DE102004033586A1 - Verfahren zur Auswertung von Biochips - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Auswertung von auf Biochips befindlichen Spots. DOLLAR A Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Auswertung von Biochips anzubieten, bei dem auf die bislang üblichen Laserscanner-Systeme verzichtet wird und im sichtbaren Licht eine quantitative Auswertung möglich wird. DOLLAR A Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit einem Verfahren zur Auswertung von auf Biochips befindlichen Spots, das dadurch gekennzeichnet ist, dass nach Durchführung von biochemischen oder immunologischen Reaktionen mit den auf membranöse Träger gespotteten Biomakromolekülen auf den Spots ein sichtbarer Farbstoff erzeugt und dieser Farbstoff mit einem Auflichtscanner oder einer Digitalkamera gemessen und densitometrisch ausgewertet wird.
Description
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Auswertung von Biochips entsprechend dem Oberbegriff des Anspruches 1.
- Die heute bekannten Biochips, also Microarrays zur Untersuchung von DNA- und Proteinwechselwirkungen, dienen häufig parallelen vergleichenden Studien auf einem Chip. Hierzu ist es nötig, mehrere Reaktionen gleichzeitig auf einem Chip durchzuführen, die dann allerdings getrennt voneinander ausgewertet werden. Dieses wird mit der Benutzung von Fluoreszenzkonjugaten mit unterschiedlichen Absorptions- und Emissionsmaxima erreicht. Die Auswertung erfolgt durch Anregung der Fluoreszenzkonjugate in monochromatischem Licht. Bei den derzeit bekannten Messapparaturen wird dieses Licht mittels eines Laserstrahls erzeugt. Zur Auswertung der fluoreszenzmarkierten Biochips werden hochkomplexe Laserscanner eingesetzt; was nachteiligerweise mit hohen Kosten verbunden ist.
- Weiterhin sind viele dieser Laserscanner auf eine Chipform adaptiert, die sich an mikroskopischen Glasobjektträgern anlehnt.
- Andere bekannte Möglichkeiten der Auswertung von Biochips beruhen auf der Messung eines Chemolumineszenzkonjugates, welches durch die Freisetzung von Lichtquanten eine Auswertung der Reaktionen auf dem Chip ermöglicht. Ebenso wie bei dem laserbasierten Scannersystem sind zur Auswertung dieser Chips hochempfindliche – und dementsprechend teure – Detektionssysteme notwendig.
- Bei immunologischen Untersuchungen von Seren werden zumeist nur einzelne Immunglobulinklassen untersucht. Insofern ist die komplexe Technologie der Laserscanner für immunologische Untersuchungen zu kompliziert und steht, auch bedingt durch die hohen Investitionskosten, einer weiteren Verbreitung im Bereich der klinischen Diagnostik im Wege.
- Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Auswertung von Biochips anzubieten, bei dem auf die bislang üblichen Laserscanner-Systeme verzichtet wird und im sichtbaren Licht eine quantitative Auswertung möglich wird.
- Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit den Merkmalen des Anspruches 1.
- Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
- So ist es überraschenderweise gelungen, die Verwendung der bislang üblichen Laserscanner-Systeme überflüssig zu machen, indem anstelle von Glas-Chips übliche membranöse Trägermaterialien mit Microspots beschichtet werden und anstelle eines bislang gebräuchlichen fluoreszenz- oder chemoluminiszenzbasierenden Nachweissystems ein solches tritt, welches einen sichtbaren Farbstoff (Wellenlänge 300 bis 800 nm) generiert und dadurch eine densitometrische Auswertung in sichtbarem Licht und eine quantitative Auswertung ermöglicht. Die digitale Erfassung der auf Biochips befindlichen Spots erfolgt mittels eines einfachen Auflichtscanners oder aber mit einer Digitalkamera. Anschließend wird eine densitometrische Auswertung durchgeführt.
- In einer Weiterbildung der Erfindung erfolgt die Erzeugung eines sichtbaren Farbstoffes mittels Enzymreaktion oder Goldmarkierung.
- In einer Ausgestaltung der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass Proteine, Nukleinsäuren, Nukleotide, Peptide oder andere biologisch aktive Verbindungen auf Flächenträger gespottet, nachfolgend mit komplementären Reaktionspartnern zur Reaktion gebracht und dann in einem enzymhaltigen oder goldmarkierten Detektionssystem nachgewiesen werden.
- In einer weiteren Ausgestaltung werden Antigene oder Antikörper auf einen Flächenträger gespottet und nachfolgend mit einem Antikörper oder Antigen zur Reaktion gebracht, die dann direkt oder indirekt mit den Enzymen Peroxidase oder Alkalische Phosphatase oder durch Goldmarkierung detektiert werden.
- Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass das an einen Antikörper oder Antigen gebundene Enzym mit präzipitierendem Substrat zur Reaktion gebracht wird, wobei die Intensität des Farbstoffes aber auch die Farbintensität der goldmarkierten Antigene oder Antikörper der Stärke der Antigen-Antikörper-Reaktion proportional sind.
- In einer weiteren Ausgestaltung werden Flächenträger aus Kunststoff, Glas oder vorzugsweise Nitrozellulose verwendet.
- Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die präzipitierten Farbstoffe mit einem einfachen Scanner oder einer Digitalkamera gemessen und densitometrisch ausgewertet werden.
