JP5935132B2 - 蛋白質の整列方法 - Google Patents
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Description
本発明は蛋白質の整列方法に関する。さらに、詳しくは、本発明はナノテクノロジー等への応用基礎技術として活用できる蛋白質の整列方法に関する。
セルロースと酵素という固液境界面で起こる反応を解明するために多くの研究が行われている。本発明者等が研究を行っている好熱嫌気性細菌（Clostridium thermocellum、以下、クロストリジウム・サーモセラムと呼ぶ。）は、地上で最も速くセルロースを分解する。セルロースの分解には酵素複合体である「セルロソーム）が主役を果たしていることが知られている。またこれまでの分子遺伝学的研究からセルロソームはカビ酵素とは全く異なる構造を有している。セルロースの分解のメカニズムに関しては不明であり、その解明が期待されている。
非特許文献１では、グラファイトの疎水性の表面に固定した結晶セルロースと酵素との反応で、結晶セルロース上を酵素が移動することが、原子間力顕微鏡でカビ、セルラーゼの一分子の動きを可視化できることが報告されている。
グラファイトでは、その疎水性から蛋白質が表面に吸着するが、通常、蛋白質が非特異的吸着を起こした場合、構造的変化が起こり蛋白質としての機能を失う。これまで、グラファイトなどの炭素材料上に固定され、さらに機能を失っていない活性の蛋白質は、確認されていない。
Kiyohiko Igarashi, Anu Koivula, Masahisa Wada, Satoshi Kimura, Merja Penttila and Masahiko Samejima, "High Speed Atomic Force Microscopy Visualizes Processive Movemnet of Trichoderma reesi Cellobiohydrolase I on Crystalline Cellulose", Journal of Biological Chemistry, December 25, Vol. 284, No.52,pp. 36186-36190.,2009
N. Kodera, D. Yamamoto, R. Ishikawa, and T. Ando, "Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy", Nature 468, 72-76, 2010.
Demain AL, Newcomb M, Wu JH.,Microbiol, "Cellulase, clostridia, and ethanol", Microbiol. Mol. Biol. Rev., Vol.69, No.1., pp.124-154, March 2005
Fierobe HP, Mingardon F, Mechaly A, Belaich A, Rincon MT, Pages S, Lamed R, Tardif C, Belaich JP, Bayer EA ,"Action of designer cellulosomes on homogeneous versus complex substrates: controlled incorporation of three distinct enzymes into a defined trifunctional scaffoldin", J Biol Chem.,280(16), pp16325-16334, Epub 2005 Feb 10
従来の知見では、セルロース分解に寄与する酵素複合体（セルロソーム）を構成する骨格蛋白質がグラファイトに非特異的に吸着した場合、骨格蛋白質としての機能を失うことが予想されている。
本発明は、炭素材料等の表面上に活性の蛋白質を整列させることができる蛋白質の整列方法を提供することを目的としている。
本発明者等は、組換え技術によってセルロソームの部分構造を作成し、グラファイトに添加して原子間力顕微鏡で観察したところ、複数の骨格蛋白質がグラファイトの六角板状結晶に沿って規則性を持って整列し、グラファイト上に整列した骨格蛋白質にセルロソームの酵素サブユニットが結合して自己組織化することを見出し、本発明に想到した。
上記目的を達成するために、本発明の蛋白質の整列方法は、炭素からなる基材に、蛋白質を整列させることを特徴とする。
上記構成において、セルロソームのセルロース結合ドメイン、コヘシンドメイン及びドッケリンドメインの何れかを、蛋白質として利用する。
蛋白質を、好ましくは、セルロソームのセルロース結合ドメイン及びコヘシンドメインからなる構造体とし、蛋白質に結合する機能性蛋白質を、ドッケリンドメインを有する蛋白質とする。
コヘシンドメインを、異なる微生物種由来のコヘシンドメインのアミノ酸配列を有するようにし、かつ、微生物種のもつドッケリンドメインを酵素等の機能性蛋白質に有するようにし、微生物種特異的コヘシン・ドッケリン相互作用を利用することで、数種類の機能性蛋白質を配置してもよい。
基材を、好ましくは炭素からなる鉱物由来の材料とするか、または、グラファイトとする。
蛋白質を、好ましくは、セルロソームのセルロース結合ドメイン及びコヘシンドメインからなる構造体とし、蛋白質に結合する機能性蛋白質を、ドッケリンドメインを有する蛋白質とする。
コヘシンドメインを、異なる微生物種由来のコヘシンドメインのアミノ酸配列を有するようにし、かつ、微生物種のもつドッケリンドメインを酵素等の機能性蛋白質に有するようにし、微生物種特異的コヘシン・ドッケリン相互作用を利用することで、数種類の機能性蛋白質を配置してもよい。
基材を、好ましくは炭素からなる鉱物由来の材料とするか、または、グラファイトとする。
上記の何れかに記載の蛋白質の整列方法により、蛋白質が炭素からなる基材上に整列された複合基板を得ることができる。
本発明によれば、炭素からなる基材に、蛋白質を整列させることができる。例えば、セルロソームの骨格蛋白質の有するコヘシンドメインとセルロソームの酵素サブユニットが持つドッケリンドメインを使い、基材上に機能を失わずに蛋白質を固定することができる。
