的肽有时被称为quantotypic肽(Q-肽)。Q-肽不仅具有蛋白水解肽的所有特征，而且对可构成参考肽的残基施加限制以消除人工修饰和/或不完全切割(Holman等人，Bioanalysis 2012；4(14):1763-1786)。
一种或多种给定蛋白质的绝对定量水平可通过SRM/MRM方法确定，其中将一种生物样本中来自给定蛋白质的单个肽的SRM/MRM特征峰面积与已知量的“加标”内部标准物的SRM/MRM特征峰面积进行比较。在特定实施方案中，所述内部标准物是合成型式的相同的精确肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成此类同位素标记的内部标准物，由此质谱分析产生与天然肽特征峰不同且截然不同并可用作比较峰的可预测且一致的SRM/MRM特征峰。因此，当将内部标准物以已知量掺入到生物样本的蛋白质制剂中并通过质谱分析时，将天然肽的特征峰面积与内部标准物肽的特征峰面积进行比较，并且这种数值比较指示存在于来自生物样本的原始蛋白质制剂中的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。片段肽的绝对定量数据根据每种样本中所分析的蛋白质的量来显示。绝对定量可对于许多肽进行，并且因此同时定量在单一样本中的多种蛋白质；和/或对于多种样本进行，以获得对于在单个生物样本中和/或在整组的单个样本中绝对蛋白质量的了解。
肽绝对定量的另一种策略是通过均衡肽的等摩尔性。这种方法包括化学合成呈二肽形式的目标同位素标记的Q-肽。常见的氨基酸序列位于Q-肽的N末端，并且被称为均衡肽。在溶解和蛋白水解消化后，可通过参考单个光标记的肽来准确地确定Q-肽的量。然后可将适当量的每种标准物肽添加到目标样本中(预先消化或在蛋白水解之前)，以促进绝对定量(Holzmann等人，Anal.Chem.2009；81:10254-10261)。绝对定量也可以使用定量串联体(QconCAT)蛋白质(Beynon等人Nat.Methods 2005；2:587-589；Johnson等人J.Am.Soc.MassSpectrom.2009；20:2211-2220；Ding等人J.Proteome Res.2011；10:3652-3659；Carroll等人Molecular&Cellular Proteomics 2011；9月19日:mcp-M111)。在这种策略中，在稳定的同位素富集培养基中生长的大肠杆菌中异源产生了重组人工蛋白质，该蛋白质是来自几种目标蛋白质的标准物肽的亲和标记的级联体(concatenation)。然后将QconCAT蛋白亲和纯化并与样本共消化，从而产生组成其的所有“重”Q-肽的化学计量混合物，并且随后分析来自天然蛋白和内部标准物的蛋白水解肽。QconCAT方法的一种变型，称为肽级联标准物(PCS)，在人工蛋白质序列中的Q肽之间使用反映它们的内源环境的侧翼区(Kito等人，J.Proteome Res.2007；6:792-800)。其他特定实施方案使用用于绝对定量的蛋白质标准物(PSAQ)(Brun等人，Mol.Cell.Proteomics 2007；6:2139-2149)。PSAQ使用重组蛋白，而不是来自几种蛋白质的肽的级联体，待定量的整个蛋白质以稳定的同位素标记形式表达。然后可将一种或几种PSAQ添加到样本的预消化物中以有助于定量。
特定实施方案使用无标记的策略进行蛋白质定量，如基于强度的测量(America和Cordewener，Proteomics 2008；8:731-749)或光谱计数(Lundgren等人ExpertRev.Proteomics 2010；7:39-53)。
为了获得给定肽的相对定量水平，可将一种生物样本中来自给定蛋白质的单个肽或多个肽的质谱分析得出的特征峰面积(或峰高，如果峰被充分解析)与使用相同SRM/MRM方法针对一种或多种另外且不同的生物样本中来自相同蛋白质的相同的一种或多种肽确定的特征峰面积进行比较。以此方式，在相同的实验条件下，相对于两种或更多种生物样本中来自相同蛋白质的相同的一种或多种肽，确定了来自给定蛋白质的特定的一种或多种肽的量。另外，相对定量可通过比较通过SRM/MRM方法得到的一种或多种给定肽的特征峰面积与来自在来自生物样本的相同蛋白质制剂内的不同蛋白质的一种或多种另外不同的肽的特征峰面积而对于来自在单一样本内的单一蛋白质的所述一种或多种给定肽来确定。以这种方式，相对于同一样本中的另一种蛋白质，确定了来自给定蛋白质的特定肽的量，并且因此确定了给定蛋白质的量。这些方法产生来自给定蛋白质的单个肽或多个肽的定量，以及样本之间和样本内来自相同蛋白质或来自不同蛋白质的另一种或多种肽的量，其中如由特征峰面积确定的量是相对于彼此而言，不管来自生物样本的蛋白质制剂中肽的绝对重量/体积或重量/重量的量。有关不同样本之间各个特征峰面积的相对定量数据可标准化为每种样本所分析的蛋白质的量。可在单个样本中同时跨多个肽和/或跨多个样本进行相对定量，以了解相对蛋白质的量。
特征肽水平可以浓度单位(例如，pmol/L)表示。在特定实施方案中，可将源自接受WAS和/或XLA筛查的受试者的测试样本中的特征肽的平均浓度与正常对照样本中的相应肽的平均浓度进行比较。在特定实施方案中，正常对照样本可源自一个或多个正常对照受试者或源自正常对照受试者群体。在特定实施方案中，正常对照受试者包括未患有或未知患有WAS和/或XLA的受试者。在特定实施方案中，正常对照受试者包括不具有与WAS和/或XLA相关的基因突变的受试者。
在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中WASp289特征肽的平均浓度包括在7000pmol/L至30000pmol/L范围内、在7500pmol/L至28000pmol/L范围内，以及在8000pmol/L至26000pmol/L范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中WASp 289特征肽的平均浓度包括7000pmol/L、7100pmol/L、7200pmol/L、7300pmol/L、7400pmol/L、7500pmol/L、7600pmol/L、7700pmol/L、7800pmol/L、7900pmol/L、8000pmol/L、8100pmol/L、8200pmol/L、8300pmol/L、8400pmol/L、8500pmol/L、8600pmol/L、8700pmol/L、8800pmol/L、8900pmol/L、9000pmol/L、9100pmol/L、9200pmol/L、9300pmol/L、9400pmol/L、9500pmol/L、9600pmol/L、9700pmol/L、9800pmol/L、9900pmol/L、10000pmol/L、11000pmol/L、12000pmol/L、13000pmol/L、14000pmol/L、15000pmol/L、16000pmol/L、17000pmol/L、18000pmol/L、19000pmol/L、20000pmol/L、21000pmol/L、22000pmol/L、23000pmol/L、24000pmol/L、25000pmol/L、26000pmol/L、27000pmol/L、28000pmol/L、29000pmol/L、30000pmol/L，或更高的浓度。
在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中BTK 545特征肽的平均浓度包括在400pmol/L至2000pmol/L范围内、在500pmol/L至1800pmol/L范围内，以及在600pmol/L至1500pmol/L范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中BTK 545特征肽的平均浓度包括400pmol/L、450pmol/L、500pmol/L、550pmol/L、600pmol/L、650pmol/L、700pmol/L、750pmol/L、800pmol/L、850pmol/L、900pmol/L、950pmol/L、1000pmol/L、1050pmol/L、1100pmol/L、1150pmol/L、1200pmol/L、1250pmol/L、1300pmol/L、1350pmol/L、1400pmol/L、1450pmol/L、1500pmol/L、1550pmol/L、1600pmol/L、1650pmol/L、1700pmol/L、1750pmol/L、1800pmol/L、1850pmol/L、1900pmol/L、1950pmol/L、2000pmol/L，或更高的浓度。
在特定实施方案中，预定的截断值用作给定特征肽的阈值。给定特征肽的浓度高于阈值表明所测定的DBS来自未罹患WAS和/或XLA的个体。给定特征肽的浓度低于阈值或不存在表明所测定的DBS来自罹患WAS和/或XLA的个体。在特定实施方案中，可通过分析正常对照群体和计算此群体中给定特征肽的浓度的标准偏差(SD)来确定阈值。可将阈值设置为来自给定特征肽的平均浓度的某个SD。在特定实施方案中，阈值是来自给定特征肽的平均浓度的-1SD、-1.1SD、-1.2SD、-1.3SD、-1.4SD、-1.5SD、-1.6SD、-1.7SD、-1.8SD、-1.9SD、-2.0SD、-2.1SD、-2.2SD、-2.3SD、-2.4SD、-2.5SD、-2.6SD、-2.7SD、-2.8SD、-2.9SD、-3.0SD或更高SD。在特定实施方案中，为了诊断或筛查WAS和/或XLA，可通过分析正常对照群体并计算此群体中给定特征肽的浓度与内源性ATP7B浓度的比率的标准偏差(SD)来确定阈值(Jung等人，J.Proteome Res.2017；16:862–871)。可将每种PIDD的肽浓度截断值设置为从每种特征肽的平均浓度或给定特征肽的浓度与内源性ATP7B浓度的比率得出的某个SD。
在特定实施方案中，本公开的特征肽的阈值浓度包括来自正常对照群体中相应特征肽的平均浓度的-1.0SD、-1.25SD、-1.3SD、-1.35SD、-1.4SD、-1.45SD、-1.5SD、-1.55SD、-1.6SD、-1.65SD、-1.7SD、-1.75SD、-1.8SD、-1.85SD、-1.9SD、-1.95SD、-2.0SD、-2.25SD、-2.3SD、-2.35SD、-2.4SD、-2.45SD、-2.5SD、-2.55SD、-2.6SD、-2.65SD、-2.7SD、-2.75SD、-2.8SD、-2.85SD、-2.9SD、-2.95SD、-3.0SD或更高SD。
在特定实施方案中，WASp 289肽的阈值浓度包括3600pmol/L或更低、3550pmol/L或更低、3500pmol/L或更低、3490pmol/L或更低、3480pmol/L或更低、3470pmol/L或更低、3460pmol/L或更低、3450pmol/L或更低、3440pmol/L或更低、3430pmol/L或更低、3420pmol/L或更低、3410pmol/L或更低、3400pmol/L或更低、3300pmol/L或更低、3200pmol/L或更低、3100pmol/L或更低、3000pmol/L或更低、2900pmol/L或更低、2800pmol/L或更低、2700pmol/L或更低、2600pmol/L或更低、2500pmol/L或更低、2300pmol/L或更低、2200pmol/L或更低、2100pmol/L或更低、2000pmol/L或更低。在特定实施方案中，WASp 289肽的阈值浓度包括3384.4pmol/L。
在特定实施方案中，BTK 545肽的阈值浓度包括350pmol/L或更低、345pmol/L或更低、340pmol/L或更低、335pmol/L或更低、330pmol/L或更低、325pmol/L或更低320pmol/L或更低315pmol/L或更低310pmol/L或更低300pmol/L或更低290pmol/L或更低280pmol/L或更低270pmol/L或更低、260pmol/L或更低、250pmol/L或更低、240pmol/L或更低、230pmol/L或更低、220pmol/L或更低、210pmol/L或更低、200pmol/L或更低、190pmol/L或更低、180pmol/L或更低、170pmol/L或更低、160pmol/L或更低、150pmol/L或更低、140pmol/L或更低、130pmol/L或小于120pmol/L或更低110pmol/L或更低100pmol/L或更低。在特定实施方案中，BTK 545肽的阈值浓度包括311.4pmol/L或更低。
可通过相关领域中已知的任何方法来合成一种或多种标准物肽。此类合成肽可进一步包含具有一种或多种天然修饰的氨基酸。此类天然修饰可包括谷氨酰胺和天冬酰胺的脱氨基、胺化、氧化和羟基化。
本文公开的方法包括基于用本文公开的组合物和方法筛查WAS和/或XLA的结果来治疗受试者(例如人)。治疗受试者包括递送治疗有效量。治疗有效量包括提供有效量、防治性治疗和/或治疗性治疗的那些。
“有效量”是引起受试者的所需生理变化所必需的组合物的量。例如，对于WAS和/或XLA，有效量可提供症状减轻、症状消除或治愈。通常施用有效量用于研究目的。本文公开的有效量可在动物模型或体外测定中引起与评估疾病的发生、进展和/或消退有关的统计学显著效果。
特定实施方案可包括作为“防治性治疗”施用组合物。防治性治疗包括向未表现出WAS和/或XLA的体征或症状或者仅表现出WAS和/或XLA的早期体征或症状的受试者施用的治疗，因此治疗是出于减少或降低出现该病症的症状或负面影响的风险的目的而施用的。因此，防治性治疗用作针对WAS和/或XLA的症状或负面影响的预防性治疗。
在特定实施方案中，防治性治疗可预防WAS和/或XLA，延迟或减少WAS和/或XLA的发作。在特定实施方案中，防治性治疗可在其他预防性措施(如使用抗生素)之前、同时或之后给予。在特定实施方案中，防治性治疗可预防WAS和/或XLA，或降低与WAS和/或XLA相关的症状或并发症的严重程度。
WAS的症状和并发症可包括：出血、湿疹、血性腹泻；和反复感染。XLA的症状和并发症可包括：感染、腹泻、不生长、关节疾病、肾脏炎症、红血细胞分解，以及皮肤和肌肉炎症。
“治疗性治疗”包括向表现出WAS和/或XLA的症状或体征的受试者施用的治疗，并且是出于减轻或消除WAS和/或XLA的那些体征或症状的目的被施用至该受试者。在特定实施方案中，治疗性治疗可为被诊断患有WAS和/或XLA的受试者提供免疫功能。在特定实施方案中，治疗性治疗可减轻、控制或消除WAS和/或XLA的症状和并发症，如本文所述的那些。
有效量、防治性治疗和治疗性治疗不必相互排斥，并且在特定实施方案中，所施用的剂量可实现多于一种治疗类型。
在特定实施方案中，治疗有效量为被诊断为患有WAS和/或XLA的受试者提供免疫系统功能。因此，在特定实施方案中，本文公开的治疗方法包括用于诸如WAS和/或XLA的病症的干细胞移植、免疫球蛋白输注、抗生素输注和/或基因疗法。
特定受试者的实际剂量量和施用计划表可由医师、兽医或研究人员在考虑诸如包括受试者的目标、体重、疾患的严重程度、先前或同时的治疗干预、特发性疾病在内的身体和生理因素以及施用途径的参数的情况下确定。
(viii)试剂盒。还提供了含有本公开的抗体及其抗原结合片段的试剂盒。试剂盒可包括用于取血的刺血针、用于收集血滴的过滤卡、颊拭子、血液采集管、用于溶解DBS的溶液以及用于消化DBS中的标志物蛋白的适当缓冲液和酶。试剂盒可进一步包括一个或多个容器，该一个或多个容器含有抗肽抗体及其抗原结合片段和/或试剂或用品，以评估WASp289和/或BTK 545肽或其相应蛋白质的缺乏或减少。在特定实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器，该容器含有抗-WASp 289和/或抗-BTK 545抗体。可将抗体固定在固相载体如柱或珠粒上。试剂盒可进一步含有用于使肽从抗体释放的洗脱缓冲液。在特定实施方案中，试剂盒可包括一种或多种标记的参考肽以对特征肽进行绝对定量。在特定实施方案中，试剂盒还可包括有效使用试剂盒所需的一些或全部必要的实验室和/或医疗用品，如纱布、无菌粘合带、手套、管等。可改变本文所述的任何试剂盒的内容物。
试剂盒的部件可准备好储存和以后使用。与此类一个或多个容器相伴的可为由管制试剂盒的制造、使用或销售的政府机构开具的呈表格形式的报告书，所述报告书反映由制造、使用或销售的机构核准(在需要时)。
任选地，试剂盒进一步包括在所述方法中使用试剂盒的说明书。在各种实施方案中，说明书可包括适当的说明以解释与使用试剂盒相关的结果；相关废物的适当处置；等等。说明书可采用试剂盒内提供的印刷说明书的形式，或者可将说明书印刷在试剂盒本身的一部分上。说明书可呈页、小册子、手册、CD-ROM或计算机可读装置的形式，或者可在诸如网站的远程位置提供说明书的指导。
包括以下示例性实施方案和实施例以说明本
公开的特定实施方案。鉴于本公开，本领域普通技术人员应认识到，在不脱离本公开的精神和范围的情况下可对本文所公开的特定实施方案作出许多改变并且仍获得相似或类似结果。
(ix)示例性实施方案。
1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含：
