JP2008105973A - ポリペプチド固定化担体の保存方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ポリペプチドが固定化された担体の保存において、固定化されたポリペプチドの量の低減を防止し、またその機能を失活させることなく保存する手段を提供する。
【解決手段】ポリペプチドが固定化された担体の保存方法であって、該ポリペプチドが固定化された担体を凍結乾燥することを含む、前記方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ポリペプチド固定化担体を保存する方法および保存に適したポリペプチド固定化担体に関する。

ヒトゲノム計画の終了に伴い、生物、医学の研究は遺伝子解読からタンパク質解析、即ちプロテオミクスという新たなステップへと踏み出した。遺伝子は、タンパク質を生成するための単なるプログラムコードでしかなく、ほとんど全ての生体活動はそれらのコードをもとに生成された、非常に複雑な構造を持つタンパク質の分子間で行なわれている。ある種のタンパク質が正常に機能しない場合、健康に支障をきたすことが知られている。それゆえに、個々のタンパク質の機能を解明することは、医学の更なる進歩に欠かすことのできないステップであると言える。

従来は、タンパク質の性質、発現状態、構造、活性などの分析には、抽出したタンパク質の混合物を分子量や等電点の違いにより分離し、解析する２次元電気泳動法（２−Ｄ ＰＡＧＥ）が使用されてきた。しかし、２次元電気泳動法は、ハイスループット解析に不向きで、検出感度、およびサンプルの可溶化の面でも問題があった。

一方、今日までに数々のＤＮＡチップが報告されている。それらのＤＮＡチップは、ある表現型や生理状態での遺伝子発現の変化の確認や、発現パターンのデータベースを作ることに有用であった。しかし通常、遺伝子とタンパク質の発現量やパターンは必ずしも正確に相関しないため、ＤＮＡチップはタンパク質の発現レベルの定量化には使用することができない。またタンパク質は翻訳後に、リン酸化、糖鎖付加、切断などの、さまざまな修飾を受けることによってその機能が変化するため、それらの翻訳後修飾の情報をＤＮＡ解析からは得ることができない。

そこでＤＮＡアレイ技術を、タンパク質解析のツールとして用いたものとしてプロテインチップが開発された。プロテインチップの原理はＤＮＡチップと同じで、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用するタンパク質や核酸などを検出するものである。しかし、強固なＤＮＡ鎖に対し、巧みにアミノ酸が絡み合ってできている非常に不安定な構造をもつタンパク質を基板上に固定化させることは容易ではない上、多くの場合、タンパク質の反応性は３次元の折りたたみ構造の変化によって変わるため、タンパク質を取り巻く僅かな環境の変化がタンパク質を変性させることもあり、目的のタンパク質を機能が保持された状態で解析することは困難であった。

また、従来開発されたプロテインチップは、スライドガラスまたはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にタンパク質を固定化するものであるが、スライドガラスまたはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してタンパク質を固定化する方法では、タンパク質の固定化状態が不安定であり、洗浄工程において剥離するといった問題が生じるとともに、固定化されたタンパク質を長期間保存することも不可能であった。

一方、核酸分子を強固かつ高密度に固定化することができる担体として、特許文献１には、基板上にダイヤモンドライクカーボン層を有し、その表面にマレイミド基を共有結合させた担体が記載されている。しかし、該担体にタンパク質を固定化することや、タンパク質を固定化した場合の保存性については記載されていない。

