WO2005095962A1 - ポリペプチドを固定化する方法、ポリペプチドが固定化されてなる固体支持体 - Google Patents

ポリペプチドを固定化する方法、ポリペプチドが固定化されてなる固体支持体 Download PDF

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WO2005095962A1
WO2005095962A1 PCT/JP2005/006151 JP2005006151W WO2005095962A1 WO 2005095962 A1 WO2005095962 A1 WO 2005095962A1 JP 2005006151 W JP2005006151 W JP 2005006151W WO 2005095962 A1 WO2005095962 A1 WO 2005095962A1
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WO
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polypeptide
solid support
sequence
group
formula
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/006151
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English (en)
French (fr)
Inventor
Teruhisa Ichihara
Michifumi Tanga
Shuuichi Kamei
Kazuyuki Nakamura
Junko Akada
Original Assignee
Toyo Kohan Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Kohan Co., Ltd. filed Critical Toyo Kohan Co., Ltd.
Publication of WO2005095962A1 publication Critical patent/WO2005095962A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids

Definitions

  • the present invention provides a method for immobilizing a polypeptide, a solid support on which the polypeptide is immobilized, a method for detecting and purifying the polypeptide using the same, and a method for immobilizing the polypeptide.
  • a solid support For a solid support.
  • DNA chips have been reported to date! These DNA chips were useful for confirming changes in gene expression under certain phenotypes and physiological conditions, and for creating a database of expression patterns. Normally, DNA chips cannot be used to quantify protein expression levels, since gene and protein expression levels and patterns are not always exactly correlated. In addition, since the function of a protein changes after being subjected to various modifications such as phosphorylation, glycosylation, and cleavage after translation, information on the post-translational modification cannot be obtained from DNA analysis. [0005] Therefore, a protein chip was developed using the DNA array technology as a tool for protein analysis.
  • the principle of a protein chip is the same as that of a DNA chip, in which proteins are immobilized on a slide glass II membrane at high density, and proteins and nucleic acids that interact with them are detected.
  • a protein chip in which proteins are immobilized on a slide glass II membrane at high density, and proteins and nucleic acids that interact with them are detected.
  • it has been difficult to immobilize a protein with a very unstable structure, which is made up of cleverly entangled amino acids with a strong DNA strand, on a substrate.
  • conventionally developed protein chips include a polymer glass such as a polylysine applied to the surface of a slide glass or a silicon substrate, and then a protein for immobilizing proteins.
  • a polymer glass such as a polylysine applied to the surface of a slide glass or a silicon substrate
  • a protein for immobilizing proteins In a method of immobilizing a protein by applying a polymer such as the above, the immobilized state of the protein is unstable, causing problems such as peeling off in the washing step, and the immobilized protein is stored for a long time. It was impossible to do that.
  • There were also problems such as nonspecific adsorption of biological substances, inactivation of protein functions, and UV opacity of the detection system.
  • a solid support for immobilizing a polypeptide containing a protein As a support for immobilizing a polypeptide containing a protein, a solid support comprising a surface treatment layer and a chemically modified layer sequentially provided on the surface of a substrate (eg, For example, Patent Document 1), and a solid support in which a part or the whole of a substrate surface is formed of a carbon layer and a metal chelate is formed on the layer (Patent Document 2) have been developed.
  • the immobilization amount of the polypeptide on the solid support and the binding strength of the polypeptide are not necessarily sufficient, and the immobilization amount of the polypeptide is higher and the polypeptide binding strength is higher. The emergence of higher solid supports is desired.
  • Patent Document 1 JP-A-2002-365293
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-020328
  • An object of the present invention is to provide a method for firmly and specifically immobilizing a polypeptide, and a solid support for the method.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, introduced an oligocysteine sequence into a polypeptide using a solid support having a maleimide group introduced via an amino group on a substrate. As a result, it was found that the amount of immobilized polypeptide and the binding strength of the polypeptide were significantly improved, and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • R is a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 chain members
  • a method for immobilizing a polypeptide by binding a polypeptide having an oligocysteine sequence introduced thereto to a maleimide group of a solid support having a group represented by the formula:
  • R is a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 chain members
  • a polypeptide in which an oligocystine sequence is introduced is bonded to a maleimide group of a solid support having a group represented by the formula:
  • a sample polypeptide is brought into contact with the polypeptide-immobilized solid support according to any of (3) to (5) to detect an interaction between the immobilized polypeptide and the sample polypeptide. how to.
  • R is a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 chain members
  • R is a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 chain members
  • FIG. 1 shows the results of ESCA analysis of the surface of the solid support of the present invention prepared in Example 1.
  • FIG. 2 shows the structures of five types of proteins expressed in Example 2.
  • FIG. 3 shows an outline of expression vector construction in Example 2.
  • FIG. 4 shows the results of confirming EGFP expression by SDS-PAGE.
  • Fig. 5 shows the result of confirmation of fluorescence by a UV irradiation device.
  • FIG. 6 shows spotting positions of various polypeptides in Example 3.
  • FIG. 7 shows the results of immobilizing various polypeptides on a solid support having a maleimide group by spotting in Example 3.
  • FIG. 8 shows the results of Example 4 in which a solid support having a maleimide group was immersed in a solution containing various polypeptides and immobilized.
  • FIG. 9 is a diagram showing a pattern of a portion where a DLC layer was formed and an amino group and a maleimide group were introduced on a silicon substrate in Example 5.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of measurement of fluorescence in Example 5 in which a solid support was immersed in EGFP solutions of various concentrations to immobilize EGFP, and fluorescence was measured.
  • Fig. 11 is a diagram showing the results of the detection of the primary antibody and the secondary antibody reacted with chemiluminescence after immobilization of GFP in Example 5.
  • the solid support on which the polypeptide is immobilized has a structure in which a chemically modified group is bonded to the surface of the substrate.
  • Examples of the material of the substrate used in the present invention include silicon, glass, fiber, wood, paper, Lamix, plastics (eg polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), nylon, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene) Butter, phenolic resin, melamine resin, epoxy resin, and salt-and-water resin.
  • plastics eg polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), nylon, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene) Butter, phenolic resin, melamine resin, epoxy resin, and salt-and-water resin.
  • plastics eg polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), nylon, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate
  • the carbon layer formed on the substrate is not particularly limited, but may be diamond, diamond-like carbon, amorphous carbon, graphite, hafnium carbide, carbon carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, Examples of such a layer include titanium carbide, uranium carbide, tundatin carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide, and a diamond-like carbon (DLC) layer is preferred.
  • DLC diamond-like carbon
  • the carbon layer has excellent chemical stability and can withstand subsequent reactions in chemical modification and binding with the analyte.Because it is bonded to the analyte by electrostatic bonding, the bond is flexible. This is particularly advantageous in that it is transparent to the detection system UV due to lack of UV absorption and that it can be energized during electroblotting. In addition, in the binding reaction with the analyte, there is little non-specific adsorption.
  • the formation of the carbon layer can be performed by a known method.
  • examples include microwave plasma CVD (Chemical vapor deposit), ECRCVD (Electric cyclotron on resonance chemical vapor deposit), ICP (Inductive coupled plasma), DC sputtering, ECR (Electric cyclotron resonance) sputtering, and ionization evaporation.
  • the source gas (methane) is decomposed by a glow discharge generated between the electrodes due to high frequency, and a DLC (diamond-like carbon) layer is synthesized on the substrate.
  • the source gas (benzene) is decomposed and ionized using thermoelectrons generated by a tungsten filament, and a carbon layer is formed on a substrate by a bias voltage.
  • the DLC layer may be formed by an ionization vapor deposition method.
  • a direct current voltage is applied between a solid graphite material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode) to cause an arc discharge in a vacuum to generate a cathode force plasma of carbon atoms. Is generated, and by applying a more negative voltage to the substrate than the evaporation source, carbon ions in the plasma are accelerated toward the substrate to form a carbon layer.
  • a carbon layer can be formed by irradiating, for example, an Nd: YAG laser (pulse oscillation) light to a graphite target plate and fusing it, and depositing carbon atoms on a glass substrate.
  • Nd: YAG laser pulse oscillation
  • the thickness of the carbon layer is generally about a monomolecular layer to about 100 m. If the thickness is too small, the surface of the underlying solid support may be locally exposed. It is preferably 2 nm to 1 ⁇ m, more preferably 5 nm to 500 nm, because productivity is deteriorated. Note that all of the solid support may be composed of a carbon material.
  • the solid support is a laminate or composite of diamond-like carbon and a substrate material (e.g., diamond-like carbon and another substance, which can be formed only by the structure in which the carbon layer is formed on the substrate as described above).
  • a complex e.g, a two-phase body
  • a polypeptide By forming a carbon layer such as a diamond-like carbon layer on a substrate, a polypeptide can be immobilized at a high density and a high SZN ratio can be obtained, so that detection with high sensitivity becomes possible. Further, it can be used repeatedly.