(A)重链可变(VH)结构域，其包含具有SEQ ID NO:3所示序列的CDRH1、具有SEQ IDNO:4所示序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:5所示序列的CDRH3；和轻链可变(VL)结构域，其包含具有SEQ ID NO:6所示序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:7所示序列的CDRL2和具有SEQ IDNO:8所示序列的CDRL3或者
(B)VH结构域，其包含具有SEQ ID NO:9所示序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:10所示序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:11所示序列的CDRH3；和VL结构域，其包含具有SEQ ID NO:12所示序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:13所示序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:14所示序列的CDRL3。
2.如实施方案1(A)所述的抗体或其抗原结合片段，其包含以下中的一者或多者：具有SEQ ID NO：15所示序列的VH结构域；具有SEQ ID NO：17所示序列的重链；具有SEQ IDNO：16所示序列的VL结构域；或具有SEQ ID NO:18所示序列的轻链。
3.如实施方案1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH结构域具有SEQ IDNO:15所示序列并且所述VL结构域具有SEQ ID NO:16所示序列。
4.如实施方案1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链具有SEQID NO:17所示序列并且所述轻链具有SEQ ID NO:18所示序列。
5.如实施方案1(B)所述的抗体或其抗原结合片段，其包含以下中的一者或多者：具有SEQ ID NO：23所示序列的VH结构域；具有SEQ ID NO：25所示序列的重链；具有SEQ IDNO：24所示序列的VL结构域；或具有SEQ ID NO:26所示序列的轻链。
6.如实施方案1或5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH结构域具有SEQ IDNO:23所示序列并且所述VL结构域具有SEQ ID NO:24所示序列。
7.如实施方案1、5或6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链具有SEQ ID NO:25所示序列并且所述轻链具有SEQ ID NO:26所示序列。
8.实施方案1所述的抗体在方法中的用途，所述用途包括：
获得源自受试者的生物样本；
用酶消化来自所述生物样本的蛋白质以产生一种或多种肽；
执行以下富集：
用具有实施方案1(A)所述的抗体或其抗原结合片段富集WASp特征肽；和/或
用实施方案1(B)所述的抗体或其抗原结合片段富集BTK特征肽；以及
对富集的肽执行液相色谱-多反应监测质谱(LC-MRM-MS)以确定每种特征肽的浓度。
9.如实施方案8所述的用途，其中所述生物样本是干血斑(DBS)、颊拭子、外周血单个核细胞(PBMC)或白血细胞(WBC)。
10.如实施方案8或9所述的用途，其中所述酶是胰蛋白酶。
11.如实施方案8-10中任一项所述的用途，其进一步包括：
将每种特征肽的浓度与相应的预定阈值浓度进行比较；以及
如下对受试者进行诊断：
当WASp特征肽的浓度低于相应的预定阈值浓度时或当WASp特征肽不存在时，诊断所述受试者患有WAS；以及
当BTK特征肽的浓度低于相应的预定阈值浓度时或当BTK特征肽不存在时，诊断所述受试者患有XLA。
12.如实施方案8-11中任一项所述的用途，其中所述用途作为另外筛查所述受试者的苯丙酮尿症、原发性先天性甲状腺功能减退症、囊性纤维化和镰状细胞病中的一者或多者的新生儿筛查(NBS)的一部分进行。
13.如实施方案8-12中任一项所述的用途，其中所述用途在所述受试者中在不存在WAS和/或XLA的临床症状的情况下进行。
14.如实施方案11所述的用途，其中从来自正常对照受试者群体的相应生物样本中的每种特征肽的平均浓度的标准偏差来计算每种特征肽的相应的预定阈值浓度。
15.如实施方案14所述的用途，其中所述生物样本是DBS并且来自正常对照受试者群体的DBS中的所述WASp特征肽的平均浓度包括在7000pmol/L至30000pmol/L范围内的浓度。
16.如实施方案14或15所述的用途，其中所述相应的预定阈值浓度包括来自正常对照受试者群体的DBS中的所述WASp特征肽的平均浓度的-1.75标准偏差(SD)至-2.75SD。
17.如实施方案14所述的用途，其中所述生物样本是DBS，并且来自正常对照受试者群体的DBS中的所述BTK特征肽的平均浓度包括在400pmol/L至2000pmol/L范围内的浓度。
18.如实施方案14或17所述的用途，其中所述相应的预定阈值浓度包括来自正常对照受试者群体的DBS中的所述BTK特征肽的平均浓度的-1.5SD至-2.5SD。
19.一种用于筛查受试者的维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)和/或X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的测定物，所述测定物包含：
(i)如实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段和
(ii)参考特征肽，所述参考特征肽包含：
SEQ ID NO:1的WAS的WASp特征肽；和/或
SEQ ID NO:2的XLA的BTK特征肽。
20.如实施方案19所述的测定物，其中所述参考特征肽是经同位素标记的。
21.如实施方案19或20所述的测定物，其中所述抗体或其抗原结合片段附着于磁珠。
22.一种试剂盒，其包括实施方案19-21中任一项所述的测定物以及一种或多种选自以下的附加部件：滤纸卡、颊拭子、采血管、冲孔工具、消化酶、消化缓冲液、抗体或其抗原结合片段的固体载体，及洗脱缓冲液。
(x)实验性实施例。实施例1.概述。进行了研究以评估基于与选择性反应监测质谱耦合的肽免疫亲和富集(免疫-SRM)的多重测定是否能够可靠地且准确地将患有维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)和X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的受影响的患者与彼此以及与未受影响的正常对照干血斑(DBS)样本区分开来。对来自42例原发性免疫缺陷病症(PIDD)患者、40例正常成人对照和62例正常新生儿的DBS样本中的WASp和BTK(分别用于WAS和XLA)的蛋白水解产生的肽进行了盲法多重分析。免疫-SRM测定可靠地定量DBS中的靶肽，包括测定内和测定间精确度(13％和22％；17％和43％)、线性(1.39–2000fmol肽)和稳定性(72小时内≤0.06％差异)。对特征肽的分析发现与对照组相比，受影响患者中的肽水平的统计上显著的降低(或不存在)(WASp和BTK：p＝0.0001)。来自DBS中的WASp和BTK的蛋白水解肽的基于免疫-SRM的定量可将相关PIDD病例与对照区分开。所述方法可用于进行选择性PIDD的大规模多重新生儿筛查。图2A-11B和表5-7中的数据是用针对WASp 289和BTK 545的多克隆抗体产生的。
材料和方法。患者样本。PIDD和正常对照血液样本从Seattle Children'sImmunology Diagnostic Laboratory获得。在机构审查委员会批准后，从华盛顿州新生儿筛查实验室(Shoreline，WA)取得新生儿DBS。XLA DBS是从20名疑似越南患者收集的，并按常规邮件运输至西雅图儿童医院。通过桑格测序(Sanger sequencing)获得的这些患者的基因型先前已被报道(Segundo等人Front Immunol.Frontiers；2018；9:289)。总共获得了来自42名PIDD患者和40名正常对照的DBS样本。通过以下方式制备正常对照和PIDD患者DBS：将70μL血液/12mm斑吸移到滤纸卡(Protein Saver 903 Card，Whatman，Piscataway，NJ)上，使其在室温下干燥过夜，并在-80℃下储存在密封的塑料袋中直到使用。将受影响的患者样本从收集地点运输并储存在-80℃直到使用。
替代肽的选择和抗体产生。通过计算机胰蛋白酶消化和NCBI BLAST工具选择WASp和BTK的替代肽。根据公认的免疫-SRM开发的主要标准(包括肽长度、转录后修饰的缺乏以及根据BLAST搜索在人基因组中的独特性)进行最终的肽选择，如先前所述(Kerfoot等人，Proteomics Clin Appl.2012；6:394–402；Abbatiello等人，Mol.CellProteomics.American Society for Biochemistry and Molecular Biology；2015；14:2357–2374；Hoofnagle等人Clin.Chem.2016；62:48–69)。ATP7B特征肽的肽选择和单克隆抗体产生先前已被报道。Jung等人，2017，同上。然后凭经验筛查粗肽，以确定通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测和定量的适合性。
成功产生了针对两种肽的单克隆抗体(mAb)。简言之，合成具有N末端半胱氨酸延伸的特征肽，并将其缀合至匙孔血蓝蛋白(KHL)以进行免疫。每种肽注射两只新西兰白兔。将该肽的mAb成功地从25mL抗血清中进行亲和纯化。
免疫-SRM测定试剂。ProteaseMAXTM表面活性剂(编号V2072)和蛋白质组学级胰蛋白酶(编号V5113)购自Promega(Madison，WI)。牛血清白蛋白标准物(200mg/mL)和(3-[3-胆酰胺丙基)＝二甲基铵基]-1-丙磺酸酯)(PierceTM CHAPS，编号PI28300)洗涤剂购自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA)。碳酸氢铵(40867-50G-F)购自Fluka Analytical(Munich，Germany)。乙腈(编号A955)、水(编号W6，LCMS最佳等级)、甲酸(编号PI28905)和磷酸盐缓冲盐水(PBS，编号10010-023)购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)。
重的稳定同位素标记的肽获自Anaspec(Fremont，CA)。稳定的同位素标记的肽通过HPLC纯化至>95％，并且将C末端精氨酸或赖氨酸用13C和15N原子标记，分别导致质量偏移+8或+10Da。将等分试样在-20℃下储存在5％乙腈/0.1％甲酸中直到使用。
将抗体以1μg抗体与2.5μL珠粒的比率固定在2.8μm Dynabeads蛋白G磁珠(编号10004D，Invitrogen，Carlsbad，CA)上。简言之，将250μL的磁珠添加至1.5mL Eppendorf管(022363204 Eppendorf)中，并用250μL的1×PBS洗涤两次，然后添加100μg的抗体和1×PBS+0.03％CHAPS(编号28300，Thermo Scientific，Waltham，MA)，以产生总计250μL体积。使抗体在4℃滚动下与珠粒偶联过夜。第二天，通过化学交联将抗体固定在珠粒上。简言之，使用磁下拉法(magnetic pulldown)收集抗体珠粒，丢弃过量的PBS，并添加200mM三乙醇胺(pH8.5)(编号T58300，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)中的300μL新鲜制备的20mM DMP(庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐，编号D8388，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。将样本在室温下滚动30分钟，并丢弃在三乙醇胺中的DMP。添加250μL的150mM单乙醇胺(编号411000，SigmaAldrich，St.Louis，MO)，并将珠粒在室温下滚动30分钟。将抗体珠粒使用250μL的5％乙酸+0.03％CHAPS洗涤两次(每次在室温下滚动5分钟)，并且使用250μL的1×PBS+0.03％CHAPS再洗涤一次。然后洗涤CD3ε、WASp和BTK抗体连接的珠粒，并在5％乙酸+3％乙腈(ACN)中孵育，用250μL的1xPBS+0.03％CHAPS洗涤，并且后两个步骤重复一次。用250μL的1×PBS+0.03％CHAPS洗涤所有抗体连接的珠粒，直到达到中性pH(7.0)。然后将洗涤的抗体连接的珠粒重新悬浮在250μL的1×PBS+0.03％CHAPS和2.5μL的NaN3(52002-5G Sigma Aldrich)中以获得抗真菌性质，并储存在4℃下直到使用。
DBS蛋白提取和胰蛋白酶消化。对于每个样本(盲法正常对照或患者)，使用标准皮革冲孔工具将含有70μL血液的整个DBS斑(13mm)打孔成直径3-mm的17个冲孔。最终样本表示是WAS：n＝11，XLA：n＝26，以及正常对照(n＝40)。将冲孔置于1.5mL eppendorf管中，并向每个管中添加490μL的50mM碳酸氢铵(pH 8)中的0.1％ProteaseMaxTM。将管在EppendorfMixMate(Eppendorf，Hamburg，Germany)上涡旋振荡1小时，然后将10μL的每个样本等分并稀释200倍，以进行Bradford测定来确定蛋白质浓度。在5mM下用2MDTT进行二硫键还原，并向每个管中添加另外490μL的50mM碳酸氢铵(pH 8)中的0.1％ProteaseMaxTM，然后在37℃水浴中孵育30分钟。然后以1:50的酶与蛋白质比率(w/w)添加胰蛋白酶，并添加乙腈至15％的最终浓度。将混合物在37℃水浴中孵育过夜进行消化，然后以13,000RPM离心10分钟，然后将每种上清液转移至新管中并在SavantTM SpeedVacTM高容量浓缩器(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)中干燥。所有胰蛋白酶消化的DBS消化物均储存在-80℃直到使用。
对于从华盛顿州NBS实验室分析的样本，使用5或6个3-mm冲孔进行蛋白质提取和消化(n＝62)。程序与针对之前样本的程序是同一的，不同之处在于体积减少如下：每次添加150μL的0.1％ProteaseMaxTM和0.78μL的DTT。
肽免疫亲和富集。将DBS消化物重新悬浮在1×PBS+0.03％CHAPS中，以产生1μg/μL标称蛋白质消化物浓度。对于每个靶标，将交联的抗体包被的珠粒添加至总质量为2μg的抗体中。然后添加20μL的1M Tris pH 8.0(15568-025UltraPure，Invitrogen，Carlsbad，CA)。添加同位素标记的肽作为内部标准物(IS)。将此悬浮液在4℃下滚动孵育过夜以实现肽捕获。第二天，将抗体珠粒:肽复合物用100μLPBS+0.01％CHAPS洗涤两次，并在100μL 0.01％PBS+0.01％CHAPS中洗涤一次。最后，通过在30μL的5％乙酸/3％ACN中孵育来洗脱肽。将释放的肽储存在-80℃下直到分析。对于从WA State NBS实验室分析的样本，程序与针对之前样本的程序是同一的，不同之处在于体积减少如下：58.1μL的1x PBS+0.03％CHAPS，对于每种肽0.59μg pAb，3.13μL内部标准物(IS)和12.5μL TRIS。
液相色谱-串联质谱。利用两个独立的LC-MS/MS系统和仪器配置(如下所述)，在两个实验室地点对富集的样本进行了分析，以检查实验室间数据采集的变异性。然后将测量的肽浓度进行比较以进行方法验证。先前已经报道了肽母离子谱和子离子谱(Kerfoot等人，Proteomics Clin Appl.2012；6:394–402)。
仪器包括具有与Waters M级梯度泵和负载泵(Waters，Milford，MA)连接的ionkey源技术的Waters Xevo TQ-XS MS。色谱溶剂是A：H2O+0.1％甲酸(FA)和B：ACN+0.1％FA。最初，使用98:2A:B的恒定流以20μL/min在3分钟内将肽混合物负载到M级阱对称性300μm x50mm C18柱(
Figure BDA0003843047680000561
5μm)上。随后，使流反向，并使用梯度流跨150μm x100 mm BEH C18ikey(
Figure BDA0003843047680000562
1.7μm)分离肽。梯度方法编程在表4中给出。在此地点监测的肽包括WASp 289。
