JP4477936B2 - 核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
A)標的核酸と非共有結合(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、
B)分析物(アナライト)核酸の溶液から、検出すべき標的核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、
C)分析混合物の核酸を標識化ユニットで標識化すること、
D)場合により、弱く結合した核酸を除去するために表面を洗浄液で繰り返し処理すること、及び
E)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、
からなる方法に関する。
従って、本発明はまた様々な核酸の混合物から標的核酸を検出する方法であって、以下の工程:
A)標的核酸と非共有結合(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、
B')分析混合物の核酸を標識化ユニットで標識化すること、
C')標識化核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、
D)場合により、弱く結合した核酸を除去するために表面を洗浄液で繰り返し処理すること、及び
E)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、
からなる方法に関する。
−発現プロファイリング:RNAアナライト混合物、又はRNAアナライト混合物を用いる酵素反応後に得られる対応DNA混合物(例、cNDA)、の非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション。次いで、RNA混合物又はDNA混合物を標識体(labeling entity)とカップリングさせた後、ストリンジェントな洗浄工程を適用する。
−SNP(一塩基多型):SNPを含有するDNA混合物又酵素反応後に得られる対応DNA混合物とDNA混合物との非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション。次いで、DNA混合物と標識体(labeling entity)とのカップリング後、ストリンジェントな洗浄工程を適用する。
−増幅遺伝子の検出:増幅及び/又は非増幅遺伝子を含有するDNA混合物のハイブリダイゼーション、又は酵素反応で得られた対応するDNA混合物のDNA混合物との非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション。次いで、DNA混合物と標識体(labeling entity)とのカップリング、次いでストリンジェントな洗浄工程の適用。
非ストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいて達成されるシグナル強度が選択すべきハイブリダイゼーション反応においても保持されるので、密接に関連した核酸のハイブリダイゼーションによる区別が向上している。
・標的核酸の連結を、非ストリンジェントなハイブリダイゼーションの前又は後に行うことができる。
・ハイブリダイゼーション以外の方法で標識化ユニットを標的核酸に結合(カップリング)させるので、標的の配列に無関係である。
・標識化に使用できる様々な標識化ユニットの選択肢が当技術分野の当業者には既知である。そのため、種々の方法でDNAアレイを読み取ることが可能である。
実施例
実施例1 標識化の前及び後における区別の比較
5'-アミノを修飾した、アレル特異的なオリゴヌクレオチドを、あらかじめアミン基を有するポリマーで被覆しておいた酸化シリコンチップ上に共有結合的に固定化して2つのDNAチップを調製した。共有結合による固定化はホモ二官能性架橋試薬(交差リンカー)(homobifunctional cross-linker)BS3 (ビス-スルホ-スクシンイミジル スベラート、Pierce)を用いて行った。アレル−特異的オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
5'-amino-ttt ttt ttt cct aac tcg aac cc (配列番号:1)(試料C)
5'-amino-ttt ttt ttt cct aac ttg aac cc (配列番号:2)(試料T)
チップのサイズは1cm2であった。アレル特異的オリゴヌクレオチドをチップの表面に5μlづつ、2連で固定化し、チップあたり4スポットとなるようにした。
5'-ビオチン-ttg tgt ttg tct gcg acc (配列番号:3)
また、非ビオチニル化プライマーの配列は以下の通りである。
5'-ccc aac acc aaa tat aca cca (配列番号:4)
5'-ビオチン-tt gtgtttgtct gcgacccaga atcactgggg ttcAagttag ggttcagatc tgagccaggt tagggggtta atgtcagggg gtaaagatta ggaggttggt gtatatttgg tgttggg (配列番号:5)
(式中、AはSNP部位を表す。)
PCR生成物2×50μlをMicrocon-3カラム(Millipore供給、MWCO=3,000)で遠心分離して脱塩した。脱塩したPCR生成物を0.11N NaOH、0.9M NaCl、0.005%SDSの混合物45μlに溶解した。アルカリ性の標的溶液を同等に調製した2つのDNAチップに適用し、25℃で10分間インキュベートした。
