KR101731615B1 - 켈빈 프루브 현미경을 이용한 dna-나노입자 복합체 기반의 초고감도 고속 단일 내지 복수의 염기 변이 검지방법 - Google Patents

켈빈 프루브 현미경을 이용한 dna-나노입자 복합체 기반의 초고감도 고속 단일 내지 복수의 염기 변이 검지방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 켈빈 프루브 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용한 나노입자 기반의 초고감도 고속 단일 내지 다중 유전자 변이 검지방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 탐침 DNA를 나노입자에 고정화 시킨 후 표적 DNA와 혼성화(hybridization)시킨 합성물을 기판 위에 뿌리고 켈빈 프루브 현미경으로 측정된 표면 전위(surface potential)로 유전자의 변이 여부를 1개의 염기 변이 수준에서 식별하는 방법에 관한 것이다.

Description

켈빈 프루브 현미경을 이용한 DNA-나노입자 복합체 기반의 초고감도 고속 단일 내지 복수의 염기 변이 검지방법{High-throughput detection method for single-to-multiple nucleotide mutations based on nanoparticle-DNA corona complex via Kelvin probe force microscopy}
본 발명은 켈빈 프루브 현미경을 이용한 DNA-나노입자 복합체 기반의 초고감도 고속 단일 내지 복수의 염기 변이 검지방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 금속 나노입자에 탐침(probe)으로서 DNA(deoxyrebonucleic acid) 단일가닥을 고정화시키는 단계와 표적 DNA 단일가닥을 처리하여 탐침 DNA 단일가닥과 표적 DNA 단일가닥의 결합을 유도하는 혼성화 단계 혼성화 단계를 거쳐 이중가닥이 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)를 금속 기판에 반응시키는 단계 및 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용하여 표면 전위(surface potential)를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 측정된 표면 전위(surface potential)를 동일한 방식으로 측정한 정상 DNA 또는 상기 측정한 표적 DNA와 상이한 수의 염기 변이를 갖는 표적 DNA에 대한 표면 전위(surface potential)와 비교하여, 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법에 관한 것이다.
유전체 검지는 친자확인 검사, 유전자 발현 개요, 약물 스크리닝 및 질병 예측 분야에 있어서 가장 주목 받는 부분이다. 특히, 우리나라의 경우 급격한 고령화 사회로 진행됨에 따라 건강에 관한 관심이 점차 높아지고 있는 추세이다. 실제로 건강관리 및 검진을 위한 병원 이용자 수는 매년 기하급수적으로 증가하고 있다. 따라서 단순한 생명연장이 아닌 삶의 질의 향상을 위한 질병예측에 있어서 DNA 특정 서열 검출은 정밀진단을 위해 반드시 필요한 기술로 요구되어지고 있다.
하나의 염기서열 변이까지 검출 가능한 DNA 분석을 위한 기존의 방법들은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 바탕으로 하는 방법(Mun HY, et al. 2009. Gold Nanoparticle-Based Label-Free Detection of BRCA1 Mutations Utilizing DNA Ligation on DNA Microarray, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, Vol.9, 1019 - 1024)으로 형광표지를 하지 않는다고 하더라도 중합효소 연쇄반응이 선행되어야 하고, 점돌연변이를 검출하기 위한 결찰연쇄반응(ligation chain reaction, LCR) 등 여러 과정이 필요할 뿐만 아니라 각 반응에서 온도조절이 필요하다는 점에서 번거롭고 오랜 시간이 소요되어 비효율적이다.
따라서 최근 간편한 방법으로 각광받고 있는 기술은 DNA의 상보적 결합을 전기적, 또는 전기화학적인 방법으로 검출하려는 것이다. 미국특허 제2006-0089825호는 생체분자의 상호작용을 알아내기 위해 핵산, 폴리펩타이드(polypeptide), 작은 분자 또는 항체항원 결합 등을 탐침(Probe)과 대상(Target)으로 하여 스캐닝 켈빈 마이크로 프로브 기술을 적용해 분자 간 상호결합에 따른 표면 지형학을 나타내는 접촉전위차 이미지와 접촉전위차 측정치의 변화를 통해 생체 분자의 상호작용을 검출하는 방법에 관한 발명으로 간단한 과정을 통해 빠른 시간 내에 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 하지만 탐침과 대상 사이의 상호작용에 따른 결합 유무 정도를 파악할 수 있을 뿐 결합친화도 까지는 파악할 수 없기 때문에 세밀한 DNA변이 분석은 불가능하다.
고감도의 생체분자 간의 결합을 전기적으로 검출하기 위해 켈빈 프루브 현미경을 이용한 기술을 제시해 주는 연구로 나노탐침을 사용해 10 nm 미만의 분해능, 50 nM의 민감도와 1,100 um/s 속도의 성능으로 3개의 염기서열 부정합까지 분석할 수 있는 방법이 있다.(Sinensky, & Belcher, Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy, Nature Nanotechnology 2, 653 - 659) 하지만 이 기술 역시 하나의 염기서열 변이까지는 파악할 수 없다는 점에서 완벽한 DNA변이 검출 방법이라 할 수 없다.