以下、図面を用いて本発明の実施形態を説明する。
図１は本発明の実施形態に係る複合体１の概略を示す模式図であり、図２は本発明の実施形態に係る部分骨格蛋白質２０Ａの概略を示す模式図である。
図に示すように、複合体１は、基材１０と、この基材１０上に固定したセルロソーム等の骨格蛋白質２０と、この骨格蛋白質２０に結合したドッケリンを含む機能性蛋白質３２である酵素と、から構成されている。機能性蛋白質３０とドッケリンドメイン３１とからなる機能性蛋白質３２を、ドッケリンを含む機能性蛋白質３２と呼ぶ。
図１は本発明の実施形態に係る複合体１の概略を示す模式図であり、図２は本発明の実施形態に係る部分骨格蛋白質２０Ａの概略を示す模式図である。
図に示すように、複合体１は、基材１０と、この基材１０上に固定したセルロソーム等の骨格蛋白質２０と、この骨格蛋白質２０に結合したドッケリンを含む機能性蛋白質３２である酵素と、から構成されている。機能性蛋白質３０とドッケリンドメイン３１とからなる機能性蛋白質３２を、ドッケリンを含む機能性蛋白質３２と呼ぶ。
セルロソームは、セルラーゼを保持するための骨格蛋白質２０であるスキャホールディン蛋白質を細胞表層に保持し、このスキャホールディン蛋白質にセルラーゼが結合されることにより構成されている。スキャホールディン蛋白質は、セルラーゼ結合ドメイン２２とコヘシンドメイン２１を有しており、セルロソームを構成するセルラーゼは、コヘシンドメイン２１に水素結合等の非共有結合で結合するドックリンドメイン３１を有していることが報告されている（非特許文献３参照）。
基材１０は、炭素原子だけからなる炭素材料等を使用することができる。炭素材料として、グラファイトやカーボンナノチューブ等を利用することができる。グラファイト（graphite、黒鉛）は、炭素から成る元素鉱物であり、六角板状結晶を有している。グラファイトは、亀の甲状の層状物質である。この層毎の面内は、強い共有結合で炭素間が繋がっているが、層と層の間（面間）は、弱いファンデルワールス力で結合している。本実施形態では基材１０にグラファイトを用いたものとして説明する。
基材１０は、上記グラファイトだけでなく、図１に示す分子内のセルロース結合ドメイン２２及び後述する図２に示すセルロース結合ドメイン２２に親和性があるものであればいずれでも構わない。例えば、セルロースを含んでいてもよい。
本実施形態の複合体１において、図２に示すように、骨格蛋白質２０或いは部分骨格蛋白質２０Ａは、基材１０の表面に、セルロース結合ドメイン２２を介して整列している。
図３は、本発明の実施形態に係る骨格蛋白質２０を表面に整列させる方法を模式的に示す概略図である。
図３に示すように、基材１０は、複数の骨格蛋白質２０或いは部分骨格蛋白質２０Ａを含む水溶液を、炭素原子が六角網状に並んで構成される面１０Ａの表面に添加して作製される。基材１０の面１０Ａ上に、骨格蛋白質２０或いは部分骨格蛋白質２０Ａが固定する。さらに、図１に示すように、骨格蛋白質２０或いは部分骨格蛋白質２０Ａには、ドッケリンを含む機能性蛋白質３２を結合させることができる。
図３に示すように、基材１０は、複数の骨格蛋白質２０或いは部分骨格蛋白質２０Ａを含む水溶液を、炭素原子が六角網状に並んで構成される面１０Ａの表面に添加して作製される。基材１０の面１０Ａ上に、骨格蛋白質２０或いは部分骨格蛋白質２０Ａが固定する。さらに、図１に示すように、骨格蛋白質２０或いは部分骨格蛋白質２０Ａには、ドッケリンを含む機能性蛋白質３２を結合させることができる。
蛋白質を、好ましくは、セルロソームのセルロース結合ドメイン２２、コヘシンドメイン２１及びドッケリンドメイン３１の何れかとすることができる。蛋白質を、セルロソームのセルロース結合ドメイン２２及びコヘシンドメイン２１からなる構造体として基材１０に整列させることができる。ドッケリンを含む機能性蛋白質３２を、ドッケリンドメイン３１を有する蛋白質としてもよい。
セルロソームを構成する酵素サブユニットには、約２４のアミノ酸からなるドッケリンドメイン３１があることが、共通の特性である。このドッケリンドメイン３１と、骨格をなす蛋白質に存在する疎水性のコヘシンドメイン２１が、高い結合定数で結合することが明らかとなっている。この二つのドッケリンドメイン３１とコヘシンドメイン２１の相互作用が、セルロソームを形成させる基本的な機構であり（非特許文献３参照）、蛋白質−蛋白質の相互作用としては、比較的高い結合定数を持っている。
上記のコヘシン・ドックリン相互作用は、微生物種特異的であることが明らかとなっている。すなわち、クロストリジウム・サーモセラムのドッケリンドメイン３１は、クロストリジウム・サーモセラムのコヘシンドメイン２１と結合する。クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）のドッケリンドメインは、クロストリジウム・セルロリティカムのコヘシンドメインと結合する。従ってこれらの特性を利用した人工セルロソームの作成が報告されている（非特許文献４参照）。
例えば、後述するように、クロストリジウム・サーモセラムのコヘシンドメイン２１を、同じくセルロソームを生産するとされるクロストリジウム・セルロボランスのコヘシンドメインのアミノ酸配列としてもよい。その場合、ドッケリンを含む機能性蛋白質を、コヘシンドメインと同じ微生物由来のドッケリンドメインとして利用してもよい。つまり、クロストリジウム・セルロボランスのドッケリンドメインを含む機能性蛋白質を上記のコヘシンドメインに結合してもよい。この微生物種特異的なコヘシン・ドッケリンドメインの相互作用を利用することで、２種類以上、数種類の機能性蛋白質を配置、整列させることができる。
（骨格蛋白質の例）
骨格蛋白質２０の具体例を説明する。骨格蛋白質２０として、セルロソーム（酵素複合体）に含まれる酵素３０をクローニングしたものを利用することができる。この酵素３０は、骨格蛋白質２０を構成するコヘシンドメイン２１と結合するドッケリンドメイン３１を備える。
