KR101991593B1 - 공진 주파수 이동현상을 이용한 유전자 돌연변이 검출용 센서 - Google Patents

공진 주파수 이동현상을 이용한 유전자 돌연변이 검출용 센서 Download PDF

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강지민
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Abstract

본 발명은 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체를 이용한 단일염기변이 검출용 센서, 키트 및 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 DNA-DNA간 혼성화 반응 및 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체의 미스매치 염기에의 결합 과정을 통하여 완전한 혼성화를 이룬 표적핵산 및 불완전한 혼성화를 이룬 단일염기변이의 공진 주파수의 차이를 정량적으로 분석함으로써, PCR에 의한 DNA 증폭단계 없이도 저비용 및 고민감도로 신속하고 정확하게 단일염기변이를 검출할 수 있다. 또한, 약물 처방에 대한 폐암 등과 같은 질병 치료의 예후를 예측함으로써 환자의 치료방침을 미리 결정할 수 있는 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Description

공진 주파수 이동현상을 이용한 유전자 돌연변이 검출용 센서{Sensor for detection of gene mutation using resonance frequency shift}
본 발명은 단일염기변이를 높은 선택성 및 고감도로 검출할 수 있는 센서 및 이를 이용하여 단일염기변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
단일염기변이(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)는 DNA 염기서열에서 하나의 염기가 치환되어 나타나는 유전적 변이로, 병의 원인 또는 치료제에 대한 반응성 등에 있어 개인차를 가지고 온다. 이에 단일염기서열 변이의 검출과 확인은 맞춤 의약뿐 아니라 신약개발에도 연결되기 때문에 관심이 집중되고 있다.
단일염기서열 변이의 신속한 검출을 위해서 다양한 방법이 사용되고 있다. 예를 들어, 고해상도 용융분석(HRM)기술(Do, H., et al., BMC Cancer, 2008. 8(1) p. 1-14.), 파이로 시퀀싱(Ogino, S., et al., The Journal of Molecular Diagnostics, 2005. 7(3): p. 413-421; Tsiatis, A.C., et al., The Journal of Molecular Diagnostics, 2010. 12(4): p. 425-432), 생거 시퀀싱, 잠긴 핵산(LNA)- 폴리머라제연쇄반응(Arcila, M., et al., The Journal of Molecular Diagnostics, 2011. 13(1): p. 64-73), 정량적 PCR (Thierry, A.R., et al., The Journal of Molecular Diagnostics, 2011. 13(1): p. 64-73), digital PCR ( Laurent-Puig, P., et al., Nat Med, 2014. 20(4): p. 430-435), 하부 변성 온도 PCR에서의 동시 증폭 ( Zuo, Z., et al., Modern Pathology, 2009. 22(8): p. 1023-31) 및 켈빈 프로브 힘 현미경(KPFM) 등이 있다(Jang, K., et al., Biosensors and Bioelectronics, 2017. 87: p. 222-228).
그러나 표적 유전자를 증폭시킴으로써 작동하는 PCR 기법은 몇 가지 증폭 단계를 수행하므로 필연적으로 가격이 비싸고 검출 과정 또한 매우 복잡하며, KPFM 방법은 실험실 환경의 요구, 높은 운영 비용 및 복잡한 치료 절차를 거쳐야 한다는 단점을 가진다(Jang, K., et al., Biosensors and Bioelectronics, 2017. 87: p. 222-228).
마이크로 캔틸레버와 같은 나노기계 소자(nano mechanical device)는 DNA 혼성화, 단백질 항원-항체 결합, RNA-단백질 상호작용, 펩타이드-약물 상호작용, 및 막 단백질 상에 리간드-결합과 같은 다양한 생물학적 분자 사이에 상호작용에 있어 특성 분석을 가능하게 한다. 특히, 단일가닥 DNA(ssDNA) 샘플 사이의 상보적인 혼성화 과정을 이용한 DNA 감지(sensing)가 많이 연구되고 있으며, 주로 액상의 나노입자를 이용한 표적핵산의 분리 및 신호 검출이 연구되고 있다(Y. Weizmann et al., J Am Chem Soc, 133:3238, 2011; S. Cai et al., Analyst, 135:615, 2010; J. T. Petty et al., Anal Chem, 84:356, 2012). 하지만, 불안정한 상태의 액상의 나노입자를 이용한 돌연변이 DNA 검출은 온도 및 pH를 조절에 의해 혼성화 효율에 영향을 받으므로, 나노입자의 광학 특성은 유체역학적 효과, pH 및 혼합적 요소에 의해 변하기 때문에 신호에 부정적인 영향을 주며, 액상의 나노입자를 이용한 센서는 여러 복잡한 단계를 거쳐야 하기 때문에 낮은 반응 효율 및 낮은 재현성을 가지는 문제점이 있다(A. G. Kanaras et al., Angew Chem Int Edit, 42:191, 2003).