현재까지 많은 연구진들에 의해 개발된 DNA 분석방법들은 중합효소 연쇄반응을 바탕으로 한 표지 방법으로 그 과정이 매우 복잡하고 재현성이 낮아 효율성이 떨어진다. 또한 효율성을 높이기 위한 DNA의 상보적 결합을 전기적, 또는 전기화학적인 방법으로 검출하려는 방법은 간단한 준비과정으로 신속하게 결과를 얻을 수 있는 반면 정확도가 다소 떨어지는 문제점을 갖고 있다. 따라서 상기의 문제점들을 모두 극복한 간편한 방법으로 신속하게 하나의 염기서열 변이까지 확인할 수 있는 보다 정밀한 DNA 검출 방법이 요구되어진다.
미국공개특허 제2006-0089825호
Mun, H. Y. & Park H. G. (2009). Gold Nanoparticle-Based Label-Free Detection of BRCA1 Mutations Utilizing DNA Ligation on DNA Microarray, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, Vol.9, 1019 - 1024. Sinensky, A. K. & Belcher, A. M. (2007). Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy, Nature Nanotechnology 2, 653 - 659.
본 발명에서는 유전자 변이를 검출하기 위하여 DNA-나노입자 복합체를 기반으로 켈빈 프루브 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용하여 표면 전위를 측정하고, 동일한 방법으로 정상 표적 DNA 단일가닥 또는 상기 측정한 표적 DNA와 상이한 수의 염기 변이를 갖는 다른 표적 DNA에 대한 표면 전위를 측정해 비교하여, 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에서는 상기 과제 해결을 위하여 (a) 금속 나노입자에 탐침(probe)으로서 DNA(deoxyrebonucleic acid) 단일가닥을 고정화시키는 단계, (b) 표적 DNA 단일가닥을 처리하여 탐침 DNA 단일가닥과 표적 DNA 단일가닥의 결합을 유도하는 혼성화 단계, 및 (c) 혼성화 단계를 거쳐 이중가닥이 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)를 금속 기판에 반응시키는 단계를 거쳐 (d) 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용하여 표면 전위(surface potential)를 측정하고, 동일한 방식으로 측정한 정상 DNA 또는 상기 측정한 표적 DNA와 상이한 수의 염기 변이를 갖는 다른 표적 DNA에 대한 표면 전위(surface potential)를 비교하여 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법을 제공함으로써, 형광표지 없이 간단한 방법으로 신속하게 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)를 이용해 켈빈 프루브 현미경의 감도를 높여 하나의 염기서열 변이까지 표적 DNA상 유전자 변이 유무 검출하고 더 나아가 표적 DNA 상 변이된 염기 수를 식별할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 변이 검지방법은 금속 나노입자를 DNA 결합표면으로 이용하여 탐침과 접촉할 수 있는 결합점을 최소화 하여 보다 세밀한 DNA-DNA(혼성화된 이중가닥 DNA) 간 결합정도 파악을 가능하게하고, 10 × 10 ㎛²의 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM) 이미지만으로 2,000개 이상의 DNA가 고정화되어 있는 각각의 나노입자 몇 십 개가 동일조건에서 측정되므로 통계적 분석이 가능해 100 ㎕이하의 미량의 DNA 시료로 라벨 없이 간단하고 신속하게 하나의 염기서열 변이까지도 높은 신뢰수준으로 파악할 수 있는 초고감도 고속 유전자변이 검지방법이다.
도 1은 본 발명의 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)를 기반으로 켈빈 프루브 현미경을 이용한 유전자 변이 검지방법의 모식도이다.
도 2는 DNA가 고정화되지 않은 금 나노입자, 탐침 DNA 단일가닥이 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(이하, pDNA 코로나(coronae)), 및 탐침 DNA 단일가닥과 상보적인 DNA 단일가닥(표적 cDNA)이 혼성화된 이중가닥 DNA가 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(이하, p-cDNA 코로나(coronae)) 각각을 켈빈 프루브 현미경으로 측정한 위상(topology) 이미지(a~c), 표면 전위(surface potential) 이미지(d~f)), 및 위상 높이 이미지와 표면 전위 이미지를 통해 서로 대응하는 부분을 그래프(g~i)로 나타낸 것이다.