骨格蛋白質２０の具体例を説明する。骨格蛋白質２０として、セルロソーム（酵素複合体）に含まれる酵素３０をクローニングしたものを利用することができる。この酵素３０は、骨格蛋白質２０を構成するコヘシンドメイン２１と結合するドッケリンドメイン３１を備える。
骨格蛋白質２０の一例はＣｉｐＡであり、このＣｉｐＡ（１９６ｋＤａ）は、図１に示すように９つのコヘシンドメイン２１と、１つのセルロース結合ドメイン２２と、を備えている。セルロース結合ドメイン２２は、２番目のコヘシンドメイン２１と３番目のコヘシンドメイン２１との間に設けられている。これらのコヘシンドメイン２１は、微生物由来のもの、例えばクロストリジウム・サーモセラム由来の骨格蛋白質２０を利用することができる。
骨格蛋白質２０の代わりにその一部である骨格蛋白質２０Ａを利用してもよい。図２に示す部分骨格蛋白質２０ＡはｍＣｉｐＡ（分子量は５３ｋＤａ）であり、このｍＣｉｐＡはＣｉｐＡのＮ末端からセルロース結合ドメイン２２までのＣｉｐＡの部分構造体である。ｍＣｉｐＡは、図２に示すようにＣｉｐＡのセルロース結合ドメイン２２と２個のコヘシンドメイン２１とを備えている。これらの骨格蛋白質２０及び部分骨格蛋白質２０Ａは、組み換え技術によって作成される。
（ドッケリンドメイン）
さらに、骨格蛋白質２０のコヘシンドメイン２１と親和性のあるドッケリンドメイン３１として、同じく上記の微生物由来のドッケリンドメインを用いることができる。ドッケリンドメイン３１を有しているドッケリンを含む機能性蛋白質３２としては、酵素、抗体及び標識化合物の何れかとしてもよい。
さらに、骨格蛋白質２０のコヘシンドメイン２１と親和性のあるドッケリンドメイン３１として、同じく上記の微生物由来のドッケリンドメインを用いることができる。ドッケリンドメイン３１を有しているドッケリンを含む機能性蛋白質３２としては、酵素、抗体及び標識化合物の何れかとしてもよい。
本実施形態のドッケリンドメイン３１は、コヘシンドメイン２１と同じ微生物由来のものを用いることが可能である。例えば、骨格蛋白質２０及びその一部である部分骨格蛋白質２０Ａとしては、以下の微生物由来の蛋白質を用いることができる。
クロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）
クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）
クロストリジウム・ジョースイ（Clostridium josui）
クロストリジウム・アセトブティリカム（Clostridium acetobutylicum）
クロストリジウム・セロビオパルム（Clostridium cellobioparum）
クロストリジウム・パピロソルベンス（Clostridium papyrosolvens）
ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）
ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ruminococcus flavefaciens）
アセトビブリオ・セルロリティクス（Acetivibrio cellulolyticus）
バクテロイディス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens）
ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）
クロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）
クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）
クロストリジウム・ジョースイ（Clostridium josui）
クロストリジウム・アセトブティリカム（Clostridium acetobutylicum）
クロストリジウム・セロビオパルム（Clostridium cellobioparum）
クロストリジウム・パピロソルベンス（Clostridium papyrosolvens）
ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）
ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ruminococcus flavefaciens）
アセトビブリオ・セルロリティクス（Acetivibrio cellulolyticus）
バクテロイディス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens）
ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）
（複合体の作製方法の一例）
骨格蛋白質２０やこの骨格蛋白質に結合するドッケリンを含む機能性蛋白質３２の整列方法の一例を説明する。
先ず、グラファイトで構成される基材１０上に骨格蛋白質２０を含む水溶液を添加する。これにより、グラファイトの面に複数の骨格蛋白質２０が整列する。
次に、ドッケリンを含む機能性蛋白質３２として、酵素３０を含む水溶液を基材１０上に添加する。これにより、酵素３０のドッケリンドメイン３１が骨格蛋白質２０のコヘシンドメイン２１に結合し、基材１０上で自己組織化する。
このように、炭素材料等で構成される基材１０に酵素３０をドッケリンドメイン３１を介して固定することができる。酵素３０を固定する温度等は室温でもよい。また、温度は用いる酵素３０に応じて調整してもよい。
骨格蛋白質２０やこの骨格蛋白質に結合するドッケリンを含む機能性蛋白質３２の整列方法の一例を説明する。
先ず、グラファイトで構成される基材１０上に骨格蛋白質２０を含む水溶液を添加する。これにより、グラファイトの面に複数の骨格蛋白質２０が整列する。
次に、ドッケリンを含む機能性蛋白質３２として、酵素３０を含む水溶液を基材１０上に添加する。これにより、酵素３０のドッケリンドメイン３１が骨格蛋白質２０のコヘシンドメイン２１に結合し、基材１０上で自己組織化する。
このように、炭素材料等で構成される基材１０に酵素３０をドッケリンドメイン３１を介して固定することができる。酵素３０を固定する温度等は室温でもよい。また、温度は用いる酵素３０に応じて調整してもよい。