- Beispiel 1: Beschichtung des Biochips
- Von dem Antigen dsDNA wird mit einem geeigneten Beschichtungspuffer, beispielsweise Carbonatpuffer, eine Verdünnung mit einer Endkonzentration von 100-250 μg/ml hergestellt. Von dieser Beschichtungslösung wird mit einem Piezospotter ein Spotarray auf einen geeigneten Träger aufgebracht. Pro Spot werden ca. 2nl Lösung aufgespottet. Die so erzeugten Biochips werden bei Raumtemperatur getrocknet und, im Falle der membranösen Trägermaterialien, geschnitten und mit einer geeigneten Proteinlösung blockiert. Die blockierten Chips werden dreimal gewaschen und an der Luft getrocknet.
- Beispiel 2: Entwicklung eines Chips mit Serum
- Ein zu untersuchendes Patienten- oder Blutspenderserum wird mittels eines geeigneten Verdünnungspuffers um den Faktor 100 vorverdünnt. Von dieser Vorverdünnung wird ein Aliquot in eine Inkubationswanne gefüllt. In dieser Wanne wird der Chip submers mit dem Serum bei Raumtemperatur für 1h unter leichtem Schwenken inkubiert. Die nichtgebundenen Serumbestandteile werden in mehreren 5-minütigen Waschschritten mit einem geeigneten Waschpuffer vom Chip entfernt. Es folgt eine Inkubation für 30 Min. bei Raumtemperatur mit einem enzymmarkierten Konjugat, welches spezifisch an humanes IgG, M oder A bindet. In einem weiteren Waschschritt wird nichtgebundenes Konjugat entfernt. Es erfolgt die Zugabe eines präzipitierenden TMB Substrates bei Raumtemperatur. Die Enzymreaktion wird nach 10 Min. durch Zugabe von 0,1 M H2SO4 gestoppt. Nach weiteren 5 Min. werden die Chips getrocknet.
- Die Digitalisierung der Chips erfolgt durch Scannen mit einem handelsüblichen Auflichtscanner bei einer Minimalauflösung von 600 dpi in Farbe.
- Wird zur Auswertung eine Arraysoftware benutzt, so muss das erzeugte Bild in die jeweiligen für die Auswertungsprogramme erforderlichen Bildformate überführt werden:
Bspw.
16 bit Graustufen (65536 Graustufen)
Invertiert
Tagged Image Format (TIF) - Das so umgewandelte Bild enthält unverändert die Informationen über die Intensitäten der Spots und lässt sich nun mit der geeigneten Software auswerten.
- Beispiel 3: Entwicklung eines Chips mit Goldkonjugat
- Ein zu untersuchendes Patienten- oder Blutspenderserum wird mittels eines geeigneten Verdünnungspuffers um den Faktor 100 vorverdünnt. Von dieser Vorverdünnung wird ein Aliquot in eine Inkubationswanne gefüllt. In dieser Wanne wird der Chip submers mit dem Serum bei Raumtemperatur für 1h unter leichtem Schwenken inkubiert. Die nichtgebundenen Serumbestandteile werden in mehreren 5-minütigen Waschschritten mit einem geeigneten Waschpuffer vom Chip entfernt. Es folgt eine Inkubation für 30 Min. bei Raumtemperatur mit einem goldmarkierten Sekundärantikörper, welcher spezifisch an humanes IgG, M oder A bindet. Nach 5 Min. werden die Chips getrocknet.
- Die Auswertung der Chips erfolgt durch Scannen mit einem handelsüblichen Auflichtscanner bei einer Minimalauflösung von 600 dpi in Farbe oder visuell.
- Wird zur Auswertung eine Arraysoftware benutzt, so muss das erzeugte Bild in die jeweiligen für die Auswertungsprogramme erforderlichen Bildformate überführt werden:
Bspw. 16 bit Graustufen (65536 Graustufen)
Invertiert
Tagged Image Format (.TIF) - Das so umgewandelte Bild enthält unverändert die Informationen über die Intensitäten der Spots und lässt sich nun mit der geeigneten Software auswerten.
Claims (7)
- Verfahren zur Auswertung von auf Biochips befindlichen Spots, dadurch gekennzeichnet, dass nach Durchführung von biochemischen oder immunologischen Reaktionen mit den auf membranöse Träger gespottete Biomakromoleküle auf den Spots ein sichtbarer Farbstoff erzeugt und dieser Farbstoff mit einem Auflichtscanner oder einer Digitalkamera gemessen und densitometrisch ausgewertet wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung eines sichtbaren Farbstoffes mittels Enzymreaktion oder Goldmarkierung erfolgt.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Proteine, Nukleinsäuren, Nukleotide, Peptide oder andere biologisch aktive Verbindungen auf Flächenträgern gespottet, nachfolgend mit komplementären Reaktionspartnern zur Reaktion gebracht und dann in einem enzymhaltigen oder goldmarkierten Detektionssystem nachgewiesen werden.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene oder Antikörper auf einen Flächenträger gespottet und nachfolgend mit einem Antikörper oder Antigen zur Reaktion gebracht werden, die dann direkt oder indirekt mit dem Enzym Peroxidase oder Alkalische Phosphatase oder durch Goldmarkierung detektiert werden.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das an einen Antikörper oder ein Antigen gebundene Enzym mit präzipitierendem Substrat unter Bildung eines Farbstoffes, dessen Farbintensität der Stärke der Antigen-Antikörper-Reaktion proportional ist, zur Reaktion gebracht wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Flächenträger Kunststoff, Glas oder vorzugsweise Nitrozellulose verwendet wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die präzipitierten Farbstoffe mit einem einfachen Scanner oder einer Digitalkamera gemessen und densitometrisch ausgewertet werden.
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