또한, 대부분의 바이오 센서들은 단일 가닥의 프로브를 사용하여 DNA 상보결합을 통해 타겟 유전자를 검출하는 방법이므로 타겟 유전자가 단일염기서열 오류를 가지고 있다면 정상 유전자와 동일한 검출 결과가 나타나며 이에 기존의 방법으로는 검출 데이터가 정상 유전자 때문에 나온 신호인지, 아니면 변이 유전자를 검출하여 나온 신호인지 판단하기가 어려운 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 표적핵산의 단일염기변이를 효과적으로 검출하기 위해 예의 노력한 결과, 단일염기 미스매치를 인식하여 결합할 수 있는 뮤테이터 에스(Mutator S) 단백질에 금 나노입자를 결합시켜 AuNP-MutS 복합체를 제작하고, 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 표면에 고정된 마이크로 공진기를 제작한 후 상기 마이크로 공진기의 프로브와 표적핵산과의 혼성화 반응을 수행한 결과, 불완전한 혼성화를 이룬 단일염기변이에 AuNP-MutS가 결합하여 발생한 공진주파수 이동을 정량적으로 분석할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 PCR에 의한 유전자 증폭 과정없이 단시간 내에 DNA 내의 단일염기 미스매치를 고민감도로 신속하게 탐지할 수 있는 센서, 키트 및 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 마이크로 공진기와 상기 마이크로 공진기 표면에 고정되고 단일염기변이 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하되, 상기 단일염기변이 유전자는 프로브와 혼성화된 후 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체와 결합하는 것인 단일염기변이 검출용 센서, 및 (a) 뮤테이터 에스(Mutator S) 단백질에 금속 나노입자를 결합시키는 단계; (b) 마이크로 공진기의 표면에 단일염기변이 유전자와 선택적으로 결합할 수 있는 프로브를 고정하는 단계; (c) 상기 마이크로 공진기의 표면을 단일염기변이 유전자가 포함된 액상 시료에 담그어 상기 프로브와 단일염기변이 유전자의 혼성화를 수행하는 단계; (d) 금속 나노입자가 결합된 뮤테이터 에스 단백질이 상기 혼성화된 이중가닥 DNA의 단일염기 불일치를 인식하여 선택적으로 결합하는 단계; 및 (e) 상기 선택적 결합으로 인한 질량 증가에 따른 상기 마이크로 공진기의 공진 주파수 이동현상을 분석하는 단계;를 포함하는 단일염기변이의 검출방법을 제공함으로써 상기 과제를 해결하였다. 본 발명에서는 표적 단일염기변이 유전자의 농도에 따른 검출 민감도와 단일염기변이의 종류에 따른 검출 특이성 실험을 수행하였다.
본 발명의 표적핵산의 단일염기변이 검출용 센서, 키트 및 검출 방법은 DNA-DNA간 혼성화 반응 및 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체의 미스매치 염기에의 결합 과정을 통하여 표적핵산 및 단일염기변이의 공진 주파수의 차이를 정량적으로 분석함으로써, PCR에 의한 DNA 증폭단계 없이도 저비용 및 고민감도로 신속하고 정확하게 단일염기변이를 검출할 수 있다. 또한, 약물 처방에 대한 폐암 등과 같은 질병 치료의 예후를 예측함으로써 환자의 치료방침을 미리 결정할 수 있는 유용한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 센서의 구조 및 이를 이용하여 단일염기변이를 검출하는 개략적인 개념을 도시한 도면으로서, 마이크로 공진기의 표면에 고정된 단일가닥의 프로브 DNA와 표적 핵산인 단일염기변이 DNA가 불완전하게 혼성화된 상태에서 금속 나노입자와 결합된 뮤테이터 에스(Mutator S) 단백질과의 상호작용에 의해 발생하는 공진 주파수의 이동 현상을 보여주는 개념도이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 DNA 서열을 나타낸 것으로 붉은색으로 표시된 것은 단일염기변이를 나타낸 것이고, 푸른색은 변이가 생기지 않은 정상 염기를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 금 나노입자-뮤테이터 에스 복합체(AuNP-MutS)의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 센서의 검출원리를 보여준다.
도 5에서 (A)는 본 발명에 따른 마이크로 공진기 표면상에 단일가닥의 프로브의 고정화를 확인한 형광 현미경 이미지이고, (B)는 프로브가 결합되지 않은 본래 상태의 공진기 표면(좌)과 프로브가 고정화된 공진기 표면(우)에 대한 20μm AFM 이미지 비교를 통해 프로브 DNA가 공진기 표면에 고정화된 것을 확인한 것이다.
도 6은 순수 뮤테이터 에스(MutS) 단백질의 AFM 영상(좌) 및 KPFM 이미지(우)이다.
도 7에서 (A)는 완충액 샘플 중 노출된 AuNP 및 AuNP-MutS의 사진 이미지이고, (B)는 금 나노입자(흑색선), 금 나노입자와 버퍼(푸른색) 및 MutS-금 나노입자와 버퍼(적색선)의 UV-visible 흡수 스펙트럼을 도시한 그래프이고, (C)는 금 나노입자 및 MutS-금 나노입자에 대한 AFM 및 KPFM 이미지이다[수평 눈금 막대는 50nm, 수직은 5 nm(상단) 및 100 mV(하단)].
도 8는 본 발명에서 사용된 샘플들의 높이(상단) 및 KPFM(하단) 데이터를 나타낸 것이다.
도 9a와 도 9b는 금 나노입자의 질량 증폭기로서의 효과를 평가한 그래프이다.
도 10은 다양한 농도의 단일염기변이 유전자에 대하여 본 발명에 따른 센서 및 검출 방법을 사용하여 측정한 공진 주파수 시프트를 나타낸 것이다.
도 11는 다른 종류의 단일염기변이에 대한 공진 주파수 시프트를 도시한 그래프이다.
도 12은 돌연변이 유전자와 정상 유전자의 비율에 따른 공진 주파수 시프트를 도시한 그래프이다.
도 13는 다른 종류의 프로브에 대한 공명 주파수 시프트를 도시한 그래프이다.
도 14는 저 용량 DNA 검출 실험에 따른 공명 주파수 시프트를 도시한 그래프이다.
본 발명은 마이크로 공진기; 및 상기 마이크로 공진기 표면에 고정되고 단일염기변이 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하되, 상기 단일염기변이 유전자는 프로브와 혼성화된 후 금속 나노입자-뮤테이터 에스(Mutator S) 복합체와 결합하는 것인 단일염기변이 검출용 센서에 관한 것이다.