本発明の課題は、ポリペプチドが固定化された担体の保存において、固定化されたポリペプチドの量の低減を防止し、またその機能を失活させることなく保存する手段を提供することである。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、ポリペプチドを固定化した担体を凍結乾燥処理に付すことにより、あるいは、ポリペプチドを固定化した担体を洗浄後、遠心乾燥し、真空パックすることにより、ポリペプチドの固定化量の低減を防止し、またその機能を失活させることなく長期間にわたり保存できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ポリペプチドが固定化された担体の保存方法であって、該ポリペプチドが固定化された担体を凍結乾燥することを含む、前記方法。
（２）凍結乾燥する前に、ポリペプチドが固定化された担体を洗浄することをさらに含む、（１）記載の方法。
（３）凍結乾燥した後に、ポリペプチドが固定化された担体を真空パックすることをさらに含む、（１）または（２）記載の方法。
（４）ポリペプチドが固定化された担体の保存方法であって、該ポリペプチドが固定化された担体を洗浄後、遠心乾燥し、真空パックすることを含む、前記方法。
（５）担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層にマレイミド基が共有結合したものである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）担体が、表面にダイヤモンドライクカーボン層を有し、該層上に式I：

［式中、ｎは１〜１２の整数である］
で表される基が共有結合したものである、（５）記載の方法。
（７）担体上にポリペプチドを固定化し、これを凍結乾燥してなるポリペプチド固定化担体。
（８）担体上にポリペプチドを固定化し、洗浄後、これを凍結乾燥してなるポリペプチド固定化担体。
（９）担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層にマレイミド基が共有結合したものである、（７）または（８）記載のポリペプチド固定化担体。
（１０）担体が、表面にダイヤモンドライクカーボン層を有し、該層上に式I：

［式中、ｎは１〜１２の整数である］
で表される基が共有結合したものである、（９）記載のポリペプチド固定化担体。
（１１）（７）〜（１０）のいずれかに記載のポリペプチド固定化担体を真空パックしてなる、ポリペプチド固定化担体。

本発明においてポリペプチドは、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質を包含し、単純タンパク質、複合タンパク質でもよく、天然のものでも合成のものでもよい。ポリペプチドの長さは特に限定されないが、本発明は、アミノ酸数１〜１００００、好ましくは１〜１０００のポリペプチドの固定化および保存に好適である。本発明において担体に固定化される標的ポリペプチドとしては、特に限定されない。例えば、抗体、酵素、病原性タンパク、ペプチド系ホルモン、レセプター、キナーゼ、糖タンパク質、金属タンパク質、ウイルス、誘導タンパク質等のタンパク質が固定化された担体を好適に保存することができる。

本発明においてポリペプチドが固定化される担体は、特に制限されず、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カーボンファイバーに代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されず、板状、糸状、ビーズ状、多孔質状、網状、円筒状などいずれも使用できるが、好ましくは板状である。板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。

好ましくは、表面にカーボン層を有し、該カーボン層にマレイミド基が共有結合した構造を有する担体を用いる。ここでカーボン層にマレイミド基が共有結合したとは、カーボン層の炭素にマレイミド基が直接共有結合した場合だけでなく、リンカーを介して共有結合する場合も包含する。そのような担体としては、基板上にカーボン層を有し、該カーボン層にマレイミド基が共有結合した構造を有する担体が挙げられる。ここで、基板は特に制限されず、例えば、上記の材料からなる基板を用いることができる。好ましくはシリコン材料、さらに好ましくは単結晶シリコンからなる基板を用いる。

基板上に形成させるカーボン層としては、特に限定されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロムまたは炭化バナジウム等を挙げることができる。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾やポリペプチドの結合における反応に耐えることができる点、およびＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点において有利である。本発明においては、カーボン層としてダイヤモンドライクカーボン層を有する担体を用いるが好ましい。ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）は、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。

本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Chemical Vapor Deposit）法、ＥＣＲＣＶＤ（Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit）法、ＩＣＰ（Inductively Coupled Plasma）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Electric Cyclotron Resonance）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Electron Beam）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。

高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成しても良い。

アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。

レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧ（Yttrium aluminum garnet）レーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。

本発明において好ましくは使用される表面にカーボン層を有する担体としては、前記のように基板上にカーボン層を形成した構造だけでなく、ダイヤモンドライクカーボンと基板材料との積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドライクカーボンと他の物質との複合体、（例えば２相体））であってもよい。

