JP2004020328A - 化学修飾を施した固体支持体およびその用途 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、タンパク質の解析やタンパク質保存を効率的に行うためのタンパク質を安定に固定化する固体支持体であって、タンパク質の機能失活がなく、検出系ＵＶに対して透明性である固体支持体を提供することである。
【解決手段】基板表面の一部又は全部がカーボン層で構成されており、その層上に金属キレートが形成されてなる固体支持体。
【選択図】 図２
【解決手段】基板表面の一部又は全部がカーボン層で構成されており、その層上に金属キレートが形成されてなる固体支持体。
【選択図】 図２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子生物学分野、生化学関連分野において有用な、ペプチドの固定化が可能な、又はマイクロラボラトリーとして有用な固体支持体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム計画の終了に伴い、生物、医学の研究は遺伝子解読からタンパク質解析、即ちプロテオミクスという新たなステップへと踏み出した。遺伝子は、タンパク質を生成するための単なるプログラムコードでしかなく、ほとんど全ての生体活動はそれらのコードをもとに生成された、非常に複雑な構造を持つタンパク質の分子間で行なわれている。ある種のタンパク質が正常に機能しない場合、健康に支障をきたすことが知られている。それゆえに、個々のタンパク質の機能を解明することは、医学の更なる進歩に欠かすことのできないステップであると言える。
【０００３】
従来は、タンパク質の性質、発現状態、構造、活性などの分析には、抽出したタンパク質の混合物を分子量や等電点の違いにより分離し、解析する２次元電気泳動法（２−Ｄ ＰＡＧＥ）が使用されてきた。しかし、２次元電気泳動法は、ハイスル−プット解析に不向きで、検出感度、およびサンプルの可溶化の面でも問題があった。
【０００４】
一方、今日までに数々のＤＮＡチップが報告されている。それらのＤＮＡチップは、ある表現型や生理状態での遺伝子発現の変化の確認や、発現パターンのデータベースを作ることに有用であった。しかし通常、遺伝子とタンパク質の発現量やパターンは必ずしも正確に相関しないため、ＤＮＡチップはタンパク質の発現レベルの定量化には使用することができない。またタンパク質は翻訳後に、リン酸化、糖鎖付加、切断などの、さまざまな修飾を受けることによってその機能が変化するため、それらの翻訳後修飾の情報をＤＮＡ解析からは得ることもできない。
【０００５】
そこでＤＮＡアレイ技術を、タンパク質解析のツールとして用いたものとしてプロテインチップが開発された。プロテインチップの原理はＤＮＡチップと同じで、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用するタンパク質や核酸などを検出するものである。しかし、強固なＤＮＡ鎖に対し、巧みにアミノ酸が絡み合ってできている非常に不安定な構造をもつタンパク質を基板上に固定化させることは容易ではない上、多くの場合、タンパク質の反応性は３次元の折りたたみ構造の変化によって変わるため、タンパク質を取り巻く僅かな環境の変化がタンパク質を変性させることもあり、目的のタンパク質を機能が保持された状態で解析することは困難であった。
【０００６】
また、従来開発されたプロテインチップは、スライドガラス又はシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にタンパク質を固定化するものであるが、スライドガラス又はシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してタンパク質を固定化する方法では、タンパク質の固定化状態が不安定であり、洗浄工程において剥離するといった問題が生じるとともに、固定化されたタンパク質を長期間保存することも不可能であった。また、生体物質の非特異吸着や、タンパク質の機能失活、検出系ＵＶ不透明性等の問題もあった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、タンパク質の解析やタンパク質保存を効率的に行うための、ペプチドを安定に固定化する固体支持体であって、タンパク質の機能失活がなく、検出系ＵＶに対して透明性であり、さらに結合させたペプチドの脱着が可能な固体支持体を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、表面がカーボン層から構成された基板を化学修飾し、さらに金属キレートを形成させた固体支持体により、上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）基板表面の一部又は全部がカーボン層で構成されており、その層上に金属キレートが形成されてなる固体支持体。
（２）カーボン層がダイヤモンドライクカーボン層又はダイヤモンド層である（１）に記載の固体支持体。
（３）前記カーボン層の厚みが、炭素単分子〜１００μｍである（１）又は（２）に記載の固体支持体。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体の表面にペプチドを固定化してペプチドを解析する方法。
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体の表面にペプチドを固定化してペプチドを保存する方法。
（６）その表面に形成された金属キレートにペプチドが固定化されてなる（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の固体支持体は、基板の表面にカーボン層を形成し、このカーボン層に特定の化学修飾を施したことを特徴とするものである。本発明における化学修飾とは、このカーボン層の上に金属キレートを形成するキレート配位子を、スペーサーを介して導入して、金属キレートを形成させることを意味する。このような化学修飾によって、ペプチドを固体支持体の表面に固定化することができる。
【００１１】
本発明において基板とはカーボン層を形成させるための基材を意味し、このような基材は、特に限定されないが、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体を挙げることができる。本発明においては、蛍光測定におけるバックグラウンドの低減、透過光による測定、コスト、生産性の観点から、ガラス又はシリコンを用いるのが好ましい。基板の形状及びサイズは特に限定されないが、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００１２】
スペーサーの構造としては、ペプチドの結合を阻害せず、金属キレート配位子を導入できるものであれば特に限定されないが、炭素数１〜１２、中でも１〜６の炭化水素鎖が好ましい。このような炭化水素鎖は、飽和でも不飽和でもよく、置換されていても無置換でもよい。また、直鎖状、分枝状又は環状でもよい。例えば、炭素数１〜１２、好ましくは１〜６のアルキレン基、例えば、メチレン、エチリデン、ジメチルメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、１，２−シクロへキシレン、１，４−シクロへキシレン；（メチル）（フェニル）メチレン、ジフェニルメチレン等のアリールアルキレン基；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−；フェニレン等のアリーレン基；及びベンゼン誘導体又はシクロヘキサン誘導体構造を有する２価の基等を挙げることができる。
【００１３】
本発明においてキレート配位子とは、金属イオンに配位してキレート化合物をつくることができる多座配位子をいう。キレート配位子の構造としては、例えば、イミノジカルボン酸、ニトリロトリ酢酸、テルピリジン、ビピリジン、トリエチレンテトラアミン、ビエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸類似化合物、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、大環状ポリアミンジオキソ誘導体、ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、ジメチルグリオキシム、２，４−ペンタンジオン、アラニン、ビピリジン、ジアミノシクロペンタン、ジエチレントリアミン、ジメチルグリオキシム、アエチレントリアミン五酢酸、グリシン、ヘキサエチレンヘキサミン、２−メチル−１，２−プロパンジアミン、イソキノリン、マロン酸、Ｏ−フェニレンジアミン、シュウ酸、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−アミノエチル）エチレンジアミン、１，１０−フェナントロリン、γ−ピコリン−１，２−プロパンジアミン、ピリジン、キノリン、ヒスチジン、３，４−ジアセチル−２，５−ヘキサンジオン、２，２’，２’’−テルピリジン、テトラエチレンペンタアミン、１，３−プロパンジアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、トリエチレンテトラアミン及び尿素等の構造を有するものが挙げられる。本発明においては、イミノジカルボン酸構造、イミノジカルボン酸類似構造、トリエチレンテトラアミン構造をとるものが好ましい。