表4.特征肽的LC方法设置。A＝H2O+0.1％甲酸，B＝ACN+0.1％甲酸
Figure BDA0003843047680000571
跃迁和碰撞能量(CE)的参数取自Skyline中先前优化值的线性回归，以及使用Waters intellistart技术生成的那些参数，以鉴定电离时最强烈的碎片。在Q1和Q3四极杆中以单位/单位分辨率获得SRM跃迁，停留时间为5ms并且质量范围之间有3ms停顿，因此循环时间为1.5s。所有样本均以盲法方式运行。
方法性能评估。执行反应曲线以确定DBS的背景基质中的测定线性和灵敏度。使用提取缓冲液(ProteaseMaxTM，碳酸氢铵)一式三份提取来自正常对照DBS的冲孔(每个样本4个冲孔)。对提取的蛋白质进行胰蛋白酶消化，并合并消化物以创建共同的背景基质。将重的稳定同位素标准物掺入到消化物中，并连续稀释以创建具有不同肽含量(2000、200、12.5、4.17、1.39、0.69fmol)的样本。将两微克与磁性蛋白G珠粒共价偶联的每种抗体添加到背景基质中，并且孵育过夜。用PBS洗涤抗体珠粒，并通过SRM分析洗脱液。
通过在单独的5天内进行内源性(轻)肽信号的测量来表征测定内和测定间变异性以分别评价该测定的精密度和准确度。每天对每个样本进行5次完整过程重复分析(包括冲孔、提取、消化、富集和质谱分析)。
最后，通过将在室温下储存1天和3天的DBS中检测到的内源性(轻)肽与在密闭容器中在-80℃下的DBS中检测到的肽进行比较来评估稳定性。每个样本按上述过程一式三份进行加工。在每个时间点计算差异百分比。
数据分析。使用Skyline(MacCoss Lab Software，open source，Seattle，WA；MacLean等人，Bioinformatics.2010；26:966–968)分析和绘制所有SRM数据。通过比较特征肽的峰面积的比率与它的以已知浓度(100fmol)被添加的IS来定量内源性目标肽浓度。使用Graphpad Prism(San Diego，CA)生成统计数据。使用Graphpad Prism和95％置信区间构建接受者操作特征(ROC)曲线。
结果。肽选择和抗体开发。所选择的肽序列、分子量、母离子和子离子列于图1中。先前已经报道了目标肽的片段化模式。(Kerfoot等人，Proteomics Clin Appl.2012；6:394–402)。产生了针对该肽的抗体(Pacific Immunology，Ramona，CA)，由于该抗体能够成功捕获其靶序列并且不存在由共纯化的肽污染物引起的背景信号，因此该抗体被寻求用于人样本。
方法性能评估。表5中报告了分析优值(figures of merit)。总之，线性反应跨度在1.39至2000fmol肽的范围内(图2A、2B)。反应曲线上所有点的中值变异系数(CV)是11％。定量下限(LLOQ)由最低点定义，以产生13％和22％的CV。LLOQ为0.69fmol和1.39fmol。对于这两种肽，平均测定内(即日内)变异性为13％和22％，而测定间(即日间)变异性为17％和43％。
表5.特征肽的分析性能
Figure BDA0003843047680000581
Figure BDA0003843047680000591
最后，通过将在室温下储存1天和3天的DBS中检测到的内源性(轻)肽与在密闭容器中在-80℃下保藏的DBS中检测到的肽进行比较来评估稳定性。结果报告在表5中。该肽均具有高于LLOQ的内源性信号，并且随时间推移的变化很小。每种肽的代表性多反应监测(MRM)色谱图示出在图3A、3B中。
肽浓度。在分析后，对正常对照不设盲以定义用于受影响患者比较的正常范围。来自正常对照的平均肽浓度如下(平均值±SD)：WASp289＝10326.98±4513.13pmol/L，并且BTK 545＝1038.44±465.77pmol/L。在每种情况下，对特征肽的分析发现患者肽水平相对于对照组在统计学上显著(p<0.05-0.0001)的降低(图4A、4B)。大多数受影响患者中的肽水平显著降低或不存在。对于每个患者，还使用先前开发的免疫-SRM方法确定ATP7B 1056的浓度(Jung等人，2017，JProteome Res 16:862–871)。这些蛋白质浓度用作质量控制(QC)测量值，并且它们在样本之间的一致性被用于评估消化和过程可再现性(图5)。
每个PIDD诊断的肽浓度截断值设置为-1.75SD(WASp 289)和-2SD(BTK 545)。使用这些范围在正常对照中导致1个假阳性指示。NC4由WASP 289指示。NC特征肽值示出在图6中。PIDD的阳性鉴定的截断值在表6中给出。
表6.使用与BTK 545和WASp 289结合的多克隆抗体时按浓度计的特征肽截断值。
Figure BDA0003843047680000592
使用这些截断值，可预测每位患者的特定PIDD诊断。预测的诊断显示出与临床或遗传诊断的良好一致性，如图7所示。每个分子确诊的WAS和BTK病例也通过免疫-SRM分析进行了诊断。临床诊断为无丙种球蛋白血症的两名患者，患者10和13通过免疫-SRM具有正常BTK蛋白水平。在分子上，在这些患者中未鉴定出BTK的突变(Segundo等人，FrontImmunol.Frontiers；2018；9:289)。令人感兴趣的是，患有无丙种球蛋白血症的患者12具有低BTK蛋白水平，但在BTK的编码区中未发现突变。对于所使用的每种特征肽，ROC图的曲线下面积(AUC)分析显示面积为0.930(对于WASp 289)和0.999(BTK 545)，p值<0.0001(图8A、8B)。总体97.6％的病例在临床诊断与免疫-SRM测定结果之间保持一致。令人感兴趣的异常和不一致病例将在下文进一步讨论。
NBS实验室(新生儿)样本的特征肽浓度示出在图9中。每种DBS样本的测得的肽浓度显著高于先前设定的PIDD诊断截断值，表明状态未受影响。
已证明免疫-SRM是用于自DBS多重检测患有两种威胁生命的PIDD(即，WAS和XLA)的患者的灵敏且特异的蛋白质组学筛查方法。结果清楚地将PIDD患者与正常对照区分开来，其中低水平的细胞内蛋白WASp和BTK的内源性肽与目标疾病(分别为WAS和XLA)相关。这些诊断可以在一次运行中进行，每种疾病靶标的运行时间为6.67分钟。所公开的结果还证明了在DBS中的肽稳定性，其中在室温下储存72小时后浓度的变化极小(表5)。
免疫-SRM平台以这种高度多重方式可靠地检测了来自正常对照DBS的内源性肽。正常对照DBS(N＝40)不被设盲，并被用于定义正常范围和潜在筛查阳性截断值(图6)。在临床实验室中，诊断测试的参考范围由普通群体中的正态分布确定。筛查测试的初始截断值通常是保守的，目的是检测所有真阳性，而不产生相对于疾病发生率的过高筛查阳性率(表6)。然而，这些截断值会根据基于群体的研究不断地得到验证和调整。给定这些参数，筛查阳性结果的定义是低于此实施例中的肽的平均值1.75和2个标准偏差(SD)。选择的截断值产生了1个假阳性正常对照，其在使用WASP 289时被筛查为WAS患者(图6)。在NC4的情况下，重新筛查显示WASp水平在正常范围内。这些初步的截断值不是静态的，并且随着筛查更多的正常对照和患者样本将变得更好。
使用这些截断值，阳性地鉴定出涵盖广泛范围的突变的每位分子验证的WAS和BTK患者(图7)。如所假设的，在大多数BTK和WAS病例中，肽浓度降低，而与基因型无关(Qasim等人，Br.J.Haematol.2001；113:861–865；Jin等人Blood.American Society ofHematology；2004；104:4010–4019；Futatani等人British Journal ofHaematology.2001；114(1):141-9)。因此，这些肽为诊断和筛查提供了生物标志物。
构建ROC曲线以评估免疫-SRM分析的诊断能力。这些图将真阳性率与假阳性率联系起来，截断值越来越严格。随着诊断截断值降低，测试将具有更大的能力来记录真阳性，但是这一过程也更有可能导致假阳性。因此，维持高真阳性率和低假阳性率的筛查测试将导致图靠近y轴和较大的AUC(图8A、8B)。这些值表明对PIDD的特征肽进行免疫-SRM分析的高诊断准确性。
消化和过程性能的QC监测以ATP7B特征肽测量值的形式包括在当前的免疫-SRM多重检测中。由于并非所有检测到的代谢物都是有用的NBS靶标，因此使用代谢物比率的计算和次要代谢物分析来提高NBS对某些疾病的灵敏度和特异性，如甲基丙二酸尿症中的C3:C2比率和2-甲基柠檬酸分析(Lindner等人，J.Inherit.Metab.Dis.第2版2008；31:379–385)。此外，靶标比率法可解释由多种因素带来的样本之间的差异，所述因素包括样本收集质量、储存、提取和消化效率以及血液特性(Razavi等人，Bioanalysis.Future Science LtdLondon，UK；2016；8:1597–1609)。在此，发现ATP7B浓度在整个筛查的样本中在很大程度上是一致的(图6)。缺乏ATP7B可用于标记加工不当或处理不当的试样。作为初始实验，将每种PIDD肽按与同一样本中ATP7B的内源性浓度的比率进行比较。基于肽浓度的所得预测结果与临床诊断完全一致，从而证明免疫-SRM和ATP7B比率法是PIDD诊断的有效补充工具(图10和表7)。这类比率可用于临床免疫-SRM筛查，前提是所选择的肽被证明是一大批样本中普遍存在且显著不变的信号。
表7.使用与BTK 545和WASp 289结合的多克隆抗体时按与ATP7B肽的比率计的特征肽截断值
Figure BDA0003843047680000621
值得注意的是，在根据桑格测序(Sanger sequencing)缺乏BTK突变的两名临床确定的无丙种球蛋白血症患者(样本#10和#13)中发现了正常水平的BTK(图7)。因此，尽管未进行更广泛的遗传测试，但这些患者可能未患XLA，而是可能患有其他常染色体形式的无丙种球蛋白血症。另一名患者(样本#12)具有降低的BTK蛋白水平，但没有可鉴定的BTK突变。这表明所述突变可在编码区和内含子-外显子接点的测序过程中遗漏，或者患者可能携带影响调控元件、聚腺苷酸化信号或内含子区域的BTK突变。这些病例突出了免疫-SRM的临床实用性。
另外，从同一WAS患者的骨髓移植(BMT)前后获得两个样本(分别为图7中的样本#29和30)。BMT前，免疫-SRM分析鉴定所述患者患有WAS。BMT后，所述患者被鉴定为正常。此病例突出了免疫-SRM遵循BMT的治疗过程并确认免疫系统成功重构的能力。类似的原理可应用于接受基因疗法的单一遗传病症的患者。
总体而言，所述分析证明，所公开的测定具有宽的线性范围和可接受的精确度，以确定DBS中靶肽的浓度(表5)。
由华盛顿州的NBS实验室提供的随机选择的新生儿样本被用于测试在NBS的背景下利用免疫-SRM分析的可行性。由于有限的样本可用性并且为了从较小的样本测试特征肽分析的效用，将所使用的DBS量从1个完整斑减少至5个或6个3-mm冲孔。目标肽易于被富集和分析，而对样本加工的变化最小。特征肽的浓度均大于从已知正常对照的分析获得的预定截断值(图9)。因此，这些患者将被指定为正常。以大大减少的样本输入来稳健地执行这种分析的能力使免疫-SRM分析更适合转化成NBS。这种高通量多重方法可有效减少每种疾病的运行时间，从而使其适用于NBS，在NBS中，当前的自动化方法的典型运行时间少于三分钟(Rashed等人，Clin.Chem.1997；43:1129–1141；Khalid等人，J Med Screen.SAGEPublications，Sage UK：英国伦敦；2008；15:112–117)。使用在环境温度下经由传统邮局自越南运输的DBS成功预测BTK患者也突出了在DBS收集和运输为经济的资源贫乏地区进行诊断测试的潜在效用。
实施例2.本研究描述了从与WASp 289和BTK 545特征肽结合的本文所述的单克隆抗体获得的结果。在临床、诊断和新生儿筛查测定中，单克隆抗体优于多克隆抗体，因为单克隆抗体具有可重复性和一致性。单克隆抗体在免疫SRM测定中的表现与多克隆抗体相当，因为它们能够从干血斑中富集特征肽，生成正常对照范围，并将患者与对照区分开来。发现WASp 289和BTK 545的单克隆和多克隆抗体产生具有相同标准偏差的正常对照范围(图11A、11B和表8)。在这些群体中，当发现使用单克隆抗体试剂时平均肽浓度适度增加。这可能是由于该试剂相对于多克隆抗体的均匀性，多克隆抗体可能具有更大的非特异性结合或减少的肽结合表位群体。
表8.单克隆抗体(BTK 545，n＝55；WASp 289，n＝50)和多克隆抗体(n＝40)之间的正常对照群体平均差异。
Figure BDA0003843047680000631
Figure BDA0003843047680000641
使用针对WASp 289的单克隆抗肽抗体，从正常对照DBS中富集目标肽。目标特征肽以14905.9±4608.6pmol/L的平均浓度存在(图12)。
使用针对BTK 545的单克隆抗肽抗体，从正常对照DBS中富集目标肽。目标特征肽的平均浓度为1267.8±478.2pmol/L。利用该标志物分析XLA患者(n＝8)，发现每个临床确诊的XLA病例均通过BTK 545的免疫SRM分析得到诊断(图13和表9)。
表9.使用BTK 545对XLA患者的免疫SRM分析。
Figure BDA0003843047680000642
ND＝未检测到
患者3中的氨基酸变化p.R544G消除了直接位于BTK 545生物标志物肽之前的胰蛋白酶切割位点。这种变化阻断了胰蛋白酶消化释放BTK 545肽，并且由于额外氨基酸的分子量差异，类似地导致野生型内源BTK 545的缺乏。由于与氨基酸变化相关的质量转移，MS无法检测到含有突变位点的特征肽。这会导致总肽质量发生变化，从而使突变肽在质谱仪中无法检测到，并导致野生型生物标志物信号缺失。因此，在患者3中检测不到BTK 545水平。因此，可以使用BTK 545潜在地鉴定先前描述的特征肽BTK 407(PCT/US2019/054856)可能遗漏的病例，因为BTK 545包括患者3中的点突变。这表明使用多种特征肽可以增加患者鉴定的可能性，特别是如果存在将会导致由免疫-SRM引起的假阴性的已知突变。
基于单克隆抗体分析，WASp 289截断值被设定为3384.4pmol/L(-2.5SD)，BTK 545截断值被设定为311.4pmol/L(-2SD)(表10)。
表10.使用单克隆抗体时BTK 545和WASp 289的正常对照范围、标准偏差和截断值。
Figure BDA0003843047680000651
NBS是近代最成功的公共卫生举措之一，但是依赖于下游酶缺乏所致的代谢物累积的检测。然而，许多遗传病症(包括PIDD)的特征在于蛋白质不存在或减少，从而限制了当前NBS方法的范围(Qasim等人，Br.J.Haematol.2001；113:861–865；Jin等人Blood.American Society of Hematology；2004；104:4010–4019)。通过能够检测来自DBS的PIDD相关肽，免疫-SRM填补了当前覆盖范围的这一空白，从而使NBS扩展到目前没有代谢物生物标志物的可治疗疾病。免疫-SRM将快速提供蛋白质缺乏的定量证据，并且可与来自DBS的初步筛查和分子分析同时进行，而无需进一步的侵入性程序。这些特征肽的定量奠定了免疫-SRM作为多种先天性疾病的高度多重筛查和诊断工具的基础。
预测性实施例1.用于诊断维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)和X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的WASp和/或BTK特征肽的免疫-SRM测定。将使用特征肽WASp 289、BTK 545或它们的组合，以及如实施例2和本文其他地方所述的它们的相关单克隆抗体通过免疫-SRM对来自患有WAS或XLA的患者或疑似患有WAS或XLA的患者的DBS(如上所述)、颊拭子样本、外周血单个核细胞(PBMC)或白血细胞(WBC)以及来自正常对照的相应样本进行分析。
颊拭子样本。控制机构审查委员会(controlling institutional review board)将批准颊拭子样本的方案，并且所有受试者都将给出书面知情同意。正常对照颊拭子样本将从商业供应商处获得。所有颊拭子样本都将在实验室中储存在-20℃或-80℃下。设盲的样本将标有发送者提供的ID，并且经确认和同意的患者样本将在收到后被给予实验室ID。皮袋中的尼龙植绒干拭子Copan Diagnostics 502CS01将从Fisher Scientific(伊利诺伊州芝加哥市(Chicago，IL)；目录号23-600-951)获得。2-mL低温储存内螺纹小瓶将从FisherScientific(伊利诺伊州芝加哥市；目录号12-567-501)获得。颊拭子样本采集可遵循以下描述的方案：CHLA.(2016年4月4日).Buccal Swab Collection Procedure.CHLA-ClinicalPathology；(2016年7月27日).Buccal DNA Collection Instructions.PathwayGenomics；(2017年12月14日).Instruction for Buccal Swab SampleCollection.Otogenetics；PDXL PDXL.(2017年11月28日).Buccal Swab collectionprocedure–PersonalizedDx Labs[Video].YouTube.见万维网上的youtube/3ftvHkfM71o？t＝146；以及Centers of Disease Control and Prevention(CDC).(2020年7月8日).Interim Guidelines for collecting，handling，and testing clinical specimensfor Covid-19.见万维网上的cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/guidelines-clinical-specimens.html。可以如上文针对DBS所述的那样将含有细胞的颊拭子的尖端夹入管中进行溶解和消化。
