KR101742211B1 - 마이크로 rna의 초민감성 정량 분석 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA와 RNA의 이중가닥에 특이적으로 결합하는 하이브리드 결합 도메인 (hybrid binding domain, HBD)이 고정된 원자간력현미경의 탐침을 이용하여 무표지의 마이크로RNA를 초고민감도로 검출하는 방법 및 상기 하이브리드 결합도메인이 고정된 원자간력현미경의 탐침 및 무표지의 마이크로 RNA를 포함하는 정량분석장치에 관한 것이다.
Description
본 발명은 마이크로RNA(microRNA, miRNA)의 초민감성 정량 분석 장치 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것으로, 원자간력 현미경(atomic force microscope, AFM)을 이용한 결합힘 지도화로 무표지 마이크로 RNA를 검출하는 것에 관한 것이다.
마이크로RNA는 19-25개의 염기서열로 이루어진 비번역(noncoding) 단일가닥 RNA로서 1993년 예쁜꼬마선충에서 최초로 발견되었으며 2000년대에 이르러 인간을 포함한 다른 종에서도 발견되고 종 사이에 염기서열의 유사성이 보고됨으로써 큰 주목을 받고 있다(D.P. Bartel, Cell 136, 215-233 (2009)). 마이크로RNA는 특정 메신저RNA에 결합하여 이를 자르거나 번역을 억제함으로써 단백질 생성을 조절한다. 이는 인간 전체 유전자 발현의 30% 이상에 관여하는 것으로 알려졌으며 세포 증식, 사멸, 발달 및 분화 등의 다양한 생물학적인 기능을 미세 조정하는 역할을 한다.
마이크로RNA의 비정상적인 발현과 다양한 질병과의 연관성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 특히 암(cancer)과의 연관성에 대한 보고가 주를 이루고 있다. 따라서 생체 조직, 세포 및 체액에 존재하는 마이크로RNA를 이용하여 질병의 조기 진단, 예후 판단 및 치료법 개발에 활용하려는 연구가 지속되고 있으며, 초기 상태의 종양 세포 등을 구별하기 위해 단일 세포를 분석할 수 있는 고민감도의 마이크로RNA 분석법이 요구되고 있다.
현재 마이크로RNA의 정량 분석은 주로 기존의 DNA와 RNA 분석에 사용되어 온 마이크로어레이와 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 이뤄지고 있다. 하지만 이 기술들은 평균 22개의 짧은 염기서열 길이를 가지는 마이크로RNA의 분석에 직접 적용하기 어렵다. 마이크로어레이의 경우 마이크로RNA의 짧은 길이 때문에 프로브 DNA를 선택하는데 한계가 있으며 이는 여러 마이크로RNA의 동시 분석을 위한 해리온도(melting temperature) 표준화를 제한하는 한편 배경 소음 신호로 인하여 최대민감도가 1 pM 수준이다. 일반적인 RT-PCR의 경우 사용되는 프라이머 DNA와 마이크로RNA의 길이가 유사하여 증폭을 할 수 없다. 위 문제점들은 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA), 헤어핀 구조를 가지는 DNA, 아데닐산중합반응 (polyadenylation)이나 핵산 연결(ligation)을 이용한 마이크로RNA의 연장 등의 기술들을 도입함으로써 부분적으로 해결되었으나 분석 시간, 비용 및 오차율 증가를 수반하고 있으며 여러 플랫폼(제조사) 간 결과의 차이가 보고되었다(P. Mestdagh, et al. Nat. Methods 11, 809-815 (2014)).
따라서 위 기술들로 미량(단일세포에 존재하는 마이크로RNA는 평균 500 개로 보고됨)의 마이크로RNA를 정량분석하는 방법은 아직 재현성 및 신뢰도를 획득하지 못하였다.
한편, 원자간력 현미경은 나노미터 수준의 공간 분해능으로 3차원 표면 이미징이 가능할 뿐만 아니라 탐침과 표면 간의 상호작용력을 수 피코뉴튼 (picoNewton, pN) 수준으로 분석할 수 있다. 특히, 생체 내와 유사한 조건(수용액)에서 분석이 가능하기 때문에 단일 생체 분자 간의(DNA-DNA, DNA-RNA, 항원-항체, 단백질-리간드 등) 상호작용력 측정을 통해 생체물질의 구조, 동역학 및 분포 등을 분석할 수 있다(P. Hinterdorfer, et al. Nat. Methods 3, 347-355 (2006)).