カーボン層にアミノ基を導入し、該アミノ基にマレイミド基導入試薬を反応させることにより、カーボン層にマレイミド基を共有結合させることができる。

カーボン層へのアミノ基の導入は、カーボン層に塩素ガス中で紫外線を照射することにより表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。あるいはカーボン層を有する担体を、アンモニア雰囲気下でプラズマ法に付すことにより実施できる。ここで、プラズマ法とは、真空条件下、直流あるいは交流による放電にプラズマを発生させ、原料ガスとして例えばベンゼンやメタンを用い、イオン化したガスでバイアスを印加した基板を処理する方法である。

このように形成させたアミノ基と、以下の式II：

で表されるマレイミド基導入試薬またはその塩を反応させることにより、式I：

で表されるような化学修飾基をカーボン層上に形成することができる。

式IまたはIIにおいて、ｎは１〜１２、好ましくは４〜６の整数、より好ましくは５である。式IIで表されるマレイミド基導入試薬の塩としては特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を使用できる。ナトリウム塩を使用するのが好ましい。

具体的には、カーボン層にアミノ基が導入された担体を、バッファー中に通常０．１〜１００ｍＭの濃度で式IIのマレイミド基導入試薬を含む溶液に浸漬することにより反応させる。バッファーとしては、ＰＢＳ、トリエタノールアミンバッファー、ホウ酸ナトリウムバッファー等を使用することができる。ＰＢＳ（ｐＨ６〜９）を使用するのが好ましい。反応温度は、通常１０〜８０℃、好ましくは２５〜３０℃、反応時間は、通常１〜３００分、好ましくは３０〜６０分である。

上記のマレイミド基を有する化学修飾基は、共有結合によってカーボン層中の炭素と強固に結合しているため、洗浄や温度変化によっても剥離することがなく、またポリペプチド固定化担体の長期間の保存にも適している。また、マレイミド基はポリペプチド中のＳＨ基との反応性が高いため、ポリペプチドを効果的に結合することができる。

ポリペプチドの担体への固定化は、目的とするポリペプチドをスポッティグ用バッファーに溶解し、担体上にスポッティングすることにより実施できる。ポリペプチドを、濃度が通常０．１〜５００μＭ、好ましくは５〜１０μＭとなるようにスポッティング用バッファーに溶解し、スポッティング用溶液を調製する。スポッティング用バッファーとしては、１〜５０％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、５０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、３×ＳＳＣ（saline sodium citrate）、純水等を使用することができる。本発明においては、ＰＢＳを使用するのが好ましい。マレイミド基は加水分解されやすく、ｐＨ７付近で反応効率が最も良い。

調製したスポッティング用溶液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることができる。このとき、多種類のポリペプチドを互いに独立したスポットとしてアレイ状に配列することにより、この複数種のポリペプチドと標的分子とがそれぞれ相互作用するか否かを同時に検出することができる。

ポリペプチド溶液をスポッティング後、ポリペプチドが担体に固定化する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常１０〜８０℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で、通常０．５〜１０時間、好ましくは１〜２時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度５０〜９０％の条件で行うのが望ましい。

一実施形態においては、ポリペプチドを担体に固定化後、該担体を凍結乾燥処理に付す。凍結乾燥は、通常４．６ｔｏｒｒ以下、好ましくは１ｔｏｒｒ以下で、０．５〜１５時間、好ましくは１〜１０時間にわたって実施する。凍結乾燥においては、−１００℃〜−７０℃にて凍結後（例えば液体窒素中で凍結後）、凍結乾燥を行うのが好ましい。ポリペプチドが固定化された担体を、ＰＢＳ等の水溶液に浸漬したまま、凍結処理および凍結乾燥処理を行うこともできる。

