JP5759351B2 - ボロン酸基固定化支持体を用いたピロリン酸検出法 - Google Patents
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Description
被検物を上記導電性支持体上のボロン酸基と接触させる工程、
上記導電性支持体の電気的変化を測定する工程、及び
上記電気的変化に基づいてピロリン酸を検出する工程
を含む、ピロリン酸を電気的に検出する方法。
[2]前記ボロン酸基を含む化合物が、フェニルボロン酸誘導体、メチルボロン酸誘導体、及びプロペニルボロン酸誘導体からなる群より選択される少なくとも1種である、[1]に記載の方法。
[3]前記ボロン酸基を含む化合物がボロン酸基を含む水溶性ポリマー分子である、[1]又は[2]に記載の方法。
[3-2]前記水溶性ポリマー分子がポリ ((2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン)-co-(n-ブチルメタクリル酸)-co-(p-ビニルフェニルボロン酸))である、[3]に記載の方法。
[3-3]前記水溶性ポリマー分子がポリ ((2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン)-co-(ジメチルアミノエチルメタクリル酸)-co-(p-ビニルフェニルボロン酸))である、[3]に記載の方法。
[4-2]前記分子が4-メルカプトフェニルボロン酸である、[4]に記載の方法。
[5]前記導電性支持体が貴金属を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[5-2]前記貴金属が、銀、金、白金及びパラジウムからなる群より選択される少なくとも1種である、[5]に記載の方法。
[5-3]前記ボロン酸基を含む化合物がフェニルボロン酸基及び頭部基を含む分子であり、該頭部基が銀、金、白金及びパラジウムからなる群より選択される少なくとも1種と共有結合可能な官能基である、[5-2]に記載の方法。
[5-4]前記導電性支持体が電極を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[5-5]前記導電性支持体が溶液中に配置されている、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6-2]前記測定器が微小な電圧変化を測定することが可能な測定器である、[6]に記載の方法。
[6-3]前記測定器が、微小な電圧変化を測定するためにトランジスタを回路内に有する測定器である、[6]に記載の方法。
[7]前記測定器が、微小な電圧変化を測定するために電界効果トランジスタ(FET)を回路内に有する測定器である、[6]に記載の方法。
ピロリン酸の検出結果に基づいてDNA相補鎖合成に取り込まれた塩基の種類を決定する工程
を含む、ターゲットDNAの塩基配列を決定する方法。
[8-2][1]〜[7]のいずれかに記載の方法に従って、ターゲットDNA又はRNAを鋳型としたDNAポリメラーゼによるDNA相補鎖合成により生じるピロリン酸を検出する工程、
ピロリン酸の検出結果に基づいてDNA相補鎖合成に取り込まれた塩基の種類を決定する工程、及び
ターゲットDNA又はRNAの全体又は一部の塩基配列を決定する工程
を含む、ターゲットDNA又はRNAを検出又は定量する方法。
[9]DNAポリメラーゼ及び/又はターゲットDNAが、前記導電性支持体表面に固定されている、[8]に記載の方法。
[9-2]DNAポリメラーゼ及び/又はターゲットDNAが、ボロン酸基を含む化合物が固定化された電極表面に固定されている、[8]に記載の方法。
[9-3]前記導電性支持体へ固定されるDNAポリメラーゼが、ボロン酸基に対する結合能を有するDNAポリメラーゼである、[9]に記載の方法。
[11]ターゲットDNA又はRNAが、前記導電性支持体とは異なる固体支持体表面に固定されている、[8]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[11-2]複数の反応セルにそれぞれターゲットDNA又はRNAが固定された固体支持体を入れ、それぞれの反応セルに対応した電気的変化測定を行い、それぞれの反応セルにおいてDNA相補鎖合成により生成されたピロリン酸を検出する、[11]に記載の方法。
[11-3]ターゲットDNA又はRNAが固定された固体支持体が金属製ビーズである、[11]又は[11-2]に記載の方法。
[11-4]ターゲットDNA又はRNAが固定された固体支持体が磁性ビーズである、[11]又は[11-2]に記載の方法。
[11-5]前記導電性支持体が、DNAポリメラーゼが固定された電極が配置された第1の領域と、第1の領域に隣接し、かつボロン酸基を含む化合物が固定化された参照電極が配置された第2の領域とからなる、[8]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[11-6]第2の領域を含む空間にはアピラーゼなどの核酸合成基質を分解する酵素が保持されている、[11-5]に記載の方法。
[11-7]DNAの段階的な相補鎖合成をモニターすることにより、ターゲットDNAの塩基配列を決定する、[8]〜[11]のいずれかに記載の方法。
ピロリン酸の検出結果に基づいて、ターゲットDNA又はRNAへのハイブリダイゼーションを検出する工程
を含む、ターゲットDNA又はRNAを検出する方法。
[12-2]複数の反応セル内に保持された各プローブを用いたDNA相補鎖合成を行い、生じるピロリン酸を検出することにより、遺伝子発現プロフィール分析を行う、[12]に記載の方法。
[13][1]〜[7]のいずれかに記載の方法に従って、ターゲットDNAにハイブリダイズした2つのプローブ間のニックがDNAリガーゼ反応により連結されることにより生じるピロリン酸を検出する工程、及び
ピロリン酸の検出結果に基づいて、ターゲットDNAへの2つのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程
を含む、ターゲットDNAを検出する又はターゲットDNA上の一塩基多型を検出する方法。