外周血单个核细胞(PBMC)和白血细胞(WBC)。PBMC和WBC将通过本领域已知的方案采集，该方案为诸如以下描述的方案：Kerfoot等人，Proteomics Clin Appl，2012.6(7-8):394-402；Grievink等人(2016)Biopreserv Biobank 14(5):410-415；Corkum等人，(2015)BMC Immunol.16:48；以及Jia等人(2018)Biopreserv Biobank 16(2):82-91；以及Zhou等人(2012)Clinical and Vaccine Immunology 19(7):1065-1074。可将分离的PBMC或WBC溶解，并且可以如上文针对DBS所述的那样对来自细胞的蛋白质进行消化。
将会对免疫SRM-诊断与临床诊断进行比较。如果可用，将为每位患者获取WAS和/或BTK基因的遗传信息和治疗信息。免疫-SRM测定可以与其他疾病的其他特征肽复用。这些研究将表明，利用本文所述单克隆抗体的免疫-SRM测定可被用于检测包括DBS、颊拭子样本、PBMC或WBC在内的生物样本中的所公开的WASp和/或BTK特征肽，并根据检测到的特征肽水平诊断受试者是否患有WAS和/或XLA。
(xi)结尾段落。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可使用许多众所周知的方案中的任一种容易地确定，包括以下描述的那些方案：Kabat等人(1991)"Sequences ofProteins of Immunological Interest,"第5版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(Kabat编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)J MolBiol 273:927-948(Chothia编号方案)；Maccallum等人(1996)J Mol Biol 262:732-745(Contact编号方案)；Martin等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.，86:9268-9272(AbM编号方案)；Lefranc M P等人(2003)Dev Comp Immunol 27(1):55-77(IMGT编号方案)；以及Honegger和Pluckthun(2001)J Mol Biol 309(3):657-670("Aho"编号方案)。给定CDR或FR的边界可根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案两者的编号均是基于最常见的抗体区域序列长度，并通过插入字母(例如“30a”)调节插入，并且一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。在特定实施方案中，本文公开的抗体CDR序列是根据Kabat编号。
本文提供的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基和氨基酸残基的字母缩写示出的，该字母缩写如在37CFR§1.822中所定义以及在WIPO标准ST.25(1998)附录2表1和表3中的表格中所列出。仅示出每个核酸序列的一条链，但互补链应被理解为包括在合适的实施方案中。
在本文未明确提供的范围内，本文公开的蛋白质的编码序列和本文公开的编码序列的蛋白质序列可以容易地从本领域普通技术人员获得。
本文所公开的每个实施方案可包括以下、基本上由或由以下组成：该每个实施方案的特别陈述的要素、步骤、成分或组分。因此，术语“包括/包含(include)”或“包括/包含(including)”应解释为叙述：“包括/包含(comprise)、由……组成或基本上由……组成”。过渡术语“包括/包含(comprise)”或“包括/包含(comprises)”意指具有但不限于，并且允许包括未指定的要素、步骤、成分或组分，即使是主要量。过渡短语“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施方案的范围限制为指定的要素、步骤、成分或组分以及并不实质地影响所述实施方案的那些。物质效应将导致本文公开的抗体或抗原结合片段与其同源肽生物标志物结合的能力在统计学上显著降低。
除非另外指示，否则说明书和权利要求书中所用的表示成分的量、性质如分子量、反应条件等的所有数字应当理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求中所陈述的数值参数都是近似值，所述近似值可根据本发明要寻求获得的所需性质而变化。在最低限度，并且不试图将等效物原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数均应当至少根据报告的有效数字的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。当要求进一步清楚时，术语“约”当与陈述的数值或范围结合使用时具有本领域技术人员合理地归于它的含义，即将稍微大于或稍微小于陈述值或范围表示为在以下范围内：陈述值的±20％；陈述值±19％；陈述值±18％；陈述值±17％；陈述值±16％；陈述值±15％；陈述值±14％；陈述值±13％；陈述值±12％；陈述值±11％；陈述值±10％；陈述值±9％；陈述值±8％；陈述值±7％；陈述值±6％；陈述值±5％；陈述值±4％；陈述值±3％；陈述值±2％；或陈述值±1％。
尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中所陈述的数值尽可能准确地报告。然而，任何数值固有地包含必然由在其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一个/种”、“所述”以及类似的指代语应解读为涵盖单数和复数指代语。本文中列举数值的范围仅意在作为一种单个地提及落在所述范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文另外指出，否则每个单个值均被并入在本专利说明书中，如同它在本文中被单独列举一样。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文中所描述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地说明本发明，而不会对原本要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解读为指示任何未要求保护的要素是实施本发明所必需的。
本文所公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解读为是限制性的。每一群组成员均可单独地或以与该群组的其它成员或本文中存在的其它要素的任何组合的方式被提及和被要求保护。可预见，出于简便和/或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员可包括于所述组内，或从所述组中删除。当出现任何这种包括或删除时，本说明书被认为含有所修改的组，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
本文描述了本发明的某些实施方案，包括为本发明人所知用于实施本发明的最佳模式。当然，本领域技术人员在阅读前面的描述后将会明了这些所描述实施方案的变化形式。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变化形式，并且本发明人打算以不同于本文具体描述的方式的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律允许的本发明所附权利要求中所叙述的主题的所有修改形式和等效形式。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖呈所有可能的变化形式的上述元素的任何组合。
此外，在整个说明书中，已经大量参考了专利、印刷的出版物、期刊文章和其他书面文本(本文的参考材料)。每一参考材料关于它们的参考教义单个地以引用的方式整体并入本文。
应当理解，本文所公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可采用的其他修改形式也在本发明的范围内。因此，例如但不限于，可根据本文的教义利用本发明的替代配置。因而，本发明不限于明确示出和描述的实施方案。
本文示出的细节是作为实例并且仅出于说明性讨论本发明的优选实施方案的目的给出的，并且之所以呈现所述细节，是为了提供被认为是本发明的各个实施方案的原理和概念方面的最有用且易理解的描述的内容。在这方面，没有试图比基本理解本发明所需的更详细地展示本发明的结构细节，借助于附图和/或实施例所作的描述使得本领域技术人员明了如何可以在实践中实施本发明的若干形式。
本公开中使用的定义和解释意欲并且旨在控制任何未来的解读，除非在实例中有明确且不含糊的修改，或者当该含义的应用使任何解读变得无意义或基本上无意义。在术语的解读将使它变得无意义或基本上无意义的情况下，定义应该从韦氏字典(Webster'sDictionary)第3版或本领域普通技术人员已知的字典诸如生物化学和分子生物学牛津字典(Attwood T等人编辑，Oxford University Press，Oxford，2006)中取得。
序列表
<110> 西雅图儿童医院以西雅图儿童研究机构名义经营(Seattle Children'sHospital d/b/a Seattle Children's Research Institute)
<120> 特异性地结合与原发性免疫缺陷：维斯科特-奥尔德里奇综合征和X连锁无丙种球蛋白血症相关的肽的抗体
<130> S281-0015PCT/SCRI.277WO
<150> US 63/004,415
<151> 2020-04-02
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Leu Ile Tyr Asp Phe Ile Glu Asp Gln Gly Gly Leu Glu Ala Val Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Tyr Val Leu Asp Asp Glu Tyr Thr Ser Ser Val Gly Ser Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体可变重(VH)结构域的CDRH1
<400> 3
Ser Ser Asp Met Thr
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体VH结构域的CDRH2
<400> 4
Tyr Met Ser Ser Asn Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Gly
1 5 10 15
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体VH结构域的CDRH3
<400> 5
Gly Val Leu Gly Thr Arg Ser Ile His Ile
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗 WASp 289抗体可变轻(VL)结构域的CDRL1
<400> 6
Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn Arg Leu Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体VL结构域的CDRL2
<400> 7
Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体VL结构域的CDRL3
<400> 8
Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Asn Gln Asp Gly Ile Gly
1 5 10
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体VH结构域的CDRH1
<400> 9
Ser Thr Phe Val Val Ser
1 5
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体VH结构域的CDRH2
<400> 10
Ser Ile Asp Val Gly Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体VH结构域的CDRH3
<400> 11
Gly Thr Asn Phe Gly Phe
1 5
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体VL结构域的CDRL1
<400> 12
Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn Arg Leu Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体VL结构域的CDRL2
<400> 13
Gln Ala Ser Lys Leu Glu Thr
1 5
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体VL结构域的CDRL3
<400> 14
Ala Gly Tyr Lys Gly Ser Ser Ser Asp Gly His Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289 VH结构域(不含前导肽)
<400> 15
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Asp
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Tyr Met Ser Ser Asn Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Thr Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Cys Arg Gly Val
85 90 95
Leu Gly Thr Arg Ser Ile His Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Leu
115
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289 VL结构域(不含前导肽)
<400> 16
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Glu Val Ser Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asp Val Val
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Asn
85 90 95
Gln Asp Gly Ile Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体重链(不含前导肽)
<400> 17
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Asp
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Tyr Met Ser Ser Asn Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Thr Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Cys Arg Gly Val