미국 특허등록번호 제8,067,169호는 원자간력현미경과 T자 모양의 캔틸레버 (cantilver)를 이용하여 평평한 고체 표면 위에서 짧은 길이의 핵산을 검출하는 방법을 제시하였다. 이 방법은 표면에 단일가닥의 프로브 DNA를 고정하고 표적 핵산을 혼성화시켰을 때 혼성화된 이중가닥 핵산과 단일가닥 프로브 DNA의 강성 (stiffness)이 차이나는 것을 이용하여 짧은 길이의 표적 핵산을 검출한 방법이다. 이는 마이크로RNA를 검출하는데도 적용가능하나(S. Husale, et al. Nature 462, 1075-1078 (2009)) (1) 생체 시료에 이중가닥 핵산과 유사한 강성을 가지는 물질이 존재할 시에 분석에 오차가 생기고, (2) 평평하고 강성이 높은 고체 표면에서만 분석이 가능하며, (3) 마이크로RNA의 전구체인 primary 마이크로RNA와 precursor 마이크로RNA를 구별할 수 없다는 한계점이 있다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 캔틸레버의 탐침에 DNA/RNA 혼성화체에 결합하는 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함하는 원자간력 현미경(atomic force microscope)용 캔틸레버를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 캔틸레버를 포함하는 분석 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 캔틸레버를 사용하여 프로브 DNA 스팟을 결합힘-지도화하여 시료 내 이중나선의 개수로부터 마이크로 RNA의 개수를 산출하는, 마이크로 RNA 정량 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, DNA와 RNA가 혼성화된 이중가닥에 특이적으로 결합하는 하이브리드 결합 도메인 (hybrid binding domain, HBD)이 고정된 원자간력 현미경의 탐침을 이용하여 무표지의 마이크로RNA를 초고민감도로 검출하는 방법 및 상기 하이브리드 결합도메인이 고정된 원자간력 현미경의 탐침 및 무표지의 마이크로 RNA를 포함하는 정량분석장치를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 예는, 바디; 및 상기 바디의 말단에 형성된 탐침(tip)을 포함하며, 상기 탐침의 표면에 고정되며, DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 마이너 그루브에 염기서열 비특이적으로 결합하는 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함하는, 원자간력 현미경(atomic force microscope)용 캔틸레버에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 캔틸레버; 표적 miRNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA가 고정된 기판; 및 표적 miRNA를 포함하는 시료를 포함하는, 마이크로 RNA의 초고민감성 정량 분석 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 표적 마이크로RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 기판 표면에 고정하여 프로브 DNA 스팟을 형성하고, 상기 기판에 표적 마이크로RNA가 포함된 시료를 접촉시켜 상기 프로브 DNA와 마이크로 RNA로 이루어지는 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선을 형성하는 단계; 상기 캔틸레버를 이용하여 상기 스팟의 결합힘-지도화를 수행하고, 상기 결합힘이 관찰되는 스팟에 상기 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선이 존재하는 것으로 결정하는 단계; 및 상기 시료 내 이중나선의 개수를 카운팅하여 마이크로 RNA의 개수로 결정하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA 정량 분석 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예에 따른 원자간력 현미경(atomic force microscope)용 캔틸레버는 바디; 및 상기 바디의 말단에 형성된 탐침(tip)을 포함하며, 상기 탐침의 표면에 고정되며, DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 마이너 그루브에 염기서열 비특이적으로 결합하는 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함한다.
상기 하이브리드 결합 도메인은 인간 리보핵산 가수분해효소 1(ribonuclease I, RNase I)의 아미노 말단(N-terminal)에 있는 도메인으로 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 가닥에 특이적으로 결합할 수 있으며, HBD의 결정구조 내에는 RNA와 DNA에 각각 독립적으로 결합하는 영역이 존재한다. 바람직하게는, HBD는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것 일 수 있다.
캔틸레버 팁에 상기 하이브리드 결합 도메인의 배향을 일정하도록 고정시키기 위하여, 상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase, GST)를 결합시킨 융합 단백질을 발현시킨 후, 상기 융합 단백질의 글루타티온 s-전달효소 부분을 캔틸레버 팁에 고정시킬 수 있다. 상기 하이브리드 결합 도메인, 팁에 고정화를 위한 융합 파트너(예, 글루타티온-S-전달효소), 히스티딘-태그 결합, 비오틴화(biotinylation), 및 상기 하이브리드 결합 도메인에 도입한 위치특이적 돌연변이(site-specific mutation) 로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 변형을 포함할 수 있다. 캔틸레버 팁에 HBD가 일정한 배향으로 고정되었을 때, 마이크로RNA의 분석은 재현성 있는 결과를 얻을 수 있는 확률이 높아진다. 바람직하게는 상기 하이브리드 결합 도메인은, 글루타티온 S-전달 효소를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
구체적으로 상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 연결된 글루타티온 S-전달 효소를 포함하는 하이브리드 결합 도메인의 변이체는, 글루타티온 S-전달 효소 부분이 탐침에 고정되고, 변이체의 카르복시 말단은 탐침 면과 반대방향으로 향하게 배향되도록 조절될 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로 RNA 정량분석 방법 및 장치에 있어서, 분석대상 표적 miRNA와, 상기 miRNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA가 고정된 기판을 접촉시켜, DNA/RNA 혼성화체를 형성하고, 상기 HBD가 결합된 캔틸레버를 이용한 AFM방법으로 분석을 수행할 수 있다. 상기 DNA/RNA 혼성화체는 표적 마이크로 RNA와 상기 표적 miRNA에 상보적으로 결합 가능한 프로브 DNA로 형성된다.
본 발명에 따른 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체는 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 마이너 그루브에 염기서열 비특이적으로 결합할 수 있다. 상기 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체가 결합하는 DNA/RNA 혼성화체의 위치는 RNA 가닥 중 연속적인 2개 염기의 2'-OH기이고; DNA 가닥 중 3개의 포스포데옥시리보스 단위일 수 있다.
상기 DNA/RNA 혼성화체의 결합하는 하이브리드 결합 도메인의 위치는,
DNA/RNA 혼성화체의 DNA 가닥이 결합하는 하이브리드 결합 도메인의 Y3, K33, K34; 및 DNA/RNA 혼성화체의 RNA 가닥이 결합하는 하이브리드 결합 도메인의 W17 및 F32 수 있다.
상기 표적 마이크로 RNA는 단일 세포 유래일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예는, 상기 캔틸레버; 표적 miRNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA가 고정된 기판; 및 표적 miRNA를 포함하는 시료를 포함하는, 초고민감도 마이크로 RNA 정량 분석 키트를 포함하며, 상기 키트는 원자간력 현미경을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 표적 마이크로RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 기판 표면에 고정하여 프로브 DNA 스팟을 형성하고, 상기 기판에 표적 마이크로RNA가 포함된 시료를 접촉시켜 상기 프로브 DNA와 마이크로 RNA로 이루어지는 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선을 형성하는 단계; 제1항 내지 제9항의 캔틸레버를 이용하여 상기 스팟의 결합힘-지도화를 수행하고, 상기 결합힘이 관찰되는 스팟에 상기 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선이 존재하는 것으로 결정하는 단계; 및 상기 시료 내 이중나선의 개수를 카운팅하여 마이크로 RNA의 개수로 결정하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA 정량 분석 방법에 관한 것이다.