  • the shape and size of the substrate are not particularly limited, and examples of the shape include a flat plate, a thread, a sphere, a polygon, and a powder.
  • the width is usually 0.1. ⁇ 100mm, length 0.1 ⁇ 100mm, thickness 0.01 ⁇ ⁇ : about LOmm.
  • the surface is intentionally roughened in Ra FIS B 0601) in the range of lnm to 1000 nm.
  • Ra FIS B 0601 Ra FIS B 0601
  • Such a roughened surface is advantageous in that the surface area of the substrate increases and a large amount of polypeptide can be immobilized at high density.
  • an amino group is introduced into the substrate having the carbon layer.
  • the introduction of the amino group can be carried out by irradiating the substrate with ultraviolet rays in chlorine gas to chlorinate the surface and then irradiating the substrate with ultraviolet rays in ammonia gas.
  • the method can be performed by subjecting a substrate provided with a diamond-like carbon layer to a plasma method in an ammonia atmosphere.
  • the plasma method is a method in which plasma is generated in a discharge of direct current or alternating current under vacuum conditions, and benzene or methane is used as a source gas, for example, and a biased substrate is treated with a gas subjected to ionization.
  • R is a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 chain members.
  • the divalent hydrocarbon group having 1 to 12 chain members alkylene groups having 1 to 12 chain members, preferably 4 to 6 chain members, such as tetramethylene group, pentamethylene group, hexamethylene group, and 1 to 12 chain members
  • a divalent alicyclic hydrocarbon group such as a cyclohexylene group or an arylene group such as 2,2'-biphenylene
  • a divalent aromatic ring-containing hydrocarbon group such as an o-xylylene group.
  • These divalent hydrocarbon groups include, for example, a C alkyl group, an aryl group, a trimethylsilyl group.
  • the C alkyl group includes, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group,
  • aryl groups include aromatic hydrocarbon groups such as phenyl, 1-naphthyl and 2-naphthyl, furyl, phenyl, phenyl, pyrrolyl, oxazolyl, isoxazolyl, thiazolyl, and isothiazolyl.
  • aromatic complex ring groups such as imidazolyl group, pyrazolyl group, pyridyl group, pyrimidyl group, pyridazyl group, pyrazur group, quinolyl group and isoquinolyl group.
  • the acryl group include C aliphatic acryl groups such as formyl group, acetyl group, propanol group, butanol group, pentanoyl group, and hexanoyl group.
  • R examples include — (CH 2) —, — (CH 2) —, — (CH 2) —, —CH (C
  • the salt of the compound represented by the formula II is not particularly limited, and for example, a sodium salt, a potassium salt and the like can be used. It is preferable to use sodium salt.
  • the reaction is carried out by immersing the solid support having the amino group introduced therein in a solution containing the compound of the formula II at a concentration of usually 0.1 to L00 mM in a buffer.
  • a buffer PBS (phosphate buffered saline), triethanolamine buffer, sodium borate buffer and the like can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • triethanolamine buffer sodium borate buffer and the like
  • the reaction temperature is usually 10 to 80 ° C, preferably 25 to 30 ° C, and the reaction time is usually 1 to 300 minutes. , Preferably 30 to 60 minutes.
  • the chemical modifying group having a maleimide group is firmly bonded to the carbon in the carbon layer by a covalent bond, so that it is not peeled off by washing or temperature change. It is also possible to store the solid support for a long time.
  • the polypeptide includes peptide fragments, oligopeptides and proteins. It may be a simple protein, a complex protein or a natural or synthetic protein.
  • the number of amino acids of the polypeptide immobilized on the solid support of the present invention is not particularly limited. The strength is usually 10 to 3,000, preferably ⁇ 50 to 2,000, and more preferably ⁇ 100 to 1500.
  • the polypeptide that can be immobilized on the solid support of the present invention is not particularly limited. For example, antibodies, enzymes, pathogenic proteins, peptide hormones, receptors, kinases, glycoproteins, metalloproteins, viral proteins, and inducible proteins Etc. can be suitably immobilized.
  • the polypeptide also includes a peptide derivative.
  • Peptide derivatives include peptides in which one or several amino acids have been induced by a chemical reaction.
  • Examples of peptide derivatives include molecules from which reactive amino acid side groups, such as free amino groups, free carboxyl groups, or free hydroxyl groups have been derived.
  • Specific examples of derivatives of amino groups are sulphonic or carboxylic amides, thiourethane derivatives and ammonium salts, for example the hydrochloride.
  • carboxyl group derivatives are salts, esters and amides.
  • Examples of hydroxyl group derivatives are o-acyl or o-alkyl derivatives.
  • peptides in which one or several amino acids are naturally occurring or have been replaced by amino acid homologues of the twenty "standard" amino acids that are non-naturally occurring.
  • amino acid homologues examples include 4-hydroxyproline, 5-hydroxylysine, 3-methylhistidine, homoserine, ortin, ⁇ -alanine and 4-aminobutyric acid.
  • a covalent bond is formed by introducing an oligocysteine sequence into a polypeptide and reacting a maleimide group present on the surface of the solid support of the present invention with an SH group of a cysteine residue.
  • the maleimide group has high selectivity for SH groups, and thus can specifically bind a polypeptide having an origocystin sequence introduced thereto to a solid support. It comes out.
  • the oligocysteine sequence generally means a sequence in which at least 3, preferably 3 to: LO, more preferably 4 to 6 cysteine residues are continuous.
  • the oligocystin sequence may be referred to as a cysteine tag.
  • a label for purification in addition to the oligocysteine sequence for immobilization in the target polypeptide.
  • labels include oligo-histidine sequences that specifically interact with metal ions such as zinc, nickel or cobalt ions (referred to as histidine tags, including, for example, hex-histidine sequences), or zinc, respectively.
  • histidine tags including, for example, hex-histidine sequences
  • a polylysine sequence containing at least about 4 lysines or a polyarginine sequence containing at least 4 arginine residues, which specifically interacts with copper may be mentioned.
  • the target polypeptide can be easily isolated using a reagent or column that specifically interacts with the label.
  • a nickel column can be used for oligohistidine sequences.
  • Introduction of an oligocysteine sequence and an oligohistidine sequence into a polypeptide can be carried out by a method combining PCR generally used in the art and gene closing using Escherichia coli.
  • a plasmid vector having a region encoding an oligocystine sequence and an oligohistidine sequence is constructed, and the target polypeptide is introduced later using a restriction enzyme site or the like.
  • a polypeptide in which the oligocysteine and oligohistidine sequences are linked can be produced.
  • nucleotide sequence encoding a target polypeptide when amplified by PCR or the like, a nucleotide sequence encoding an oligocysteine sequence and an oligohistidine sequence is contained in each DNA primer, and this is used to prepare a target polypeptide. After amplifying the nucleotide sequence of the peptide, this DNA fragment can be introduced into a vector and expressed to produce a fusion polypeptide linked to both sequences.
  • the oligocysteine sequence is preferably introduced at the N-terminus or C-terminus of the target polypeptide.
  • the site of introduction is not limited to the terminal unless it hinders the fixation. Since the SH group reacts with the maleimide group to form a covalent bond, the target polypeptide binds tightly to the chemical modifying group of the present invention.
  • the oligohistidine sequence is generally introduced in a form that is not linked to the N-terminal or C-terminal of the target polypeptide or the oligocysteine sequence without having the oligocysteine sequence of the target polypeptide.
  • the introduction site is not limited to the end unless otherwise defined.Oligohistidine and a target polypeptide having an oligocysteine sequence are expressed in a host cell, extracted, and then a nickel column is used using the oligohistidine sequence. Purification is performed by an ordinary method such as
  • polypeptide into which the oligocystin sequence is introduced is dissolved in a spotting buffer, and spotted on the solid support of the present invention, whereby the polypeptide can be immobilized.
  • the polypeptide into which the oligocystin sequence is introduced is dissolved in a spotting buffer so that the concentration is usually 0.01 to: LOO / zM, preferably 5 to 50 ⁇ l, to prepare a spotting solution.
  • a spotting buffer include a 1-100%, preferably 20-50% PEG (polyethylene glycol) solution, PBS (phosphate buffered saline), 50% DMSO (dimethyl sulfoxide), and 3 ⁇ SSC (saline sodium citrate) and pure water can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • PBS phosphate buffered saline
  • 50% DMSO dimethyl sulfoxide
  • 3 ⁇ SSC saline sodium citrate
  • the maleimide group has the best reaction efficiency at around pH 7 as soon as it is hydrolyzed.
  • the prepared spotting solution can be dispensed into a 96-well or 384-well plastic plate, and the dispensed solution can be spotted on a solid support using a spotter or the like.
  • a spotter or the like By arranging various kinds of polypeptides in an array as spots independent of each other, the interaction of the plural kinds of polypeptides can be detected.