85 90 95
Leu Gly Thr Arg Ser Ile His Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Leu Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr
145 150 155 160
Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro
180 185 190
Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
245 250 255
Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn
260 265 270
Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn
275 280 285
Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro
305 310 315 320
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu
325 330 335
Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg
340 345 350
Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
420 425 430
Ser Arg Ser Pro Gly Lys
435
<210> 18
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体轻链(不含前导肽)
<220>
<221> misc_feature
<222> (208)..(208)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 18
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Glu Val Ser Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asp Val Val
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Asn
85 90 95
Gln Asp Gly Ile Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly
100 105 110
Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ser Ala Asp Leu
115 120 125
Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe
130 135 140
Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr
145 150 155 160
Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr
165 170 175
Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His
180 185 190
Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Xaa
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 19
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289 VH结构域(含有前导肽)
<400> 19
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Ser Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Met Ser Ser Asn Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Cys
100 105 110
Arg Gly Val Leu Gly Thr Arg Ser Ile His Ile Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Leu
130
<210> 20
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289 VL结构域(含有前导肽)
<400> 20
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Glu Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asn Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Asn Gln Asp Gly Ile Gly Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Lys
130
<210> 21
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体重链(含有前导肽)
<400> 21
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Ser Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Met Ser Ser Asn Asp Arg Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Cys
100 105 110
Arg Gly Val Leu Gly Thr Arg Ser Ile His Ile Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Leu Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser
195 200 205
Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys
210 215 220
Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro
225 230 235 240
Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
275 280 285
Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
340 345 350
Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu
355 360 365
Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
420 425 430
Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 22
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗WASp 289抗体轻链(含有前导肽)
<220>
<221> misc_feature
<222> (231)..(231)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 22
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Glu Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asn Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Asn Gln Asp Gly Ile Gly Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Ala Asp Leu Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
145 150 155 160
Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175
Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
180 185 190
Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
195 200 205
Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln
210 215 220
Gly Thr Thr Ser Val Val Xaa Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 23
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545 VH结构域(不含前导肽)
<400> 23
Gln Ser Leu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Leu Phe Gln Pro Gly Gly Phe
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Phe
20 25 30
Val Val Ser Leu Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ser Ile Asp Val Gly Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Asn Phe Gly Phe Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545 VL结构域(不含前导肽)
<400> 24
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly Asp
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Val
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Gly Ser Ser
85 90 95
Ser Asp Gly His Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体重链(不含前导肽)
<400> 25
Gln Ser Leu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Leu Phe Gln Pro Gly Gly Phe
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Phe
20 25 30
Val Val Ser Leu Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ser Ile Asp Val Gly Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Asn Phe Gly Phe Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr
145 150 155 160
Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro
180 185 190
Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
245 250 255
Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn
260 265 270
Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn
275 280 285
Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro
305 310 315 320
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu
325 330 335
Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg
340 345 350
Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
420 425 430
Ser Arg Ser Pro Gly Lys
435
<210> 26
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体轻链(不含前导肽)
<400> 26
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly Asp
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Val
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Gly Ser Ser
85 90 95
Ser Asp Gly His Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly
100 105 110
Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln
115 120 125
Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe
130 135 140
Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr
145 150 155 160
Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr
165 170 175
Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His
180 185 190
Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 27
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545 VH结构域(含有前导肽)
<400> 27
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Arg Cys Gln Ser Leu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Leu Phe Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Phe Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
35 40 45
Ser Thr Phe Val Val Ser Leu Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Ala Ser Ile Asp Val Gly Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Thr Asn Phe Gly Phe Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 28
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545 VL结构域(含有前导肽)
<400> 28
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Lys Ser Val Pro Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Gln
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Glu Thr