【００１４】
キレート配位子を導入するための工程は、特に限定されないが、例えば、基板表面を塩素化、アミノ化した状態で、形成された第１級アミノ基に、ハロカルボン酸類を反応させてキレート配位子を形成することができる。アミノ化は、例えば、アンモニアガス又はポリアミン類ガス中で紫外線照射することにより実施できる。あるいは、適宜触媒を用い、適当な溶媒下でポリアミン類を反応させることにより行うこともできる。この場合に使用できるポリアミン類としては、特に限定されないが、例えば、メチレンジアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ペンタメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、フェニレンジアミン、ベンジジン、ジアミノスチルベン、トリジン、ジアミノベンジジン、ポリアリルアミン等が挙げられ、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ポリアリルアミンを用いるのが好ましい。溶媒としては、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ジメトキシエタン、ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン等を用いることができ、触媒又は反応試薬としては、トリエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン、ピリジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン等を用いることができる。
【００１５】
続いて、ハロカルボン酸を用いることによりイミノジ酢酸類似構造を有するキレート配位子を形成することができる。ハロカルボン酸としては特に限定されないが、例えば、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸等が挙げられ、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸を用いるのが好ましい。
あるいは、無水エチレンジアミン四酢酸を用いることによりキレート配位子を形成することもできる。
【００１６】
別法として、カーボン層が形成された基板を塩素化し、次いでこれをアミノ化した後、さらにカルボキシル基を導入し、末端のカルボキシル基にキレート配位子を導入することもできる。この場合、塩素化及びアミノ化は上記と同様の方法によって実施できる。カルボキシル基は、例えば、アミノ基を適当なジカルボン酸と反応させることにより導入できる。形成されたカルボキシル基に、例えば、イミノジ酢酸などのイミノジカルボン酸、ニトリロトリ酢酸、テルピリジン、ビピリジン、トリエチレンテトラアミン、ビエチレントリアミン及びこれらの塩を加えることによりキレート配位子を導入することができる。本発明においては、イミノジカルボン酸を用いるのが好ましい。キレート配位子を導入する際には、適宜触媒や反応試薬などを用いて適当な溶媒下で行うことができる。
【００１７】
そして、上記のようにして形成されたキレート配位子に対して金属イオンを添加することにより、金属キレートを形成させることができる。キレートを形成する金属イオンとしては、例えば、鉄イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、カルシウムイオン、銀イオン、銅イオン、錫イオン、クロムイオン、ルテニウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、カドミウムイオン、マンガンイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、水銀イオン、鉛イオン等が挙げられ、ペプチドに対する親和性の観点からニッケルイオン、コバルトイオン、亜鉛イオン、銅イオン等が好ましい。キレート配位子が形成された基板表面にこれらの金属の塩、例えば、硫酸ニッケル、コハク酸ニッケル、水酸化ニッケル、酢酸コバルト、アミド硫酸コバルト、塩化コバルト、安息香酸コバルト、ホウ酸コバルト、臭化コバルト、クロム酸コバルト、ギ酸コバルト、ナフテン酸コバルト、硝酸コバルト、オレイン酸コバルト、リン酸コバルト、ステアリン酸コバルト、硫酸コバルト、酒石酸コバルト、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、硝酸亜鉛、シュウ酸亜鉛、硫酸亜鉛、酒石酸亜鉛、塩化銅、フッ化銅、ギ酸銅、グルコン酸銅、硝酸銅、シュウ酸銅、リン酸銅、硫酸銅等を添加することにより、金属キレートを形成させることができる。この際、錯形成を安定に行わせるために、クエン酸、酒石酸等を加え、必要に応じｐＨを３〜１１に調整することが望ましい。このようにして形成された金属キレートに対して、ペプチドが配位することにより固体支持体に固定化される。
【００１８】
また金属キレートは、静電結合、イオン性結合又は同位共有結合によってカーボン層に導入することもできる。カーボン層に疎水性相互作用が可能な官能基を導入してこれに金属キレートを導入することもできる。
【００１９】
本発明においてペプチドは、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質を包含し、単純タンパク質、複合タンパク質でもよく、天然のものでも合成のものでもよい。ペプチドの長さは特に限定されないが、アミノ酸数１〜１００００、好ましくは１〜１０００のものを固定化するのに好適である。本発明の固体支持体に固定化できる標的ペプチドとしては、特に限定されず、例えば、抗体、酵素、病原性タンパク、ペプチド系ホルモン、レセプター、キナーゼ、糖タンパク質、金属タンパク質、ウイルス、誘導タンパク質等のタンパク質を好適に固定化することができる。
【００２０】
標的ペプチドは、キレートを形成している金属イオンと特異的に作用するように、適当な標識を有するのが好ましい。このような標識としては、亜鉛、ニッケル又はコバルトイオンのような金属イオンと特異的に相互作用するポリヒスチジン配列（例えば、ヘキサヒスチジン配列）、又は、それぞれ、亜鉛若しくは銅と特異的に相互作用する、少なくとも約４個のリシンを含むポリリシン配列若しくは少なくとも４個のアルギニン残基を含むポリアルギニン配列が挙げられる。このような標識を有するペプチドは、例えば、標的ペプチドをコードするヌクレオチド配列を標識ペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結し、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳し、続いて標識と特異的に相互作用する試薬を用いて翻訳反応物から単離することによって入手できる。
【００２１】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に限定されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム又は炭化バナジウム等を挙げることができる。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾やペプチドの結合における反応に耐えることができる点、及びＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点において有利である。
【００２２】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＰＣ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００２３】
高周波プラズマＣＶＤ法では、１３．５６ＭＨｚの高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基体上にＤＬＣ（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ、ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基体上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成しても良い。