  • Incubation is usually performed at a temperature of 4 to 30 ° C., preferably 25 to 30 ° C., for usually 0.5 to 16 hours, preferably 1 to 2 hours. Incubation is preferably performed in a high humidity atmosphere, for example, at a humidity of 50 to 90%. Following the incubation, washing is preferably performed using a washing solution (eg, 50 mM TBS / 0.05% Tween20) to remove polypeptides not bound to the solid support.
  • a washing solution eg, 50 mM TBS / 0.05% Tween20
  • the present invention also relates to a method for detecting an interaction between polypeptides by reacting a polypeptide immobilized on a solid support as described above with a sample polypeptide interacting with the polypeptide.
  • the interaction between polypeptides include an antigen-antibody reaction, an enzyme reaction, a reaction between a receptor and a ligand, and a biotin-streptavidin interaction.
  • the sample polypeptide was labeled and immobilized on a solid support. By contacting with the polypeptide and reading out the label derived from the sample polypeptide interacting with the polypeptide, the presence or absence of the interaction can be detected. Labeling of the sample polypeptide can be performed by a method commonly used in the art.
  • the label is not particularly limited as long as it can be incorporated into the polypeptide.
  • 1S fluorescent labels (CyDye such as Cy3 and Cy5, FITC, RITC, rhodamine, texathread, TET, TAMRA, FAM , HEX, ROX, GFP, etc.), radioactive labeling ( ⁇ -32P, ⁇ -32P, 35S, etc.), enzyme labeling (HRP (Horseradish peroxidase), ALPHA lipophosphatase, etc.).
  • HRP Hydrophilidish peroxidase
  • ALPHA lipophosphatase etc.
  • chemiluminescent reagent luminol, luciferin, umbelliferone, coelenterazine, dioxetane compound, D-luciferin potassium, bis-oxalate (2,4,6 )can be detected.
  • the sample of the sample polypeptide is prepared by dissolving in a buffer so that the concentration is usually 0.01 to: LOO / zM, preferably 1 to 10M.
  • the obtained sample solution is dropped on a solid support on which the polypeptide prepared above is immobilized, and the mixture is incubated. The interaction is performed by performing the chilling.
  • Incubation is usually performed at 4 to 30 ° C, preferably 25 to 30 ° C, usually for 0.5 to 16 hours, preferably for 1 to 4 hours.
  • the incubation is preferably performed in a high humidity atmosphere.
  • the solid support is washed and dried, and the detection is performed by reading the label.
  • the amino acid sequence of the polypeptide that specifically interacted with the polypeptide on the solid support can be analyzed.
  • mass spectrometry can be performed by ionizing only the polypeptide that has interacted with the polypeptide immobilized on the solid support.
  • the substance immobilized on the solid support can be directly subjected to mass spectrometry by a means such as laser desorption Z ionization-time-of-flight mass spectrometry.
  • mass spectrometry by a means such as laser desorption Z ionization-time-of-flight mass spectrometry.
  • the types of ionization methods that can be used for mass spectrometry include matrix-assisted laser desorption (MALDI), ionization by electron impact (EI), photoionization, and LET emitted from radioisotopes.
  • Ionization using ⁇ or j8 rays secondary ionization, fast atom bombardment ionization, field ionization, surface ionization, chemical ionization (CI), field ionization (FI), spark discharge A matrix-assisted laser desorption (MALDI) method and an ion bombardment (EI) method using electron impact are preferred.
  • the present invention also provides a method of introducing an oligocysteine sequence into a polypeptide of interest, bringing the oligocysteine sequence into contact with the solid support of the present invention, and binding the same to the solid support by a covalent bond with a maleimide group.
  • a method for purifying the polypeptide Since the solid support having a maleimide group of the present invention specifically binds to the SH group, it can be separated and purified by binding only the polypeptide into which the oligocystin sequence is introduced.
  • a protein expression vector that expresses an oligocysteine sequence fused to a protein is constructed, and a maleimide group that specifically covalently binds under mild conditions is introduced into the SH group of the cysteine.
  • the protein can be recovered using the solid support thus prepared.
  • the use of a protein tag consisting of an oligocystin sequence and the use of covalent binding as a recovery system can be achieved by using a conventional histidine tag using metal chelate, a GST tag using affinity between enzyme and substrate, and a specific antibody. Epi such as FLAG tag used It is a completely new and completely different idea from topp tags.
  • the conventional protein tag focuses on purifying the tagged protein itself, whereas the cysteine tag (oligocysteine sequence) of the present invention is obtained by recovering with a strong covalent bond.
  • the cysteine tag oligocysteine sequence
  • covalent recovery facilitates the purification and purification of the cysteine-tag fusion protein itself, and is also excellent for analyzing post-translational modifications of proteins by directly subjecting the protease to mass spectrometry after cleavage on a solid support.
  • a DLC layer having a thickness of ⁇ m was formed on a silicon substrate cut into a 3 mm square by using the gas obtained by mixing 95% by volume of methane gas and 5% by volume of hydrogen at an accelerating voltage of 0.5 kV by ion ion deposition. After that, amination was performed for 10 minutes by a plasma method in an ammonia gas atmosphere.
  • reaction solution having the following composition was prepared, and the aminated solid support was immersed in the reaction solution for 30 minutes. Thereafter, the substrate was washed three times with pure water and vacuum dried at 100 ° C for 30 minutes.
  • sulfo EMCS Dojini Danigaku Kenkyusho Co., Ltd.
  • CH 2 a sodium salt having a length of one
  • FIG. 2 shows the structures of the proteins represented in Samples 1 to 5.
  • the site is cross-linked with Ndel and Xhol, and the reading frame is inserted downstream of 6XHis and 5XCys, and the 6XHis-GFP and 5XCysGFP ( Figure 3, Step 3) proteins are inserted.
  • An expression vector was constructed.
  • a single colony was placed on a toothpick from an agar medium (LB, Ampicillin 50 ⁇ g / ml, Chloramphenicol 50 ⁇ g / ml) in which the BL21 strain (manufactured by Novagen) transformed with an expression vector into which DNA encoding each protein had been introduced was cultured. And suspended in 30 ml of LB medium (Ampicillin 50 ⁇ g / ml). IPTG was added to a final concentration of 0.4 mM and cultured at 23 ° C and 160 rpm for 24 hours.
  • LB agar medium
  • Ampicillin 50 ⁇ g / ml Ampicillin 50 ⁇ g / ml
  • Chloramphenicol 50 ⁇ g / ml Chloramphenicol 50 ⁇ g / ml
  • IPTG was added to a final concentration of 0.4 mM and cultured at 23 ° C and 160 rpm for 24 hours.
  • Each culture was centrifuged and collected (10OOg, 10min, 4 ° C).
  • the LB medium was discarded, the cells were resuspended in PBS (pH 7.4), E. coli was washed with Vortex, and collected again. Thereafter, the dry weight of E. coli was measured.
  • the protein extraction reagent Bugbuster (Novagen) was added to 5 ml Zg, Benzonase (Novagen) to 25 U / ml, and Lysozyme (Novagen) to 5 KU / ml, and shaken at room temperature for 20 minutes. After centrifugation (lOOOOg, lOmin, 4 ° C), the supernatant was recovered and filtered through a 0.2 / zm filter.
  • Samples 1, 2, 4, and 5 were tagged with a His tag and purified using a His-Trap column (Amersham). Thereafter, the solution was desalted with Microcon YM-10 (manufactured by Millipore) and concentrated. For sample 3, column purification was not possible, so only desalting and concentration were performed.
  • Example 2 Mix the various types of tagged EGFP recovered in Example 2 with 100% PEG 1: 1 A 10 1 solution was prepared. Each spotting solution was spotted on the solid support produced in Example 1 in a 0.51 position using a micropilotter in the arrangement shown in FIG. Incubated for 1 hour at room temperature in a moist box. After washing with 50 mM TBS / 0.05% Tween20 (25 ° C, 5 min), the plate was washed with PBS (pH 7.4) (25 ° C, 5 min). The sample was washed with pure water, carefully covered with a cover glass so as not to dry, and measured with LAS-1000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) (exposure 30 seconds). Fig. 7 shows the results.
  • Example 2 and 2 ⁇ PBS were mixed 1: 1 in a PCR tube to prepare a soaking solution 501.
  • the solid support prepared in Example 1 was immersed in a tube and incubated at room temperature for 18 hours. After washing with PBS for 30 minutes, the sample was washed with pure water, covered with a cover glass so as not to dry, and measured with LAS-1000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) (exposure: 30 seconds).
  • Fig. 8 shows the results.
  • EGFP Enhanced Green Fluorescence Protein
  • DLC diamond-like carbon
  • a resist was applied on a silicon substrate by a spin coater. Next, a mask having a pattern as shown in FIG. Then, a DLC layer was formed and amino groups were introduced in the same manner as in Example 1.
  • the obtained substrate was immersed in ImM Sulfo EMCS reagent in lX PBS (pH 7.4) at room temperature for 1 hour, washed with PBS (10 minutes) and ultrapure water (10 minutes X 2), and dried.