구체적으로 프로브 DNA 스팟을 제작한 후 표적 마이크로RNA가 포함된 수용액을 스팟 위에서 움직이게 하여 표적의 혼성화가 일어나게 한다. 그리고 세척 과정을 거친 후, 수용액 상에서 HBD가 고정된 팁으로 결합힘-지도화를 수행한다. 마이크로RNA가 혼성화된 위치에서 HBD와 DNA/RNA 이중나선 간의 특이적인 결합힘을 관찰할 수 있고, 지도화 영역 내에 캡쳐된 마이크로RNA의 개수를 셀 수 있다. 그리고 지도화가 이뤄진 영역과 프로브 DNA 스팟 전체의 면적을 비교하여 전체 영역에 캡쳐된 마이크로RNA의 개수를 계산할 수 있다.
바람직하게는 상기 표적 마이크로RNA는 표지되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 표적 마이크로RNA는 단일 세포 유래일 수 있다. 작은 개수의 표적 마이크로RNA가 넓은 면적의 프로브 DNA 스팟에 고정될 경우 단위 면적 당 캡춰된 표적의 개수가 작아서 일부 영역을 스캔하여 전 영역으로 환산하는 계산법의 신뢰도가 낮아진다. 따라서 단일 세포 내 존재하는 마이크로 RNA와 같이 작은 개수의 마이크로RNA를 정량 분석하기 위해서는 수 마이크론의 프로브 DNA 스팟을 제작하는 것이 필요하다. 즉, 샘플에 따라 다양한 지름을 갖는 프로브 DNA 스팟을 제작하여 사용함으로써 고민감도뿐만 아니라 넓은 dynamic range를 갖는 분석이 가능하다.
구체적으로 상기 이중나선을 카운팅하는 단계는, 단위 면적당 캡쳐된 이중나선 개수를 카운팅하는 단계; 및 하기의 식 1에 의하여 시료 내 총 이중나선 개수를 산출하는 단계를 포함할 수 있다.
[식 1]
시료 내 총 이중나선 개수= (단위 면적 당 이중나선 개수 × (스팟 면적/단위 면적))/(원자간력 현미경의 캡쳐 효율%/100)
예를 들어, 동역학적 거동 너비가 8nm 픽셀인 경우, 결합힘이 관찰되는 4개의 인접한 픽셀; 또는 동역학적 거동 너비가 10nm 픽셀인 경우 결합힘이 관찰되는 3개의 인접한 픽셀의 위치에 이중나선이 있는 것으로 결정할 수 있다.
또한 본 발명의 상기 프로브 DNA 스팟의 크기(지름)는 표적 마이크로 RNA 농도에 따라 결정되는 것을 특징으로 하며 바람직하게는 상기 표적마이크로 RNA 농도는 5×10-20 내지 2×10-13M 범위인 것을 사용할 수 있다. 상기 프로브 DNA 스팟의 지름은 하기의 식 2 및 식 3으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에 의하여 산출될 수 있다.
[식 2]
프로브 DNA 스팟 지름(νm) = (마이크로 RNA 농도([M]) × 1019 / 5)0 . 5 ; 및
[식 3]
프로브 DNA 스팟 지름(νm) = (마이크로 RNA 수([개]) / 10)0 .5
상기 표적 마이크로 RNA 및 산출 식에 의하여 표적마이크로 RNA 농도가 5×10-20 내지 2×10-13M 범위일 때 프로브 DNA 스팟의 크기는 각각 1 마이크로미터 내지 200 마이크로미터 (지름) 일 수 있다.
상기 DNA/마이크로 RNA 이중나선 개수는 결합힘-지도화를 1 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회, 더욱 바람직하게는, 3회 내지 5회 수행한 평균값으로 결정하여 더욱 정확한 값을 얻을 수 있다.
상기 기판은 소재에 한정되지 않으나 유리, 금속, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 세라믹, 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체, 합금으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.
본 발명에 사용되는 상기 동역학적 너비는 20 나노미터 내지 100 나노미터일 수 있다.
구체적으로 기판 표면에 고정된 DNA/마이크로RNA와 GST-HBD이 결합 가능한 동역학적 거동 범위보다 힘-지도의 픽셀 크기를 작게 하면 하나의 캡쳐된 마이크로RNA에 대해서 여러 개의 인접한 픽셀에서 결합힘이 관찰되게 된다. 고해상도 힘-지도화 결과 양자 간의 결합이 가능한 동역학적 거동 범위가 약 30 nm의 지름을 갖는 경우 8 나노미터의 픽셀로 지도화할 경우 4개의 인접한 픽셀에서 결합힘이 관찰되어야 그 위치에 마이크로RNA가 캡쳐된 것으로 판단할 수 있다. 10 나노미터의 픽셀로 지도화할 경우는 3개의 인접한 픽셀에서 결합힘이 관찰되어야 한다. 고해상도의 힘-지도에서 결합힘이 관찰되는 픽셀의 클러스터를 관찰함으로써 신뢰도 높게 개개의 마이크로RNA를 검출할 수 있다(도 6, 7, 8).