【００２４】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基体に印加することにより基体に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００２５】
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧ（Ｙｔｔｒｉｕｍ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｇａｒｎｅｔ）レーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００２６】
ペプチドを本発明の固体支持体に固定化してこれを保存する場合は、基板表面にダイヤモンド層が形成されていることが好ましい。ダイヤモンドは熱伝導性に優れており、急速な冷却が可能だからである。
【００２７】
ダイヤモンドとして、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、又は天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。また、それらの構造が単結晶体又は多結晶体のいずれでも差し支えない。生産性の観点よりマイクロ波プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンド層を用いることが好ましい。
【００２８】
本発明の固体支持体をペプチドの保存に用いる場合、固体支持体の表面は意図的に粗面化されていることが望ましい。このような粗面化表面は表面積が増えて多量のペプチドを固定させることに好都合だからである。固体支持体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。さらに、この固体支持体は、ダイヤモンドと他の物質との複合体（例えば、２層からなる基板）であってもよい。
【００２９】
各ペプチドが機能を失うことなく安定に存在できるバッファー中に本発明の固体支持体を浸漬する事により、本発明の方法により固定化されたペプチドは、バッファー中で保存するのと同等の期間にわたって、その機能を失うことなく安定に固体支持体上に固定化される。
【００３０】
本発明の固体支持体をペプチドの解析に用いる場合、基板表面は、ペプチドの非特異的吸着を防ぎ、試薬に対する耐性を高め、蛍光測定におけるバックグラウンドを低減し、透過光による測定を可能にし、そして、コスト及び生産性も高いという観点からダイヤモンドライクカーボンで形成されていることが好ましい。ダイヤモンドの場合と同様に、ダイヤモンドライクカーボン層を形成させる基板は特に限定されず、スライドガラス、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体等を使用することができる。また、タンパク質等の解析に用いる場合は、基板の形状は解析装置に合わせた形状、例えば球状又は平板状であることが好ましい。
【００３１】
ダイヤモンドライクカーボン層を基板表面に形成し、そして上記のように化学修飾して金属キレートを形成した固体支持体を用い、例えば、蛍光標識したペプチドをこの固体支持体に固定化して蛍光検出を行うと、バックグラウンドが低く蛍光シグナルが高くなる、すなわち高度のＳ／Ｎ比がもたらされる。
【００３２】
本発明の固体支持体表面のカーボン層の厚さは、可視光の透過性、蛍光に対するバックグラウンドの低下の観点から炭素単分子〜１００μｍであることが好ましく、より好ましくは炭素単分子〜１００ｎｍ、さらに好ましくは炭素単分子〜１０ｎｍである。なお、透過性の点で若干劣るが、固体支持体のすべてがカーボンで構成されたものでも適用できる。
【００３３】
本発明の固体支持体は、これに結合した標的ペプチドを質量分析によって解析するためにも好適である。この場合の質量分析に使用可能な質量分析計の様式は、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ、Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、連続的又はパルス型電子スプレー（ＥＳＩ、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）及びイオンスプレー又は熱スプレーのような関連方法、ならびに大質量クラスター衝撃（ＭＣＩ、Ｍａｓｓｉｖｅ−ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｍｐａｃｔ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）のようなイオン化（Ｉ）手法を含むが、これらに限定されない。そのようなイオン源は、線形又は非線形反射飛行時間（ＴＯＦ：Ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ）、単一又は多重四重極、単一又は多重磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ、Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｏｎ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、イオン捕獲、ならびにイオン捕獲／飛行時間のようなそれらの組合せを含む検出様式に適合させることができる。イオン化については、数多くのマトリックス／波長の組合せ（ＭＡＬＤＩ）又は溶媒の組合せ（ＥＳＩ）が使用できる。アットモル以下のレベルのタンパク質は、例えばＥＳＩ質量分析（Ｖａｌａｓｋｏｖｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１１９９−１２０２（１９９６））及びＭＡＬＤＩ質量分析（Ｌｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１６６２−１６６３（１９９６））を用いて検出できる。
【００３４】
電子スプレー質量分析はＦｅｎｎら（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８：４４５１−５９（１９８４）；ＷＯ９０／１４１４８）によって記述されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析はＨｉｌｌｅｎｋａｍｐら（”Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ ＵＶ−Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”（ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅとＭｃＣｌｏｓｋｅｙ編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌ．１９９０），ｐ．４９−６０）によって記述されている。ＥＳＩに関しては、多数のイオンピークが存在し、そのすべてが質量計算に使用できるため、サンプルのフェムトモル量の分子量の測定が非常に正確である。
【００３５】
質量分析によって測定した標的ペプチドの質量を、対応する既知のペプチドの質量と比較することができる。例えば、標的ペプチドが突然変異タンパク質である場合、対応する既知のペプチドとして対応する正常タンパク質と比較することができる。
【００３６】
上記のような質量分析を用いて標的ペプチドを解析する工程は、標的ペプチドのアミノ酸配列又はその一部を決定することによって実施できる。アミノ酸配列決定は、例えば、カルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＧ若しくはカルボキシペプチダーゼＢのようなカルボキシペプチダーゼ等の酵素を用いてカルボキシル末端から、又はエドマン分解法を用いて若しくはアラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ピログルタミン酸ペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、マイクロクロソームペプチダーゼのようなアミノペプチダーゼ等の酵素を用いて、標的ペプチドのＮ末端から実施することができる。そして放出されたアミノ酸を質量分析によって同定する。
このようなペプチドの質量分析に用いる場合は、ダイヤモンドライクカーボン層を有する固体支持体を用いるのが好ましい。