好ましくは、ポリペプチドを担体に固定化後、凍結乾燥を行う前に、担体を洗浄する。洗浄液としては、特に制限されないが、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、３×ＳＳＣ（saline sodium citrate）、純水、ＴＢＳ（Tris Buffered Saline）、ならびにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）やＴｗｅｅｎなどの界面活性剤を含む緩衝液等を使用することができる。本発明においては、ＰＢＳおよび界面活性剤を含むＴＢＳ、特にＴｗｅｅｎを含むＴＢＳを使用するのが好ましい。洗浄は、単独の洗浄液で実施してもよいし、複数種の洗浄液で実施してもよい。洗浄は、常温で、通常１〜６０分、好ましくは５〜３０分程度行う。本明細書案において、常温とは、２０℃〜３０℃、好ましくは約２５℃の温度をさす。このような洗浄処理により、ポリペプチドの固定化量の低減を防止できるとともに、担体に固定化されたポリペプチドの機能の損失を効果的に防止することができる。

また、好ましくは凍結乾燥に付したポリペプチド固定化担体を、１枚ずつ真空パック用袋に入れ、真空パックする。真空パック用袋の材料としては、水および酸素を通さないものであれば、特に制限はなく、例えばポリエチレン、ポリエステル等の単層フィルム、ポリエチレンとポリエステルのラミネートフィルムあるいはこれらの樹脂にアルミニウムなどの金属を蒸着したものが挙げられる。

また、真空パック用袋に用いるフィルムの厚みも特に限定されず、内容物の重量等に応じて適宜の機械的強度のものを用いることができるが、通常２０〜３００μｍの厚さのものが好適である。２０μｍ未満の場合、機械的強度が不足する傾向があるからであり、また３００μｍを超えると、取扱性が劣るからである。

真空パック用袋の形態としては、真空パック用袋を構成するフィルムが２枚重なっていて、その３辺がラミネートされており、なおかつ内容物を個別入れるための仕切りが入っているような構造が好ましい。

また、真空パック時の温度は、好ましくは１５〜１００℃、更に好ましくは２５〜５０℃である。真空パック時の圧力は、好ましくは１〜１×１０^−８ｔｏｒｒ、更に好ましくは１×１０^−１〜１×１０^−４ｔｏｒｒである。

真空パック前に、真空引き後、不活性ガスで圧戻しして再度真空引きする操作を少なくとも１回行うことが好ましい。ここで用いる不活性ガスとしては、例えば窒素ガス、アルゴンガス、ネオンガスまたはこれらの混合物が挙げられる。

前記担体は、直接、真空パック用袋中に空間容積が極力少なくなるように封止することが好ましい。

凍結乾燥後のポリペプチド固定化担体を真空パックすることにより、ポリペプチドの固定化量の低減を防止できるとともに、担体に固定化したポリペプチドの機能の損失をさらに効果的に防止することができる。

本発明の保存方法において、ポリペプチド固定化担体を常温にて遮光下で保存するのが好ましい。

本発明により保存されたポリペプチド固定化担体を相互作用の検出等に使用する場合は、凍結乾燥状態の担体をそのまま使用してもよいし、ＰＢＳや純粋等の水溶液に浸漬した後で使用してもよい。

本発明はまた、ポリペプチドが固定化された担体の保存方法であって、該ポリペプチドが固定化された担体を洗浄後、遠心乾燥し、真空パックすることを含む、前記方法に関する。この実施形態において、凍結乾燥のかわりに遠心乾燥を実施すること以外の条件、すなわちポリペプチド、担体および真空パックについても、その他の条件についても、上記実施形態と同様である。ポリペプチド固定化担体の洗浄、遠心乾燥および真空パックを組み合わせることにより、ポリペプチドの固定化量の低減を防止できるとともに、担体に固定化したポリペプチドの機能の損失をさらに効果的に防止することができる。