상기 힘-지도화 단계에서 상기 마이크로 RNA는 DNA/RNA 혼성화체가 형성된 후 혼성화되지 않은 영역의 뉴클레오타이드 개수가 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 6개일 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 마이크로 RNA 전구체(precursor microRNA)는 핵으로부터 세포질로 나온 것으로서 효소 단백질에 의해 절단되지 않은 상태로서, 서열의 길이가 길고(예를 들어, 60 내지 90개의 뉴클레오타이드), 헤어핀을 갖는 것을 일컫는다. 상기 마이크로 RNA 전구체는 프로브 DNA와 혼성화되지만, 혼성화되지 않은 단일가닥이 상기 혼성화된 이중결합과 하이브리드 결합 도메인의 결합을 방해하여 본원발명의 탐침에 의해 인식되지 않는다.
또한 시료 내 DNA 역시 프로브 DNA와 혼성화 되지만, 본원발명의 하이브리드 결합 도메인은 RNA-DNA 이중나선에 특이적으로 결합하므로, DNA-DNA 이중결합은 본원발명의 탐침에 의해 인식되지 않는다. 따라서 본원발명에 의할 경우 마이크로 RNA의 전구체나 DNA의 결합에 의한 위양성 신호(false positive)를 배제할 수 있다.
본 발명에 따르는 원자간력현미경의 결합힘 지도화를 이용한 마이크로RNA 검출법은 샘플의 표지나 증폭과정 없이 극미량의 마이크로RNA를 정량분석 할 수 있다.
또한 개개의 마이크로RNA를 표준화(normalization)없이 절대 정량(absolute quantification)할 수 있으며, 다양한 탄성이나 강성을 갖는 기질 위에서 분석할 수 있고, 마이크로RNA의 전구체나 DNA의 결합에 의한 위양성 신호(false positive)를 배제할 수 있다.
단일세포 내에 존재하는 수준의 마이크로RNA를 분석할 수 있으므로 세포 다양성 연구 및 단일 세포 진단에 활용할 수 있는 기능성을 갖는다.
도 1은 본 발명에 따른 AFM을 이용한 표적 마이크로RNA 분석 원리를 나타내는 모식도이다.
도 2는 캔틸레버 팁에 고정된 HBD가 캔틸레버의 접근과 후퇴에 따라 기판 표면의 프로브 DNA/마이크로RNA 이중나선에 결합했다가 떨어지는 것을 나타내는 모식도이다.
도 3은 형광분자가 표지된 프로브 DNA를 이용하여 다양한 크기의 프로브 DNA 스팟을 제작하고 형광현미경으로 확인한 것이다.
도 4는 HBD와 프로브 DNA/마이크로RNA 혼성화체의 이중나선 사이의 특이적인 결합에 따른 힘-거리 곡선과 결합힘과 결합거리의 히스토그램을 나타낸 것이다.
도 5는 결합힘이 관찰되는 확률을 나타낸 결합힘 지도의 예이다. 10.0 μm * 10.0 μm, 500 나노미터 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정한 것이다.
도 6은 8 nm 픽셀 크기로 힘-지도화를 수행하여 혼성화된 마이크로RNA에 해당하는 결합힘이 나타나는 픽셀의 클러스터(노란색 원)를 관찰한 것이다. 같은 캔틸레버 팁으로 전구체 마이크로RNA가 혼성화된 영역도 지도화하였으나 클러스터가 관찰되지 않았음을 나타낸다.
도 7은 약 1,200개의 표적 마이크로RNA를 포함한 샘플을 지름 6.4μm 크기의 프로브 DNA 스팟 위에서 분석한 예. (a) 프로브 DNA 스팟의 형광 현미경 이미지, (b) 스팟 내 임의의 위치에서 얻은 힘-지도(300 nm × 300 nm, 픽셀 크기 10 nm, 픽셀 당 5회 측정).
도 8은 단일세포 내의 표적 마이크로RNA를 분석한 예. 단일 신경세포에서 얻은 RNA 시료가 포함된 수용액을 두 개로 나눠서 각각 다른 스팟 에서 분석하였다. KCl로 자극을 가한 세포가 그렇지 않은 세포를 각각 분석하여 비교하였다 (500 nm × 500 nm, 픽셀 크기 10 nm, 픽셀당 5회 측정). 노란색 픽셀이 결합힘이 관찰된 픽셀이다.
도 2는 캔틸레버 팁에 고정된 HBD가 캔틸레버의 접근과 후퇴에 따라 기판 표면의 프로브 DNA/마이크로RNA 이중나선에 결합했다가 떨어지는 것을 나타내는 모식도이다.
도 3은 형광분자가 표지된 프로브 DNA를 이용하여 다양한 크기의 프로브 DNA 스팟을 제작하고 형광현미경으로 확인한 것이다.
도 4는 HBD와 프로브 DNA/마이크로RNA 혼성화체의 이중나선 사이의 특이적인 결합에 따른 힘-거리 곡선과 결합힘과 결합거리의 히스토그램을 나타낸 것이다.
도 5는 결합힘이 관찰되는 확률을 나타낸 결합힘 지도의 예이다. 10.0 μm * 10.0 μm, 500 나노미터 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정한 것이다.
도 6은 8 nm 픽셀 크기로 힘-지도화를 수행하여 혼성화된 마이크로RNA에 해당하는 결합힘이 나타나는 픽셀의 클러스터(노란색 원)를 관찰한 것이다. 같은 캔틸레버 팁으로 전구체 마이크로RNA가 혼성화된 영역도 지도화하였으나 클러스터가 관찰되지 않았음을 나타낸다.
도 7은 약 1,200개의 표적 마이크로RNA를 포함한 샘플을 지름 6.4μm 크기의 프로브 DNA 스팟 위에서 분석한 예. (a) 프로브 DNA 스팟의 형광 현미경 이미지, (b) 스팟 내 임의의 위치에서 얻은 힘-지도(300 nm × 300 nm, 픽셀 크기 10 nm, 픽셀 당 5회 측정).