【００３７】
【実施例】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ガラス基板として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のものを用いた。このガラス基板の表面に、イオン化蒸着法により、メタンガス９５体積％、水素ガス５体積％を混合したガスを原料として、ＤＬＣ層を１０ｎｍ厚みに形成したスライドガラスを作成した。
【００３８】
次に、このスライドガラス表面を化学修飾し、ニッケルイオンを配位させた。すなわち、スライドガラスを入れた反応容器内に塩素を導入した後、高圧水銀灯の光を１分間照射することによってガラス基板表面を塩素化し、ジメチルホルムアミド２００ｍｌ、エチレンジアミン１２ｍｌ、トリエチルアミン３８ｍｌの混合液に浸漬し、室温で５時間撹拌した後、水２００ｍｌで３回洗浄し、クロロ酢酸２８．２ｇを含む１．２５モル水酸化ナトリウム水溶液２４０ｍｌに加えて室温で一晩撹拌した。このスライドガラスを酒石酸１５．０ｇ、クエン酸２１．０ｇ、２８％アンモニア水３０ｍｌを含む０．２モル硫酸ニッケル水溶液５００ｍｌに浸漬し、室温で３時間撹拌し、水２００ｍｌで３回洗浄した後、ＸＰＳ（Ｘ−ｒａｙ ｐｈｏｔｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）にて表面分析したところ、８５５．０〜８５９．０ｅＶにニッケル由来のピークを確認した。
【００３９】
前記において、ＸＰＳで分析する前の固体支持体を水２００ｍｌで３回洗浄し、乾燥後、真空パックをした。真空パックは、真空容器を１Ｔｏｒｒ以下まで排気した後に、その中で真空袋を熱融着することによりパックする。真空パック内で４℃にて６ヶ月放置してもＸＰＳによるニッケルピークの分析結果は、経時しない場合と同じであり、キレートとして固定化する機能に変化が見られなかった。
【００４０】
実施例２
ＤＬＣ（Ｄｉａｍｏｎｄ ｌｉｋｅ ｃａｒｂｏｎ、ダイヤモンドライクカーボン）層を形成した基板上に金属キレートを形成させた固体支持体を作成し、この固体支持体上にポリヒスチジン配列を融合させたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をピペッターで０．２μｌずつスポットした。そして、３７℃に保った湿箱に入れ、１時間反応させた。その後１×ＰＢＳで１５分間洗浄し、ＬＡＳ１０００（富士写真フィルム株式会社製）にて蛍光測定を行った。条件は次の通りである。ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）；１３０万画素（冷却ＣＣＤカメラ）、有効画素；１３８４（Ｈ）×９２２（Ｖ）ピクセル、画角；７ｃｍ×１１ｃｍ、露出時間；１０秒。ＧＦＰによる自家蛍光を測定した。測定結果を図１に示す。図１は、タンパク質を固定化した固体支持体について、化学発光測定装置により、ＧＦＰによる自家蛍光の強度を二次元に画像化したものである。丸くスポットになっているところがＧＦＰの存在部分である。この結果ポリヒスチジン配列を融合したＧＦＰから蛍光が観測された。以上から、ＧＦＰは蛍光機能を保持したまま固定化されていることが明らかとなった。
【００４１】
また、前記したように、ポリヒスチジン配列を融合させたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を固定化した固体支持体を、オートクレーブ減菌した０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）４５ｍＬに、４℃で１週間、２週間、１ヶ月間浸漬した後、ＬＡＳ１０００（富士写真フィルム株式会社製）にて、ＧＦＰによる自家蛍光を測定した。測定条件は以下の通りである。ＣＣＤ：１３０万画素（冷却ＣＣＤカメラ）、有効画素：１３８４（Ｈ）×９２２（Ｖ）ピクセル、画角：７ｃｍ×１１ｃｍ、露出時間：１０秒。測定結果を図３に示す。図３は、タンパク質を固定化した固体支持体について、化学発光測定装置により測定したＧＦＰによる自家蛍光の強度率をグラフ化したものである。この時ＧＦＰの自家蛍光はスポット部位の８９ピクセルを測定し、各ピクセルの平均を自家蛍光強度とした。これにより、ＧＦＰを固定化した状態で、４℃で１ヶ月保存しても、初期の自家蛍光強度率１に対して、強度率０．８を維持しており、ＧＦＰが安定に固定化されているとともに、その機能が保持されていることが明らかとなった。
【００４２】
実施例３
ＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を形成した基板上に金属キレートを形成させた固体支持体を作成し、この固体支持体上にＣｙ５蛍光標識したポリヒスチジン配列を融合させたＧＦＰとＣｙ３蛍光標識したプロテインＡをピペッターで０．２μｌずつスポットした。そして３７℃に保った湿箱に入れ、１時間反応させた。そして、▲１▼１×ＰＢＳで１５分間洗浄、▲２▼１０ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳで１５分間洗浄、▲３▼５００ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳで１５分間洗浄、の３種の処理を行った後、ＦＬＡ８０００（富士写真フィルム株式会社製）にて蛍光測定を行った。測定結果を図２に示す。図２は、タンパク質を固定化した固体支持体について、蛍光測定装置により測定した色素による蛍光強度を二次元に画像化したものである。丸くスポットになっているところが蛍光標識したタンパクの存在部分である。その結果、▲１▼ではＣｙ５蛍光標識したポリヒスチジン配列を融合させたＧＦＰとＣｙ３蛍光標識したプロテインＡの両方が固定化しており、▲２▼ではＣｙ５蛍光標識したポリヒスチジン配列を融合したＧＦＰのみが固定化しており、▲３▼では両方が固定化されていなかった。以上から、本発明の固体支持体においては、イミダゾールの濃度を変えることによりタンパク質の脱着が可能であることが明らかとなった。
【００４３】
実施例４
ガラス基板として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のものを用いた。このガラス基板の表面に、イオン化蒸着法により、メタンガス９５体積％、水素ガス５体積％を混合したガスを原料として、ＤＬＣ層を１０ｎｍ厚みに形成したスライドガラスを作成した。
【００４４】
次に、このスライドガラス表面を化学修飾し、ニッケルイオンを配位させた。すなわち、スライドガラスを入れた反応容器内に塩素を導入した後、高圧水銀灯の光を１分間照射することによってガラス基板表面を塩素化し、イミノジ酢酸１９．８ｇを含む０．８モル水酸化ナトリウム水溶液２５０ｍｌに入れて溶液を室温で一晩撹拌した。このスライドガラスを酒石酸１５．０ｇ、クエン酸２１．０ｇ、２８％アンモニア水３０ｍｌを含む０．２モル硫酸ニッケル水溶液５００ｍｌに浸漬し、室温で３時間撹拌し、水２００ｍｌで３回洗浄した後、ＸＰＳにて表面分析したところ、８５５．０〜８５９．０ｅＶにニッケル由来のピークを確認した。前記において、ＸＰＳで分析する前の固体支持体を水２００ｍｌで３回洗浄し、乾燥した後、真空パックをした。真空パックは、真空容器を１Ｔｏｒｒ以下まで排気した後に、その中で真空袋を熱融着することによりパックする。真空パックの中で、４℃で６ヶ月放置してもニッケル由来のピークの分析結果は、経時しない場合と同じであり、キレートとしての機能が維持されていることが明らかとなった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明のカーボン層上に金属キレートを形成した固体支持体は、ＵＶ透過性などの光学的特性に優れており、さらに、ペプチドをその機能を失うことなく長期間にわたり安定に固定化できるとともに、ペプチドの脱着が可能である。従って、ペプチドの保存及び解析において有用な手段として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】タンパク質の固定化された固体支持体について、化学発光測定装置により、ＧＦＰによる自家蛍光の強度を二次元に画像化したものである。丸くスポットになっているところがＧＦＰの存在部分である。
【図２】タンパク質を固定化した固体支持体について、蛍光測定装置により、色素による蛍光強度を二次元に画像化したものである。丸くスポットになっているところが蛍光標識したタンパクの存在部分である。