本発明の蛋白質の整列方法によれば、蛋白質の組換え技術によって、例えばセルロソームの部分構造を作成し、グラファイトに添加して複数の骨格蛋白質２０をグラファイトの六角板状結晶に沿って規則性を持って整列させることができる。グラファイト上に整列した骨格蛋白質２０にセルロソームの酵素サブユニットを結合させて自己組織化させることもできる。
このようなグラファイト等の炭素材料からなる基材１０上に蛋白質を固定する技術は、例えばバイオチップ、バイオセンサー、バイオデバイス、マイクロアレイ、クロマトグラフィー担体、固定化ポリマー、固定化酵素、味覚センサー、蛋白質非特異的吸着防止、医療材料用バイオチップ、蛋白質薬物運搬用素材、蛋白質分離、機能性分子の製造としての利用が考えられる。
具体的には骨格蛋白質２０を用いて、炭素材料からなる基材１０上に固定し、その後、ドッケリンドメイン３１を本来持つようなセルロソーム酵素サブユニットはもちろんのこと、ドッケリンドメイン３１を遺伝子組換えなどで人為的に付与させた機能を有する蛋白質等を用いて、基材１０上に固定される骨格蛋白質２０とのコヘシン・ドッケリン相互作用により自己組織化することが可能となる。
上記の蛋白質としては、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、付加脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素、合成酵素（リガーゼ）、エピ化反応、分子内転移、ラセミ化反応を触媒する蛋白質などＥＣ番号が付けられている酵素機能を有する蛋白質が挙げられる。さらに蛋白質としては、抗体、標識蛋白質、場合によってはコンジュゲートを利用し化学薬品を直接ドッケリンドメイン３１へ付与したキメラ蛋白質でもよい。
上記以外での応用であれば、蛋白質に限らない。すなわち低分子化合物や、場合によっては放射線同位体をもった標識化合物及び安定同位体をもった標識化合物でも構わない。またドッケリンドメイン３１に直接的に標識することや、標識機能を有する化合物を直接カップリングさせた、ドッケリンドメイン３１であってもよい。従って、少なくともドッケリンドメイン３１を有しており、炭素からなる基材１０に整列させた骨格蛋白質２０と相互作用し、配置させることができればいずれの形でも用いることが可能である。
（蛋白質の整列方法の変形例）
図４は、本発明の蛋白質の整列方法の変形例に係る複合体１Ａを示す模式図である。この図に示すように、複合体１Ａが図１の複合体１と異なるのは、基材１０にセルロース結合ドメイン２２を介して結合している骨格蛋白質２０に、さらに、異なる微生物種のコヘシンドメイン２３が結合している点である。さらに、この異なる微生物種のコヘシンドメイン２３にドッケリンを含む機能性蛋白質４２が結合している点にある。このドッケリンを含む機能性蛋白質４２は、コヘシンドメイン２３と同じ微生物種の機能性蛋白質４０及びドッケリンドメイン４１からなる。
上記コヘシン・ドッケリン相互作用は、微生物種特異的であることが明らかとなっている（非特許文献３参照）。すなわち、クロストリジウム・サーモセラムのドッケリンドメイン３１は、クロストリジウム・サーモセラムのコヘシンドメイン２１と結合し、クロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）のドッケリンドメイン４１は、クロストリジウム・セルロボランスのコヘシンドメイン２３と結合する。従ってこれらの特性を利用した人工セルロソームの作成が報告されている（非特許文献４）。
図４は、本発明の蛋白質の整列方法の変形例に係る複合体１Ａを示す模式図である。この図に示すように、複合体１Ａが図１の複合体１と異なるのは、基材１０にセルロース結合ドメイン２２を介して結合している骨格蛋白質２０に、さらに、異なる微生物種のコヘシンドメイン２３が結合している点である。さらに、この異なる微生物種のコヘシンドメイン２３にドッケリンを含む機能性蛋白質４２が結合している点にある。このドッケリンを含む機能性蛋白質４２は、コヘシンドメイン２３と同じ微生物種の機能性蛋白質４０及びドッケリンドメイン４１からなる。
上記コヘシン・ドッケリン相互作用は、微生物種特異的であることが明らかとなっている（非特許文献３参照）。すなわち、クロストリジウム・サーモセラムのドッケリンドメイン３１は、クロストリジウム・サーモセラムのコヘシンドメイン２１と結合し、クロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）のドッケリンドメイン４１は、クロストリジウム・セルロボランスのコヘシンドメイン２３と結合する。従ってこれらの特性を利用した人工セルロソームの作成が報告されている（非特許文献４）。
この技術を応用すれば、図１の複合体１に結合させた骨格蛋白質２０のコヘシンドメイン２１を、異なる微生物由来のコヘシンドメイン２３のアミノ酸配列を有するようにし、かつ、酵素等の機能性蛋白質４０に、そのコヘシンドメイン２３由来の微生物のドッケリンドメイン３３を有するようにしてやると、数種類の異なる機能性蛋白質３２、４２を配置することができる（非特許文献４参照）。
これにより、コヘシンドメイン２１を、異なる微生物種由来のコヘシンドメイン２３のアミノ酸配列を有するようにし、かつ、酵素等の機能性蛋白質４０に、その微生物種特異的なドッケリンドメイン４１を有するようにし、微生物種特異的コヘシン・ドッケリン相互作用を利用することで、骨格蛋白質２０上に異なる蛋白質３２、４２を配置させることが可能となる。
これにより、コヘシンドメイン２１を、異なる微生物種由来のコヘシンドメイン２３のアミノ酸配列を有するようにし、かつ、酵素等の機能性蛋白質４０に、その微生物種特異的なドッケリンドメイン４１を有するようにし、微生物種特異的コヘシン・ドッケリン相互作用を利用することで、骨格蛋白質２０上に異なる蛋白質３２、４２を配置させることが可能となる。