本発明により保存されたポリペプチド固定化担体においては、ポリペプチドの機能が保持されているため、例えば、常温の大気中で保存した場合であっても、これを用いて標的分子との相互作用を検出することができる。そのような相互作用としては、抗原と抗体またはその断片との反応、酵素と基質または阻害剤の結合反応、リガンドとレセプターの結合反応、アビジンとビオチンの結合反応、核酸と転写因子の結合反応、細胞接着因子の結合反応、糖鎖とタンパク質の結合反応、脂肪鎖とタンパク質の結合反応、リン酸基とタンパク質の結合反応、補欠因子とタンパク質の結合反応などが挙げられる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ カーボン層上にマレイミド基を有する担体の作製
３ｍｍ角に切断したシリコン基板上に、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、イオン化蒸着法によって、加速電圧０．５ｋＶでダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層を１００ｎｍの厚みに形成した。その後、アンモニアガス雰囲気でプラズマ法により１０分間アミノ化を実施した。

以下の組成の反応液を調製し、これにアミノ化した基板を浸漬し、３０分間振盪した。その後、純水で３回洗浄し、１００℃にて３０分間真空乾燥することにより、カーボン層上にマレイミド基が共有結合した担体を作製した。

反応液組成
スルホ−ＥＭＣＳ １２．３ｍｇ
１０×ＰＢＳ ３ｍｌ
超純水 ２７ｍｌ
合計 ３０ｍｌ
スルホ−ＥＭＣＳ：Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホ−スクシンイミド，ナトリウム塩（（株）同仁化学研究所）
ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水

上記で得られた担体上に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）溶液を２μｌ滴下し、液体窒素で凍結した。次に、真空中にて常温で２時間凍結乾燥を行った。担体を遮光下、常温にて大気中で３日間保存した。その後、凍結乾燥したＧＦＰスポット２点に純水を滴下し、１時間常温にて保持し、蛍光顕微鏡にてＵＶ光励起による蛍光画像を観察した。結果を図１に示す。

ＧＦＰを凍結乾燥するとスポンジ状になったが、凍結乾燥後のＧＦＰは乾燥したままでも蛍光を示した。また、凍結乾燥後のＧＦＰは純水を滴下してもスポンジ構造が変化しなかった。

比較例１
実施例１で作製した担体上にＧＦＰ溶液を２μｌ滴下し、自然乾燥させた。その後、自然乾燥したＧＦＰスポット２点に純水を滴下し、１時間常温にて保持し、蛍光顕微鏡にてＵＶ光励起による蛍光画像を観察した。結果を図２に示す。

実施例１と比較例１の結果から、担体上に固定化したタンパク質を凍結乾燥処理に付すことにより、常温の大気中で保存した場合であっても、タンパク質の高次構造が保持され、その機能も保持されることが示された。

実施例２
ＧＦＰを１０％ＰＥＧ／ＰＢＳに１０μｇ／ｌになるように希釈した。希釈したＧＦＰ溶液を０．５μｌずつ、実施例１で作製した担体上にスポットし、−８０℃で凍結した後、１０時間にわたり凍結乾燥した。凍結乾燥後に担体を遮光下、常温にて大気中で３日間保存した。

その後、５０ｍＭ ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間洗浄し、ＰＢＳで１５分間洗浄した。更に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）溶液中で常温で１時間振盪することにより、ブロッキングを行った。

こうして得られた担体を、１／１００００に希釈した１次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（２回繰り返す）。その後、１／１００００に希釈した２次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（３回繰り返す）。本実施例ならびに以下の実施例および比較例において、１次抗体および２次抗体としては、以下のものを用いた。
１次抗体：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ ＧＦＰ−２０（ＳＩＧＭＡ）
２次抗体：Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆｃ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｉｎ Ｇｏａｔ（ＳＩＧＭＡ）

続いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて化学発光させ、富士写真フイルム製ＬＡＳ−１０００を用いて化学発光を観察した。結果を図３に示す。

比較例２
ＧＦＰを１０％ＰＥＧ／ＰＢＳに１０μｇ／ｌになるように希釈した。希釈したＧＦＰ溶液を０．５μｌずつ、実施例１で作製した担体上にスポットし、遮光下、常温にて大気中で３日間保存した。

その後、５０ｍＭ ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間洗浄し、ＰＢＳで１５分間洗浄した。更に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）溶液中で常温で１時間振盪することにより、ブロッキングを行った。