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Tyr Lys Gly Ser Ser Ser Asp Gly His Gly Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Lys
130
<210> 29
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体重链(含有前导肽)
<400> 29
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Arg Cys Gln Ser Leu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Leu Phe Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Phe Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
35 40 45
Ser Thr Phe Val Val Ser Leu Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Ala Ser Ile Asp Val Gly Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Thr Asn Phe Gly Phe Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser
195 200 205
Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys
210 215 220
Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro
225 230 235 240
Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
275 280 285
Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
340 345 350
Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu
355 360 365
Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
420 425 430
Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 30
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BTK 545抗体轻链(含有前导肽)
<400> 30
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Lys Ser Val Pro Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Ser Val Tyr Ser Asp Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Gln
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Glu Thr
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Tyr Lys Gly Ser Ser Ser Asp Gly His Gly Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
145 150 155 160
Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175
Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
180 185 190
Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
195 200 205
Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln
210 215 220
Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 31
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有前导序列的抗WASp 289可变重结构域编码序列(EB0610A-9G7-H1)
<400> 31
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcagtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
accgtctctg gattctccct cagcagctcc gacatgacct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatacatcgg atacatgagt agtaatgata ggccatacta cgcgagctgg 240
gcaaatggtc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tgactctgaa aatcaccagt 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgttgtagag gtgttcttgg tactaggtcg 360
attcacatct ggggcccagg caccctggtc accgtctcct ta 402
<210> 32
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有前导序列的抗WASp 289可变轻结构域编码序列(EB0610A-9G7-K1)
<400> 32
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgcca tcgtgatgac ccagactcca tcccccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtgagagt gtctatagtg acaaccgctt atcctggtat 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagcaa ctgatctatg gtgcatccac tctggcatct 240
gaggtctcat cgcgattcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcaac 300
gatgtggtgt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatataaaag tagtaatcaa 360
gatggtattg gtttcggcgg agggaccgag gtggtcgtca aa 402
<210> 33
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有前导序列的抗WASp 289重链编码序列(EB0610A-9G7-H1)
<400> 33
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcagtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
accgtctctg gattctccct cagcagctcc gacatgacct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatacatcgg atacatgagt agtaatgata ggccatacta cgcgagctgg 240
gcaaatggtc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tgactctgaa aatcaccagt 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgttgtagag gtgttcttgg tactaggtcg 360
attcacatct ggggcccagg caccctggtc accgtctcct tagggcaacc taaggctcca 420
tcagtcttcc cactggcccc ctgctgcggg gacacaccca gctccacggt gaccctgggc 480
tgcctggtca aaggctacct cccggagcca gtgaccgtga cctggaactc gggcaccctc 540
accaatgggg tacgcacctt cccgtccgtc cggcagtcct caggcctcta ctcgctgagc 600
agcgtggtga gcgtgacctc aagcagccag cccgtcacct gcaacgtggc ccacccagcc 660
accaacacca aagtggacaa gaccgttgcg ccctcgacat gcagcaagcc catgtgccca 720
ccccctgaac tcctgggggg accgtctgtc ttcatcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780
ctcatgatct cacgcacccc cgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggatgac 840
cccgaggtgc agttcacatg gtacataaac aacgagcagg tgcgcaccgc ccggccgccg 900
ctacgggagc agcagttcaa cagcacgatc cgcgtggtca gcaccctccc catcgcgcac 960
caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag tgcaaagtcc acaacaaggc actcccggcc 1020
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaga gggcagcccc tggagccgaa ggtctacacc 1080
atgggccctc cccgggagga gctgagcagc aggtcggtca gcctgacctg catgatcaac 1140
ggcttctacc cttccgacat ctcggtggag tgggagaaga acgggaaggc agaggacaac 1200
tacaagacca cgccggccgt gctggacagc gacggctcct acttcctcta cagcaagctc 1260
tcagtgccca cgagtgagtg gcagcggggc gacgtcttca cctgctccgt gatgcacgag 1320
gccttgcaca accactacac gcagaagtcc atctcccgct ctccgggtaa atga 1374
<210> 34
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有前导序列的抗WASp 289轻链编码序列(EB0610A-9G7-K1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (693)..(693)
<223> n 是 a、c、g 或 t
<400> 34
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgcca tcgtgatgac ccagactcca tcccccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtgagagt gtctatagtg acaaccgctt atcctggtat 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagcaa ctgatctatg gtgcatccac tctggcatct 240
gaggtctcat cgcgattcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcaac 300
gatgtggtgt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatataaaag tagtaatcaa 360
gatggtattg gtttcggcgg agggaccgag gtggtcgtca aaggtgatcc agttgcacct 420
actgtcctca tcttcccacc atctgctgat cttgtggcaa ctggaacagt caccatcgtg 480
tgtgtggcga ataaatactt tcccgatgtc accgtcacct gggaggtgga tggcaccacc 540
caaacaactg gcatcgagaa cagtaaaaca ccgcagaatt ctgcagattg tacctacaac 600
ctcagcagca ctctgacact gaccagcaca cagtacaaca gccacaaaga gtacacctgc 660
aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc canagcttca ataggggtga ctgttag 717
<210> 35
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有前导序列的抗BTK 545可变重结构域编码序列
(EB0611A-3F7-H2)
<400> 35
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccggtgtcag 60
tcgctgcagg ggtccggggg aggcctgttc cagcctgggg gattcctggc actcacctgc 120
aaagcctctg gattctcctt cagtagcacg ttcgtggtgt ccttgatccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtggat cgcgtccatt gatgttggta gtagtggtat cacttactac 240
gcgagctggg cgaaaggccg cttcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg 300
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agggaccaac 360
tttggcttct ggggcccagg caccctggtc accgtctcct ca 402
<210> 36
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有前导序列的抗BTK 545可变轻结构域编码序列
(EB0611A-3F7-K2)
<400> 36
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgcca tcgtgatgac ccagactcca tcttccaagt ctgtccctgt gggagacaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtgagagt gtttatagtg acaaccgctt atcctggttt 180
cagcagaaac aagggcagcc tcccaagctc ctgatctacc aggcatccaa attggaaact 240
ggggtcccat cgcggttcag cggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
gatgtggtgt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatataaagg tagtagtagt 360
gatggccatg gtttcggcgg agggaccgag gtggtggtca aa 402
<210> 37
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有前导序列的抗BTK 545重链编码序列(EB0611A-3F7-H2)
<400> 37