【図３】タンパク質を固定化した固体支持体の蛍光強度を、経時的に試験した結果を表すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子生物学分野、生化学関連分野において有用な、ペプチドの固定化が可能な、又はマイクロラボラトリーとして有用な固体支持体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム計画の終了に伴い、生物、医学の研究は遺伝子解読からタンパク質解析、即ちプロテオミクスという新たなステップへと踏み出した。遺伝子は、タンパク質を生成するための単なるプログラムコードでしかなく、ほとんど全ての生体活動はそれらのコードをもとに生成された、非常に複雑な構造を持つタンパク質の分子間で行なわれている。ある種のタンパク質が正常に機能しない場合、健康に支障をきたすことが知られている。それゆえに、個々のタンパク質の機能を解明することは、医学の更なる進歩に欠かすことのできないステップであると言える。
【０００３】
従来は、タンパク質の性質、発現状態、構造、活性などの分析には、抽出したタンパク質の混合物を分子量や等電点の違いにより分離し、解析する２次元電気泳動法（２−Ｄ ＰＡＧＥ）が使用されてきた。しかし、２次元電気泳動法は、ハイスル−プット解析に不向きで、検出感度、およびサンプルの可溶化の面でも問題があった。
【０００４】
一方、今日までに数々のＤＮＡチップが報告されている。それらのＤＮＡチップは、ある表現型や生理状態での遺伝子発現の変化の確認や、発現パターンのデータベースを作ることに有用であった。しかし通常、遺伝子とタンパク質の発現量やパターンは必ずしも正確に相関しないため、ＤＮＡチップはタンパク質の発現レベルの定量化には使用することができない。またタンパク質は翻訳後に、リン酸化、糖鎖付加、切断などの、さまざまな修飾を受けることによってその機能が変化するため、それらの翻訳後修飾の情報をＤＮＡ解析からは得ることもできない。
【０００５】
そこでＤＮＡアレイ技術を、タンパク質解析のツールとして用いたものとしてプロテインチップが開発された。プロテインチップの原理はＤＮＡチップと同じで、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用するタンパク質や核酸などを検出するものである。しかし、強固なＤＮＡ鎖に対し、巧みにアミノ酸が絡み合ってできている非常に不安定な構造をもつタンパク質を基板上に固定化させることは容易ではない上、多くの場合、タンパク質の反応性は３次元の折りたたみ構造の変化によって変わるため、タンパク質を取り巻く僅かな環境の変化がタンパク質を変性させることもあり、目的のタンパク質を機能が保持された状態で解析することは困難であった。
【０００６】
また、従来開発されたプロテインチップは、スライドガラス又はシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にタンパク質を固定化するものであるが、スライドガラス又はシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してタンパク質を固定化する方法では、タンパク質の固定化状態が不安定であり、洗浄工程において剥離するといった問題が生じるとともに、固定化されたタンパク質を長期間保存することも不可能であった。また、生体物質の非特異吸着や、タンパク質の機能失活、検出系ＵＶ不透明性等の問題もあった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、タンパク質の解析やタンパク質保存を効率的に行うための、ペプチドを安定に固定化する固体支持体であって、タンパク質の機能失活がなく、検出系ＵＶに対して透明性であり、さらに結合させたペプチドの脱着が可能な固体支持体を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、表面がカーボン層から構成された基板を化学修飾し、さらに金属キレートを形成させた固体支持体により、上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）基板表面の一部又は全部がカーボン層で構成されており、その層上に金属キレートが形成されてなる固体支持体。
（２）カーボン層がダイヤモンドライクカーボン層又はダイヤモンド層である（１）に記載の固体支持体。
（３）前記カーボン層の厚みが、炭素単分子〜１００μｍである（１）又は（２）に記載の固体支持体。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体の表面にペプチドを固定化してペプチドを解析する方法。
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体の表面にペプチドを固定化してペプチドを保存する方法。
（６）その表面に形成された金属キレートにペプチドが固定化されてなる（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の固体支持体は、基板の表面にカーボン層を形成し、このカーボン層に特定の化学修飾を施したことを特徴とするものである。本発明における化学修飾とは、このカーボン層の上に金属キレートを形成するキレート配位子を、スペーサーを介して導入して、金属キレートを形成させることを意味する。このような化学修飾によって、ペプチドを固体支持体の表面に固定化することができる。
【００１１】
本発明において基板とはカーボン層を形成させるための基材を意味し、このような基材は、特に限定されないが、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体を挙げることができる。本発明においては、蛍光測定におけるバックグラウンドの低減、透過光による測定、コスト、生産性の観点から、ガラス又はシリコンを用いるのが好ましい。基板の形状及びサイズは特に限定されないが、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００１２】
スペーサーの構造としては、ペプチドの結合を阻害せず、金属キレート配位子を導入できるものであれば特に限定されないが、炭素数１〜１２、中でも１〜６の炭化水素鎖が好ましい。このような炭化水素鎖は、飽和でも不飽和でもよく、置換されていても無置換でもよい。また、直鎖状、分枝状又は環状でもよい。例えば、炭素数１〜１２、好ましくは１〜６のアルキレン基、例えば、メチレン、エチリデン、ジメチルメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、１，２−シクロへキシレン、１，４−シクロへキシレン；（メチル）（フェニル）メチレン、ジフェニルメチレン等のアリールアルキレン基；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−；フェニレン等のアリーレン基；及びベンゼン誘導体又はシクロヘキサン誘導体構造を有する２価の基等を挙げることができる。
【００１３】
本発明においてキレート配位子とは、金属イオンに配位してキレート化合物をつくることができる多座配位子をいう。キレート配位子の構造としては、例えば、イミノジカルボン酸、ニトリロトリ酢酸、テルピリジン、ビピリジン、トリエチレンテトラアミン、ビエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸類似化合物、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、大環状ポリアミンジオキソ誘導体、ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、ジメチルグリオキシム、２，４−ペンタンジオン、アラニン、ビピリジン、ジアミノシクロペンタン、ジエチレントリアミン、ジメチルグリオキシム、アエチレントリアミン五酢酸、グリシン、ヘキサエチレンヘキサミン、２−メチル−１，２−プロパンジアミン、イソキノリン、マロン酸、Ｏ−フェニレンジアミン、シュウ酸、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−アミノエチル）エチレンジアミン、１，１０−フェナントロリン、γ−ピコリン−１，２−プロパンジアミン、ピリジン、キノリン、ヒスチジン、３，４−ジアセチル−２，５−ヘキサンジオン、２，２’，２’’−テルピリジン、テトラエチレンペンタアミン、１，３−プロパンジアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、トリエチレンテトラアミン及び尿素等の構造を有するものが挙げられる。本発明においては、イミノジカルボン酸構造、イミノジカルボン酸類似構造、トリエチレンテトラアミン構造をとるものが好ましい。
【００１４】