こうして得られた担体を、１／１００００に希釈した１次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（２回繰り返す）。その後、１／１００００に希釈した２次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（３回繰り返す）。続いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて化学発光させ、富士写真フイルム製ＬＡＳ−１０００を用いて化学発光を観察した。結果を図４に示す。

実施例２と比較例２の結果から、担体上に固定化したタンパク質を凍結乾燥処理に付すことにより、常温の大気中で保存した場合であっても、タンパク質の固定化量の低減を防止でき、またタンパク質の機能が保持されることが示された。

実施例３
ＧＦＰを５０％ＰＥＧ／ＰＢＳに１０μｇ／ｌになるように希釈した。希釈したＧＦＰ溶液を０．５μｌずつ、実施例１で作製した担体上にスポットした。スポット後、５０ｍＭ ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間洗浄し、ＰＢＳで１５分間洗浄した。得られた担体を新たにＰＢＳに浸積したまま、−８０℃にて１時間凍結し、さらに凍結乾燥（真空度 １ｔｏｒｒ以下）を行った。凍結乾燥した担体を大気中に取り出し、遮光下、大気中で３日間、常温で保存した。保存後、担体を取り出し、ＰＢＳに浸積した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）溶液中で常温で１時間振盪することにより、ブロッキングを行った。

こうして得られた担体を、１／１００００に希釈した１次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（２回繰り返す）。その後、１／１００００に希釈した２次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（３回繰り返す）。続いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて化学発光させ、富士写真フイルム製ＬＡＳ−１０００を用いて化学発光を観察した。結果を図５に示す。

実施例３の結果から、タンパク質を担体に固定化して洗浄し、これを凍結乾燥処理に付すことにより、タンパク質の保存において、タンパク質の固定化量の低減を防止でき、その機能を効果的に維持できることが示された。

比較例３
ＧＦＰを５０％ＰＥＧ／ＰＢＳに１０μｇ／ｌになるように希釈した。希釈したＧＦＰ溶液を０．５μｌずつ、実施例１で作製した担体上にスポットした。スポット後、５０ｍＭ ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間洗浄し、ＰＢＳで１５分間洗浄した。遠心乾燥した後、遮光下、常温にて大気中で３日間保存した。

保存後、担体を取り出し、ＰＢＳに浸積した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）溶液中で常温で１時間振盪することにより、ブロッキングを行った。

こうして得られた担体を、１／１００００に希釈した１次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（２回繰り返す）。その後、１／１００００に希釈した２次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（３回繰り返す）。続いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて化学発光させ、富士写真フイルム製ＬＡＳ−１０００を用いて化学発光を観察した。結果を図６に示す。

実施例４
ＧＦＰを５０％ＰＥＧ／ＰＢＳに１０μｇ／ｌになるように希釈した。希釈したＧＦＰ溶液を０．５μｌずつ、実施例１で作製した担体上にスポットした。スポット後、５０ｍＭ ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間洗浄し、ＰＢＳで１５分間洗浄した。得られた担体を新たなＰＢＳに浸積したまま、−８０℃にて１時間凍結した後凍結乾燥（真空度 １ｔｏｒｒ以下）を行った。凍結乾燥した担体を大気中に取り出し、真空パックし、２週間、常温で保存した。保存後、担体を真空パックから取り出し、ＰＢＳに浸漬した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）溶液中で常温で１時間振盪することにより、ブロッキングを行った。

こうして得られた担体を、１／１００００に希釈した１次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（２回繰り返す）。その後、１／１００００に希釈した２次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（３回繰り返す）。続いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて化学発光させ、富士写真フイルム製ＬＡＳ−１０００を用いて化学発光を観察した。結果を図７に示す。

実施例４の結果から、タンパク質を担体に固定化して洗浄し、これを凍結乾燥処理に付した後、真空パックすることにより、タンパク質の保存において、タンパク質の固定化量の低減を防止でき、その機能をさらに効果的に維持できることが示された。