도 3은 켈빈 프루브 현미경으로 측정한 3차원(3D) 위상(topology) 및 표면 전위(surface potential) 이미지(10 x 10 ㎛2) 및 탐침 DNA와 표적 DNA의 혼성화 상태를 나타내는 DNA 서열 모식도이다(a: DNA가 결합하지 않은 나노입자(100 nm), b: pDNA 코로나(coronae), c: p-cDNA 코로나(coronae), d: 탐침 DNA 단일가닥과 상보성이 없는 DNA 단일가닥(표적 ncDNA)이 혼성화된 이중가닥 DNA가 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(이하, p-ncDNA 코로나(coronae)), e: 1개의 염기서열 변이가 있는 표적 DNA(m1DNA)와 탐침 DNA가 혼성화된 이중가닥 DNA가 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(이하, p-m1DNA 코로나(coronae)), f: 2개의 염기서열 변이가 있는 표적 DNA(m2DNA)와 탐침 DNA가 혼성화된 이중가닥 DNA가 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(이하, p-m2DNA 코로나(coronae)), g: 3개의 염기서열 변이가 있는 표적 DNA(m3DNA)와 탐침 DNA가 혼성화된 이중가닥 DNA가 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(이하, p-m3DNA 코로나(coronae)), h: 4개의 염기서열 변이가 있는 표적 DNA(m4DNA)와 탐침 DNA가 혼성화된 이중가닥 DNA가 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(이하, p-m4DNA 코로나(coronae)), i: 5개의 염기서열 변이가 있는 표적 DNA(m5DNA)와 탐침 DNA가 혼성화된 이중가닥 DNA가 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(이하, p-m5DNA 코로나(coronae)).
도 4는 유전자 변이의 검지를 위한 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)에 대한 KPFM 측정의 통계적 분석을 나타내는 그래프이다(p-cDNA 코로나(coronae), p-m1DNA 코로나(coronae), p-m2DNA 코로나(coronae), p-m3DNA 코로나(coronae), p-m4DNA 코로나(coronae), p-m5DNA 코로나(coronae), 및 p-ncDNA 코로나(coronae)의 위상 높이 및 표면 전위에 대한 히스토그램과 가우스 피팅 곡선(Gaussian fitting curve)(a, b) 및 박스 플롯(box plot)과 t검정(c, d)).
도 5 표적 DNA 농도에 따른 표면 전위의 분포 분석을 나타내는 그래프이다(a, d, g: p-cDNA 코로나(coronae), b, e, h: p-m1DNA 코로나(coronae), c, f, i: p-ncDNA 코로나(coronae), j, k l: 두 가지 다른 상태(단일가닥 또는 이중가닥 코로나(coronae))의 비율 정량화(j: pDNA, k: m1DNA, l; ncDNA)).
도 6 DNA-DNA 혼성화에 의한 DNA 분자의 구조적 변화에 대한 모식도이다.
본 발명은 a) 금속 나노입자에 탐침(probe)으로서 DNA(deoxyrebonucleic acid) 단일가닥을 고정화시키는 단계; (b) 표적 DNA 단일가닥을 처리하여 탐침 DNA 단일가닥과 표적 DNA 단일가닥의 결합을 유도하는 혼성화 단계; (c) 혼성화 단계를 거쳐 이중가닥이 고정화되어 있는 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)를 금속 기판에 반응시키는 단계; 및 (d) 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용하여 표면 전위(surface potential)를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 측정된 표면 전위(surface potential)를 동일한 방식으로 측정한 정상 DNA 또는 상기 측정한 표적 DNA와 상이한 수의 염기 변이를 갖는 다른 표적 DNA에 대한 표면 전위(surface potential)와 비교하여, 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 탐침 DNA 단일가닥은 정상 DNA 단일가닥과 상보적으로 결합하는 단일가닥이다.
본 발명의 일 양태에서, 검출을 위해 필요한 탐침 DNA 단일가닥은 또는 표적 DNA 단일가닥의 양은 100 ㎕ 이하일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 금속 나노입자는 금(Au) 나노입자일 수 있으며, 이 경우 금 나노입자의 크기는 100 ㎚이하인 것일 수 있다. 금 나노입자의 크기가 100 nm를 초과하는 경우 나노입자 특성이 소멸되어 생리활성물질이 결합된 입자를 제조하는 것이 불가능해질 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 금속기판은 금(Au) 기판일 수 있으며, 100 ㎚이하 크기의 금 나노입자를 사용하는 경우 금(Au) 기판의 두께가 20 nm 이하일 때 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 통한 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex) 측정을 위한 최적화 조건일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(a)에서, 금속 나노입자에 고정화되는 탐침 DNA 단일가닥은 티올(thiol)기 개질된 탐침 DNA일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(a)에서, 탐침 DNA는 정상 BRCA1 와 상보적인 결합을 하는 것으로 BRCA1 유전자를 검지하기 위한 DNA일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 금속 나노입자에 고정화된 탐침 DNA 단일가닥을 금속 기판 상에 적가하여 탐침 DNA 단일가닥이 금속 기판 표면과 정전기 결합(electrostatic interaction)에 의해 흡수되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 표적 DNA 단일가닥의 싱글 포인트(single point) 이상의 미스매치(mismatch)된 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 탐침 DNA와 완전하게 상보적인 표적 DNA(정상)의 혼성화에 의한 표면 전위(surface potential)는 탐침 DNA 단일가닥에 대한 표면 전위의 약 2배가 되고, 표적 DNA의 미스매치(mismatch)된 염기서열의 수가 많을수록 표면 전위(surface potential)는 감소하며, 탐침 DNA와 상보성이 전혀 없는 표적 DNA에 대한 표면 전위 값은 탐침 DNA 단일가닥에 대한 표면 전위 값과 유사하다. 