キレート配位子を導入するための工程は、特に限定されないが、例えば、基板表面を塩素化、アミノ化した状態で、形成された第１級アミノ基に、ハロカルボン酸類を反応させてキレート配位子を形成することができる。アミノ化は、例えば、アンモニアガス又はポリアミン類ガス中で紫外線照射することにより実施できる。あるいは、適宜触媒を用い、適当な溶媒下でポリアミン類を反応させることにより行うこともできる。この場合に使用できるポリアミン類としては、特に限定されないが、例えば、メチレンジアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ペンタメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、フェニレンジアミン、ベンジジン、ジアミノスチルベン、トリジン、ジアミノベンジジン、ポリアリルアミン等が挙げられ、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ポリアリルアミンを用いるのが好ましい。溶媒としては、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ジメトキシエタン、ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン等を用いることができ、触媒又は反応試薬としては、トリエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン、ピリジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン等を用いることができる。
【００１５】
続いて、ハロカルボン酸を用いることによりイミノジ酢酸類似構造を有するキレート配位子を形成することができる。ハロカルボン酸としては特に限定されないが、例えば、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸等が挙げられ、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸を用いるのが好ましい。
あるいは、無水エチレンジアミン四酢酸を用いることによりキレート配位子を形成することもできる。
【００１６】
別法として、カーボン層が形成された基板を塩素化し、次いでこれをアミノ化した後、さらにカルボキシル基を導入し、末端のカルボキシル基にキレート配位子を導入することもできる。この場合、塩素化及びアミノ化は上記と同様の方法によって実施できる。カルボキシル基は、例えば、アミノ基を適当なジカルボン酸と反応させることにより導入できる。形成されたカルボキシル基に、例えば、イミノジ酢酸などのイミノジカルボン酸、ニトリロトリ酢酸、テルピリジン、ビピリジン、トリエチレンテトラアミン、ビエチレントリアミン及びこれらの塩を加えることによりキレート配位子を導入することができる。本発明においては、イミノジカルボン酸を用いるのが好ましい。キレート配位子を導入する際には、適宜触媒や反応試薬などを用いて適当な溶媒下で行うことができる。
【００１７】
そして、上記のようにして形成されたキレート配位子に対して金属イオンを添加することにより、金属キレートを形成させることができる。キレートを形成する金属イオンとしては、例えば、鉄イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、カルシウムイオン、銀イオン、銅イオン、錫イオン、クロムイオン、ルテニウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、カドミウムイオン、マンガンイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、水銀イオン、鉛イオン等が挙げられ、ペプチドに対する親和性の観点からニッケルイオン、コバルトイオン、亜鉛イオン、銅イオン等が好ましい。キレート配位子が形成された基板表面にこれらの金属の塩、例えば、硫酸ニッケル、コハク酸ニッケル、水酸化ニッケル、酢酸コバルト、アミド硫酸コバルト、塩化コバルト、安息香酸コバルト、ホウ酸コバルト、臭化コバルト、クロム酸コバルト、ギ酸コバルト、ナフテン酸コバルト、硝酸コバルト、オレイン酸コバルト、リン酸コバルト、ステアリン酸コバルト、硫酸コバルト、酒石酸コバルト、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、硝酸亜鉛、シュウ酸亜鉛、硫酸亜鉛、酒石酸亜鉛、塩化銅、フッ化銅、ギ酸銅、グルコン酸銅、硝酸銅、シュウ酸銅、リン酸銅、硫酸銅等を添加することにより、金属キレートを形成させることができる。この際、錯形成を安定に行わせるために、クエン酸、酒石酸等を加え、必要に応じｐＨを３〜１１に調整することが望ましい。このようにして形成された金属キレートに対して、ペプチドが配位することにより固体支持体に固定化される。
【００１８】
また金属キレートは、静電結合、イオン性結合又は同位共有結合によってカーボン層に導入することもできる。カーボン層に疎水性相互作用が可能な官能基を導入してこれに金属キレートを導入することもできる。
【００１９】
本発明においてペプチドは、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質を包含し、単純タンパク質、複合タンパク質でもよく、天然のものでも合成のものでもよい。ペプチドの長さは特に限定されないが、アミノ酸数１〜１００００、好ましくは１〜１０００のものを固定化するのに好適である。本発明の固体支持体に固定化できる標的ペプチドとしては、特に限定されず、例えば、抗体、酵素、病原性タンパク、ペプチド系ホルモン、レセプター、キナーゼ、糖タンパク質、金属タンパク質、ウイルス、誘導タンパク質等のタンパク質を好適に固定化することができる。
【００２０】
標的ペプチドは、キレートを形成している金属イオンと特異的に作用するように、適当な標識を有するのが好ましい。このような標識としては、亜鉛、ニッケル又はコバルトイオンのような金属イオンと特異的に相互作用するポリヒスチジン配列（例えば、ヘキサヒスチジン配列）、又は、それぞれ、亜鉛若しくは銅と特異的に相互作用する、少なくとも約４個のリシンを含むポリリシン配列若しくは少なくとも４個のアルギニン残基を含むポリアルギニン配列が挙げられる。このような標識を有するペプチドは、例えば、標的ペプチドをコードするヌクレオチド配列を標識ペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結し、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳し、続いて標識と特異的に相互作用する試薬を用いて翻訳反応物から単離することによって入手できる。
【００２１】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に限定されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム又は炭化バナジウム等を挙げることができる。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾やペプチドの結合における反応に耐えることができる点、及びＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点において有利である。
【００２２】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＰＣ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００２３】
高周波プラズマＣＶＤ法では、１３．５６ＭＨｚの高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基体上にＤＬＣ（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ、ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基体上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成しても良い。
【００２４】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基体に印加することにより基体に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００２５】
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧ（Ｙｔｔｒｉｕｍ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｇａｒｎｅｔ）レーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００２６】