実施例５
ＧＦＰを５０％ＰＥＧ／ＰＢＳに１０μｇ／ｌになるように希釈した。希釈したＧＦＰ溶液を０．５μｌずつ、実施例１で作製した担体上にスポットした。スポット後、５０ｍＭ ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間洗浄し、ＰＢＳで１５分間洗浄した。得られた担体を遠心乾燥した（１０００ｒｐｍ １分間）。遠心乾燥後、真空パックし、２週間、常温で保存した。保存後、担体を真空パックから取り出し、ＰＢＳに浸積した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）溶液中で常温で１時間振盪することにより、ブロッキングを行った。

こうして得られた担体を、１／１００００に希釈した１次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（２回繰り返す）。その後、１／１００００に希釈した２次抗体（上記Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇａｎｔで希釈）と常温で反応させ、ＰＢＳで１０分間洗浄を行った（３回繰り返す）。続いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて化学発光させ、富士写真フイルム製ＬＡＳ−１０００を用いて化学発光を観察した。結果を図８に示す。

実施例５の結果から、タンパク質を担体に固定化して洗浄し、これを遠心乾燥処理に付した後、真空パックすることにより、タンパク質の保存において、タンパク質の固定化量の低減を防止でき、その機能を維持できることが示された。

ＧＦＰを固定化した担体を凍結乾燥したものを蛍光顕微鏡で観察した結果(a)、およびＧＦＰを固定化した担体を凍結乾燥後、純粋を滴下したものを蛍光顕微鏡で観察した結果(b)を示す。 ＧＦＰを固定化した担体を自然乾燥したものを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 ＧＦＰを固定化した担体を凍結乾燥して保存した後、特異的抗体と相互作用させたものを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 ＧＦＰを固定化した担体を保存した後、特異的抗体と相互作用させたものを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 ＧＦＰを固定化した担体を洗浄後凍結乾燥して保存した後、特異的抗体と相互作用させたものを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 ＧＦＰを固定化した担体を洗浄後遠心乾燥して保存した後、特異的抗体と相互作用させたものを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 ＧＦＰを固定化した担体を洗浄後凍結乾燥し、真空パックして保存した後、特異的抗体と相互作用させたものを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 ＧＦＰを固定化した担体を洗浄後遠心乾燥し、真空パックして保存した後、特異的抗体と相互作用させたものを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。

Claims (11)

1. ポリペプチドが固定化された担体の保存方法であって、該ポリペプチドが固定化された担体を凍結乾燥することを含む、前記方法。
2. 凍結乾燥する前に、ポリペプチドが固定化された担体を洗浄することをさらに含む、請求項１記載の方法。
3. 凍結乾燥した後に、ポリペプチドが固定化された担体を真空パックすることをさらに含む、請求項１または２記載の方法。
4. ポリペプチドが固定化された担体の保存方法であって、該ポリペプチドが固定化された担体を洗浄後、遠心乾燥し、真空パックすることを含む、前記方法。
5. 担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層にマレイミド基が共有結合したものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 担体が、表面にダイヤモンドライクカーボン層を有し、該層上に式I：
   

   

   ［式中、ｎは１〜１２の整数である］
   で表される基が共有結合したものである、請求項５記載の方法。
7. 担体上にポリペプチドを固定化し、これを凍結乾燥してなるポリペプチド固定化担体。
8. 担体上にポリペプチドを固定化し、洗浄後、これを凍結乾燥してなるポリペプチド固定化担体。
9. 担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層にマレイミド基が共有結合したものである、請求項７または８記載のポリペプチド固定化担体。
10. 担体が、表面にダイヤモンドライクカーボン層を有し、該層上に式I：
    

    

    ［式中、ｎは１〜１２の整数である］
    で表される基が共有結合したものである、請求項９記載のポリペプチド固定化担体。
11. 請求項７〜１０のいずれか１項記載のポリペプチド固定化担体を真空パックしてなる、ポリペプチド固定化担体。

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