즉, 표적 DNA 상에 염기서열이 정상 DNA와 일치하면 표면 전위는 탐침 DNA 단일가닥의 표면 전위의 약 2배가 되고, 표적 DNA 상에서 변이된 염기서열의 수가 많을수록 표면 전위는 작아지며, 대부분의 염기서열이 변이되었다면 탐침 DNA 단일가닥의 표면 전위와 유사할 수 있다. 여기서, 표면 전위(surface potential)는 DNA-나노입자 복합체들(nanoparticle-DNA corona complexes)의 표면전위의 평균값을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 10 × 10 ㎛²의 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM) 이미지만으로 2,200개 이상의 DNA가 고정화되어 있는 각각의 나노입자 수십 개가 동일조건에서 한 번에 측정되므로 100 ㎕이하의 미량의 DNA 시료로 높은 신뢰수준의 통계적 분석을 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 통계적 분석은 가우스 분포(Gaussian distribution) 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 측정된 표면 전위(surface potential)의 확률분포(probability distribution)로부터 산출한 이중가닥 DNA에 대한 단일가닥 DNA(탐침 DNA)의 비율이 높을수록 더 낮은 농도의 표적 DNA일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 DNA는 BRCA1 유전자일 수 있다.
본 발명은 또한 일 양태에서, DNA 대신 RNA, 단백질, 또는 탄수화물과 같은 생체분자 간의 결합을 초고감도로 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상설한 유전자 변이 유무를 검출하는 방법으로 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출함으로써, 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 암은 유방암, 자궁경부암, 자궁내막체암, 난소암, 위암, 식도암, 간암, 췌장암, 폐암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 골암, 결합조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨 질환, 림프종 및 다발성 골수종혈액암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출함으로써 암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있는 암은 유방암일 수 있다.
본 발명에 있어서, DNA의 미스매치(mismatch)란 유전자 상의 염기 변이 또는 부정합을 의미하고 싱글 미스매치(single mismatch)란 유전자 상의 단일 염기 변이를 의미한다.
본 발명에 있어서, DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex) 또는 DNA 코로나(corona)란 DNA 단일가닥 또는 이중가닥이 결합되어 있는 나노입자를 의미한다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예 등에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예] 유방암과 관련된 BRCA1 유전자의 변이 검지
1. 실시 재료 및 실시 방법
1.1. 금 나노입자에 탐침DNA 고정
1.1.1. 금(Au) 나노입자
Sigma Aldrich로부터 구입한 100 ㎚ 금(Au) 나노입자는 196.97 g/mol의 분자량으로 1 mM PBS에 안정화되어 있는 현탁액 상태이며, 1 mL당 3.45 ×109 ~ 4.22 ×109 나노입자 수로 존재한다.
1.1.2. DNA 용액
하기 표 1과 같이 BRCA1 유전자에서 1개에서 5개까지 염기 변이가 있는 올리고뉴클리오티드(oligonucleotides, Bio Basic Canada, Ontario, Canada)를 표적 DNA로 인위적으로 제조하였으며, 모든 올리고뉴클리오티드는 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)에 의해 정제되었다. DNA는 동일한 양의 인산 완충액(pH 7)에 용해시켜 동일한 농도의 DNA 용액이 되게 준비하였다.
Figure 112015019976002-pat00001
1.2.3. 탐침 DNA가 기능화된 금(Au) 나노입자
금 나노입자 위에 탐침 DNA를 고정화시키기 위하여 티올기(thiol group, -HS)가 결합된 탐침 DNA(염기서열: 5’-HS-CTA CCT TTT TTT TCT G-3’) 용액 2.5 mL와 콜로이드 금 나노입자 2.5 mL를 실온에서 혼합하였다. 모든 반응물들을 혼합시키기 위하여 혼합물을 16시간 동안 약하게 볼텍싱(vortexing)한 후 인산 완충액 15 mL를 첨가하여 40 시간 이상 약하게 볼텍싱(vortexing)한 다음 반응하지 않은 반응물을 제거하기 위하여 혼합물을 원심분리(14,000 rpm, 25 min, 실온)한 후 상등액 16 mL를 적재하고 인산 완충액 1 mL를 첨가하여 탐침 DNA가 기능화된 금 나노입자를 준비하였다.
1.2. 탐침DNA와 표적DNA의 혼성화
동일한 농도의 표적 DNA(예: cDNA, m1DNA, m2DNA, m3DNA, m4DNA, m5DNA, 및 ncDNA) 2.5 mL와 상기 탐침 DNA가 기능화된 금 나노입자 5 mL를 혼합한 혼합물을 3시간 동안 실온에서 약하게 볼텍싱(vortexing)하여 혼성화를 유도한 후 인산 완충액 12.5 mL를 첨가하여 상기와 동일한 방법으로 원심분리하여 혼성화 되지 않은 DNA를 제거하였다.