  • ImM Sulfo EMCS reagent in lX PBS (pH 7.4) at room temperature for 1 hour, washed with PBS (10 minutes) and ultrapure water (10 minutes X 2), and dried.
  • the resist was stripped using ethanol, and the ethanol was washed. ⁇ After the blow, the substrate was vacuum-dried at 100 ° C for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with 50 mM TBS / 0.05% Tween 20 for 5 minutes. After washing with ultrapure water for 5 minutes, fluorescence was measured using LAS-1000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) (Fig. 10). Blocking was performed for 1 hour at room temperature using Blocking Reagent (Roche). The obtained solid support was reacted with a primary antibody (monoclonal anti-green fluorescent protein (SIGMA)) diluted to 1Z10000 (room temperature, 1 hour). The plate was washed with PBS for 10 minutes, followed by V for 20 minutes.
  • SIGMA monoclonal anti-green fluorescent protein
  • HRP-labeled anti-mouse IgG antibody SIGMA
  • HRP-labeled secondary antibody HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (SIGMA)
  • SIGMA HRP-labeled anti-mouse IgG antibody
  • Chemiluminescence was performed using Super Signal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce) as a chemiluminescence reagent, and chemiluminescence was measured with LAS-1000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 11).
  • the solid support can be immobilized on the polypeptide solid support. It became clear that detection was possible with sensitivity.
  • a polypeptide can be firmly and specifically immobilized on a solid support. Therefore, the use of the solid support of the present invention enables production of a protein chip having a high detection limit. Using such a protein chip, a polypeptide that interacts with the immobilized polypeptide can be detected with high sensitivity.

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Description

明 細 書 ポリぺプチドを固定化する方法、 ポリぺプチドが固定化されてなる固体支持体 技術分野
[0001] 本発明は、ポリペプチドを固定ィ匕する方法、ポリペプチドが固定ィ匕されてなる固体 支持体、これを用いたポリペプチドの検出方法及び精製方法、ならびにポリペプチド を固定ィ匕するための固体支持体に関する。
背景技術
[0002] ヒトゲノム計画の終了に伴 、、生物、医学の研究は遺伝子解読からタンパク質解析 、即ちプロテオミクスという新たなステップへと踏み出した。遺伝子は、タンパク質を生 成するための単なるプログラムコードでしかなぐほとんど全ての生体活動はそれらの コードをもとに生成された、非常に複雑な構造を持つタンパク質の分子間で行なわれ ている。ある種のタンパク質が正常に機能しない場合、健康に支障をきたすことが知 られている。それゆえに、個々のタンパク質の機能を解明することは、医学の更なる 進歩に欠かすことのできないステップであると言える。
[0003] 従来は、タンパク質の性質、発現状態、構造、活性などの分析には、抽出したタン パク質の混合物を分子量ゃ等電点の違いにより分離し、解析する 2次元電気泳動法 (2-D PAGE)が使用されてきた。しかし、 2次元電気泳動法は、ハイスル—プット 解析に不向きで、検出感度、およびサンプルの可溶ィ匕の面でも問題があった。
[0004] 一方、今日までに数々の DNAチップが報告されて!、る。それらの DNAチップは、 ある表現型や生理状態での遺伝子発現の変化の確認や、発現パターンのデータべ ースを作ることに有用であった。し力し通常、遺伝子とタンパク質の発現量やパターン は必ずしも正確に相関しないため、 DNAチップはタンパク質の発現レベルの定量化 には使用することができない。またタンパク質は翻訳後に、リン酸化、糖鎖付加、切断 などの、さまざまな修飾を受けることによってその機能が変化するため、それらの翻訳 後修飾の情報を DNA解析からは得ることができない。 [0005] そこで DNAアレイ技術を、タンパク質解析のツールとして用いたものとしてプロティ ンチップが開発された。プロテインチップの原理は DNAチップと同じで、スライドガラ スゃ膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用するタンパク質や核酸 などを検出するものである。しかし、強固な DNA鎖に対し、巧みにアミノ酸が絡み合 つてできている非常に不安定な構造をもつタンパク質を基板上に固定化させることは 困難であった。
[0006] また、従来開発されたプロテインチップは、スライドガラス又はシリコン基板表面にポ リリジン等の高分子を塗布し、その後にタンパク質を固定ィ匕するものである力 スライ ドガラス又はシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してタンパク質を固定ィ匕 する方法では、タンパク質の固定ィ匕状態が不安定であり、洗浄工程において剥離す るといった問題が生じるとともに、固定化されたタンパク質を長期間保存することも不 可能であった。また、生体物質の非特異吸着や、タンパク質の機能失活、検出系 UV 不透明'性等の問題もあった。
[0007] このような問題に鑑み、タンパク質を含むポリペプチドを固定ィ匕するための支持体と して、基板の表面に、表面処理層及び化学修飾層を順次設けてなる固体支持体 (例 えば、特許文献 1)、基板表面の一部又は全部がカーボン層で構成されており、その 層上に金属キレートが形成されてなる固体支持体 (特許文献 2)が開発されている。
[0008] し力しながら、前記固体支持体のポリペプチドの固定ィ匕量及びポリペプチドの結合 強度は、必ずしも充分とはいえず、ポリペプチドの固定化量がより高くポリペプチド結 合強度がより高い固体支持体の出現が望まれている。
[0009] この出願の発明に関する先行技術文献情報として次のものがある。
特許文献 1：特開 2002— 365293号公報
特許文献 2：特開 2004— 020328号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の課題は、ポリペプチドを強固かつ特異的に固定ィ匕する方法、及びそのた めの固体支持体を提供することである。
課題を解決するための手段 [0011] 本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、基板上にアミノ基を介して マレイミド基を導入した固体支持体を用い、ポリペプチドにオリゴシスティン配列を導 入することにより、ポリペプチドの固定ィ匕量及びポリペプチドの結合強度が著しく向上 することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
[0012] (1)基板の表面に式 I：
[化 1]
Figure imgf000005_0001
[式中、 Rは鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である]
で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシスティン配列が導入され たポリペプチドを結合させることにより、ポリペプチドを固定ィ匕する方法。
[0013] (2)基板が、さらにカーボン層を有する（1)記載の方法。
[0014] (3)基板の表面に式 I：
[化 2]
Figure imgf000005_0002
[式中、 Rは鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である]
で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシスティン配列が導入され たポリペプチドが結合されて 、る、ポリペプチド固定化固体支持体。
[0015] (4)基板が、さらにカーボン層を有する（3)記載のポリペプチド固定ィ匕固体支持体。 ( 5)オリゴシスティン配列が導入されたポリペプチドに、さらにオリゴヒスチジン配列が 導入されて 、る、 (3)又は (4)記載のポリペプチド固定ィ匕固体支持体。