도 8은 단일세포 내의 표적 마이크로RNA를 분석한 예. 단일 신경세포에서 얻은 RNA 시료가 포함된 수용액을 두 개로 나눠서 각각 다른 스팟 에서 분석하였다. KCl로 자극을 가한 세포가 그렇지 않은 세포를 각각 분석하여 비교하였다 (500 nm × 500 nm, 픽셀 크기 10 nm, 픽셀당 5회 측정). 노란색 픽셀이 결합힘이 관찰된 픽셀이다.
이하, 발명의 다양한 실시예에 대해 설명하기로 한다. 본 발명은 다양한 변형을 가할 수 있으며, 여러 가지 실시예를 가질 수 있으며, 하기 특정 실시예들은 단지 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변형물, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
1:
GST
-
HBD가
고정된
캔틸레버
팁의 제조
1.1 GST-HBD 융합 단백질 제조
HBD(서열번호 1)를 AFM 캔틸레버 팁에 배향을 조절하여 고정하기 위해, HBD의 아미노 말단에 GST가 결합되어 있는 융합단백질을 생산하였다. 이를 위해 GST-HBD 유전자를 pGEX-4T-1에 클로닝하였다. 상기 융합단백질을 인코딩하는 유전자 벡터로 Escherichia coli BL21 (DE3) 세포를 형질 전환(transformation)하여 LB 배양액에서 배양하였다. 단백질의 발현은 0.2 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 37 ℃ 에서 처리함으로써 촉진되었다. 세포는 0.5% Tween 20 (v/v)이 포함된 용액에서 초음파로 분쇄되고, 4 ℃ 에서 25,000g로 25 분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. GSH-agarose 구슬(bead)이 채워진 column을 이용하여 GST-HBD를 정제하였다. 정제된 단백질들은 농축하여 사용하기 전까지 -80℃ 에서 보관하였다.
1.2 캔틸레버 팁에 GST-HBD의 고정
JPK Instruments사의 ForceRobot(원자간력현미경 기기)을 사용하였다. 사용된 캔틸레버는 NanoInk 사의 DPN Probe Type B에서 평균 약 4 pN/nm의 용수철 상수를 갖는 캔틸레버가 사용되었다.
GST-HBD를 고정하기 위해 캔틸레버 팁을 세척하고 자기조립 박막을 형성하여 표면 개질하는 과정을 거쳐서, 1차 아민 작용기를 표면에 도입하였다. GST-HBD에 포함된 글루타티온 (glutathione, GSH)을 캔틸레터 팁의 1차 아민기에 링커분자 (N-(4-maleimidobutyric acid)hydroxysuccinimide ester (GMBS))를 사용하여 공유결합으로 고정하였다. GST-HBD가 포함된 수용액에 캔틸레버 팁을 담궈서 팁에 도입된 GSH에 GST-HBD가 고정될 수 있도록 하고 과량의 GST-HBD를 세척한 뒤 사용하였다. 완성된 캔틸레버 팁의 모식도는 도 2에 도시되어 있다.
실시예
2: 10
.0 fM
miR
-134 분석
2.1 프로브 DNA가 고정된 기판 제조
도 1의 모식도에 나타난 방법의 일 예로서 고체 표면의 특정 영역에 프로브 DNA를 고정하여 프로브 DNA 스팟을 제작하기 위해 유리 슬라이드를 사용하였다. 유리 슬라이드를 세척하고 자기조립박막 형성을 통해 표면에 1차 아민과 선택적으로 반응하는 링커 분자 작용기 disuccinimidyl carbonate (DSC)를 도입하였다. 그리고 5'또는 3'말단에 아민기가 붙어있는 프로브 DNA (서열번호 2: 5'-CCC CTC TGG TCA ACC AGT CAC A-3')를 사용하였다. 이러한 프로브 DNA가 포함된 미량의 용액(150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate, 0.17 mM sodium dodecyl sulfate, 14.9 mM betaine, 6.2 mM sodium azide, pH 8.5)을 마이크로어레이어를 이용하여 기판 표면에 전달함으로써 평균 150 마이크로미터의 지름을 갖는 프로브 DNA 스팟을 제작하였다. 수천 개 이하의 표적 마이크로RNA 또는 단일세포 내에 존재하는 마이크로RNA를 분석하기 위해 수 마이크론의 지름을 갖는 프로브 DNA 스팟을 제작하였고, 이때 Nanosurf사의 FluidFM을 사용하였다. 비어있는 캔틸레버 내부에 전달하려는 용액을 채워 캔틸레버 팁 끝에 약 300 나노미터의 구멍으로 채워진 용액을 내보내질 수 있도록 하였다. 이를 이용하여 기판 표면에 1-10 마이크로미터의 지름을 갖는 프로브 DNA 스팟을 제작할 수 있었다. 도 3에 제작된 스팟의 예가 도시되어 있다. 도 3은 형광분자가 표지된 프로브 DNA를 이용하여 다양한 크기의 프로브 DNA 스팟을 제작하고 형광현미경으로 확인한 것이다.
2.2 표적 마이크로 RNA 혼성화 및 결합힘-지도화
표적 마이크로RNA로서 10.0 fM miR-134 용액 100 μl을 기판의 프로브 DNA 스팟 위에서 34 ℃ 에서 20 시간 동안 움직일 수 있도록 한 뒤, 세척 용액에 기판을 담그고 45 ℃ 에서 15 분간 용액을 저어서 세척하였다. 그리고 AFM으로 phosphate buffered saline(PBS) 에서 표면에 캡쳐된 마이크로RNA를 검사하였다.