例えば、非特許文献４では、クロストリジウム・サーモセラムのコヘシンドメインやクロストリジウム・サーモセラムのコヘシンドメイン、R. flavefaciensのコヘシンドメインを使いキメラ型の骨格蛋白質を作り出している。さらにクロストリジウム・サーモセラムの由来でドッケリンドメインを持つセルラーゼ(ファミリー９)、C. cellulolyticum由来でドッケリンドメインを持つセルラーゼ（ファミリー８）、R. flavefaciens由来でドッケリンドメインを持つセルラーゼ（ファミリー９）を用いてそのキメラ型の骨格蛋白質へ種特異的なコヘシン・ドッケリン相互作用により、任意の場所へ配置することも可能である。
さらに、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。
さらに、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。
本発明において作成、利用した組換蛋白質のモデルを図１に示した。クロストリジウム・サーモセラムからのゲノムＤＮＡは、以下の手順により抽出した。
０．５％セロビオースを含むＢＭ７ＣＯ−ＣＢ液体培地を用いてクロストリジウム・サーモセラムを培養後、４℃にて１０，０００回転で５分間、遠心分離して菌体を回収した。
０．５％セロビオースを含むＢＭ７ＣＯ−ＣＢ液体培地を用いてクロストリジウム・サーモセラムを培養後、４℃にて１０，０００回転で５分間、遠心分離して菌体を回収した。
（クロストリジウム・サーモセラムの培養）
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）を微結晶セルロース１０ｇ／Ｌを含むＢＭ７ＣＯ−ＣＢ培地を用いて４日間、６０℃にて培養を行った。
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）を微結晶セルロース１０ｇ／Ｌを含むＢＭ７ＣＯ−ＣＢ培地を用いて４日間、６０℃にて培養を行った。
次に、得られた菌体を溶菌させるために、１０％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）を最終濃度が０．５％になるように添加すると共に、プロテナーゼＫ（１ｍｇ/ｍＬ）溶液が５μｇ／ｍＬになるように加え、３７℃で１時間反応させた。
さらに１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム−０．７Ｍ（モル）塩化ナトリウム溶液を１％濃度になるように加え、６５℃、１０分間反応させた後、等量のクロロフォルム・イソアミルアルコール溶液を加えよく攪拌し、１５，０００回転、５分間遠心分離にて水層を得た。
さらに１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム−０．７Ｍ（モル）塩化ナトリウム溶液を１％濃度になるように加え、６５℃、１０分間反応させた後、等量のクロロフォルム・イソアミルアルコール溶液を加えよく攪拌し、１５，０００回転、５分間遠心分離にて水層を得た。
上記水層にフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール混液を等量加え、攪拌し再度１５，０００回転、５分間遠心分離にて水層を得た。この水層に対し０．６倍容量のイソプロパノールを加えゲノムＤＮＡを析出させ、再度遠心分離によりゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄、乾燥した。
なお、ＢＭ７ＣＯ−ＣＢ培地の組成は、リン酸二水素カリウム１．５ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム２．９ｇ/Ｌ、尿素２．１ｇ/Ｌ、酵母エキス６．０ｇ/Ｌ、炭酸ナトリウム４ｇ/Ｌ、システイン塩酸塩０．０５ｇ/Ｌ、０．２ｍＬミネラル溶液(ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ, ５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．７５ｇ、ＦｅＳＯ４・６Ｈ２Ｏ，０.００６３ｇを水４ｍＬに溶解)として調製した。また、培地に炭素源としてセロビオースを５ｇ／Ｌになるように加えた。最終的な培地のｐＨは７．０前後に調製した。
ＣｉｐＡは、上記調製したゲノムＤＮＡを用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣｉｐＡ（配列番号１：AGTCA GAGCTCC GCC ACA ATG ACA GTCGAG）及びＣｉｐＡＲ（配列番号２：AGTCACTCGAGTACAGGCTGTGTTGATGG）、ｍＣｉｐＡはオリゴヌクレオチドプライマーｍＣｉｐＡＦ（配列番号３：AGTCA GAGCTCC GCC ACA ATG ACA GTCGAG）及びｍＣｉｐＡＲ（配列番号４：AGTCA CTCGAG TACAGGCTGTGTTGATGG）、ＣｅｌＡはオリゴヌクレオチドプライマーＣｅｌＡＦ（配列番号５：AGTCA GAGCTCC GCA GGT GTG CCT TTT AAC）及びＣｅｌＡＲ（配列番号６：AGTC AAGCTT ATAAGGTAGGTGGGGTATG−３）、及びＣｅｌＳはオリゴヌクレオチドプライマーＣｅｌＳＡ（配列番号７：AGTC GAGCTCC GGT CCT ACA AAG GCACCTA）及びＣｅｌＳＲ（配列番号８：AGTCA GCTGAGC GTTCTTGTACGGCAATGT）をデザインし、合成した。
遺伝子を増幅する方法であるＰＣＲにより約５．５キロベース長の二本鎖増幅ＤＮＡ配列を得た。増幅したＣｉｐＡ遺伝子配列を配列番号９に示す。
遺伝子を増幅する方法であるＰＣＲにより約５．５キロベース長の二本鎖増幅ＤＮＡ配列を得た。増幅したＣｉｐＡ遺伝子配列を配列番号９に示す。
デザインしたオリゴヌクレオチドプライマーＣｉｐＦ及びＣｉｐＡＲは、大腸菌発現ベクターに挿入するため、制限酵素サイトＳａｃｌ及びＸｈｏｌサイトを付加してある。
また同じく、オリゴヌクレオチドプライマーｍＣｉｐＡＲは、同じく制限酵素サイトＸｈｏＩサイトを付加している。オリゴヌクレオチドプライマーＣｅｌＡＦ及びＣｅｌＡＲとＣｅｌＳと、オリゴヌクレオチドプライマーＣｅｌＳＡ及びＣｅｌＳＲとにも、それぞれ制限酵素サイトＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ及びＢｐｕ１１０２Ｉを付加してある。