하기 도 1은 본 발명에 따른 센서의 구조 및 이를 이용하여 단일염기변이를 검출하는 개략적인 개념을 도시한 도면으로서, 마이크로 공진기의 표면에 고정된 단일가닥의 프로브 DNA와 표적핵산인 단일염기변이 DNA가 불완전하게 혼성화된 후 AuNP-MutS 복합체와의 결합에 의해 발생하는 공진 주파수의 이동 현상을 보여주는 개념도이다.
본 발명의 '표적핵산'은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화 조건 하에서 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. '표적핵산'은 '타겟 핵산'으로 혼용되어 사용된다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 핵산에 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 본 발명에서 프로브는 돌연변형의 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 완벽하게 일치된 서열(matched sequence)을 가지는 반면 야생형의 dsDNA는 불일치된 서열(mismatched sequence)을 갖도록 디자인하는 것이 바람직하다.
본 명세서의 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일가닥 핵산이 상보적인 염기서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일가닥 핵산서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.
본 발명의 '금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체'는 뮤테이터 에스(Mutator S) 단백질에 금속 나노입자를 결합시킨 복합체로서 MutS 단백질이 단일염기 미스매치에 특이적으로 결합할 때 금속 나노입자가 함께 결합하여 질량 증폭제로서의 역할을 하게 된다.
즉, 본 발명의 센서는 상기 프로브와 결합된 단일염기변이 유전자에 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체가 결합하면 질량 증가에 따라 공진 주파수 이동 현상을 나타내는 것을 기반으로 하여 단일염기변이를 높은 선택성 및 고감도로 검출할 수 있도록 하였다.
본 발명의 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 산화아연 나노입자, 티타니아 나노입자 또는 이들의 조합일 수 있으며, 금 코어와 이를 코팅하는 은 쉘, 또는 은 코어와 이를 코팅하는 금 쉘 등과 같이 혼합된 금속 나노입자의 구조를 가지는 것이 가능하다.
또한, 금속 나노입자의 크기는 바람직하게는 5nm 내지 500nm, 보다 바람직하게는 10nm 내지 30nm 의 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 '단일염기변이'는 단일 염기의 차이를 보이는 변이를 말하며, 단일염기다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)과 점 돌연변이(point mutation)을 포함하는 개념으로 사용된다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 본 발명의 상기 단일염기변이는 KRAS(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 돌연변이를 포함하고, 바람직하게는 엑손 2 내의 코돈 12 또는 13의 점돌연변이이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 엑손 2 올리고뉴클레오티드 프로브 서열로서 5'-ACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTAC-3'(서열번호 1)을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단일염기변이가 존재하는 이미 알려진 서열 정보를 바탕으로 당업자는 이들 유전자의 특정 영역에 특이적으로 결합하는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 단일염기변이 유전자는 서열번호 3 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 상기 프로브와 마찬가지로 이에 제한되는 것이 아니며, 뮤테이터 에스(Mut S) 단백질에 의해 인식되는 단일염기 변이를 포함하는 유전자라면 타겟 핵산으로 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 KRAS(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 유전자 변이는 여러 종류의 암과 관련된 유전체 변이로 알려져 있으며, 폐암의 경우 anti-EGFR 화학요법에 내성이 있는 환자에게서 KRAS 변이가 나타나는 것이 확인되었는바, KRAS 변이를 진단한다면 치료의 예후를 예측함으로써 환자의 치료방침을 미리 결정할 수 있는 유용한 정보를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명에 있어서, 상기 단일염기변이 검출은 폐암환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 것일 수 있고, 상기 폐암은 비소세포 폐암일 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통하여 다양한 농도의 DNA 샘플에서 단일염기변이를 검출하였으며, 100 펨토몰(fM)에 해당하는 극소량의 DNA 샘플에서도 단일염기 변이를 검출할 수 있는 고감도의 센서를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 단일염기변이 유전자 검출용 센서; 및 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체를 포함하는 단일염기변이 유전자 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체를 구성하는 뮤테이터 에스(Mutator S) 단백질은 단일염기변이 유전자가 프로브와 불완전하게 혼성화되면 미스매치된 위치에 결합하여 정상 유전자와 돌연변이 유전자를 구별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 (a) 뮤테이터 에스(Mutator S) 단백질에 금속 나노입자를 결합시키는 단계; (b) 마이크로 공진기의 표면에 단일염기변이 유전자와 선택적으로 결합할 수 있는 프로브를 고정하는 단계; (c) 상기 마이크로 공진기의 표면을 단일염기변이 유전자가 포함된 액상 시료에 담그어 상기 프로브와 단일염기변이 유전자의 혼성화를 수행하는 단계; (d) 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체가 상기 혼성화된 이중가닥 DNA의 단일염기 불일치를 인식하여 선택적으로 결합하는 단계; 및 (e) 상기 선택적 결합으로 인한 질량 증가에 따른 상기 마이크로 공진기의 공진 주파수 이동현상을 분석하는 단계;를 포함하는 단일염기변이의 검출방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 검출방법에 있어서, 상기 금속 나노입자, 뮤테이터 에스 단백질, 프로브 및 단일염기변이 유전자에 대한 내용은 전술한 바와 같으며, 상기 프로브와 단일염기변이 유전자의 불완전한 혼성화 및 미스 매치된 위치에 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체가 선택적으로 결합함으로써 야기되는 공진 주파수 이동(Δfn)은 하기 식으로 표시될 수 있으며:
Δfn = (ωb - ωa) / ωb × 100
상기 식에서, ωb는 상기 프로브 DNA를 마이크로 공진기의 표면 상에 고정화시킨 후 측정한 공진 주파수이고, ωa는 프로브 DNA와 단일염기변이 DNA가 혼성화된 이중가닥 DNA에 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체가 결합된 이후에 측정한 공진 주파수이다.