ペプチドを本発明の固体支持体に固定化してこれを保存する場合は、基板表面にダイヤモンド層が形成されていることが好ましい。ダイヤモンドは熱伝導性に優れており、急速な冷却が可能だからである。
【００２７】
ダイヤモンドとして、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、又は天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。また、それらの構造が単結晶体又は多結晶体のいずれでも差し支えない。生産性の観点よりマイクロ波プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンド層を用いることが好ましい。
【００２８】
本発明の固体支持体をペプチドの保存に用いる場合、固体支持体の表面は意図的に粗面化されていることが望ましい。このような粗面化表面は表面積が増えて多量のペプチドを固定させることに好都合だからである。固体支持体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。さらに、この固体支持体は、ダイヤモンドと他の物質との複合体（例えば、２層からなる基板）であってもよい。
【００２９】
各ペプチドが機能を失うことなく安定に存在できるバッファー中に本発明の固体支持体を浸漬する事により、本発明の方法により固定化されたペプチドは、バッファー中で保存するのと同等の期間にわたって、その機能を失うことなく安定に固体支持体上に固定化される。
【００３０】
本発明の固体支持体をペプチドの解析に用いる場合、基板表面は、ペプチドの非特異的吸着を防ぎ、試薬に対する耐性を高め、蛍光測定におけるバックグラウンドを低減し、透過光による測定を可能にし、そして、コスト及び生産性も高いという観点からダイヤモンドライクカーボンで形成されていることが好ましい。ダイヤモンドの場合と同様に、ダイヤモンドライクカーボン層を形成させる基板は特に限定されず、スライドガラス、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体等を使用することができる。また、タンパク質等の解析に用いる場合は、基板の形状は解析装置に合わせた形状、例えば球状又は平板状であることが好ましい。
【００３１】
ダイヤモンドライクカーボン層を基板表面に形成し、そして上記のように化学修飾して金属キレートを形成した固体支持体を用い、例えば、蛍光標識したペプチドをこの固体支持体に固定化して蛍光検出を行うと、バックグラウンドが低く蛍光シグナルが高くなる、すなわち高度のＳ／Ｎ比がもたらされる。
【００３２】
本発明の固体支持体表面のカーボン層の厚さは、可視光の透過性、蛍光に対するバックグラウンドの低下の観点から炭素単分子〜１００μｍであることが好ましく、より好ましくは炭素単分子〜１００ｎｍ、さらに好ましくは炭素単分子〜１０ｎｍである。なお、透過性の点で若干劣るが、固体支持体のすべてがカーボンで構成されたものでも適用できる。
【００３３】
本発明の固体支持体は、これに結合した標的ペプチドを質量分析によって解析するためにも好適である。この場合の質量分析に使用可能な質量分析計の様式は、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ、Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、連続的又はパルス型電子スプレー（ＥＳＩ、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）及びイオンスプレー又は熱スプレーのような関連方法、ならびに大質量クラスター衝撃（ＭＣＩ、Ｍａｓｓｉｖｅ−ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｍｐａｃｔ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）のようなイオン化（Ｉ）手法を含むが、これらに限定されない。そのようなイオン源は、線形又は非線形反射飛行時間（ＴＯＦ：Ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ）、単一又は多重四重極、単一又は多重磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ、Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｏｎ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、イオン捕獲、ならびにイオン捕獲／飛行時間のようなそれらの組合せを含む検出様式に適合させることができる。イオン化については、数多くのマトリックス／波長の組合せ（ＭＡＬＤＩ）又は溶媒の組合せ（ＥＳＩ）が使用できる。アットモル以下のレベルのタンパク質は、例えばＥＳＩ質量分析（Ｖａｌａｓｋｏｖｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１１９９−１２０２（１９９６））及びＭＡＬＤＩ質量分析（Ｌｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１６６２−１６６３（１９９６））を用いて検出できる。
【００３４】
電子スプレー質量分析はＦｅｎｎら（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８：４４５１−５９（１９８４）；ＷＯ９０／１４１４８）によって記述されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析はＨｉｌｌｅｎｋａｍｐら（”Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ ＵＶ−Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”（ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅとＭｃＣｌｏｓｋｅｙ編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌ．１９９０），ｐ．４９−６０）によって記述されている。ＥＳＩに関しては、多数のイオンピークが存在し、そのすべてが質量計算に使用できるため、サンプルのフェムトモル量の分子量の測定が非常に正確である。
【００３５】
質量分析によって測定した標的ペプチドの質量を、対応する既知のペプチドの質量と比較することができる。例えば、標的ペプチドが突然変異タンパク質である場合、対応する既知のペプチドとして対応する正常タンパク質と比較することができる。
【００３６】
上記のような質量分析を用いて標的ペプチドを解析する工程は、標的ペプチドのアミノ酸配列又はその一部を決定することによって実施できる。アミノ酸配列決定は、例えば、カルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＧ若しくはカルボキシペプチダーゼＢのようなカルボキシペプチダーゼ等の酵素を用いてカルボキシル末端から、又はエドマン分解法を用いて若しくはアラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ピログルタミン酸ペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、マイクロクロソームペプチダーゼのようなアミノペプチダーゼ等の酵素を用いて、標的ペプチドのＮ末端から実施することができる。そして放出されたアミノ酸を質量分析によって同定する。
このようなペプチドの質量分析に用いる場合は、ダイヤモンドライクカーボン層を有する固体支持体を用いるのが好ましい。
【００３７】
【実施例】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ガラス基板として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のものを用いた。このガラス基板の表面に、イオン化蒸着法により、メタンガス９５体積％、水素ガス５体積％を混合したガスを原料として、ＤＬＣ層を１０ｎｍ厚みに形成したスライドガラスを作成した。
【００３８】