결합힘 지도화를 위해 캔틸레버 팁은 특정 위치에서 240 nm * 240 nm 영역을 접근, 접촉, 후퇴를 반복하여 정해진 횟수만큼 반복한 뒤 지정된 다음 위치로 이동하였다(8 nm 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정, 접근 및 후퇴 속도 1.0 νm/s)(도 2).
캔틸레버 팁이 접촉한 위치에 마이크로RNA가 캡쳐되어 있을 경우 HBD와 DNA/RNA 간의 결합을 나타내는 힘-거리 곡선이 관찰되었다. 그리고 이러한 힘-거리 곡선을 분석하여 HBD와 DNA/RNA 간의 결합힘의 크기와 결합 거리를 알아내었다. 도 4는 HBD와 프로브 DNA/마이크로RNA 혼성화체의 이중나선 사이의 특이적인 결합에 따른 힘-거리 곡선과 결합힘과 결합거리의 히스토그램을 나타낸 것이다.
도 4에 도시된 힘-거리 곡선과 결합 힘, 결합 거리의 히스토그램은 마이크로RNA 134번(miR-134)을 대상으로 하여 얻은 값으로서 도 4의 히스토그램을 Gaussian 분포에 피팅(fitting)함으로써 결합 힘과 결합 거리의 대표값(± 분포의 표준편차)을 각각 20 피코뉴튼, 3.9 나노미터으로 구할 수 있었다. 마이크로RNA 124번과 486번을 대상으로 하였을 때도 결합 힘은 각각 23, 19 피코뉴튼, 결합 거리는 둘 모두 3.7 나노미터로서 서로 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
실시예
3. 50 aM
miR
-134 분석
3.1 프로브 DNA가 고정된 기판 제조
실시예 2와 달리 약 1,200개의 miR-134를 분석하기 위해서 NanoSurf 사의 FluidFM와 300 nm 지름의 구멍을 갖는 캔틸레버를 이용하여 6.4μm의 지름을 갖는 프로브 DNA 스팟을 제작하였다. 프로브 DNA가 고정된 기판 제조 방법은 실질적으로 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
3.2 표적 마이크로 RNA 혼성화 및 결합힘-지도화에 의한 환산
50 aM의 miR-134 용액 40 μl에 포함된 miR-134를 프로브 DNA 스팟 위에 혼성화시켰다. 스팟 내의 4 곳의 임의의 위치에서 결합힘 지도화를 수행하였다 (300 nm * 300 nm, 10 nm 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정, 접근, 후퇴 속도 1 μm/s, 사용한 AFM 기기 및 캔틸레버의 종류는 실시예 1과 같다). 약 1,200개의 표적 마이크로RNA를 포함한 샘플을 지름 6.4 μm 크기의 프로브 DNA 스팟 위에서 현미경 이미지를 분석하였고 스팟 내 임의 위치에서 힘-지도(300 nm * 300 nm, 픽셀 크기 10 nm, 픽셀 당 5회 측정)를 얻어 분석하였다(도 7). 도 7은 약 1,200개의 표적 마이크로RNA를 포함한 샘플을 지름 6.4 μm 크기의 프로브 DNA 스팟 위에서 분석한 예. (a) 프로브 DNA 스팟의 형광 현미경 이미지, (b) 스팟 내 임의의 위치에서 얻은 힘-지도(300 nm * 300 nm, 픽셀 크기 10 nm, 픽셀 당 5회 측정).
그 결과 4 곳의 영역에서 각각 3, 2, 4, 4 개의 miR-134가 검출되었으며 이의 평균값은 3.3 개이다. 용액 내의 miR-134가 6.4 μm 지름 크기의 스팟에 모두 혼성화되었을 때, 300 nm * 300 nm 영역에서 관찰될 것으로 기대되는 miR-134의 개수가 3.4 개이므로 실제 관찰된 값과 잘 일치하였다. 미량의 마이크로RNA를 분석하기 위해서는 하나의 지도만을 얻는 것이 아니라 위와 같이 여러 영역에서 힘-지도화를 수행하여 평균값을 얻는 것이 더 정확한 값을 얻을 수 있음을 확인하였다.
실시예
4: 전구체 마이크로 RNA와의
혼성화
및
결합힘
-지도화
4.1 프로브 DNA가 고정된 기판 제조
실시예 2와 마찬가지로 JPK Instruments사의 ForceRobot 및 NanoInk 사의 DPN Probe Type B에서 평균 약 4 pN/nm의 용수철 상수를 갖는 캔틸레버를 사용되었다. 약 150 마이크로미터의 지름을 갖는 프로브 DNA 스팟을 제조하였다.
4.2 전구체 마이크로 RNA 혼성화 및 결합힘-지도화에 의한 환산
약 150 마이크로미터의 지름을 갖는 프로브 DNA 스팟에 10.0 fM miR-134 용액 100 μl를 혼성화한 후 스팟 내의 임의의 위치에서 240 nm * 240 nm 영역을 지도화했을 때(8 nm 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정, 접근 및 후퇴 속도 1.0 νm/s), 영역 내에서 2 개의 마이크로RNA(결합힘이 나타난 픽셀이 4 개 이상 모인 클러스터)가 관찰되었다(도 6). 도 6은 8 nm 픽셀 크기로 힘-지도화를 수행하여 혼성화된 마이크로RNA에 해당하는 결합힘이 나타나는 픽셀의 클러스터(노란색 원)를 관찰한 것이다. 같은 캔틸레버 팁으로 전구체 마이크로RNA가 혼성화된 영역도 지도화하였으나 클러스터가 관찰되지 않았음을 나타낸다.