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
1. 재료 및 방법
1-1. 재료
본 발명에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 Integrated DNA technologies (Coralville, IA, USA)에서 구매하였고, 금 나노 입자 (20-nm 직경, 시트 레이트 완충액에 안정화 된 현탁액), 99.9%의 에틸-알코올, TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride], Tris-HCl 완충액, Tris-EDTA(TE) 완충액, 황산, 과산화수소, 디티오트레이 톨 (DTT), NaCl, MgCl2, 인산염 완충 식염수(PBS), 염화칼륨(KCl), 페리 시안화 칼륨(K3(FeCN)6)은 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. Thermus aquaticus 뮤테이터 에스(MutS)는 Nippon gene (Tokyo, Japan.)에서 구입하였다.
시험된 DNA 서열
올리고뉴클레오타이드 서열
프로브
(서열번호 1)		 5'-Thiol- ACT CTT GCC TAC GCC ACC AGC TCC AAC TAC-3'
완전히 상보적인 타겟
(서열번호 2)		 5'-GTA GTT GGA GCT GGT GGC GTA GGC AAG AGT-3'
단일염기변이
c.35 G>A (서열번호 3) 5'-GTA GTT GGA GCT GAT GGC GTA GGC AAG AGT-3'
c.34 G>A (서열번호 4) 5'-GTA GTT GGA GCT AGT GGC GTA GGC AAG AGT-3'
c.34 G>T (서열번호 5) 5'-GTA GTT GGA GCT TGT GGC GTA GGC AAG AGT-3'
c.35 G>T (서열번호 6) 5'-GTA GTT GGA GCT GTT GGC GTA GGC AAG AGT-3'
c.38 G>A (서열번호 7) 5'-GTA GTT GGA GCT GGT GAC GTA GGC AAG AGT-3'
c.39 C>T (서열번호 8) 5'-GTA GTT GGA GCT GGT GGT GTA GGC AAG AGT-3'
구분실험을 위한 프로브
c.34 G>A 5'-Thiol- ACT CTT GCC TAC GCC ACT AGC TCC AAC TAC - 3'
c.35 G>T 5'-Thiol- ACT CTT GCC TAC ACC AAC AGC TCC AAC TAC - 3'
c.38 G>A 5'-Thiol- ACT CTT GCC TAC ATC ACC AGC TCC AAC TAC - 3'
c.39 C>T 5'-Thiol- ACT CTT GCC TAC ACC ACC AGC TCC AAC TAC - 3'
1-2. 단일염기변이 검출 센서의 제조
먼저 마이크로 캔틸레버 공진기로는 4 μm × 30 μm × 125 μm (두께 × 넓이 × 길이)의 치수 및 최대 42 N/m 의 강도를 갖는, 표면에 금이 증착된 공진기(PPP-NCH Au, Neuchβtel, Switzerland)를 사용하였다. 프로브 DNA에 결합된 티올기가 활성화되면, 금, 은 등의 금속 표면에 잘 결합하는 것으로 알려져 있다. 이에 프로브 DNA (5' - Thiol - ACT CTT GCC TAC GCC ACC AGC TCC AAC TAC - 3', 서열번호 1)의 활성화된 티올기와 공진기 표면에 증착된 금의 티올 - 골드 결합을 사용하여 공진기 표면에 프로브를 고정하여 센서를 제작하였다. 이 방법에는 DNA 말단의 티올을 활성화 시키기 위하여 TCEP 솔루션(10 μL, 200 μM)이 프로브 용액 속에 들어갔다. (10 μL, 20 μM) 그 후 생성된 용액을 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 그런 다음 증류수 980 μL (DI) 를 용액에 첨가하여 최종 DNA 농도를 0.2 μM로 하였다. 그 이후에 공진기를 피라니아(piranha) 용액과 증류수로 세정하였다 (H2SO4:H2O2 = 7:3). 그 후, 공진기를 프로브 DNA 용액에 4시간 동안 담그고, 다음으로, 공진기를 DI water로 다시 헹구고, 이어서 실온에서 데시케이터 내에서 12시간 동안 건조시켰다.
1-3. 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체의 제조(도 3)
금 나노입자(AuNP) 용액 (5 ml)과 뮤테이터 에스 단백질(MutS) 용액(50μL)을 바이알에 넣고 37℃의 암실에서 60분간 저어 주었다. 그 후, 혼합물을 3000g에서 15분간 원심 분리하고, 상등액을 버려 저장용 완충액을 뮤트에스(MutS) 반응 완충액으로 치환하였다. [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, 5 mM MgCl2]. AuNP와 MutS 결합을 확인하기 위해 SpectraMAX i3x (Molecular Devices)를 사용하여 UV-vis 스펙트럼을 분석하였다. 또한, Nanodrive 컨트롤러가 장착된 Innova 현미경을 사용하여 AuNP-MutS 형성을 입증하기 위해 탭핑 모드 AFM(원자힘현미경, Atomic force microscope) 및 KPFM(켈빈프로브힘현미경, Kelvin probe force microscopy) 측정을 수행하였다.