次に、このスライドガラス表面を化学修飾し、ニッケルイオンを配位させた。すなわち、スライドガラスを入れた反応容器内に塩素を導入した後、高圧水銀灯の光を１分間照射することによってガラス基板表面を塩素化し、ジメチルホルムアミド２００ｍｌ、エチレンジアミン１２ｍｌ、トリエチルアミン３８ｍｌの混合液に浸漬し、室温で５時間撹拌した後、水２００ｍｌで３回洗浄し、クロロ酢酸２８．２ｇを含む１．２５モル水酸化ナトリウム水溶液２４０ｍｌに加えて室温で一晩撹拌した。このスライドガラスを酒石酸１５．０ｇ、クエン酸２１．０ｇ、２８％アンモニア水３０ｍｌを含む０．２モル硫酸ニッケル水溶液５００ｍｌに浸漬し、室温で３時間撹拌し、水２００ｍｌで３回洗浄した後、ＸＰＳ（Ｘ−ｒａｙ ｐｈｏｔｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）にて表面分析したところ、８５５．０〜８５９．０ｅＶにニッケル由来のピークを確認した。
【００３９】
前記において、ＸＰＳで分析する前の固体支持体を水２００ｍｌで３回洗浄し、乾燥後、真空パックをした。真空パックは、真空容器を１Ｔｏｒｒ以下まで排気した後に、その中で真空袋を熱融着することによりパックする。真空パック内で４℃にて６ヶ月放置してもＸＰＳによるニッケルピークの分析結果は、経時しない場合と同じであり、キレートとして固定化する機能に変化が見られなかった。
【００４０】
実施例２
ＤＬＣ（Ｄｉａｍｏｎｄ ｌｉｋｅ ｃａｒｂｏｎ、ダイヤモンドライクカーボン）層を形成した基板上に金属キレートを形成させた固体支持体を作成し、この固体支持体上にポリヒスチジン配列を融合させたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をピペッターで０．２μｌずつスポットした。そして、３７℃に保った湿箱に入れ、１時間反応させた。その後１×ＰＢＳで１５分間洗浄し、ＬＡＳ１０００（富士写真フィルム株式会社製）にて蛍光測定を行った。条件は次の通りである。ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）；１３０万画素（冷却ＣＣＤカメラ）、有効画素；１３８４（Ｈ）×９２２（Ｖ）ピクセル、画角；７ｃｍ×１１ｃｍ、露出時間；１０秒。ＧＦＰによる自家蛍光を測定した。測定結果を図１に示す。図１は、タンパク質を固定化した固体支持体について、化学発光測定装置により、ＧＦＰによる自家蛍光の強度を二次元に画像化したものである。丸くスポットになっているところがＧＦＰの存在部分である。この結果ポリヒスチジン配列を融合したＧＦＰから蛍光が観測された。以上から、ＧＦＰは蛍光機能を保持したまま固定化されていることが明らかとなった。
【００４１】
また、前記したように、ポリヒスチジン配列を融合させたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を固定化した固体支持体を、オートクレーブ減菌した０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）４５ｍＬに、４℃で１週間、２週間、１ヶ月間浸漬した後、ＬＡＳ１０００（富士写真フィルム株式会社製）にて、ＧＦＰによる自家蛍光を測定した。測定条件は以下の通りである。ＣＣＤ：１３０万画素（冷却ＣＣＤカメラ）、有効画素：１３８４（Ｈ）×９２２（Ｖ）ピクセル、画角：７ｃｍ×１１ｃｍ、露出時間：１０秒。測定結果を図３に示す。図３は、タンパク質を固定化した固体支持体について、化学発光測定装置により測定したＧＦＰによる自家蛍光の強度率をグラフ化したものである。この時ＧＦＰの自家蛍光はスポット部位の８９ピクセルを測定し、各ピクセルの平均を自家蛍光強度とした。これにより、ＧＦＰを固定化した状態で、４℃で１ヶ月保存しても、初期の自家蛍光強度率１に対して、強度率０．８を維持しており、ＧＦＰが安定に固定化されているとともに、その機能が保持されていることが明らかとなった。
【００４２】
実施例３
ＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を形成した基板上に金属キレートを形成させた固体支持体を作成し、この固体支持体上にＣｙ５蛍光標識したポリヒスチジン配列を融合させたＧＦＰとＣｙ３蛍光標識したプロテインＡをピペッターで０．２μｌずつスポットした。そして３７℃に保った湿箱に入れ、１時間反応させた。そして、▲１▼１×ＰＢＳで１５分間洗浄、▲２▼１０ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳで１５分間洗浄、▲３▼５００ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳで１５分間洗浄、の３種の処理を行った後、ＦＬＡ８０００（富士写真フィルム株式会社製）にて蛍光測定を行った。測定結果を図２に示す。図２は、タンパク質を固定化した固体支持体について、蛍光測定装置により測定した色素による蛍光強度を二次元に画像化したものである。丸くスポットになっているところが蛍光標識したタンパクの存在部分である。その結果、▲１▼ではＣｙ５蛍光標識したポリヒスチジン配列を融合させたＧＦＰとＣｙ３蛍光標識したプロテインＡの両方が固定化しており、▲２▼ではＣｙ５蛍光標識したポリヒスチジン配列を融合したＧＦＰのみが固定化しており、▲３▼では両方が固定化されていなかった。以上から、本発明の固体支持体においては、イミダゾールの濃度を変えることによりタンパク質の脱着が可能であることが明らかとなった。
【００４３】
実施例４
ガラス基板として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のものを用いた。このガラス基板の表面に、イオン化蒸着法により、メタンガス９５体積％、水素ガス５体積％を混合したガスを原料として、ＤＬＣ層を１０ｎｍ厚みに形成したスライドガラスを作成した。
【００４４】
次に、このスライドガラス表面を化学修飾し、ニッケルイオンを配位させた。すなわち、スライドガラスを入れた反応容器内に塩素を導入した後、高圧水銀灯の光を１分間照射することによってガラス基板表面を塩素化し、イミノジ酢酸１９．８ｇを含む０．８モル水酸化ナトリウム水溶液２５０ｍｌに入れて溶液を室温で一晩撹拌した。このスライドガラスを酒石酸１５．０ｇ、クエン酸２１．０ｇ、２８％アンモニア水３０ｍｌを含む０．２モル硫酸ニッケル水溶液５００ｍｌに浸漬し、室温で３時間撹拌し、水２００ｍｌで３回洗浄した後、ＸＰＳにて表面分析したところ、８５５．０〜８５９．０ｅＶにニッケル由来のピークを確認した。前記において、ＸＰＳで分析する前の固体支持体を水２００ｍｌで３回洗浄し、乾燥した後、真空パックをした。真空パックは、真空容器を１Ｔｏｒｒ以下まで排気した後に、その中で真空袋を熱融着することによりパックする。真空パックの中で、４℃で６ヶ月放置してもニッケル由来のピークの分析結果は、経時しない場合と同じであり、キレートとしての機能が維持されていることが明らかとなった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明のカーボン層上に金属キレートを形成した固体支持体は、ＵＶ透過性などの光学的特性に優れており、さらに、ペプチドをその機能を失うことなく長期間にわたり安定に固定化できるとともに、ペプチドの脱着が可能である。従って、ペプチドの保存及び解析において有用な手段として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】タンパク質の固定化された固体支持体について、化学発光測定装置により、ＧＦＰによる自家蛍光の強度を二次元に画像化したものである。丸くスポットになっているところがＧＦＰの存在部分である。
【図２】タンパク質を固定化した固体支持体について、蛍光測定装置により、色素による蛍光強度を二次元に画像化したものである。丸くスポットになっているところが蛍光標識したタンパクの存在部分である。
【図３】タンパク質を固定化した固体支持体の蛍光強度を、経時的に試験した結果を表すグラフである。
Claims (6)
- 基板表面の一部又は全部がカーボン層で構成されており、その層上に金属キレートが形成されてなる固体支持体。
- カーボン層がダイヤモンドライクカーボン層又はダイヤモンド層である請求項１に記載の固体支持体。
- 前記カーボン層の厚みが、炭素単分子〜１００μｍである請求項１又は２に記載の固体支持体。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の固体支持体の表面にペプチドを固定化してペプチドを解析する方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の固体支持体の表面にペプチドを固定化してペプチドを保存する方法。
- その表面に形成された金属キレートにペプチドが固定化されてなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の固体支持体。
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