1.3. 금(Au) 기판에 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex) 반응
1.3.1. 금(Au) 기판
실리콘 다이옥사이드 웨이퍼(silicon dioxide wafer, Silicon Technology, Tokyo, Japan)를 피라나(piranha) 용액(H2SO4 : H2O2 = 1 : 1 (v/v))으로 최소 10분 정도 실온에서 헹군 후 열증착 장비(thermal evaporator)를 이용하여 크롬과 금을 규소 기판 위에 순차적으로 증착시킨 후 10 × 10 mm2로 잘라 금/크롬/규소 기판(Au (200 Å)/ Cr (50 Å)/Si substrates)을 준비하였다.
1.3.2. 금 기판에 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex) 흡착
1.2.에서 탐침 DNA와 표적 DNA를 혼성화 시킨 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complexes) 100 μL를 1.3.1에서 준비한 금 기판에 떨어뜨려 1시간 동안 DNA-나노입자 복합체가 금 기판에 흡착되도록 한 다음 탈이온수(deionized water)로 헹군 후 금 기판에 흡착된 DNA-나노입자 복합체들이 서로 뭉쳐지는 것을 방지하기 위하여 질소 바람(nitrogen gun)으로 부드럽게 건조하였다.
1.4. 표면 전위(surface potential) 측정
위상(topology)과 표면 전위(surface potential)의 측정은 시판 AFM(Atomic Force Microscopy, MultimodeV, Veeco, CA, USA)을 이용해 시행되었고, 표면 전위는 모두 리프트 모드(lift mode) KPFM에서 측정되었으며, SCM-PIT 전도성 팁(conducting tips, Bruker, CA, USA)은 전압(voltage)을 제어할 수 있는 MMEFCH 팁 홀더(MMEFCH tip holder, Veeco)에 장착하여 사용되었다.
2. 실시 결과
2.1. KPFM을 이용한 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)의 성질
2.1.1. KPFM을 이용한 DNA가 없는 금 나노입자, pDNA 금 나노입자, 및 p-cDNA 금 나노입자의 위상 높이 측정 결과
DNA가 없는 금 나노입자, 탐침 DNA만 기능화 되어 있는(pDNA) 금 나노입자, 및 탐침 DNA에 상보적으로 완벽하게 결합하는 표적 DNA(cDNA)가 혼성화 되어있는(p-cDNA) 금 나노입자의 위상 높이(topological heights)는 각각 89.0 ± 7.3 nm, 107.0 ± 6.6 nm, 및 108.5 ± 8.0 nm로 측정되었다. pDNA와 p-cDNA는 DNA가 없는 금 나노입자 경우 보다 비교적 높은 위상 높이를 나타냈으며, 이는 워블링 효과(wobbling effect)에 기인한 것으로 사료된다. DNA가 결합되어 있는 금 나노입자가 그렇지 않은 금 나노입자보다 기판에 강하게 흡착되어 워블링 효과(wobbling effect)와 같은 AFM의 결함이 제거되었기 때문에 조금 더 높은 높이를 나타낸 것으로 사료된다(도 2).
2.1.2. KPFM을 이용한 pDNA 금 나노입자 및 p-cDNA 금 나노입자의 표면 전위(surface potential) 측정 결과
탐침 DNA만 기능화 되어 있는(pDNA) 금 나노입자, 및 탐침 DNA에 상보적으로 완벽하게 결합하는 표적 DNA(정상)가 혼성화 되어있는(p-cDNA) 금 나노입자의 표면 전위(surface potential)는 각각 -0.743 V, -1.455 V로 측정되었다. 이는 p-cDNA의 표면 전위가 pDNA의 표면 전위에 두 배 정도가 되는 것이므로 금 나노입자 상에 모든 탐침 DNA가 표적 DNA(정상)와 상보적으로 완벽하게 혼성화 되었다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 표면 전위 측정을 위한 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)는 DNA-DNA간 입체장해에도 불구하고 DNA의 혼성화 정도를 측정하는데 충분히 적합하다는 것을 확인하였다.
2.2. KPFM을 이용한 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex) 기반의 유전자 돌연변이의 염기 변이 검지
2.2.1. 표적 DNA의 종류에 따른 3차원(3D) 위상과 표면 전위의 이미지
정상 표적 DNA(cDNA), 1개에서 5개까지의 염기서열 변이가 있는 각각의 표적 DNA(m1DNA, m2DNA ,m3DNA, m4DNA, m5DNA), 및 상보성이 전혀 없는 표적 DNA(ncDNA)와 탐침 DNA(pDNA)가 각각 혼성화된 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complexes)에 대하여 KPFM을 이용해 대기조건에서 10 μm·s-1의 스캔 속도로 3차원 위상과 표면 전위의 이미지를 얻었다(도 3).