(6) (3)〜（5)のいずれかに記載のポリペプチド固定ィ匕固体支持体に、試料ポリぺプ チドを接触させ、固定化されたポリペプチドと試料ポリペプチドの相互作用を検出す る方法。
(7)試料ポリペプチドを標識し、固定化されたポリペプチドと相互作用した試料ポリべ プチドに由来する標識を検出することにより相互作用を検出する、（6)記載の方法。
(8)化学発光を用いてポリペプチドの相互作用を検出する、（7)記載の方法。
[0016] (9)ポリペプチドにオリゴシスティン配列を導入し、オリゴシスティン配列が導入された 該ポリペプチドを、基板の表面に式 I：
[化 3]
Figure imgf000006_0001
[式中、 Rは鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である]
で表される基を有する固体支持体上のマレイミド基と反応させ、オリゴシスティン配列 が導入されたポリペプチドを固体支持体上に結合させることによって、該ポリペプチド を精製する方法。
[0017] (10)基板が、さらにカーボン層を有する（8)記載の方法。
( 11)基板の表面に式 I：
[化 4]
Figure imgf000006_0002
[式中、 Rは鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である] で表される基を有する、ポリペプチドを固定ィ匕するための固体支持体。
[0018] (12)基板が、さらにカーボン層を有する（11)記載の固体支持体。
(13)オリゴシスティン配列及びオリゴヒスチジン配列が導入されたポリペプチドをコー ドする遺伝子を作製するベクター。
(14)オリゴシスティン配列及びオリゴヒスチジン配列が導入されたポリペプチド。 図面の簡単な説明
[0019] [図 1]図 1は、実施例 1で作成した本発明の固体支持体の表面を ESCA解析した結 果を表す。
[図 2]図 2は、実施例 2で発現させた 5種類のタンパク質の構造を示す。
[図 3]図 3は、実施例 2における発現ベクター構築の概要を示す。
[図 4]図 4は、 EGFPの発現を SDS— PAGEで確認した結果を示す。
[図 5]図 5は、蛍光の確認を UV照射装置により行った結果を示す。
[図 6]図 6は、実施例 3における各種ポリペプチドのスポッティング位置を示す。
[図 7]図 7は、実施例 3において、マレイミド基を有する固体支持体に、各種ポリぺプ チドをスポッティングによって固定ィ匕した結果を示す。
[図 8]図 8は、実施例 4において、各種ポリペプチドを含む溶液にマレイミド基を有する 固体支持体を浸漬して固定ィヒした結果を示す。
[図 9]図 9は、実施例 5において、シリコン基板上に、 DLC層の形成、アミノ基およびマ レイミド基の導入を行った部分のパターンを表す図である。
[図 10]図 10は、実施例 5において、固体支持体を各濃度の EGFP溶液に浸漬して E GFPを固定ィ匕し、蛍光を測定した結果を表す図である。
[図 11]図 11は、実施例 5において、 GFP固定ィ匕後、一次抗体および二次抗体を反 応させ、化学発光で検出した結果を表す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 固体支持体
本発明において、ポリペプチドを固定ィ匕する固体支持体は、基板の表面に化学修 飾基が結合した構造を有する。
[0021] 本発明に用いる基板の材料としては、例えば、シリコン、ガラス、繊維、木材、紙、セ ラミックス、プラスチック (例えば、ポリエステル榭脂、ポリエチレン榭脂、ポリプロピレン 榭脂、 ABS榭脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene 榭脂）、ナイロン、アクリル 榭脂、フッ素榭脂、ポリカーボネート榭脂、ポリウレタン榭脂、メチルペンテン榭脂、フ エノール榭脂、メラミン榭脂、エポキシ榭脂、塩ィ匕ビュル榭脂）が挙げられる。本発明 においては、シリコン基板を使用するのが好ましい。
本発明においては、この基板上にカーボン層を形成することが望ましい。本発明に おいて基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、ダイヤモンド 、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラフアイト、炭化ハフニウム、炭化-ォ ブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タンダステ ン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム又は炭化バナジウム等力もなる層 を挙げることができ、ダイヤモンドライクカーボン (DLC)層が好まし 、。
カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾や分析対象物質との 結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合 するためその結合が柔軟性を持っている点、 UV吸収がないため検出系 UVに対し て透明性である点、及びエレクトロブロッテイングの際に通電可能な点にぉ 、て有利 である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点にお いても有禾 ijである。
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイ クロ波プラズマ CVD (Chemical vapor deposit)法、 ECRCVD (Electric cyclotr on resonance chemical vapor deposit)法、 ICP (Inductive coupled plasma) 法、直流スパッタリング法、 ECR (Electric cyclotron resonance)スパッタリング法 、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、 EB (Electron beam)蒸着法、 抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
高周波プラズマ CVD法では、高周波によって電極間に生じるグロ一放電により原 料ガス (メタン)を分解し、基板上に DLC (ダイヤモンドライクカーボン)層を合成する。 イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料 ガス (ベンゼン）を分解'イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形 成する。水素ガス 1〜99体積％と残りメタンガス 99〜1体積％からなる混合ガス中で 、イオン化蒸着法により DLC層を形成してもよい。
[0023] アーク式蒸着法では、固体のグラフアイト材料 (陰極蒸発源)と真空容器 (陽極)の 間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極力 炭素原 子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のノ ィァス電圧を基板に印加すること により基板に向カゝつてプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することが できる。
レーザ蒸着法では、例えば Nd: YAGレーザ (パルス発振)光をグラフアイトのターゲ ット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン 層を形成することができる。
[0024] 本発明において、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜 100 m程度であり、薄 すぎると下地固体支持体の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると 生産性が悪くなるので、好ましくは 2nm〜l μ m、より好ましくは 5nm〜500nmである なお、固体支持体のすべてが炭素材料で構成されて 、てもよ 、。
本発明において、固体支持体は、前記のように基板上にカーボン層を形成した構 造だけでなぐダイヤモンドライクカーボンと基板材料との積層体や複合体 (例えば、 ダイヤモンドライクカーボンと他の物質との複合体、（例えば 2相体) )であってもよ 、。
[0025] 基板上にダイヤモンドライクカーボン層などのカーボン層を形成することにより、高 密度にポリペプチドを固定ィ匕でき、高い SZN比が得られるため、感度の高い検出が 可能になる。また、繰り返し使用することも可能である。
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状 、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は 、幅 0. 1~ 100mm,長さ 0. 1~ 100mm,厚み 0. 01〜： LOmm程度である。
[0026] 基板としてガラスを用いる場合、その表面は、 Ra FIS B 0601)で lnm〜1000n mの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板 の表面積が増えて、多量のポリペプチドを高密度で固定化できる点で好都合である 続いて、上記カーボン層を有する基板に、化学修飾基を導入することにより固体支 持体を製造する。化学修飾基の導入は以下のように実施することができる。
[0027] まず、上記カーボン層を有する基板にアミノ基を導入する。ァミノ基の導入は、基板 に塩素ガス中で紫外線を照射することにより表面を塩素化し、次いでアンモニアガス 中で紫外線照射することにより実施できる。ある 、はダイヤモンドライクカーボン層を 施した基板を、アンモニア雰囲気下でプラズマ法に付すことにより実施できる。ここで 、プラズマ法とは、真空条件下、直流あるいは交流による放電にプラズマを発生させ 、原料ガスとして例えばベンゼンやメタンを用い、イオンィ匕したガスでバイアスを印加 した基板を処理する方法である。
[0028] このように形成させたァミノ基と、以下の式 II：
[化 5]
Figure imgf000010_0001
で表される化合物又はその塩を反応させることにより、
Figure imgf000010_0002
で表されるような化学修飾基をカーボン層上に形成することができる。