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccggtgtcag 60
tcgctgcagg ggtccggggg aggcctgttc cagcctgggg gattcctggc actcacctgc 120
aaagcctctg gattctcctt cagtagcacg ttcgtggtgt ccttgatccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtggat cgcgtccatt gatgttggta gtagtggtat cacttactac 240
gcgagctggg cgaaaggccg cttcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg 300
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agggaccaac 360
tttggcttct ggggcccagg caccctggtc accgtctcct cagggcaacc taaggctcca 420
tcagtcttcc cactggcccc ctgctgcggg gacacaccca gctccacggt gaccctgggc 480
tgcctggtca aaggctacct cccggagcca gtgaccgtga cctggaactc gggcaccctc 540
accaatgggg tacgcacctt cccgtccgtc cggcagtcct caggcctcta ctcgctgagc 600
agcgtggtga gcgtgacctc aagcagccag cccgtcacct gcaacgtggc ccacccagcc 660
accaacacca aagtggacaa gaccgttgcg ccctcgacat gcagcaagcc catgtgccca 720
ccccctgaac tcctgggggg accgtctgtc ttcatcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780
ctcatgatct cacgcacccc cgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggatgac 840
cccgaggtgc agttcacatg gtacataaac aacgagcagg tgcgcaccgc ccggccgccg 900
ctacgggagc agcagttcaa cagcacgatc cgcgtggtca gcaccctccc catcgcgcac 960
caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag tgcaaagtcc acaacaaggc actcccggcc 1020
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaga gggcagcccc tggagccgaa ggtctacacc 1080
atgggccctc cccgggagga gctgagcagc aggtcggtca gcctgacctg catgatcaac 1140
ggcttctacc cttccgacat ctcggtggag tgggagaaga acgggaaggc agaggacaac 1200
tacaagacca cgccggccgt gctggacagc gacggctcct acttcctcta cagcaagctc 1260
tcagtgccca cgagtgagtg gcagcggggc gacgtcttca cctgctccgt gatgcacgag 1320
gccttgcaca accactacac gcagaagtcc atctcccgct ctccgggtaa atga 1374
<210> 38
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有前导序列的抗BTK 545轻链编码序列(EB0611A-3F7-K2)
<400> 38
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgcca tcgtgatgac ccagactcca tcttccaagt ctgtccctgt gggagacaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtgagagt gtttatagtg acaaccgctt atcctggttt 180
cagcagaaac aagggcagcc tcccaagctc ctgatctacc aggcatccaa attggaaact 240
ggggtcccat cgcggttcag cggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
gatgtggtgt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatataaagg tagtagtagt 360
gatggccatg gtttcggcgg agggaccgag gtggtggtca aaggtgatcc agttgcacct 420
actgtcctca tcttcccacc agctgctgat caggtggcaa ctggaacagt caccatcgtg 480
tgtgtggcga ataaatactt tcccgatgtc accgtcacct gggaggtgga tggcaccacc 540
caaacaactg gcatcgagaa cagtaaaaca ccgcagaatt ctgcagattg tacctacaac 600
ctcagcagca ctctgacact gaccagcaca cagtacaaca gccacaaaga gtacacctgc 660
aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc cagagcttca ataggggtga ctgttag 717
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成Gly-Ser接头
<400> 39
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成Gly-Ser接头
<400> 40
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成Gly-Ser接头
<400> 41
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成Gly-Ser接头
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成Gly-Ser接头
<400> 43
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成Gly-Ser接头
<400> 44
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性His标签
<400> 45
His His His His His His
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Flag标签
<400> 46
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Flag标签
<400> 47
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Flag标签
<400> 48
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Xpress标签
<400> 49
Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Avi标签
<400> 50
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 51
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性钙调蛋白结合肽(CBP)标签
<400> 51
Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu
20 25
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性聚谷氨酸标签
<400> 52
Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性HA标签
<400> 53
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性HA标签
<400> 54
Tyr Ala Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性HA标签
<400> 55
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Myc标签
<400> 56
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Strep标签
<400> 57
Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> STREP标签 II
<400> 58
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Softag 1
<400> 59
Ser Leu Ala Glu Leu Leu Asn Ala Gly Leu Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性Softag 3
<400> 60
Thr Gln Asp Pro Ser Arg Val Gly
1 5
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性V5标签
<400> 61
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 62
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不含前导序列的抗WASp 289可变重结构域编码序列
(EB0610A-9G7-H1)
<400> 62
cagtcagtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ctggattctc cctcagcagc tccgacatga cctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggaatacat cggatacatg agtagtaatg ataggccata ctacgcgagc 180
tgggcaaatg gtcgattcac catctccaaa acctcgacca cggtgactct gaaaatcacc 240
agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgttgta gaggtgttct tggtactagg 300
tcgattcaca tctggggccc aggcaccctg gtcaccgtct cctta 345
<210> 63
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不含前导序列的抗WASp 289可变轻结构域编码序列
(EB0610A-9G7-K1)
<400> 63
atcgtgatga cccagactcc atcccccgtg tctgcagctg tgggaggcac agtcaccatc 60
aattgccagg ccagtgagag tgtctatagt gacaaccgct tatcctggta tcagcagaaa 120
ccagggcagc ctcccaagca actgatctat ggtgcatcca ctctggcatc tgaggtctca 180
tcgcgattca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcaa cgatgtggtg 240
tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggatataaaa gtagtaatca agatggtatt 300
ggtttcggcg gagggaccga ggtggtcgtc aaa 333
<210> 64
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不含前导序列的抗WASp 289重链编码序列(EB0610A-9G7-H1)
<400> 64
cagtcagtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ctggattctc cctcagcagc tccgacatga cctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggaatacat cggatacatg agtagtaatg ataggccata ctacgcgagc 180
tgggcaaatg gtcgattcac catctccaaa acctcgacca cggtgactct gaaaatcacc 240
agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgttgta gaggtgttct tggtactagg 300
tcgattcaca tctggggccc aggcaccctg gtcaccgtct ccttagggca acctaaggct 360
ccatcagtct tcccactggc cccctgctgc ggggacacac ccagctccac ggtgaccctg 420
ggctgcctgg tcaaaggcta cctcccggag ccagtgaccg tgacctggaa ctcgggcacc 480
ctcaccaatg gggtacgcac cttcccgtcc gtccggcagt cctcaggcct ctactcgctg 540
agcagcgtgg tgagcgtgac ctcaagcagc cagcccgtca cctgcaacgt ggcccaccca 600
gccaccaaca ccaaagtgga caagaccgtt gcgccctcga catgcagcaa gcccatgtgc 660
ccaccccctg aactcctggg gggaccgtct gtcttcatct tccccccaaa acccaaggac 720
accctcatga tctcacgcac ccccgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccaggat 780
gaccccgagg tgcagttcac atggtacata aacaacgagc aggtgcgcac cgcccggccg 840
ccgctacggg agcagcagtt caacagcacg atccgcgtgg tcagcaccct ccccatcgcg 900
caccaggact ggctgagggg caaggagttc aagtgcaaag tccacaacaa ggcactcccg 960
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc agagggcagc ccctggagcc gaaggtctac 1020
accatgggcc ctccccggga ggagctgagc agcaggtcgg tcagcctgac ctgcatgatc 1080
aacggcttct acccttccga catctcggtg gagtgggaga agaacgggaa ggcagaggac 1140
aactacaaga ccacgccggc cgtgctggac agcgacggct cctacttcct ctacagcaag 1200
ctctcagtgc ccacgagtga gtggcagcgg ggcgacgtct tcacctgctc cgtgatgcac 1260
gaggccttgc acaaccacta cacgcagaag tccatctccc gctctccggg taaatga 1317
<210> 65