また同じく、オリゴヌクレオチドプライマーｍＣｉｐＡＲは、同じく制限酵素サイトＸｈｏＩサイトを付加している。オリゴヌクレオチドプライマーＣｅｌＡＦ及びＣｅｌＡＲとＣｅｌＳと、オリゴヌクレオチドプライマーＣｅｌＳＡ及びＣｅｌＳＲとにも、それぞれ制限酵素サイトＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ及びＢｐｕ１１０２Ｉを付加してある。
なお、クロストリジウム・サーモセラムの骨格蛋白質２０であるＣｉｐＡ遺伝子配列、ＣｅｌＡ遺伝子配列及びＣｅｌＳ遺伝子配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＢＩＣ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じ、遺伝子配列を取得することができる（ＣｉｐＡ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；ＣＡＡ９１２２０．１）、（ＣｅｌＡ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；K03088）、（ＣｅｌＳ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；L06942.1）。
ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）により１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲの条件は９８℃、１分間、５５℃、１分間、７２℃、４分間を３０サイクルの条件において増幅を行った。
ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動で増幅されたバンドを確認後、キアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物は前述した制限酵素（タカラバイオ社製）を用い、３７℃で一晩それぞれ制限酵素処理を行った。
制限酵素処理済みＰＣＲ産物は再度、０．８％アガロースゲル電気泳動により制限酵素分解産物と分離し、ゲルから目的のバンドを切り出し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）により精製した。
ＣｉｐＡ遺伝子を大腸菌において発現させるため、ｐＥＴ２２ｂ発現ベクター（メルク社製）も使用した。本ベクターは発現させたい目的の蛋白質のＮ末端側に６残基のヒスチジンタグが融合されるような設計になっている。ＣｅｌＳを大腸菌において発現させる場合には、ｐＥＴ１９ｂ（メルク社製）発現ベクターを使用した。この場合、ＳａｃＩ及びＢｐｕ１１０２を用い、３７℃で一晩制限酵素処理を行った。制限酵素処理後、制限酵素切断サイトの脱リン酸を行うため、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を５０℃で１時間処理を行った。フェノール・クロロフォルム抽出を繰り返し、アルカリフォスファターゼを失活させた後、エタノール沈殿処理を行い、制限酵素処理済みｐＥＴ１９ｂ発現ベクターを回収した。
ＣｉｐＡ発現ベクター、ｍＣｉｐＡ発現ベクター、ＣｅｌＡ発現ベクター、ＣｅｌＳ発現ベクターを構築するため、上記制限酵素処理済みｐＥＴ２２ｂ及びｐＥＴ１９ｂ発現ベクターは、Ｔ４ライゲース（タカラバイオ社製）により、１６℃で一晩インキュベートを行い、それぞれの断片を連結させた。
次に、上記発現ベクターＣｉｐＡ−ｐＥＴ２２ｂ、ｍＣｉｐＡ−ｐＥＴ２２ｂ、ＣｅｌＡ−ｐＥＴ２２ｂ及びＣｅｌＳ−ｐＥＴ１９ｂは、それぞれ大腸菌ＪＭ１０９へ一度形質転換を行い、５０μｇ／ｍＬアンピシリンナトリウムと１．５％寒天を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地と呼ぶ。）により３７℃で一晩培養を行った。
次に、上記発現ベクターＣｉｐＡ−ｐＥＴ２２ｂ、ｍＣｉｐＡ−ｐＥＴ２２ｂ、ＣｅｌＡ−ｐＥＴ２２ｂ及びＣｅｌＳ−ｐＥＴ１９ｂは、それぞれ大腸菌ＪＭ１０９へ一度形質転換を行い、５０μｇ／ｍＬアンピシリンナトリウムと１．５％寒天を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地と呼ぶ。）により３７℃で一晩培養を行った。
ＬＢ培地の組成を以下に示す。
バクトペプトン１ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ
イーストエキストラクト１ｇ／Ｌ
最終的な培地のｐＨは７．０前後に調製された。
バクトペプトン１ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ
イーストエキストラクト１ｇ／Ｌ
最終的な培地のｐＨは７．０前後に調製された。
生育してきたコロニーから目的の遺伝子断片を有するクローンを選択した。選択には、大腸菌クローンからプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてそれぞれ発現ベクターを抽出した。発現ベクターの抽出後、上記プライマーによりＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１(アプライドバイオシステムズ社)、ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）または、ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によりＤＮＡ配列を読み取った。
読み取った遺伝子配列が正確かどうかを確認するため、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＢＩＣ）のホームページを通じ、得られたＤＮＡ配列データを用いて、ホモロジー検索を行って正確性を確かめた。正確な遺伝子配列を有する発現ベクターは、それぞれの蛋白質を多量発現させるため、再度大腸菌ＢＬ２１（メルク社製）へ形質転換し蛋白質多量発現大腸菌クローンを得た。