[0029] 式 I又は IIにおいて、 Rは、鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である。鎖員 1〜12の 2 価の炭化水素基としては、鎖員 1〜12、好ましくは鎖員 4〜6のアルキレン基、例えば テトラメチレン基、ペンタメチレン基、へキサメチレン基、鎖員 1〜12の 2価の脂環式 炭化水素基、例えばシクロへキシレン基、ァリーレン基、例えば 2, 2'—ビフエ-レン 基、 2価の芳香環含有炭化水素基、例えば o キシリレン基等が挙げられる。これら の 2価の炭化水素基は、例えば C アルキル基、ァリール基、トリメチルシリル基
1-10
、ァシル基等で置換されていてもよい。
ここで、 C アルキル基としては、例えばメチル基、ェチル基、プロピル基、イソ
1- 10
プロピル基、ブチル基、イソブチル基、 sec ブチル基、 tert ブチル基、ペンチル 基、イソペンチル基、へキシル基、ヘプチル基、ォクチル基、ノニル基、デシル基、シ クロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基が挙げられる
。ァリール基としては、例えば、フエ-ル基、 1 ナフチル基、 2—ナフチル基等の芳 香族炭化水素基、フリル基、チェニル基、ピロリル基、ォキサゾリル基、イソォキサゾリ ル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、ピリ ミジ-ル基、ピリダジ -ル基、ピラジュル基、キノリル基、イソキノリル基等の芳香族複 素環基が挙げられる。ァシル基としては、例えばホルミル基、ァセチル基、プロパノィ ル基、ブタノィル基、ペンタノィル基、へキサノィル基等の C 脂肪族ァシル基が
1-10
挙げられる。
[0030] Rの好ましい具体例としては、―（CH ) —、― (CH ) —、― (CH ) ―、— CH (C
2 4 2 5 2 6
H ) - (CH ) ―、 -CH CH (CH ) - (CH ) ―、― CH (CH CH ) - (CH ) ―、
3 2 3 2 3 2 2 2 3 2 3
-CH (CH CH CH ) - (CH ) 一、 CH (CH ) (CH ) 一、 CH (CH CH )
2 2 3 2 3 3 2 4 2 3
- (CH ) ―、 一 CH (CH CH CH ) - (CH ) ―、 一 CH CH (CH CH CH )— (
2 4 2 2 3 2 4 2 2 2 3
CH ) 一、 CH (CH ) (CH ) 一、 CH (CH CH ) (CH ) 一、 CH (CH
2 3 3 2 5 2 3 2 5 2
CH CH ) - (CH ) 一、 一 C H —、 一 C H 一 CH —、 一 C H— (CH ) 一、 一 C
2 3 2 5 6 4 6 4 2 6 4 2 2 6
H (CH )—等が挙げられる。
3 3
[0031] 式 IIで表される化合物の塩としては特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリ ゥム塩等を使用できる。ナトリゥム塩を使用するのが好ま 、。
具体的には、ァミノ基が導入された固体支持体を、ノ ッファー中に通常 0. 1〜： L00 mMの濃度で式 IIの化合物を含む溶液に浸漬することにより反応させる。バッファーと しては、 PBS (リン酸緩衝ィ匕生理食塩水）、トリエタノールァミンバッファー、ホウ酸ナト リウムバッファ一等を使用することができる。 PBS (pH6〜9)を使用するのが好まし！/ヽ 。反応温度は、通常 10〜80°C、好ましくは 25〜30°C、反応時間は、通常 1〜300分 、好ましくは 30〜60分である。
本発明の固体支持体において、上記のマレイミド基を有する化学修飾基は、共有 結合によってカーボン層中の炭素と強固に結合しているため、洗浄や温度変化によ つても剥離することがなぐまた固体支持体を長期間保存することも可能である。 ポリペプチドの固定ィ匕
本発明において、ポリペプチドには、ペプチド断片、オリゴペプチド及びタンパク質 が包含される。単純タンパク質、複合タンパク質でもよぐ天然のものでも合成のもの でもよい。本発明の固体支持体に固定ィ匕するポリペプチドのアミノ酸数は、特に制限 されな ヽ力 通常 10〜3000、好まし < ίま 50〜2000、より好まし <ίま 100〜1500で ある。本発明の固体支持体に固定ィ匕できるポリペプチドとしては、特に限定されず、 例えば、抗体、酵素、病原性タンパク、ペプチド系ホルモン、レセプター、キナーゼ、 糖タンパク質、金属タンパク質、ウィルスタンパク質、誘導タンパク質等のタンパク質 を好適に固定ィ匕することができる。
また、本発明においてポリペプチドにはペプチド誘導体も包含される。ペプチド誘 導体には、 1又は数個のアミノ酸が化学反応によって誘導ィ匕されたペプチドが含まれ る。ペプチド誘導体の例としては、反応性アミノ酸側基、例えば遊離のアミノ基、遊離 のカルボキシル基又は遊離のヒドロキシル基が誘導ィヒされた分子が挙げられる。アミ ノ基の誘導体の具体的な例は、スルホン酸又はカルボン酸アミド、チォウレタン誘導 体及びアンモ-ゥム塩、例えば塩酸塩である。カルボキシル基誘導体の例は、塩、ェ ステル及びアミドである。ヒドロキシル基誘導体の例は、 ο—ァシル又は ο—アルキル 誘導体である。更には、 1又は数個のアミノ酸が天然に存在するか又は非天然に存 在する 20の"標準"アミノ酸のアミノ酸同族体によって置換されたペプチドも含まれる 。かかる同族体の例は、 4ーヒドロキシプロリン、 5—ヒドロキシリシン、 3—メチルヒスチ ジン、ホモセリン、オル-チン、 βーァラニン及び 4ーァミノ酪酸である。
本発明においては、ポリペプチドにオリゴシスティン配列を導入し、本発明の固体 支持体の表面に存在するマレイミド基とシスティン残基の SH基とを反応させること〖こ より共有結合を形成する。マレイミド基は、 SH基に対する選択性が高いことから、オリ ゴシスティン配列が導入されたポリペプチドを固体支持体上に特異的に結合させるこ とがでさる。
本発明においてオリゴシスティン配列は、通常少なくとも 3個、好ましくは 3〜： LO個、 より好ましくは 4〜6個のシスティン残基が連続した配列を意味する。本明細書におい ては、オリゴシスティン配列をシスティンタグと称する場合もある。
[0033] 本発明においては、標的ポリペプチドに、固定ィ匕のためのオリゴシスティン配列に カロえて、さらに精製のための標識を導入するのが好ましい。このような標識としては、 亜鉛、ニッケル又はコバルトイオンのような金属イオンと特異的に相互作用するオリゴ ヒスチジン配列（ヒスチジンタグと称され、例えばへキサヒスチジン配列が挙げられる） 、又は、それぞれ、亜鉛若しくは銅と特異的に相互作用する、少なくとも約 4個のリシ ンを含むポリリシン配列若しくは少なくとも 4個のアルギニン残基を含むポリアルギ- ン配列などが挙げられる。このような標識を導入することにより、標識と特異的に相互 作用する試薬やカラムを用いて目的のポリペプチドを翻訳反応物力 容易に単離す ることができる。例えば、オリゴヒスチジン配列に対してはニッケルカラムを用いること ができる。
ポリペプチドへのオリゴシスティン配列及びオリゴヒスチジン配列の導入は、当技術 分野にお 、て通常用いられる PCRと大腸菌を用いた遺伝子クローユングを組み合わ せた方法により実施することができる。例えば、あら力じめオリゴシスティン配列とオリ ゴヒスチジン配列をコードする領域をもつプラスミドベクターを構築し、後で制限酵素 部位等を利用して標的ポリペプチドを導入して、得られた組み換えベクターで宿主細 胞を形質転換し、当該形質転換体において融合ポリペプチドを発現させることにより 、オリゴシスティン及びオリゴヒスチジン配列を連結したポリペプチドを製造することが できる。
または、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を PCR法などにより増幅す る際に、オリゴシスティン配列とオリゴヒスチジン配列をコードするヌクレオチド配列を 各々の DNAプライマーに含有させておき、これを用いて標的ポリペプチドのヌクレオ チド配列を増幅した後この DNA断片をベクターに導入し、発現させて両配列と連結 された融合ポリペプチドを製造することもできる。
[0034] オリゴシスティン配列は、標的ポリペプチドの N末端又は C末端に導入するのがー 般的であるが、固定ィ匕の障害とならない限り、導入部位は末端に限定されるものでは ない。 SH基は、マレイミド基と反応して共有結合を形成するため、標的ポリペプチド は本発明の化学修飾基に強固に結合する。
オリゴヒスチジン配列は、標的ポリペプチドのオリゴシスティン配列を有しな 、側の N 末端又は C末端、またはオリゴシスティン配列に連結した形で導入するのが一般的 であるが、固定ィ匕の障害とならない限り、導入部位は末端に限定されるものではない オリゴヒスチジンおよびオリゴシスティン配列を有する標的ポリペプチドは、宿主細 胞内で発現、抽出後、まずオリゴヒスチジン配列を利用して、ニッケルカラムを用いる などの通常の方法で精製を行う。
オリゴシスティン配列を導入したポリペプチドをスポッティグ用バッファーに溶解し、 本発明の固体支持体上にスポッティングすることにより、ポリペプチドを固定ィ匕するこ とがでさる。
オリゴシスティン配列を導入したポリペプチドを、濃度が通常 0. 01〜： LOO /z M、好 ましくは 5〜50 μ Μとなるようにスポッティング用バッファーに溶解し、スポッティング 用溶液を調製する。スポッティング用バッファ一としては、 1〜100%、好ましくは 20 〜50%の PEG (ポリエチレングリコール）溶液、 PBS (リン酸緩衝化生理食塩水）、 50 %DMSO (ジメチルスルホキシド）、 3 X SSC (saline sodium citrate)、純水等を 使用することができる。本発明においては、 50%PEG溶液を使用するのが好ましい 。マレイミド基は加水分解されやすぐ pH7付近で反応効率が最も良い。