19名の様々な患者由来のDNAを、そのCETP-Tagl遺伝子型に関し、先行技術に対応する遺伝子型解析法(例えば、Pyrosequencing)で検討した。次いで、19名の異なる患者のDNAを標準的な方法により、ビオチニル化プライマーと非ビオチニル化プライマーを用いてPCRで増幅した。ビオチンプライマーの配列は以下の通りである。
5'-ビオチン-ttg tgt ttg tct gcg acc (配列番号:3)
また、非ビオチニル化プライマーの配列は以下の通りである。
5'-ccc aac acc aaa tat aca cca (配列番号:4)
5'-ビオチン-tt gtgtttgtct gcgacccaga atcactgggg ttcRagttag ggttcagatc tgagccaggt tagggggtta atgtcagggg gtaaagatta ggaggttggt gtatatttgg tgttggg (配列番号:6)
(R=A又はG)
5'-アミノが修飾された、アレル−特異的なオリゴヌクレオチドを、アミン基を含有するポリマーで被覆した酸化シリコンチップ上に固定化し、19個のDNAチップを調製した。共有結合的な固定化はホモ二官能性架橋試薬(交差リンカー)BS3 (ビス-スルホ-スクシンイミジル スベラート、Pierce)を用いて行った。アレル−特異的オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
5'-アミノ-ttt ttt ttt cct aac tcg aac cc (配列番号:1)(Gアレル特異的)及び
5'-アミノ- ttt ttt ttt cct aac ttg aac cc (配列番号:2) (Aアレル特異的)
チップの大きさは1cm2であった。アレル特異的オリゴヌクレオチドをチップの表面に2連で固定化しチップあたり4スポットとなるようにした。
結果を表2に示す。19の遺伝型のうち、18の遺伝型が正確に決定された。一例(患者13)の場合、ホモ接合性のG−アレルを担っている患者をヘテロ接合性の患者と決定した。
Claims (10)
- 様々な核酸の混合物から標的核酸を検出する方法であって、以下の工程:
A)標的核酸と非共有(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、
B)アナライト核酸の溶液から、検出すべき標的核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、
C)分析混合物の核酸を標識化エレメントで標識化すること、
ここで、該標識化エレメントの分子量は10,000g/molより大きく;該核酸は、リガンド結合受容体分子と結合するリガンドとカップリングしており、標識化ユニットは該受容体分子と連結するかまたは該受容体分子でコートされており;アビジン、ニュートラアビジン及びストレプトアビジンを該受容体として用い、ビオチンをリガンドとして用いる、
また、工程C)は工程B)の前に行うこともできる、
D)温度が60℃以上の熱的に調節された緩衝液を用いるストリンジェントな条件下で表面を洗浄液で1回または繰り返し処理して弱く結合した核酸を除去すること、及び
E)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、
を含む方法。 - 工程D)の緩衝液の温度が75℃である請求項1記載の方法。
- 工程D)を、ストリンジェントな条件下で、そのイオン強度がアナライト核酸の固定化核酸上へのハイブリダイゼーションにおいて選択されるアナライト溶液のイオン強度よりも低い熱的に調節された緩衝液を用いて行う、請求項1または2に記載の方法。
- 工程D)を、ストリンジェントな条件下で、ナトリウム−塩素緩衝液であって、その緩衝液の濃度が、固定化核酸上へのハイブリダイゼーションのために選択されるナトリウム−塩素濃度より低い緩衝液を用いて行う、請求項3記載の方法。
- 標的核酸とリガンドの連結が酵素的若しくは化学的な方法、あるいはインターカレーションにより行われる、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 標識化ユニットがナノ粒子、金属複合体及び/又はAu、Ag、Pt、Pd、及びCからなる群から選択される元素に基づくクラスターである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 標識化ユニットを検出工程E)より前に又はその間に増強する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 表面が一組の異なる固定化された核酸又は核酸アナログを有する、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 検出すべき核酸がリガンドとしてのビオチンと連結されており、標識化が受容体としてのアビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンで被覆した金粒子を用いて行われる、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 金粒子がオートメタログラフィー反応により増強され、核酸の検出が光学的又は電気的に行われる、請求項8記載の方法。
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Cited By (1)
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