ＣｉｐＡ、ｍＣｉｐＡ、ＣｅｌＡ、ＣｅｌＳを得るため、それぞれの発現ベクターを持つ大腸菌ＢＬ２１をアンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地で３７℃、４時間培養を行った。培養の後、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を１ｍＭの濃度を加え、さらに１２時間培養を行った。
各大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は遠心分離（８０００回転、４℃、１０分）により菌体を回収した。回収した菌体は一度−８０℃で一晩凍結し、溶菌緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、３００ｍＭ塩化ナトリウム，１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に懸濁したのち、氷中において超音波破砕機により破砕した。得られた溶菌混濁液を遠心分離し、透明な溶菌液と沈殿している未破砕菌体とを分離後、溶菌液のみを回収し０．４５μｍフィルターを用いて濾過を行った。
その溶菌液はニッケルアガロースゲルカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル；キアゲン社製）を通して、ヒスタグ融合蛋白質を得た。さらに溶出を行った組換え蛋白質は脱塩カラム（バイオラッド社製）に通して精製した。各タンパク量測定は、必要に応じて蒸留水で希釈後、ＢＣＡ・タンパク測定キット（サーモサイエンティフィック社製）により測定を行った。蛋白質の検量線はウシ血清アルブミンを使用し作成した。
ＣｉｐＡの遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号９及び１０にそれぞれ示す。
クロストリジウム・サーモセラムのＣｉｐＡの部分構造体であるｍＣｉｐＡ遺伝子配列の遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号１１及び１２にそれぞれ示す。
クロストリジウム・サーモセラムのＣｉｐＡが有する代表的コヘシンドメイン２１の遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号１３、１４にそれぞれ示す。
クロストリジウム・サーモセラムのセルロース結合ドメイン２２（ＣＢＭ）のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列及びクロストリジウム・サーモセラムのセルロース結合ドメイン２２（ＣＢＭ）遺伝子の配列を、配列番号１５、１６にそれぞれ示す。
ＣｅｌＡの遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号１８、１９にそれぞれ示す。
ＣｅｌＳの遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号２０、２１にそれぞれ示す。
ＣｅｌＡのドッケリンドメイン３１の遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号２１、２２にそれぞれ示す。
ＣｅｌＳのドッケリンドメイン３１の遺伝子配列及びアミノ酸配列を、配列番号２３、２４にそれぞれ示す。
図１は、上記アミノ酸配列をもとにした蛋白質ドメイン構造を模式的に示したものである。観察は古寺等が開発したハイスピード原子間力顕微鏡を用いて行った（非特許文献２参照）
ハイスピード原子間力顕微鏡による観察はＢＬ−ＡＣ１０ＥＧＳ−Ａ２スモールカンチレバー（オリンパス社製）によりナノライブバージョン（オリンパス社製）を用いて行った。
台座となるグラファイトは気相成長黒鉛（Highly oriented pyrolytic graphite：ＨＯＰＧと呼ぶ。）を用いた。０．１ｍｍ以下の厚さを持ったＨＯＰＧは円柱状のグラスステージ（高さ２ｍｍ、直径１．５ｍｍ）へ貼り付け、スコッチテープを押し当ててＨＯＰＧ表面のフラットさを確保した。
高度に精製したＣｉｐＡ、ｍＣｉｐＡ、ＣｅｌＡ、ＣｅｌＳの各蛋白質は上記ハイスピード原子間力顕微鏡に使用するためそれぞれ０．２μＭ〜２０μＭに５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）により調製した。
上記ＣｉｐＡやｍＣｉｐＡは、それぞれＨＯＰＧ上に約２μＭを加えて、１秒間に１〜４フレームの高速原子間力顕微鏡像を撮影した。高速原子間力顕微鏡像の解析はＩＧＯＲ ｐｒｏ（WaveMetrics社製）を用いて行った。高速原子間力顕微鏡中のノイズスパイクを減らすために、すべての高速原子間力顕微鏡像は２×２ピクセルアベレージングフィルターで処理を行った。
図５は、骨格蛋白質２０であるＣｉｐＡをＨＯＰＧサンプルディスクへ整列させた場合の高速原子間力顕微鏡像を示す図である。この図に示すように、ＣｉｐＡは、ＨＯＰＧディスクの炭素六角格子に沿い、整列することが明らかとなった。
ＣｉｐＡの一部のドメインだけでも同じように整列するかどうかを確認するために、ｍＣｉｐＡもＣｉｐＡと同様にＨＯＰＧサンプルディスクへ加えた。
図６は、ｍＣｉｐＡをＨＯＰＧサンプルディスクへ整列させた場合の高速原子間力顕微鏡像を示す図である。この図に示すように、ｍＣｉｐＡは、図５に示すＣｉｐＡと同様に、ＨＯＰＧディスクの炭素六角格子に沿い、整列することが明らかとなった。
図６は、ｍＣｉｐＡをＨＯＰＧサンプルディスクへ整列させた場合の高速原子間力顕微鏡像を示す図である。この図に示すように、ｍＣｉｐＡは、図５に示すＣｉｐＡと同様に、ＨＯＰＧディスクの炭素六角格子に沿い、整列することが明らかとなった。
（骨格蛋白質と機能性蛋白質との結合）