調製したスポッティング用溶液を、 96穴もしくは 384穴プラスチックプレートに分注 し、分注した溶液をスポッター装置等によって固体支持体上にスポッティングすること ができる。このとき、多種類のポリペプチドを互いに独立したスポットとしてアレイ状に 配列することにより、この複数種のポリペプチドの相互作用を検出することができる。 スポッティング後、ポリペプチドが固体支持体に結合する反応を進行させるため、ィ ンキュベーシヨンを行うことが好ましい。ポリペプチドの固定ィ匕は化学反応による共有 結合の生成であるため、反応を確実に進めるベぐスポッティング後速や力にインキュ ベーシヨンを行うのが好まし 、。 インキュベーションは、通常 4〜30°C、好ましくは 25〜30°Cの温度で、通常 0. 5〜 16時間、好ましくは 1〜2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲 気下、例えば、湿度 50〜90%の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き 、固体支持体に結合していないポリペプチドを除去するため、洗浄液 (例えば、 50m M TBS/0. 05% Tween20)を用いて洗浄を行うことが好ましい。
[0036] ペプチド相互作用の検出
本発明はまた、上記のように固体支持体に固定ィ匕されたポリペプチドに、これと相 互作用する試料ポリペプチドを反応させて、ポリペプチド間の相互作用を検出する方 法に関する。ポリペプチド間の相互作用としては、例えば、抗原抗体反応、酵素反応 、レセプターとリガンドの反応、ピオチン ストレプトアビジン相互作用等が挙げられる 試料ポリペプチドを標識して、固体支持体上に固定化されたポリペプチドと接触さ せ、これと相互作用した試料ポリペプチドに由来する標識を読みとることにより、相互 作用の有無を検出することができる。試料ポリペプチドの標識は、当技術分野におい て通常用いられる方法により実施できる。
[0037] 標識としては、ポリペプチドに取り込むことが可能なものであれば特に限定されない 1S 例えば、蛍光標識（Cy3及び Cy5などの CyDye、 FITC、 RITC、ローダミン、テ キサスレッド、 TET、 TAMRA、 FAM、 HEX, ROX、 GFPなど）、放射能標識（ α— 32P、 γ— 32P、 35Sなど）、酵素標識（HRP (Horseradish peroxidase)、アル力 リフォスファタ一など）が挙げられる。蛍光標識ポリペプチドを用いた場合は、相互作 用させた後の固体支持体を蛍光撮影することにより、画像として検出することができる 。酵素標識を用いた場合は、相互作用させた後の固体支持体に化学発光試薬 (ルミ ノール、ルシフェリン、ゥンベリフエロン、セレンテラジン、ジォキシセタン化合物、 D— ルシフェリンカリウム、シユウ酸ビス（2, 4, 6 トリクロ口フエ-ル））を作用させることに より検出することができる。
この試料ポリペプチドのサンプルは、濃度が通常 0. 01〜： LOO /z M、好ましくは 1〜 10 Mとなるようにバッファーに溶解することによって調製する。得られた試料溶液を 、上記で調製したポリペプチドが固定化された固体支持体上に滴下し、インキュベー シヨンを行うことにより相互作用させる。
インキュベーションは、通常 4〜30°C、好ましくは 25〜30°Cで、通常 0. 5〜16時間 、好ましくは 1〜4時間行う。相互作用させる工程においても、高湿度雰囲気下でイン キュベーシヨンを行うのが好ましい。最後に、固体支持体を洗浄し、乾燥後、標識を 読みとることにより検出を行う。
あるいは、相互作用によって形成した複合体の質量分析を行うことにより、固体支 持体上のポリペプチドに特異的に相互作用したポリペプチドのアミノ酸配列を解析す ることができる。また、固体支持体上に固定ィ匕されたポリペプチドに相互作用したポリ ペプチドのみをイオン化して質量分析を行うこともできる。
[0038] 固体支持体上に固定化された物質は、レーザ脱離 Zイオンィ匕-飛行時間型質量 分析等の手段によりそのまま質量分析を実施することができる。質量分析する際に使 用できるイオンィ匕法の様式としては、マトリックス補助レーザ脱着 (MALDI)法、電子 衝撃によるイオンィ匕 (EI)法、光イオン化法、放射性同位体から放射される LETの大 きな α又は j8線を使用するイオン化法、 2次イオン化法、高速原子衝突イオン化法、 電界電離イオン化法、表面電離イオン化法、化学イオン化 (CI)法、フィールドイオン ィ匕 (FI)法、火花放電によるイオン化法等が挙げられ、マトリックス補助レーザ脱着 (M ALDI)法、電子衝撃によるイオンィ匕 (EI)法が好ま 、。
[0039] 本発明はまた、目的とするポリペプチドにオリゴシスティン配列を導入し、これを本 発明の固体支持体と接触させ、マレイミド基との共有結合により固体支持体上に結合 させることによって、該ポリペプチドを精製する方法に関する。本発明のマレイミド基 を有する固体支持体は、 SH基と特異的に結合するため、オリゴシスティン配列を導 入したポリペプチドのみを結合して、分離精製することができる。
本発明にお 、ては、タンパク質にオリゴシスティン配列を融合した形で発現させるタ ンパク発現ベクターを構築し、システィンが持つ SH基に、温和な条件下で特異的に 共有結合するマレイミド基を導入した固体支持体を用いてタンパク質を回収すること ができる。オリゴシスティン配列からなるタンパク質タグを用い、回収システムとして共 有結合を利用することは、従来の金属キレートを利用するヒスチジンタグ、酵素と基質 間のァフィ二ティを利用する GSTタグ、特異的抗体を利用する FLAGタグなどのェピ トープタグなどとは全く異なる新し 、発想に基づ ヽて 、る。従来のタンパク質タグはタ グ付きタンパク質それ自身を精製することに主眼が置かれて 、たのに対し、本発明に おけるシスティンタグ (オリゴシスティン配列）は、強固な共有結合で回収することによ り、システィンタグが導入されたタンパク質とともに分離されてくる結合タンパクの分離 回収条件の設定幅を広げることができる。従ってこれまでは回収できな力つた結合タ ンパク質群が釣り上げられて、タンパク質相互作用解析が飛躍的に進歩することが期 待できる。加えて共有結合による回収は、システィンタグ融合タンパクそれ自身の洗 浄精製を容易にし、固体支持体上でプロテアーゼ切断後直接質量分析に供すること で、タンパク質の翻訳後修飾を解析する上でも優れたシステムを提供できる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな い。
実施例
[0040] 実施例 1.マレイミド基を導入した固体支持体の作成
イオンィ匕蒸着法によって、 3mm角に切断したシリコン基板上に、メタンガス 95体積 %と水素 5体積％を混合したガスを原料として、加速電圧 0. 5kVで DLC層を ΙΟΟη mの厚みに形成した。その後、アンモニアガス雰囲気でプラズマ法により 10分間アミ ノ化を実施した。
以下の組成の反応液を調製し、これにァミノ化した固体支持体を浸漬させ、 30分間 浸透した。その後、純水で 3回洗浄し、 100°Cにて 30分間真空乾燥した。ここでスル ホー EMCS (株式会社 同仁ィ匕学研究所）は、上記の式 IIの化合物において、尺が 一（CH ) —であるナトリウム塩である。
2 5
[0041] スルホ— EMCS 12. 3mg[lmM]
10 X PBS (pH7. 4) 3ml
招純水 27ml
合計 30ml
[0042] micro— ESCA (Electron spectroscopy for chemical analysis： Perkm―
Elmer社製)を用いて反応前後の固体支持体表面を解析した。結果を図 1に示す。 反応前後の固体支持体表面の ESCA解析から、反応後に Oと Nのピーク強度が増 カロして 、ることがわかった（図 la)。また反応後の narrowスキャンから約 289eV付近 に新たなピークが現れていることがわかる（図 lb)。 0、 Nのピークについてはマレイミ ド基の 0、 Nに由来するものであると考えられる。また、 289eV付近に新たに出現した ピークについてはマレイミドのイミド部分に由来するものであると考えられる。以上から 、固体支持体表面には、マレイミド基が導入されていることがわかる。
[0043] 実施例 2.オリゴシスティン配列を導入した EGFP (Enhanced Green Fluoresce nce protein)の発現及び精製
<発現させたタンパク質 >
試料 1： 6 X His (GFP遺伝子なしコントロール）
試料 2： 6 X His -EGFP (N末端に 6個のヒスチジンを導入した EGFP)
試料 3： 5 X Cys-EGFP (N末端に 5個のシスティンを導入した EGFP)
試料 4 : 5 X Cys— EGFP— 6 X His (N末端に 5個のシスティン、 C末端に 6個のヒス チジンを導入した EGFP)
試料 5 : 6 X His— EGFP— 5 X Cys (N末端に 6個のヒスチジン、 C末端に 5個のシ スティンを導人した EGFP)
試料 1〜5に表されるタンパク質の構造を図 2に示す。
[0044] <発現べクタ一の構築 >
発現ベクターの構築について、概要を図 3に示す。まず、 Hisタグ付タンパク質 (N 末端に 6個のヒスチジンを導入したタンパク質)の発現プラスミドベクターである pETl 4b (Novagen社製）をベースとして、 PCR法と大腸菌内遺伝子クローユング法により 、 Hisタグ下流に新たなクロー-ングサイト Ndel、 BglII、 XhoI、 BamHI、 Kpnlを導 入した（図 3、 Stepl)。同様の方法にて、 6個のヒスチジンを 5個のシスティンに置換 した 5 X Cysタンパク質発現ベクターを構築した（図 3、 Step 2) o Clonetech社製 pE GFP— C1の GFP遺伝子を PCRにより制限酵素サイト Ndelと Xholを付けた形でクロ 一ユングし、 6 X Hisおよび 5 X Cysの下流に読み枠をあわせて挿入し、 6 X His— G FP及び 5 X Cys GFP (図 3、 Step3)タンパク質発現ベクターを構築した。
さらに、 2種類の 5 X Cys および 6 X His -ダブルタグ付き GFP (Cys - GFP - Hi sおよび His GFP Cys)発現ベクターを構築した。 6 X His GFPの下流に 5 X C ysを、 5 X Cys— GFPの下流に 6 X Hisを導入して作製した（図 3、 Step4)。各々の タグ部分の遺伝子配列は DNAシークェンスにより確認した。各々のベクターを用い てタンパク質発現用大腸菌 BL21株に形質転換し、 GFP発現のよい株を選択した。 5 X Cysをコードする塩基配列として、は TGTTGTTGTTGTTGT (配列番号 1)お よび TGTTGCTGTTGCTTGT (配列番号 2)を用いて比較したが、どちらも同様に よく発現したので、前者の塩基配列をもつプラスミドのみを固定ィ匕試験に供した。