그 결과, DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complexes)는 위상에서 양의 값으로 돌출된 형태인 반면 표면 전위 이미지에서는 음의 값으로 속이 빈 원추형 형태로 나타났으며 이는 상측면에서보다 하측면에서의 표면 전위 3차원 이미지에서 더 뚜렷하게 나타났다(도 3).
2.2.2. 음성 대조군 실험: 상보성이 전혀 없는 표적 DNA(ncDNA)에 대한 표면 전위
정확한 유전자 변이 분석을 위하여 음성 대조군 실험으로 상보성이 전혀 없는 표적 DNA(ncDNA)와 탐침 DNA(pDNA)가 혼성화된 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complexes)에 대하여 KPFM 분석을 실시하였다.
그 결과, p-ncDNA에 대한 표면 전위 분포는 탐침 DNA 단일가닥만 금 나노입자에 결합되어 있는 경우(pDNA)의 표면 전위 분포와 유사하게 나타났다. 구체적으로 p-ncDNA 표면 전위의 평균은 약 0.747 V였고, pDNA 표면 전위의 평균은 약 0.743 V였다. 즉, 표적 DNA가 탐침 DNA와 상보성이 전혀 없다면 상호작용을 하지 않기 때문에 p-ncDNA에 대한 표면 전위는 pDNA에 대한 표면 전위로부터 거의 변하지 않는다는 것을 확인하였다.
2.2.3. 변이된 염기 수에 따른 표면 전위
1개에서 5개까지의 염기 변이가 있는 각각의 표적 DNA(m1DNA, m2DNA, m3DNA, m4DNA, m5DNA)와 탐침 DNA(pDNA)가 혼성화된 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complexes)를 KPFM 분석하였다.
그 결과, p-cDNA, p-m1DNA, p-m2DNA, p-m3DNA, p-m4DNA, p-m5DNA, 및 p-ncDNA에 대한 표면 전위의 평균은 각각 1.455 V, 1.410 V, 1.334 V, 1.156 V, 0.912 V, 0.748 V, 0.747 V로 변이된 염기 수가 증가할수록 표면 전위는 작아지는 일관된 경향성을 나타냈다.
2.2.4. KPFM 측정에 의한 통계적 분석
모든 종류의 표적 DNA(cDNA, m1DNA, m2DNA, m3DNA, m4DNA, m5DNA, ncDNA)와 탐침 DNA(pDNA)가 각각 혼성화된 각각의 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex) 30 내지 55개를 무작위로 선택하여 KPFM으로 측정한 위상 높이와 표면 전위를 히스토그램 및 히스토그램에 적합한 가우스 피팅 곡선(Gaussian fitting curve)으로 나타내고, 박스 플랏(box plot)으로 나타내어 통계적인 분석 실시하였다.
그 결과, p-cDNA, p-m1DNA, p-m2DNA, p-m3DNA, p-m4DNA, p-m5DNA, 및 p-ncDNA에 대한 위상 높이는 각각 107.0 ± 6.6 nm, 103.8 ± 5.3 nm, 104.4 ± 4.5 nm, 105.3 ± 6.5 nm, 105.2 ± 3.9 nm, 106.3 ± 7.7 nm, 및 103.5 ± 6.1 nm로 탐침 DNA가 어떤 표적 DNA와 상호작용을 하더라도 위상 높이에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 4a).
반면, 표적 DNA(tDNA)와 탐침 DNA(pDNA)가 혼성화된 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)의 표면 전위는 위상 높이와 다르게 표적 DNA 상의 변이된 염기 수에 크게 의존하는 것으로 나타났다. 구체적으로 살펴보면, p-cDNA, p-m1DNA, p-m2DNA, p-m3DNA, p-m4DNA, p-m5DNA, 및 p-ncDNA에 대한 표면 전위를 히스토그램에 적합한 가우스 곡선의 평균 및 표준편차로 나타낸 통계적 값은 -1.455 ± 0.026 V(p-cDNA), -1.379 ± 0.036 V(p-m1DNA), -1.334 ± 0.041 V(p-m2DNA), -1.156 ± 0.044 V(p-m3DNA), -0.912 ± 0.055 V(p-m4DNA), -0.748 ± 0.034 V(p-m5DNA), 및 -0.747 ± 0.041 V(p-ncDNA)로 나타나 표적 DNA 상에 변이된 염기 수가 증가할수록 표면 전위의 절대값이 작아진다는 것을 확인하였다(도 4b).
2.2.5. 박스플롯(box plot)과 t검정(t-test)를 통한 변이된 염기서열 수의 차이가 1개인 두 집단 간의 구분에 대한 유의성 확인
본 발명에 따른 표면 전위 데이터를 통해 변이된 염기의 수가 1개 차이인 두 집단 간의 구분이 가능한지 확인하기 위하여 상기 측정한 표면 전위 데이터를 이용해 박스플롯(box plot)과 t검정(t-test)을 실시하였다.