通常、蛋白質は非特異的吸着を起こした場合、構造的変化が起こり蛋白質としての機能を失う。ＣｉｐＡがＨＯＰＧに非特異的に吸着した場合、骨格蛋白質２０としての機能を失うことが予想される。セルロソームの酵素サブユニットがＨＯＰＧ上に整列したＣｉｐＡに結合し自己組織化できるかどうかを確認するため、二つの酵素サブユニットＣｅｌＡ及びＣｅｌＳを作成し結合実験を行った。
通常、蛋白質は非特異的吸着を起こした場合、構造的変化が起こり蛋白質としての機能を失う。ＣｉｐＡがＨＯＰＧに非特異的に吸着した場合、骨格蛋白質２０としての機能を失うことが予想される。セルロソームの酵素サブユニットがＨＯＰＧ上に整列したＣｉｐＡに結合し自己組織化できるかどうかを確認するため、二つの酵素サブユニットＣｅｌＡ及びＣｅｌＳを作成し結合実験を行った。
先に示したｍＣｉｐＡが整列したＨＯＰＧサンプルディスク上に、先と同様にＣｅｌＡ及びＣｅｌＳを２μＬを加えて、一秒間に1〜４フレームの高速原子間力顕微鏡像を撮影した。高速原子間力顕微鏡像の解析は、上記同様にＩＧＯＲｐｒｏ（WaveMetrics社製）を用いて行った。
図７は、骨格蛋白質２０とＣｅｌＡとの結合を示す図であり、（ａ）は結合の模式図、（ｂ）は高速原子間力顕微鏡像を示す図である。
図８は、骨格蛋白質２０とＣｅｌＳとの結合を示す図であり、（ａ）は結合の模式図、（ｂ）は高速原子間力顕微鏡像を示す図である。
図７及び８の高速原子間力顕微鏡像において黄色く光っているのが、それぞれＣｅｌＡ及びＣｅｌＳ酵素蛋白質であり、ＨＯＰＧサンプルディスク上に規則的に配置された部分骨格蛋白質２０ＡであるｍＣｉｐＡに相互作用していることが示された。
図８は、骨格蛋白質２０とＣｅｌＳとの結合を示す図であり、（ａ）は結合の模式図、（ｂ）は高速原子間力顕微鏡像を示す図である。
図７及び８の高速原子間力顕微鏡像において黄色く光っているのが、それぞれＣｅｌＡ及びＣｅｌＳ酵素蛋白質であり、ＨＯＰＧサンプルディスク上に規則的に配置された部分骨格蛋白質２０ＡであるｍＣｉｐＡに相互作用していることが示された。
上記図７及び８の結果において、ＣｉｐＡの骨格蛋白質２０は、非特異的吸着を起こしているのではなく、構造を維持したまま規則的に整列していることを示しており、蛋白質としての機能を失わず、骨格蛋白質２０のコヘシンドメイン２１と蛋白質の有するドッケリンドメイン３１で相互作用しており、セルロソーム的構造を自己組織化していることが判明した。
従って、上記方法を用いることで、酵素はもちろんのこと、抗体やドッケリンを含む機能性蛋白質３２など好みの蛋白質を基材１０の表面上に機能を維持したまま整列させることができる。
従って、上記方法を用いることで、酵素はもちろんのこと、抗体やドッケリンを含む機能性蛋白質３２など好みの蛋白質を基材１０の表面上に機能を維持したまま整列させることができる。
本発明は、上記実施例に限定されることなく、特許請求の範囲に記載した発明の範囲内で種々の変形が可能であり、それらも本発明の範囲内に含まれることはいうまでもない。
１、１Ａ：複合体
１０、１０Ａ：基材
２０：骨格蛋白質
２０Ａ:部分骨格蛋白質
２１：コヘシンドメイン
２２：セルロース結合ドメイン
２３：異なる微生物種のコヘシンドメイン
３０：機能性蛋白質
３１：ドッケリンドメイン
３２：ドッケリンを含む機能性蛋白質
４０：異なる微生物種の機能性蛋白質
４１：異なる微生物種のドッケリンドメイン
４２：異なる微生物種のドッケリンを含む機能性蛋白質ＣｅｌＡ：エンド型セルラーゼ
ＣｅｌＳ：エキソ型セルラーゼ
１０、１０Ａ：基材
２０：骨格蛋白質
２０Ａ:部分骨格蛋白質
２１：コヘシンドメイン
２２：セルロース結合ドメイン
２３：異なる微生物種のコヘシンドメイン
３０：機能性蛋白質
３１：ドッケリンドメイン
３２：ドッケリンを含む機能性蛋白質
４０：異なる微生物種の機能性蛋白質
４１：異なる微生物種のドッケリンドメイン
４２：異なる微生物種のドッケリンを含む機能性蛋白質ＣｅｌＡ：エンド型セルラーゼ
ＣｅｌＳ：エキソ型セルラーゼ
ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７（クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株）
Claims (12)
- セルロース結合ドメインとコヘシンドメインとを有する骨格蛋白質を、前記セルロース結合ドメインを介して炭素からなる基材上に整列する、蛋白質の整列方法。
- セルロース結合ドメインとコヘシンドメインとを有する骨格蛋白質を、前記セルロース結合ドメインを介して炭素からなる基材上に整列した後、
ドッケリンドメインを有する機能性蛋白質の該ドッケリンドメインを前記コヘシンドメインに結合する、蛋白質の整列方法。 - 前記セルロース結合ドメインがセルロソーム由来である、請求項１又は２に記載の蛋白質の整列方法。
- 前記ドッケリンドメイン及びコヘシンドメインがクロストリジウム・サーモセラム由来である、請求項２に記載の蛋白質の整列方法。
- 前記ドッケリンドメイン及びコヘシンドメインが異なる微生物種由来であって、微生物種特異的コヘシン・ドッケンリン相互作用を有するものである、請求項２に記載の蛋白質の整列方法。
- 前記炭素からなる基材がグラファイトである、請求項１〜５の何れかに記載の蛋白質の整列方法。
- 炭素からなる基材と、
セルロース結合ドメイン及びコヘシンドメインからなる骨格蛋白質と、
を備え、
前記骨格蛋白質が、前記セルロース結合ドメインを介して前記基材上に整列されている、
複合基板。 - 前記セルロース結合ドメインがセルロソーム由来である、請求項７に記載の複合基板。
- 前記コヘシンドメインにドッケリンドメインを有する機能性蛋白質が結合した、請求項７に記載の複合基板。
- 前記ドッケリンドメイン及びコヘシンドメインがクロストリジウム・サーモセラム由来である、請求項９に記載の複合基板。
- 前記ドッケリンドメイン及びコヘシンドメインが異なる微生物種由来であって、微生物種特異的コヘシン・ドッケンリン相互作用を有するものである、請求項９に記載の複合基板。
- 前記炭素からなる基材がグラファイトである、請求項７〜１１の何れかに記載の複合基板。
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