[0045] <培養 >
各タンパク質をコードする DNAを導入した発現ベクターで形質転換した BL21株（ Novagen社製）を培養した寒天培地（LB, Ampicillin50 μ g/ml, Chloramphen icol 50 μ g/ml)よりシングルコロニーを爪楊枝にてピックアップし、 30mlの LB培 地 (Ampicillin 50 μ g/ml)に懸濁した。 IPTGを最終濃度 0. 4mMになるよう添 カロして 23°C、 160rpmにて 24時間培養した。
[0046] <抽出 >
各培養液を遠心して集菌した（lOOOg, lOmin, 4°C)。 LB培地を捨て、 PBS (pH 7. 4)に再懸濁し、 Vortexをかけて大腸菌を洗浄し再び集菌した。その後大腸菌の 乾燥重量を測定した。タンパク質抽出試薬 Bugbuster (Novagen社製)を 5mlZg、 Benzonase (Novagen社製)を 25U/ ml、 Lysozyme (Novagen社製)を 5KU/ mlになるよう添カ卩して室温で 20分間振とうした。遠心（lOOOg, lOmin, 4°C)後、上 清を回収し 0. 2 /z mフィルターでろ過した。
[0047] <精製 >
試料 1、 2、 4、 5に関しては Hisタグが付いているため His— Trapカラム（アマシャム 製）にて精製した。その後マイクロコン YM— 10 (ミリポア社製）にて脱塩し、濃縮した 。試料 3に関してはカラム精製ができないため、脱塩、濃縮のみ行った。
[0048] く確認 >
EGFP発現の確認は SDS— PAGE (ゲル濃度 12. 5%)で行った（図 4)。また、蛍 光の確認は UV照射装置により行った（図 5)。
[0049] 実施例 3.マレイミド基を有する固体支持体へのポリペプチドのスポッティング
実施例 2で回収した各種タグ付き EGFPと 100%PEGを 1： 1で混合し、スポッティン グ溶液を 10 1調製した。実施例 1で製造した固体支持体上にマイクロピぺッターを 用いて各スポッティング溶液を図 6に示す配置で 0. 5 1づっスポットを行った。湿箱 に入れて室温で 1時間インキュベートした。 50mM TBS/0. 05%Tween20で洗 浄後（25°C, 5min)、 PBS (pH7. 4)で洗浄した（25°C, 5min)。純水洗浄し、乾燥 しないように注意してカバーガラスをかけ、 LAS— 1000 (富士写真フィルム社製）に て測定した (露光 30秒)。結果を図 7に示す。
[0050] 実施例 4.マレイミド基を有する固体支持体への各種タグ付き EGFPの浸漬による固 定化
PCRチューブに実施例 2で回収した各種タグ付き EGFPと 2 X PBSを 1： 1で混合し 、浸漬用溶液 50 1を調製した。チューブ中に実施例 1で製造した固体支持体を浸 漬し、室温で 18時間インキュベートした。 PBSで 30分洗浄後、純水洗浄し乾燥しな いように注意してカバーガラスをかけ、 LAS— 1000 (富士写真フィルム社製）にて測 定した (露光 30秒)。結果を図 8に示す。
[0051] 実施例 3及び 4の結果より本発明の固体支持体がヒスチジンタグよりもシスティンタ グと選択的に結合することが示された。
[0052] 実施例 5.化学発光を用いたポリペプチド相互作用の検出
5- 1 パターン付き固体支持体の作成
浸漬による EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein)の固定化及び 化学発光が確認しやす 、ように、ダイヤモンドライクカーボン (DLC)層およびアミノ 基およびマレイミド基をパターン状に形成させものを作成した（図 9)。
シリコン基板上にスピンコーターでレジストを塗布した。次に、図 9に示すようなパタ ーンを有するマスクを被せて露光し、現像した。そして、実施例 1と同様の方法で、 D LC層の形成およびアミノ基の導入を実施した。得られた基板を l X PBS (pH7. 4) 中の ImM スルホー EMCS試薬に、室温にて 1時間浸潰し、 PBS (10分）および超 純水（10分 X 2)で洗浄後、乾燥させた。
続いて、エタノールを用いてレジストを剥離し、エタノールを洗浄した。ヱアブロー後 、 100°Cにて 1時間真空乾燥させた。
[0053] 5- 2 EGFPの固定ィ匕およびィ匕学発光による相互作用の検出 実施例 2と同様の方法で作成した 6 X His-EGFP- 5 X Cys (N末端に 6個のヒス チジン、 C未端に5個のシスティンを導入したEGFP)または6 X His— EGFP (N末 端に 6個のヒスチジンを導入した EGFP)をバッファー（20mM リン酸ナトリウム（PH 7. 4) /0. 5M NaCl/O. 5M イミダ 一ノレ）【こ溶解し、それぞれ【こつさ、 lOOng Z 1、 lOngZ μ 1、 lng/ μ 1、 0. lng/ μ 1、 0. Olng/ μ 1のタンパク質溶液を作成 した。これらの溶液に、 5— 1で作成した固体支持体を浸漬し遮光して室温で 1時間 放置した。その後、 50mM TBS/0. 05%Tween20で 5分 X 3回洗浄した。さらに 超純水で 5分洗浄し、 LAS— 1000 (富士写真フィルム社製）にて蛍光を測定した（図 10)。 Blocking Reagent (Roche社製）を用いて室温で 1時間ブロッキングした。得 られた固体支持体を 1Z10000に希釈した一次抗体（monoclonal anti— green fluorescent protein (SIGMA) )と反応させた（室温、 1時間）。 PBSで 10分、続 V、て 20分洗浄した。そして 1Z 10000に希釈した HRP標識二次抗体 (HRP標識抗 マウス IgG抗体（SIGMA) )と反応させた（室温、 1時間）。 PBSで 10分→20分→10 分洗浄した。化学発光試薬として Super Signal ELISA Femto Maximum S ensitivity Substrate (ピアス社）を用いて化学発光させ、 LAS— 1000 (富士写真 フィルム社製）にて化学発光を測定した（図 11)。
[0054] 以上の結果より.オリゴシスティン配列の存在によりポリべプチドを選択的に固体支 持体に結合できることが明らかとなった。また、化学修飾基を導入したパターン形成 部分のみに GFPが結合していることから、本発明により非特異的吸着を効果的に防 止できることが明ら力となった。
さらに. 3. 7fmolZ 1という低濃度のボリペプチド溶液に固体支持体を浸漬するこ とにより、ポリペプチド固体支持体上に固定ィ匕できること、またィ匕学発光によりポリべ プチドの相互作用を高感度で検出できることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
[0055] 本発明により、固体支持体上にポリペプチドを強固かつ特異的に固定ィ匕することが できる。従って、本発明の固体支持体を用いることにより、検出限界の高いプロテイン チップの製造が可能になる。このようなプロテインチップを用い、固定化されたポリべ プチドと相互作用するポリペプチドを感度よく検出することができる。

Claims

請求の範囲
基板の表面に式 I :
Figure imgf000022_0001
[式中、 Rは鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である]
で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシスティン配列が導入され たポリペプチドを結合させることにより、ポリペプチドを固定ィ匕する方法。
[2] 基板が、さらにカーボン層を有する請求項 1記載の方法。
[3] 基板の表面に式 I：
[化 2]
Figure imgf000022_0002
[式中、 Rは鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である]
で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシスティン配列が導入され たポリペプチドが結合されて 、る、ポリペプチド固定化固体支持体。
[4] 基板が、さらにカーボン層を有する請求項 3記載のポリペプチド固定ィ匕固体支持体
[5] オリゴシスティン配列が導入されたポリペプチドに、さらにオリゴヒスチジン配列が導 入されている、請求項 3又は 4記載のポリペプチド固定ィ匕固体支持体。
[6] 請求項 3〜5のいずれか 1項記載のポリペプチド固定ィ匕固体支持体に、試料ポリべ プチドを接触させ、固定化されたポリペプチドと試料ポリペプチドの相互作用を検出 する方法。
[7] 試料ポリペプチドを標識し、固定化されたポリペプチドと相互作用した試料ポリぺプ チドに由来する標識を検出することにより相互作用を検出する、請求項 6記載の方法
[8] 化学発光を用いてポリペプチドの相互作用を検出する、請求項 7記載の方法。
[9] ポリペプチドにオリゴシスティン配列を導入し、オリゴシスティン配列が導入された 該ポリペプチドを、基板の表面に式 I：
[化 3]
Figure imgf000023_0001
[式中、 Rは鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である]
で表される基を有する固体支持体上のマレイミド基と反応させ、オリゴシスティン配列 が導入されたポリペプチドを固体支持体上に結合させることによって、該ポリペプチド を精製する方法。
[10] 基板が、さらにカーボン層を有する請求項 9記載の方法。
[11] 基板の表面に式 I：
[化 4]
Figure imgf000023_0002
[式中、 Rは鎖員 1〜12の 2価の炭化水素基である]
で表される基を有する、ポリペプチドを固定ィ匕するための固体支持体。
基板が、さらにカーボン層を有する請求項 11記載の固体支持体。 [13] オリゴシスティン配列及びオリゴヒスチジン配列が導入されたポリペプチドをコード する遺伝子を作製するベクター。
[14] オリゴシスティン配列及びオリゴヒスチジン配列が導入されたポリペプチド。
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