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不含前导序列的抗WASp 289轻链编码序列(EB0610A-9G7-K1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (624)..(624)
<223> n 是 a、c、g 或 t
<400> 65
atcgtgatga cccagactcc atcccccgtg tctgcagctg tgggaggcac agtcaccatc 60
aattgccagg ccagtgagag tgtctatagt gacaaccgct tatcctggta tcagcagaaa 120
ccagggcagc ctcccaagca actgatctat ggtgcatcca ctctggcatc tgaggtctca 180
tcgcgattca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcaa cgatgtggtg 240
tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggatataaaa gtagtaatca agatggtatt 300
ggtttcggcg gagggaccga ggtggtcgtc aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc 360
atcttcccac catctgctga tcttgtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 420
aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 480
ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 540
actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 600
cagggcacga cctcagtcgt ccanagcttc aataggggtg actgttag 648
<210> 66
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不含前导序列的抗BTK 545可变重结构域编码序列
(EB0611A-3F7-H2)
<400> 66
cagtcgctgc aggggtccgg gggaggcctg ttccagcctg ggggattcct ggcactcacc 60
tgcaaagcct ctggattctc cttcagtagc acgttcgtgg tgtccttgat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcgtcc attgatgttg gtagtagtgg tatcacttac 180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgcttcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagggacc 300
aactttggct tctggggccc aggcaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 67
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不含前导序列的抗BTK 545可变轻结构域编码序列
(EB0611A-3F7-K2)
<400> 67
atcgtgatga cccagactcc atcttccaag tctgtccctg tgggagacac agtcaccatc 60
aattgccagg ccagtgagag tgtttatagt gacaaccgct tatcctggtt tcagcagaaa 120
caagggcagc ctcccaagct cctgatctac caggcatcca aattggaaac tggggtccca 180
tcgcggttca gcggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgatgtggtg 240
tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggatataaag gtagtagtag tgatggccat 300
ggtttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaa 333
<210> 68
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不含前导序列的抗BTK 545重链编码序列(EB0611A-3F7-H2)
<400> 68
cagtcgctgc aggggtccgg gggaggcctg ttccagcctg ggggattcct ggcactcacc 60
tgcaaagcct ctggattctc cttcagtagc acgttcgtgg tgtccttgat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcgtcc attgatgttg gtagtagtgg tatcacttac 180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgcttcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagggacc 300
aactttggct tctggggccc aggcaccctg gtcaccgtct cctcagggca acctaaggct 360
ccatcagtct tcccactggc cccctgctgc ggggacacac ccagctccac ggtgaccctg 420
ggctgcctgg tcaaaggcta cctcccggag ccagtgaccg tgacctggaa ctcgggcacc 480
ctcaccaatg gggtacgcac cttcccgtcc gtccggcagt cctcaggcct ctactcgctg 540
agcagcgtgg tgagcgtgac ctcaagcagc cagcccgtca cctgcaacgt ggcccaccca 600
gccaccaaca ccaaagtgga caagaccgtt gcgccctcga catgcagcaa gcccatgtgc 660
ccaccccctg aactcctggg gggaccgtct gtcttcatct tccccccaaa acccaaggac 720
accctcatga tctcacgcac ccccgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccaggat 780
gaccccgagg tgcagttcac atggtacata aacaacgagc aggtgcgcac cgcccggccg 840
ccgctacggg agcagcagtt caacagcacg atccgcgtgg tcagcaccct ccccatcgcg 900
caccaggact ggctgagggg caaggagttc aagtgcaaag tccacaacaa ggcactcccg 960
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc agagggcagc ccctggagcc gaaggtctac 1020
accatgggcc ctccccggga ggagctgagc agcaggtcgg tcagcctgac ctgcatgatc 1080
aacggcttct acccttccga catctcggtg gagtgggaga agaacgggaa ggcagaggac 1140
aactacaaga ccacgccggc cgtgctggac agcgacggct cctacttcct ctacagcaag 1200
ctctcagtgc ccacgagtga gtggcagcgg ggcgacgtct tcacctgctc cgtgatgcac 1260
gaggccttgc acaaccacta cacgcagaag tccatctccc gctctccggg taaatga 1317
<210> 69
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不含前导序列的抗BTK 545轻链编码序列(EB0611A-3F7-K2)
<400> 69
atcgtgatga cccagactcc atcttccaag tctgtccctg tgggagacac agtcaccatc 60
aattgccagg ccagtgagag tgtttatagt gacaaccgct tatcctggtt tcagcagaaa 120
caagggcagc ctcccaagct cctgatctac caggcatcca aattggaaac tggggtccca 180
tcgcggttca gcggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgatgtggtg 240
tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggatataaag gtagtagtag tgatggccat 300
ggtttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc 360
atcttcccac cagctgctga tcaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 420
aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 480
ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 540
actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 600
cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc aataggggtg actgttag 648

Claims (20)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含：
(A)重链可变(VH)结构域，其包含具有SEQ ID NO:3所示序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:4所示序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:5所示序列的CDRH3；和轻链可变(VL)结构域，其包含具有SEQ ID NO:6所示序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:7所示序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:8所示序列的CDRL3或者
(B)VH结构域，其包含具有SEQ ID NO:9所示序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:10所示序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:11所示序列的CDRH3；和VL结构域，其包含具有SEQ ID NO:12所示序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:13所示序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:14所示序列的CDRL3。
2.如权利要求1(A)所述的抗体或其抗原结合片段，其包含以下中的一者或多者：具有SEQ ID NO：15所示序列的VH结构域；具有SEQ ID NO：17所示序列的重链；具有SEQ ID NO：16所示序列的VL结构域；或具有SEQ ID NO:18所示序列的轻链。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH结构域具有SEQ ID NO:15所示序列并且所述VL结构域具有SEQ ID NO:16所示序列。
4.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链具有SEQ ID NO:17所示序列并且所述轻链具有SEQ ID NO:18所示序列。
5.如权利要求1(B)所述的抗体或其抗原结合片段，其包含以下中的一者或多者：具有SEQ ID NO：23所示序列的VH结构域；具有SEQ ID NO：25所示序列的重链；具有SEQ ID NO：24所示序列的VL结构域；或具有SEQ ID NO:26所示序列的轻链。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH结构域具有SEQ ID NO:23所示序列并且所述VL结构域具有SEQ ID NO:24所示序列。
7.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链具有SEQ ID NO:25所示序列并且所述轻链具有SEQ ID NO:26所示序列。
8.权利要求1所述的抗体在方法中的用途，其包括：
获得源自受试者的生物样本；
用酶消化来自所述生物样本的蛋白质以产生一种或多种肽；
执行以下富集：
用权利要求1(A)所述的抗体或其抗原结合片段富集WASp特征肽；和/或
用权利要求1(B)所述的抗体或其抗原结合片段富集BTK特征肽；以及
对富集的肽执行液相色谱-多反应监测质谱(LC-MRM-MS)以确定每种特征肽的浓度。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述生物样本是干血斑(DBS)、颊拭子、外周血单个核细胞(PBMC)或白血细胞(WBC)。
10.如权利要求8所述的用途，其中所述酶是胰蛋白酶。
11.如权利要求8所述的用途，其进一步包括：
将每种特征肽的浓度与相应的预定阈值浓度进行比较；以及
如下对受试者进行诊断：
当WASp特征肽的浓度低于相应的预定阈值浓度时或当WASp特征肽不存在时，诊断所述受试者患有WAS；以及
当BTK特征肽的浓度低于相应的预定阈值浓度时或当BTK特征肽不存在时，诊断所述受试者患有XLA。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述用途作为另外筛查所述受试者的苯丙酮尿症、原发性先天性甲状腺功能减退症、囊性纤维化和镰状细胞病中的一者或多者的新生儿筛查(NBS)的一部分进行。
13.如权利要求11所述的用途，其中所述用途在所述受试者中在不存在WAS和/或XLA的临床症状的情况下进行。
14.如权利要求11所述的用途，其中从来自正常对照受试者群体的相应生物样本中的每种特征肽的平均浓度的标准偏差来计算每种特征肽的相应的预定阈值浓度。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述生物样本是DBS并且来自正常对照受试者群体的DBS中的所述WASp特征肽的平均浓度包括在7000pmol/L至30000pmol/L范围内的浓度。
16.如权利要求14所述的用途，其中所述生物样本是DBS，并且来自正常对照受试者群体的DBS中的所述BTK特征肽的平均浓度包括在400pmol/L至2000pmol/L范围内的浓度。
17.一种用于筛查受试者的维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)和/或X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的测定物，所述测定物包含：
(i)如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段和
(ii)参考特征肽，所述参考特征肽包含：
SEQ ID NO:1的WAS的WASp特征肽；和/或
SEQ ID NO:2的XLA的BTK特征肽。
18.如权利要求17所述的测定物，其中所述参考特征肽是经同位素标记的。
19.如权利要求17所述的测定物，其中所述抗体或其抗原结合片段附着于磁珠。
20.一种试剂盒，其包括权利要求17所述的测定物和一种或多种选自以下的附加部件：
滤纸卡、颊拭子、采血管、冲孔工具、消化酶、消化缓冲液、抗体或其抗原结合片段的固体载体，及洗脱缓冲液。
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