그 결과, 박스플롯에서 표적 DNA의 종류에 따른 표면 전위에 대한 중앙값(median)은 모두 서로 명확하게 구분되는 차이를 나타냈으므로 변이된 염기의 수 차이가 1개인 모든 두 집단 간의 구분은 용이하게 이루어진다는 것을 박스플롯을 통해 확인하였다(도 4d).
또한, t검정에서 변이된 염기의 수 차이가 1개인 모든 두 집단 간 표면 전위의 평균에 대한 유의확률(P-value)이 모두 5% 보다 작게 나타났으므로 변이된 염기 수 차이가 1개인 모든 두 집단 간 표면 전위의 평균은 유의적으로 차이가 있다는 것을 t검정을 통해 확인하였다(도 4d).
따라서 박스플롯(box plot)과 t검정(t-test)를 통해서 본 발명에 따른 표면 전위 데이터를 통해 변이된 염기 수가 1개 차이인 두 집단 간의 구분이 가능하다는 것이 확인되었으며, 이는 본 발명에 따른 표적 DNA(tDNA)와 탐침 DNA(pDNA)가 혼성화된 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)에 대한 표면 전위 측정이 특정 유전자에서 단 1개의 염기 수준의 변이도 구별하게 할 수 있을 뿐만 아니라 염기서열의 단일 및/또는 다중 간의 변이를 정확하게 구별하게 할 수 있다는 것을 입증한다.
2.2.6. 표적 DNA의 농도에 따른 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)의 표면 전위 분포
본 발명의 검지 방법에 대한 또 다른 평가를 위하여 768 pM, 7.68 nM, 및 76.8 nM의 서로 다른 3개의 농도로 각각 표적 DNA가 탐침 DNA와 완벽한 상보적인 결합을 하는 정상 표적 DNA(cDNA), 단일 염기서열이 변이된 표적 DNA(m1DNA), 및 상보성이 전혀 없는 표적 DNA(ncDNA) 경우에 대하여 본 발명의 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex) 기반의 KPFM을 통한 검지를 실시하였다.
그 결과, 표적 DNA(cDNA 또는 m1DNA)가 낮은 농도(7.68 nM and 768 pM)로 탐침 DNA(pDNA)와 혼성화된 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)에 대한 표면 전위의 분포는 두 개의 서로 다른 상태로 나타난 반면 표적 DNA가 충분한 농도(76.8 nM)로 혼성화된 경우에서는 하나의 가우스 피크(Gaussian peak)로 나타났으며, 상보성이 전혀 없는 표적 DNA(ncDNA) 경우는 농도에 관계없이 감지할만한 표면 전위 변화가 없었다(도 5). 이는 혼성화 되는 표적 DNA가 충분한 농도로 존재하지 않으면 DNA-나노입자 복합체에 DNA가 단일가닥과 이중가닥의 두 가지 상태로 존재한다는 것을 의미한다.
한편, 표면 전위 분포에서 단일가닥 DNA과 이중가닥 DNA 대한 분포 사이에 중간 상태의 표면 전위 분포는 없었다. 이는 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex) 상에서의 혼성화가 무작위로 일어나지만 케스케이드(cascade) 방식으로 일어난다는 것으로 DNA 혼성화의 개시가 DNA 분자의 입체구조적 변화에 기인한 DNA 분자 간 입체 장해(steric hinderance)를 낮춰주기 때문이며, 결과적으로 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)는 표적 DNA가 전부 혼성화 되거나 전부 혼성화 되지 않은 조건하에서 반응이 일어나는 양자택일 혼성 모델(all or nothing hybridization model)로 반응이 일어난다는 것을 확인하였다.
또한, 표적 DNA의 종류(cDNA 및 m1DNA) 또는 농도에 따라 표면 전위에 대한 분포들 간의 미세한 크기적 차이가 있는 것으로 나타났다. 표적 DNA의 종류(cDNA 및 m1DNA)에 따른 차이는 표면 전위의 수치 차이에 대한 것으로 완벽한 상보적인 혼성화를 이루는 표적 DNA(cDNA) 보다 단일 염기서열 변이를 갖는 표적 DNA(m1DNA) 대한 분포가 낮은 값의 표면 전위를 나타냈다. 이는 상설한 바와 같이 완벽한 상보적인 혼성화를 이루는 표적 DNA(cDNA)보다 단일 염기서열 변이를 갖는 표적 DNA(m1DNA)의 탐침 DNA에 대한 결합 친화도가 낮기 때문에 탐침 DNA와 단일 염기서열 변이를 갖는 표적 DNA(m1DNA) 간의 상호작용이 더 약해서 표면 전위가 작아지는 것에 기인한다.
표적 DNA의 농도에 따른 차이를 수치화하기 위하여 이중가닥 DNA에 대한 단일가닥 DNA의 비율을 확률 분포의 비율 표로 나타내었다(도 5j-i).