[15]前記導電性支持体にさらにDNAポリメラーゼが固定化されている、[14]に記載のデバイス。
[15-2]DNAの塩基配列決定、ターゲットDNA若しくはRNAの検出、又は一塩基多型の検出に使用するための、[14]又は[15]に記載のデバイス。
[16]ボロン酸基を含む化合物が固定化された導電性支持体、及び
導電性支持体における電気的変化を測定する手段
を備えることを特徴とするピロリン酸検出用センサ。
本発明は、導電性支持体に固定化したポリマー中のボロン酸基(例えばフェニルボロン酸)、又は単独で導電性支持体に固定化したボロン酸基と、ピロリン酸が接触したときに誘起される電気的変化を検出することにより、ピロリン酸の存在又はその量を検出する方法を提供する。正確な反応機構はわかっていないが、ボロン酸基に存在する水酸基とピロリン酸に存在する水酸基とがおそらく結合することに基づいて、導電性支持体上の電気的変化が生じる。なお、予想外にも、DNAポリメラーゼの基質となるデオキシリボ核酸(dCTP、dATP、dTTP及びdGTP)にも水酸基が存在するが、デオキシリボ核酸の存在下においては有意な電気的変化は観察されない。そのため、本発明は、ボロン酸基を含む化合物を固定化した導電性支持体を用いることにより、ピロリン酸を特異的に検出できるという知見に基づいている。
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr(6Y)(配列番号4)
Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Trp(6SW)(配列番号5)
Ser-Ser-Ser-Ser-Trp(4SW)(配列番号6)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp(6YW)(配列番号7)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp(4YW)(配列番号8)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Gly(6Y2G)(配列番号9)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys(6Y2K)(配列番号10)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Lys(6YGK)(配列番号11)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr-Tyr(4YW2Y)(配列番号12)
Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr-Tyr-Tyr(3YW3Y)(配列番号13)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr(5YWY)(配列番号14)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys-Trp(6Y2KW)(配列番号15)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Lys(6YW2K)(配列番号16)。
金基板(10×10mm、厚さ100mm、シリコンナイトライド上に金スパッタリング)を濃硫酸と過酸化水素水を3:1で混合した洗浄液(Piranha solution)中に浸漬し、時おり溶液を撹拌しながら1時間洗浄した。
実施例1に示した方法で金基板を作製し洗浄後、4-メルカプトフェニルボロン酸処理したものと、処理していないものを各々リン酸緩衝生理食塩水(10mM NaH2PO4/Na2HPO4、150mM NaCl pH7.4)に浸漬して1時間平衡化を行った。
実施例2の4-メルカプトフェニルボロン酸処理した金基板と同じ手順で、金基板の前処理を行った。
5'- AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号1)
3'- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCAAAAAAAAAA(配列番号2)。
実施例2の4-メルカプトフェニルボロン酸処理した金基板と同じ手順で、金基板の前処理を行った。
(a)5'- AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号1)
3'- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCAAAAAAAAAA(配列番号2)
(b)5'- AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号1)
3'- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGCCCAAAGGGCCCAAAGGGCCCAAAGGG(配列番号3)。
ボロン酸基を含むポリマーの1例として、ポリ((2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン)-co-(n-ブチルメタクリル酸)-co-(p-ビニルフェニルボロン酸))(以下、PMBVと略す)を、60モル% 2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン基、20モル% n-ブチルメタクリル酸、及び20モル%p-ビニルフェニルボロン酸となるように重合した。
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr(6Y)(配列番号4)
Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Trp(6SW)(配列番号5)