1-4. 본 발명에 따른 센서의 단일염기변이 검출 민감도 평가
본 발명에 따른 센서의 감도를 평가하기 위해, 100 nM의 가장 높은 농도에서 10 fM의 가장 낮은 농도까지 순차적으로 다양한 농도의 검출 용액을 준비하였다. 검출 용액은 DI water에 200 mM Na+ 이온과 DNA를 함유하고, 실험에서 사용된 기본 KRAS는 c.35G>A (5' - GTA GTT GGA GCT GAT GGC GTA GGC AAG AGT - 3') 를 사용하였다. KRAS DNA가 고정된 공진기 센서를 검출용액에 실온에서 30분 동안 담가 두었다. 검출 단계를 완료한 후, 공진기를 실온에서 30분 동안 MutS 반응 완충액으로 MutS - AuNP 용액에 침지시켜 질량을 증폭시켰다. 이후 공진기를 6시간 동안 건조시켰다. 공진기의 공진 주파수는 AFM (Bruker, Santa Barbara, CA, USA) 을 사용하여 측정하였다. 또한, 동일한 프로토콜에 따라 코돈 12와 13에서 돌연변이가 있는 다른 KRAS 돌연변이 DNA를 검사했다. 돌연변이 DNA의 시퀀스는 다음과 같다. c.34 G>A (5' - GTA GTT GGA GCT AGT GGC GTA GGC AAG AGT - 3'), c.34 G>T (5' - GTA GTT GGA GCT TGT GGC GTA GGC AAG AGT - 3'), c.35 G>T (5'-GTA GTT GGA GCT GTT GGC GTA GGC AAG AGT - 3'), c.38 G>A (5'-GTA GTT GGA GCT GGT GAC GTA GGC AAG AGT - 3'), c.39 C>T (5'-GTA GTT GGA GCT GGT GGT GTA GGC AAG AGT - 3').
1-5. 본 발명에 따른 센서의 단일염기변이 검출 특이성 평가
KRAS 돌연변이 유전자의 선택적 검출성을 확인하기 위해 본 발명에 따른 센서의 정상 KRAS 유전자 (5' - GTA GTT GGA GCT GGT GGC GTA GGC AAG AGT - 3') 를 샘플에 투입하였다. 이때, 돌연변이 DNA의 농도는 100 pM으로 고정되었지만 정상 DNA는 1:1 (100 pM) 에서 1 : 10000 까지 증가시켜 검출을 측정하였다.
1-6. 금속 나노입자의 질량 증폭기로서의 효과 확인
검출에서 AuNP-MutS의 역할을 확인하기 위해 세 가지 대조 실험이 수행되었다. 첫 번째 대조군 용액은 정상 유전자와 함께 AuNP-MutS를 함유하고 있다. 두 번째 대조군 용액은 프로브 유전자만을 갖는 AuNP-MutS를 함유하였다. 제3 대조군 용액은 금 나노입자가 없는 돌연변이 표적 유전자와 함께 MutS 만을 함유하였다.
1-7. 다른 종류의 단일염기변이 구분 검출 실험
서로 다른 단일염기변이를 구별하기 위해 표적 KRAS 돌연변이 (c.39 C>T: 5' - GTA GTT GGA GCT GGT GGT GTA GGC AAG AGT - 3') 를 DI water에 용해시켜 100 pM의 최종 농도로 만들었다. 각기 KRAS 유전자와 상보 결합하는 프로브 (상보결합 c.34G>A 변이: 5' - thiol - ACT CTT GCC TAC GCC ACT AGC TCC AAC TAC - 3', 상보결합 c.35G>T 변이: 5' - Thiol - ACT CTT GCC TAC ACC AAC AGC TCC AAC TAC - 3', 상보결합 c.38G>A 변이: 5' - Thiol - ACT CTT GCC TAC ATC ACC AGC TCC AAC TAC - 3' 상보결합 c.39 C>T 변이: 5' - thiol - ACT CTT GCC TAC ACC ACC AGC TCC AAC TAC - 3') 를 1-2와 동일한 방법으로 각 공진기에 고정하였다. 그 다음 공진기를 표적 KRAS 돌연변이를 포함하는 용액에 30분간 침지 후, 공진기를 건조기 (dessicator) 에서 6시간 동안 건조하고 공진 주파수를 1-4와 동일한 방법으로 측정하였다.
1-8. DNA 소량 개수 검출 실험
DNA 검출 개수를 줄이기 위해서는 더 좋은 검출 한계를 얻거나, 적은 용량의 검출 용액을 사용하는 것이 필요한데, 더 좋은 검출 한계를 얻는 것은 실험 결과 상 어려움으로 인해 용액을 줄여 적은 용량에서 센싱이 가능한지 확인하는 실험을 진행하였다.
2. 결과
2-1. 본 발명의 센서의 특징
프로브, 금 나노입자 (AuNP)와 결합된 MutS 및 마이크로 캔틸레버 공진기를 사용하여 단일염기변이의 매우 민감하고 선택적 검출이 수행되었다. 첫째, 정상 유전자에 상보적인 프로브를 설계하여 프로브와 돌연변이 유전자가 하나의 일치하지 않는 염기를 가질 수 있도록 설계하였다. 정상 유전자와 단일염기변이를 구별하기 위해, MutS 단백질을 이용했다. 이 단백질은 염기 서열이 일치하지 않는 염기와 특이적으로 상호 작용한다. 정상 유전자와 프로브는 완전히 상보적이므로 MutS에 결합할 수 없다. 그러나 단일염기변이가 있는 유전자가 프로브와 상호 결합할 때, MutS는 불일치한 위치에 결합할 수 있다. 본 발명에서는 MutS를 AuNP에 부착하여 MutS가 불일치 염기에 결합할 때 AuNP도 결합할 수 있도록 했다. 이 검출 방법은 마이크로 캔틸레버 기반 공진기를 사용하여 수행되었다. 공진기 센서는 공진 주파수 이동에 기초하여 돌연변이를 검출한다. 탄성 연속체 모델의 고전 이론에 기초하여 공진기의 공진 주파수 이동은 질량의 증가에 비례한다. 금 - 티올 상호 작용을 통해 공진기의 표면에 프로브를 고정시켰다. 일단 단일염기변이가 프로브와 AuNP에 결합되면, 공진기의 질량이 증가하고 공진 주파수 이동이 일어난다. 단일염기변이는 공진 주파수 이동을 측정하여 탐지할 수 있다. 고감도 검출 돌연변이는 대량 증폭기 역할을 하는 AuNP에 기인하며 MutS와 단일 불일치 염기의 특이적 상호 작용을 통해 선택성을 얻었다.