같은 캔틸레버 팁으로 전구체(precursor) 마이크로RNA(pre-mir-134)가 10.0 fM로 혼성화된 영역에서 힘-지도화를 수행했을 때, 클러스터가 관찰되지 않았고, miR-134가 혼성화된 영역으로 돌아왔을 때 다시 3 개의 클러스터가 관찰되었다. 이는 사용된 힘-지도화 조건에서 HBD가 mature 마이크로RNA에만 결합하고 전구체에는 결합하지 않는 것을 나타낸다. Pre-mir-134의 농도를 1,000 배 높여서 10.0 pM로 혼성화하였을 때도 클러스터는 관찰되지 않아 긴 마이크로RNA 전구체가 프로브 DNA와 이중나선을 형성하였을 때 HBD가 결합하지 않는 것을 확인하였다.
실시예
5: DNA와의
혼성화
및
결합힘
-지도화
관찰된 결함힘이 DNA/마이크로RNA에 결함함으로써 나타나는 것임을 확인하기 위해 마이크로RNA를 혼성화시키기 전과 마이크로RNA 대신 DNA를 혼성화한 뒤에 힘-지도화를 수행하였다. 마이크로RNA는 miR-134(서열번호 2)를 사용하고, DNA는 miR-134와 같은 서열을 가진(uracil(U)는 thymine(T)으로 대체) miR-134 상동 DNA를 사용하였다. 두 핵산 모두 10.0 νM 농도의 용액 100 νl를 150 νm 지름을 갖는 프로브 DNA 스팟과 접촉하도록 하여 혼성화가 일어나도록 하였다. 10.0 μm * 10.0 μm, 500 나노미터 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정하였고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 결합힘이 관찰되는 확률을 나타낸 결합힘 지도의 예이다. 10.0 μm * 10.0 μm, 500 나노미터 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정한 것이다.
마이크로RNA 혼성화 전이나 DNA를 혼성화(10.0 νM)한 뒤 프로브 DNA 스팟에서 힘-지도화를 수행했을 때는 특이적인 힘-거리 곡선이 관찰되는 확률이 매우 낮았으나 마이크로RNA를 혼성화(10.0 νM)했을 때는 높음을 관찰하여 혼성화된 DNA는 HBD에 의해 검출되지 않는 것을 확인하였다.
실시예
6: 단일세포 내
miR
-134 분석
신경세포를 대상으로 하여 단일세포에 존재하는 miR-134를 분석하였다. 생쥐(mouse, C57BL/6)의 해마 신경세포(hippocampal neuron)을 일차 배양하여 7일째 되는 날(DIV7), 하나의 그룹에는 배양액에 KCl 용액을 최종농도가 40 mM이 되도록 주입하여 2 시간 동안 신경세포를 자극하고, 하나의 그룹은 대조군으로써 KCl이 포함되지 않은 물을 주입하였다. 위와 같은 자극 조건에서(KCl 40 mM, 2 시간) 신경세포 내의 miR-134는 2-4 배 증가하는 것으로 알려진 바 있다. 이를 단일 세포 수준에서 확인하기 위해 laser capture microdissection (LCM) 방법을 사용하여 단일 신경세포를 분리한 뒤 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA를 추출하는 방법은 상용화된 kit를 사용하였다. 추출한 RNA가 포함된 수용액을 둘로 나눠서 각각 다른 프로브 DNA 스팟에서 혼성화시켰다. 그 후 각 스팟에서 힘-지도화를 수행하여 표면에 캡쳐된 miR-134의 개수를 계산하고, 단일 신경세포에서 얻은 RNA 시료가 포함된 수용액을 두 개로 나눠서 스팟에서 계산된 것을 더하여 단일 신경세포 내에 존재하는 miR-134의 개수를 알아보았다(500 nm * 500 nm, 픽셀 크기 10 nm, 픽셀당 5회 측정). 프로브 스팟에 의한 영향이 유의미하게 큰 지를 알아보기 위하여 단일 세포에서 나온 샘플을 두 개로 나누어 확인하였다. KCl로 자극을 가한 세포가 그렇지 않은 세포를 각각 분석하여 비교하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다 (도 8).
단일 신경세포에서 얻은 RNA 시료가 포함된 수용액을 두 개로 나눠서 각각 다른 스팟 에서 분석하였다. KCl로 자극을 가한 세포가 그렇지 않은 세포를 각각 분석하여 비교하였다 (500 nm *500 nm, 픽셀 크기 10 nm, 픽셀당 5회 측정). 그 결과를 도 8에 나타내었고, 노란색 픽셀이 결합힘이 관찰된 픽셀이다. 그 결과를 아래 식 1에 대입하여 시료 내 총 이중나선 개수를 산출하였다.
[식 1]
시료 내 총 이중나선 개수= (스팟의 단위 면적 당 이중나선 개수 × (스팟 면적/단위 면적))/(원자간력 현미경의 캡쳐 효율%/100)
이를 통해 대조군에서는 단일 신경세포에 약 1,100개의 miR-134가 존재하고 자극을 가한 세포에는 약 4,600개가 존재함을 알 수 있었으며, 각 스팟에서 나온 결과의 차이는 세포 간의 차이에 비해 현저하게 작았다. 따라서 단일 세포에 존재하는 마이크로RNA도 성공적으로 검출할 수 있으며 대조군과 실험군의 차이도 단일세포 수준으로 알아낼 수 있음을 입증하였다.
<110> POSCO
<120> Method and Appratus for Ultrasensitive Quantification of microRNA
<130> DPP20154409
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 50
<212> PRT
<213> HBD protein
<400> 1
Met Phe Tyr Ala Val Arg Arg Gly Arg Lys Thr Gly Val Phe Leu Thr
1 5 10 15
Trp Asn Glu Cys Arg Ala Gln Val Asp Arg Phe Pro Ala Ala Arg Phe
20 25 30
Lys Lys Phe Ala Thr Glu Asp Glu Ala Trp Ala Phe Val Arg Lys Ser
35 40 45
Ala Ser
50
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> miR-134
<400> 2
ugugacuggu ugaccagagg gg 22
Claims (19)
- 바디; 및 상기 바디의 말단에 형성된 탐침(tip)을 포함하며,
상기 탐침의 표면에 고정되며, DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 마이너 그루브에 염기서열 비특이적으로 결합하는 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함하는,
원자간력 현미경(atomic force microscope)용 캔틸레버.