Ser-Ser-Ser-Ser-Trp(4SW)(配列番号6)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp(6YW)(配列番号7)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp(4YW)(配列番号8)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Gly(6Y2G)(配列番号9)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys(6Y2K)(配列番号10)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Lys(6YGK)(配列番号11)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr-Tyr(4YW2Y)(配列番号12)
Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr-Tyr-Tyr(3YW3Y)(配列番号13)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr(5YWY)(配列番号14)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys-Trp(6Y2KW)(配列番号15)
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Lys(6YW2K)(配列番号16)。
ルシフェラーゼ(以下Luc)発現プラスミドであるpURE2 Lucプラスミドをテンプレートとして、タンパク質分子に6Y2K(配列番号10)及び6YW(配列番号7)のペプチドタグを4残基のグリシン残基を介してC末端に付加できるように導入した。プラスミドへの導入方法としてInverse PCR法を用いた。Inverse PCR法では環状DNAの配列導入部位を基準として背中合わせになる様にプライマーを選択する。このときプライマーには導入しようとする配列をアンカー配列1及び2として付加しておく。この条件でPCR反応を行うと末端にアンカー配列1及び2が付加された直鎖状の2本鎖DNAが生成する。これをセルフライゲーション反応で繋ぎ合わせることにより、望みの部位にアンカー配列が導入された環状二本鎖DNAを得ることができる。
402 ボロン酸基を含む化合物
403 ペプチドタグ
404 DNAポリメラーゼ又はDNAリガーゼ
405 ピロリン酸の放出
406 ボロン酸基とピロリン酸との接触
配列番号4〜16:人工配列(合成オリゴペプチド)
配列番号17〜19:人工配列(合成オリゴヌクレオチド)
Claims (15)
- ボロン酸基を含む化合物が固定化された導電性支持体を準備する工程、
被検物を上記導電性支持体上のボロン酸基と接触させる工程、
上記導電性支持体の電気的変化を測定する工程、及び
上記電気的変化に基づいてピロリン酸を検出する工程
を含む、ピロリン酸を電気的に検出する方法。 - 前記ボロン酸基を含む化合物が、フェニルボロン酸誘導体、メチルボロン酸誘導体、及びプロペニルボロン酸誘導体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記ボロン酸基を含む化合物がボロン酸基を含む水溶性ポリマー分子である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ボロン酸基を含む化合物がフェニルボロン酸基及びチオール基を含む分子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記導電性支持体が貴金属を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記電気的変化を、前記導電性支持体に導電体を介して接続した電圧変化測定器によって測定する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定器が、微小な電圧変化を測定するために電界効果トランジスタ(FET)を回路内に有する測定器である、請求項6に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法に従って、ターゲットDNAを鋳型としたDNAポリメラーゼによるDNA相補鎖合成により生じるピロリン酸を検出する工程、及び
ピロリン酸の検出結果に基づいてDNA相補鎖合成に取り込まれた塩基の種類を決定する工程
を含む、ターゲットDNAの塩基配列を決定する方法。 - DNAポリメラーゼ及び/又はターゲットDNAが、前記導電性支持体表面に固定されている、請求項8に記載の方法。
- 前記導電性支持体へ固定されるDNAポリメラーゼが、ボロン酸基に対する結合能を有するペプチドタグを分子内に含むDNAポリメラーゼである、請求項9に記載の方法。
- ターゲットDNA又はRNAが、前記導電性支持体とは異なる固体支持体表面に固定されている、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法に従って、ターゲットDNA又はRNAにハイブリダイズしたプローブからのDNAポリメラーゼによるDNA相補鎖合成により生じるピロリン酸を検出する工程、及び
ピロリン酸の検出結果に基づいて、ターゲットDNA又はRNAへのハイブリダイゼーションを検出する工程
を含む、ターゲットDNA又はRNAを検出する方法。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法に従って、ターゲットDNAにハイブリダイズした2つのプローブ間のニックがDNAリガーゼ反応により連結されることにより生じるピロリン酸を検出する工程、及び
ピロリン酸の検出結果に基づいて、ターゲットDNAへの2つのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程
を含む、ターゲットDNAを検出する又はターゲットDNA上の一塩基多型を検出する方法。 - ボロン酸基を含む化合物が固定化された導電性支持体を備えることを特徴とするピロリン酸を電気的に検出するためのデバイス。
- 前記導電性支持体にさらにDNAポリメラーゼが固定化されている、請求項14に記載のデバイス。
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