2-2. 원자력 현미경과 형광 현미경을 이용한 센서 제작 검증(도 5)
검증을 위해 각각의 상태를 원자력 현미경의 Tapping mode를 이용하여 스캐닝하였다. 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope, SEM)은 전자의 투과로 인해 표면의 분자나 DNA를 측정하기에 적합하지 않다. 각각의 상태를 평균 거칠기를 통해 검증하였다. 이 평균 거칠기는 중심 평면을 기준으로 한 표면 높이 (
Figure 112017130567868-pat00001
) 의 평균값이며, 위편과 아래편의 면적을 동일시하며 다음의 수식에 의해 계산된다.
<수학식>
Figure 112017130567868-pat00002
다음의 식에서 N은 샘플에서의 포인트의 개수이다.
돌연변이의 검출을 위해, 프로브는 금 코팅 공진기 표면과 프로브 한쪽 끝에서의 티올 변형 사이의 금 - 티올 상호 작용을 통해 공진기 표면에 고정화되었다. 프로브의 고정화를 확인하기 위해 프로브에 형광 염료를 붙이고 고정화 전후에 공진기의 형광 이미지를 얻었다(도 5의 A). 프로브 고정화 전의 베어 공진기는 형광 신호를 방출하지 않았지만, 프로브가 고정화된 후에 강한 형광 신호가 관찰되었다. 또한, AFM을 사용한 평가는 공진기의 표면이 매우 평평하고 표면 거칠기가 0.64 nm 임을 보여 주었다(도 5의 B). 1.07 nm의 증가 된 표면 거칠기와 함께, 프로브 DNA 고정 후 약간 엠보싱 된 표면이 관찰되었다. 이로부터 프로브 DNA가 공진기 표면에 고정화되어 있는 것이 확인하였다.
2-3. MutS와 금속 나노입자의 결합 검증(도 6 내지 8)
AuNP 용액을 37℃에서 1시간 동안 MutS 단백질 용액과 함께 배양하였다. AuNP (AuNP-MutS) 를 이용한 MutS의 형성은 UV-Vis 스펙트럼 및 KPFM 결과에 기초하여 확인되었다. 도 7은 완충액 중의 노출된 AuNP 및 AuNP-MutS 의 사진 이미지 및 UV-Vis 스펙트럼을 도시한다. 노출된 AuNP 및 AuNP-MutS 솔루션은 각각 735 nm 및 524 nm 에 위치한 피크에 해당한다. AuNP 용액이 526 nm 에 하나의 피크를 갖는 것을 감안할 때, 완충액에서 AuNP 가 극적으로 피크 변화가 관찰되었다. 피크 변화는 완충 용액에서 높은 염 농도에 의해 유도된 AuNP의 응집으로 나타냈다. 그러나 AuNP-MutS 완충 용액에 해당하는 피크는 흡착된 MutS 때문에 일정하게 유지되며, 이는 전체 음전하를 가지며, 따라서 높은 염 농도에서도 AuNP들을 안정화시킨다. AuNP에 의한 MutS의 변형은 KPFM을 통해 추가로 확인되었다. KPFM은 전하 상태의 분자 변화를 측정하는 AFM의 변형이다. 도 8의 c는 노출된 AuNP, MutS 및 AuNP-MutS 샘플의 높이 및 표면 전위 프로파일을 도시한다. 노출된 AuNP 의 평균 높이와 표면 전위는 각각 19.6 nm와 -93.7 mV 였다. 얻은 값은 직경 20 nm의 AuNP 의 높이와 표면 전위를 측정 한 이전 보고서에서 얻은 값과 매우 유사하다. MutS 의 평균 높이와 표면 전위는 각각 5.6 nm와 -37.2 mV 였다(도 6). MutS 의 평균 높이는 이전 보고서 의 MutS 높이와 매우 유사했으며(Wang, H., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003. 100(25): p. 14822-14827); Lamers, M.H., et al., Nature, 2000. 407(6805): p. 711-7) MutS 가 전반적인 음전하를 띄고 있음을 관찰할 수 있었다. AuNP-MutS 의 경우 평균 높이와 표면 전위는 각각 35.7 nm와 -208.0 mV였다. 표면 높이가 AuNP에 MutS가 흡착될 때 114.3 mV 만큼 감소하는 동안 평균 높이는 16nm 만큼 증가했다. 평균 높이의 증가와 표면 전위의 감소를 통해 AuNP 에 MutS의 흡착을 확인했다.
2-4. 금속 나노입자의 질량 증폭기로서의 효과 확인(도 9)
공진기에서 프로브 고정화 및 AuNP 와 MutS 을 제작한 후, 대조 실험을 KRAS 돌연변이 검출 전에 수행하였다. 주파수 변위 평가를 위해 다음과 같이 계산된 정규화 된 공진 주파수 변이를 도입했다.
<수학식>
Δfn = (ωb - ωa) / ωb × 100
ωb 와 ωa 는 검출 전후의 공진기의 공진 주파수 변화이다. 대조 실험에서 AuNP의 질량 증폭기로서의 효과를 평가했다. 프로브와 표적 KRAS 돌연변이 DNA (c.35G> KRAS 돌연변이)의 농도는 모두 100 nM 이었다. 실험 전에 공진기는 KRAS 돌연변이 DNA 의 부재하에 AuNP-MutS 만을 함유하는 용액에 노출시켰다. 이 경우, 공진기와 AuNP-MutS 사이의 상호 작용을 암시하는 주파수 이동은 관찰되지 않았다 (도 10b). 또한, KRAS 돌연변이 DNA의 존재하에서 검출하였을 때, AuNP가 없을 때, 유의한 주파수 이동이 관찰되지 않았지만(0.05 ± 0.01 %), AuNP-MutS 를 사용하여 0.49 ± 0.05 %의 정규화 된 주파수 편이를 사용하여 상당한 주파수 편이가 관찰되었다(도 9b). 주파수 시프트 값의 비교는 AuNP의 첨가가 주파수 시프트를 대략 10배 증가시킨다는 것을 나타냈다.