- 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 결합 도메인은 인간 리보핵산가수분해효소 1(ribonuclease I, RNase I)의 아미노 말단 도메인인, 캔틸레버.
- 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 캔틸레버,
- 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 결합 도메인의 변이체는,
상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase, GST)가 연결된 것;
상기 하이브리드 결합 도메인에 히스티딘-태그가 연결된 것;
상기 하이브리드 결합 도메인에 비오틴화된 것; 및
상기 하이브리드 결합 도메인 내 위치 특이적 돌연변이가 형성된 것으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것인, 캔틸레버.
- 제4항에 있어서, 상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 연결된 글루타티온 S-전달 효소를 포함하는 하이브리드 결합 도메인의 변이체는, 글루타티온 S-전달 효소가 탐침에 고정되고, 변이체의 카르복시 말단은 탐침면과 반대방향으로 향하게 배향되는 것인, 캔틸레버.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA/RNA 혼성화체는 표적 마이크로 RNA(miRNA) 및 상기 표적 miRNA에 상보적으로 결합 가능한 프로브 DNA로 이루어지는 것인, 캔틸레버.
- 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체가 결합하는 DNA/RNA 혼성화체의 결합 위치가
RNA 가닥 중 연속적인 2개 염기의 2'-OH기이고;
DNA 가닥 중 3개의 포스포데옥시리보스 단위인 것인, 캔틸레버
- 제7항에 있어서,
상기 DNA/RNA 혼성화체의 결합하는 하이브리드 결합 도메인의 위치는,
DNA/RNA 혼성화체의 DNA 가닥이 결합하는 하이브리드 결합 도메인의 Y3, K33, K34; 및
DNA/RNA 혼성화체의 RNA 가닥이 결합하는 하이브리드 결합 도메인의 W17 및 F32인, 캔틸레버.
- 제6항에 있어서 상기 표적 miRNA는 단일 세포 유래인 것인, 캔틸레버.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 한에 따른 캔틸레버; 및
표적 miRNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA가 고정된 기판을 포함하는, 초고민감도 마이크로 RNA 정량 분석 키트.
- 제10항에 있어서, 상기 키트는 원자간력 현미경을 추가로 포함하는 것인 분석 키트.
- 표적 마이크로RNA(miRNA)에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 기판 표면에 고정하여 프로브 DNA 스팟을 형성하고,
상기 기판에 표적 miRNA가 포함된 시료를 접촉시켜 상기 프로브 DNA와 마이크로 RNA로 이루어지는 DNA/RNA 혼성화체를 형성하는 단계;
제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 캔틸레버를 이용하여 상기 스팟의 결합힘-지도화를 수행하고,
상기 결합힘이 관찰되는 스팟에 상기 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 분석 방법은
상기 시료 내 이중나선의 개수를 카운팅하여 표적 miRNA을 정량 하는 단계를 더욱 포함하는 분석 방법
- 제13항에 있어서, 상기 이중나선의 개수를 카운팅하는 단계는,
스팟의 단위 면적당 캡쳐된 이중나선 개수를 카운팅하는 단계; 및
하기의 식 1에 의하여 시료 내 총 이중나선 개수를 산출하는 단계를 포함하는, 분석 방법.
[식 1]
시료 내 총 이중나선 개수= (스팟의 단위 면적 당 이중나선 개수 × (스팟 면적/단위 면적))/(원자간력 현미경의 캡쳐 효율%/100)
- 제12항에 있어서, 상기 이중나선이 존재하는 것으로 결정하는 단계는
동역학적 거동 너비가 8nm 픽셀인 경우, 결합힘이 관찰되는 4개의 인접한 픽셀; 또는
동역학적 거동 너비가 10nm 픽셀인 경우 결합힘이 관찰되는 3개의 인접한 픽셀의 위치에 이중나선이 있는 것으로 결정하는 것인, 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 시료 내 표적 miRNA의 농도는 5×10-20 내지 2×10-13M인 것인, 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 형성된 프로브 DNA 스팟의 크기는 하기의 식 2 및 식 3으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에 의하여 산출되는 것인, 분석 방법:
[식 2]
프로브 DNA 스팟 지름(νm) = (마이크로 RNA 농도([M]) × 1019 / 5)0 . 5 ; 및
[식 3]
프로브 DNA 스팟 지름(νm) = (마이크로 RNA 수([개]) / 10)0 .5
- 제12항에 있어서 상기 기판은, 유리, 금속, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 세라믹, 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체 및 합금으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것인, 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 마이크로 RNA는 DNA/RNA 혼성화체가 형성된 후 혼성화되지 않은 영역의 뉴클레오타이드 개수가 0 내지 6개인 것인, 분석 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150164100A KR101742211B1 (ko) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 마이크로 rna의 초민감성 정량 분석 방법 및 장치 |
| US15/412,025 US11111528B2 (en) | 2015-11-23 | 2017-01-22 | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of microRNA using an atomic force microscope and a hybrid binding domain |
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| KR1020150164100A KR101742211B1 (ko) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 마이크로 rna의 초민감성 정량 분석 방법 및 장치 |
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|---|---|
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ID=59052410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150164100A KR101742211B1 (ko) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 마이크로 rna의 초민감성 정량 분석 방법 및 장치 |
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