그 결과, 이중가닥 DNA에 대한 단일가닥 DNA의 비율은 탐침 DNA의 농도가 감소할수록 증가하는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명에 따른 검지 방법은 탐침 DNA와 혼성화되는 표적 DNA 상에 변이된 염기 수가 증가할수록 표면 전위의 절대값이 작아진다는 것을 통해 유전자 상에서 변이된 염기 수를 명확하게 파악할 수 있게 할 뿐만 아니라 표적 DNA의 농도에 따라 나타나는 이중가닥 DNA에 대한 단일가닥 DNA의 비율을 통해 표적 DNA의 농도를 추측할 수 있게 한다는 것을 확인하였다.
3. 결론
상기 실시예를 통해 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)와 켈빈 프루브 현미경(Kelvin probe force microscopy, KPFM) 결합은 동일 유전자상에서 하나에서 5개까지의 염기 변이를 정확히 식별할 수 있게 하는 매우 유용한 기술이라는 것을 확인하였다. 탐침 DNA가 고정되어 있는 나노입자를 표적 DNA를 검지하기 위한 나노스케일의 플랫폼으로 이용하였다. 또한 KPFM를 이용한 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)의 측정 데이터를 통해 표적 DNA의 변이된 염기 수에 따른 위상 높이는 구별할만한 변화를 나타내지 않지만 표면 전위는 당-인산 백본(backbone)에 의해 음의 전하가 되는 DNA 때문에 변이된 염기 수가 증가할수록 변함없이 감소한다는 것을 확인하였다. 따라서 DNA-나노입자 복합체의 표면 전위를 하나의 염기 수준의 변이까지 정확히 검지할 수 있게 하는 매우 유용한 실질적인 물리적 항(term)으로 이용하였다. 종래의 다른 검지 수단에 비하여 본 발명에 따른 검지방법은 간단한 준비과정으로 신속하고 재현성이 매우 높은 장점이 있을 뿐만 아니라 몇 십 개의 DNA-나노입자 복합체의 통계적 분석이 한 번의 KPFM 이미징(imaging)으로 실현되어 유전자상에 염기서열의 특정 변이에 대한 초고감도 고속 검지를 제안한다. 더 나아가 본 발명에 따른 검지방식은 질병 발현과 염기 변이 사이의 관계 조사뿐만 아니라 기존의 방법으로 검지할 수 없었던 다른 생체 분자들의 검지를 가능하게 할 수 있다.

Claims (15)

  1. (a) 금속 나노입자에 탐침(probe)으로서 DNA(deoxyrebonucleic acid) 단일가닥을 고정화시키는 단계;
    (b) 표적 DNA 단일가닥을 처리하여 단계 (a)의 금속나노 입자에 고정화된 탐침 DNA 단일가닥과 표적 DNA 단일가닥의 결합을 유도하는 혼성화 단계;
    (c) 혼성화 단계를 거쳐 이중가닥이 고정화되어 있는 금속나노 입자를 금속 기판에 반응시키는 단계;
    (d) 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용하여표면 전위(surface potential)를 측정하는 단계;
    (e) 대조군으로 상기 단계 (b)의 표적 DNA 단일가닥과 상이한 수의 염기 변이를 갖는 DNA를 표적 DNA로 하여, 상기 단계 (a) 내지 (d)와 동일한 단계로 대조군 표적 DNA의 표면전위를 측정한 후, 상기 단계 (d)의 표면전위와 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 단계 (d)의 표면전위가 상기 단계 (e)의 대조군의 표면전위보다 감소할 경우, 단계 (b)의 표적 DNA가 단계 (e)의 표적 DNA보다 미스매치된 염기서열 수가 많은 것으로 판정하는 단계를 포함하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (f)의 검출을 위해 필요한 탐침 DNA 단일가닥은 또는 표적 DNA 단일가닥의 양은 100 ㎕ 이하인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 금속 나노입자는 금(Au) 나노입자인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 금(Au) 나노입자는 90 내지 100 ㎚ 이하인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이를 검출하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 금속기판은 금(Au) 기판인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 금(Au) 기판은 두께가 18 내지 20 nm 이하인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 단계(a)에서, 금속 나노입자에 고정화되는 탐침 DNA 단일가닥은 티올(thiol)기 개질된 탐침 DNA인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단계(a)에서, 금속 나노입자에 고정화된 탐침 DNA 단일가닥을 금속 기판 상에 적가하여 탐침 DNA 단일가닥이 금속 기판 표면과 정전기 결합(electrostatic interaction)에 의해 흡수되는 것을 특징으로 하는, 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (f)의 검출하는 방법은 표적 DNA 단일가닥의 싱글 포인트(single point) 이상의 미스매치(mismatch)된 서열을 검출하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    측정된 표면 전위(surface potential)의 확률분포(probability distribution)로부터 산출한 이중가닥 DNA에 대한 단일가닥 DNA(탐침 DNA)의 비율이 높을수록 더 낮은 농도의 표적 DNA인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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