2-5. 단일염기변이 유전자의 농도별 검출 결과(도 10)
AuNP의 질량 증폭기로서의 효과를 확인한 후, 단일염기변이의 정량적 검출을 수행했다. 검출은 다양한 농도의 KRAS 돌연변이 DNA (100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, 10 fM 및 0 M) 하에서 수행 하였다. KRAS 돌연변이의 농도가 감소함에 따라 주파수 이동 값 또한 감소했다(도 10). 기본 용액 (0M) 에 대한 주파수 이동은 0.01 ± 0.01 %로 매우 가깝게 10 fM (0.02 ± 0.01 %) 이다. 그러나 100 fM 농도에서의 주파수 편이는 0.04 ± 0.01 %로 기본 용액의 표준 편차의 세 배로 추가된 평균값보다 약간 더 높다. 위의 결과는 센서의 검출 한계 (LOD) 가 100 fM 임을 나타낸다.
또한, 동일한 프로브 DNA를 사용하여 다양한 KRAS 돌연변이 (c.34 G> A, c.34 G> T, c.35 G> T, c.38 G> A 및 c.39 C> T)의 검출을 수행했다. 모든 KRAS 돌연변이는 고정된 농도가 100 pM 이었다. c.35 G> A 돌연변이의 결과는 도 12(0.20 ± 0.02 %)와 같이 100 pM 농도에 대한 결과와 일치했다. 모든 KRAS 돌연변이가 하나의 일치하지 않는 염기를 가지고 있다면, AuNP-MutS 는 공진 주파수 이동을 유도하기 위해 불일치한 위치에 결합해야 한다. 도 11에 도시된 바와 같이, KRAS 돌연변이 모두에 대해 정규화된 공진 주파수 이동이 관찰되었다. 구체적으로, 획득된 주파수 이동은 c.34 G <A, c.34 G> T, c.35 G> T, c.38 G> A 및 c.39 C> T KRAS 돌연변이는 0.17 ± 0.02 % 0.22 ± 0.02 %, 0.23 ± 0.01 %, 0.18 ± 0.01 % 및 0.22 ± 0.02 %이다. KRAS 돌연변이가 다른 염기 서열을 가지고 있음에도 불구하고 우리는 유사한 정규화된 공진 주파수 변화를 관찰하였는데, 제안된 방법이 단일염기변이의 유형보다 돌연변이 DNA의 농도에 더 큰 영향을 받는다는 것을 의미한다. 따라서 제안된 방법은 단일염기변이 검출을 위한 일반적인 정량적 기법으로 사용될 수 있다.
2-6. 본 발명에 따른 센서의 단일염기변이의 선택적 검출 결과(도 12)
본 발명에 따른 센서의 단일염기변이 DNA에 대한 선택성을 확인하기 위해 단일염기변이 DNA와 정상 DNA에 대한 감도를 측정하였다. 먼저, AuNP-MutS 와 정상 DNA 사이의 상호 작용을 평가하기 위한 대조 실험을 수행했다. 프로브가 정상 DNA 와 완전히 상보한다는 점을 고려할 때, MutS 는 DNA 에 결합해서는 안된다. 예상대로, 정상 DNA 를 사용하는 MutS 및 AuNP-MutS 모두에서 유의한 주파수 전이가 검출되지 않았다(도 12의 회색막대). AuNP-MutS 와 돌연변이 DNA의 특이적인 상호 작용을 확인한 후, 연속 희석 검출을 수행하였다. KRAS 돌연변이 DNA의 농도를 100 pM으로 고정하고 정상 DNA의 농도를 조절하여 희석율을 조절하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 1:0, 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 및 0:1000의 비율에 대응하여 얻어진 정규화된 공진 주파수 시프트는 0.20 ± 0.02 %, 0.15 ± 0.01 %, 0.12 ± 0.01 %, 0.10 ± 0.01 %, 0.09 ± 0.01 %, 0.06 ± 0.01 % 및 0.04 ± 0.01 %이다. 이러한 결과는 제안된 방법이 돌연변이와 정상 DNA의 혼합체에서 단일염기변이를 검출할 수 있음을 시사한다. 또한, 우리의 방법은 단일염기변이 유전자의 희석으로부터 돌연변이를 0.1 % 정도로 검출할 수 있다.
2-7. 다른 종류의 단일염기변이 구분 검출 결과(도 13)
제안된 방법을 단일염기변이 진단 기술로 활용하기 위해서는 단일염기변이의 차별이 달성되어야 한다. 서로 다른 프로브를 가진 다양한 공진기를 사용하여 제안된 방법의 차별 성능을 검증했다. 이 경우 표적 돌연변이는 c.39 C>T였고 정상 DNA와 c.34G>A, c.35G>T, c.38G>A 및 c에 상보적인 프로브를 선택했다. 39 C>T KRAS 돌연변이 프로브를 공진기 표면에 고정시키고, 공진기를 100 pM 농도의 c.39 C>T 돌연변이체를 함유하는 용액에 침지시켰다. 예상대로, c.39 C>T KRAS 단편 에 완전히 상보적인 프로브에 대해 유의한 표준화 된 공진 주파수 이동 (0.02 ± 0.01 %) 을 관찰하지 않았다. 그러나 C.39 C>T KRAS 시료와 프로브 사이에 하나의 미스 매치 된 염기가 존재하기 때문에, 다른 프로브에서 상당한 정규화된 공진 주파수 이동 (0.10 %) 이 관찰되었다. 따라서 이 결과는 본 발명의 센서 및 방법을 통해 서로 다른 단일염기변이를 구별 할 수 있음을 보여준다.
2-8. 적은 용량에서 검출 결과(도 14)
검출 시 실험에서 사용된 DNA 용액의 양은 100 mL 로 100 fM 기준에서 약 60만개의 DNA가 존재하게 된다. 이를 보다 적은 DNA 개수를 검출하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. 실험 결과 저 용량 DNA 검출 실험에 있어서 증발과 같은 부차적인 한계점이 있었지만, 10 μL의 용량에 대해서 검출을 성공적으로 진행하였다(도 14). 이 또한 컨트롤 실험의 평균에 3 표준 편차를 더하여 데이터를 구분하였다.
앞서 살펴본 바와 같이 본 발명에서는 단일염기변이를 검출하기 위한 매우 민감하고 선택적 방법을 개발했다. 검출은 AuNP-MutS와 단일염기변이 DNA의 흡착에 의해 유도된 공진기의 공진 주파수 이동을 기반으로 이루어졌다. 설계된 프로브 DNA가 정상 DNA와 완전히 상보한다는 점을 감안하면 AuNP-MutS는 단일염기변이가 있는 경우에만 공진기에 결합하여 단일염기변이의 선택적 검출이 이루어졌다. 단일염기변이의 고감도 검출은 질량 증폭기로 작용하는 AuNP를 100 fM의 획득 된 LOD와 함께 도입함으로써 달성되었다. 또한, 제안된 방법은 정상 DNA가 있는 상태에서 단일염기변이를 0.1 %의 낮은 농도까지 성공적으로 검출하여 다른 종류의 단일염기변이를 구별 할 수 있었다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Sensor for detection of gene mutation using resonance frequency shift <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe DNA <400> 1 actcttgcct acgccaccag ctccaactac 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type DNA <400> 2 gtagttggag ctggtggcgt aggcaagagt 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single mismatch c.35 G>A <400> 3 gtagttggag ctgatggcgt aggcaagagt 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single mismatch c.34 G>A <400> 4 gtagttggag ctagtggcgt aggcaagagt 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single mismatch c.34 G>T <400> 5 gtagttggag cttgtggcgt aggcaagagt 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single mismatch c.35 G>T <400> 6 gtagttggag ctgttggcgt aggcaagagt 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single mismatch c.38 G>A <400> 7 gtagttggag ctggtgacgt aggcaagagt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single mismatch c.39 C>T <400> 8 actcttgcct acgccaccag ctccaactac 30

Claims (19)

  1. 마이크로 공진기; 및
    상기 마이크로 공진기 표면에 고정되고 단일염기변이 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하되,
    상기 단일염기변이 유전자는 프로브와 혼성화된 후 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체와 결합하는 것이고, 상기 단일염기변이는 KRAS 돌연변이인 것인, 단일염기변이 검출용 센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브와 결합된 단일염기변이 유전자에 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체가 결합하면 질량 증가에 따라 공진 주파수 이동 현상을 나타내는 센서.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 산화아연 나노입자, 티타니아나노입자 또는 이들의 조합인 센서.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 KRAS 돌연변이는 KRAS의 엑손 2 내의 코돈 12 또는 13의 점돌연변이인 센서.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 프로브의 서열은 5'-ACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTAC-3'인 센서.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단일염기변이 유전자는 서열번호 3 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인 센서.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단일염기변이 검출은 폐암 환자의 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 것인 센서.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포 폐암인 센서.
  10. 제1항에 있어서, 100 펨토몰(fM)의 검출한계값을 갖는 센서.
  11. 제1항에 따른 센서; 및
    금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체를 포함하는 단일염기변이 유전자 검출용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 산화아연 나노입자, 티타니아 나노입자 또는 이들의 조합인 키트.
  13. 제11항에 있어서, 상기 단일염기변이는 KRAS 돌연변이인 것인 키트.
  14. (a) 뮤테이터 에스(Mutator S) 단백질에 금속 나노입자를 결합시키는 단계;
    (b) 마이크로 공진기의 표면에 단일염기변이 유전자와 선택적으로 결합할 수 있는 프로브를 고정하는 단계;
    (c) 상기 마이크로 공진기의 표면을 단일염기변이 유전자가 포함된 액상 시료에 담그어 상기 프로브와 단일염기변이 유전자의 혼성화를 수행하는 단계;
    (d) 금속 나노입자가 결합된 뮤테이터 에스 단백질이 상기 혼성화된 이중가닥 DNA의 단일염기 불일치를 인식하여 선택적으로 결합하는 단계; 및
    (e) 상기 선택적 결합으로 인한 질량 증가에 따른 상기 마이크로 공진기의 공진 주파수 이동현상을 분석하는 단계;를 포함하고,
    상기 단일염기변이는 KRAS 돌연변이인, 단일염기변이의 검출방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 공진 주파수 이동(Δfn)은 하기 식으로 표시되는 것인 단일염기변이의 검출방법:
    Δfn = (ωb - ωa) / ωb × 100
    상기 식에서, ωb는 상기 프로브 DNA를 마이크로 공진기의 표면 상에 고정화시킨 후 측정한 공진 주파수이고, ωa는 프로브 DNA와 단일염기변이 DNA가 혼성화된 이중가닥 DNA에 금속 나노입자-뮤테이터 에스 복합체가 결합된 이후에 측정한 공진 주파수이다.
  16. 제14항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 산화아연 나노입자, 티타니아 나노입자 또는 이들의 조합인 방법.
  17. 삭제
  18. 제14항에 있어서,
    상기 프로브의 서열은 5'-ACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTAC-3'인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 단일염기변이 유전자는 서열번호 3 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인 방법.
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Acta Biochim Pol. 52(3):575-83 (2005.08.04.)* *
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