DE10120349B4 - Verfahren zur Erfassung molekularer Bindungsereignisse auf Affinitätssensoren - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Erfassung molekularer Bindungsereignisse unter Verwendung eines im Durchlichtmodus arbeitenden Filmscanners, bestehend aus einer optischen Anordnung, bei der über eine Lichtquelle und eine Kondensoroptik ein photographischer Film ausgeleuchtet wird, und einem optischen Abbildungssystem, das in eine Bildebene fokussiert, in der sich ein linearer Bilderfassungssensor befindet, um diese Bildebene zu scannen, wobei anstelle des photographischen Films ein transparantes Trägersubstrat eingeführt wird, auf dem sich die aktive Fläche eines Affinitätssensors befindet, auf der im Bereich der einzelnen Bindungsorte über Kopplungspartner Signalstoffe gebunden sind, welche aus funktionalisierten Nanopartikeln bestehen und eine Nanopartikelschicht bilden, durch deren Absorptionsverhalten die Position der Bindungsorte nachgewiesen wird.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Molekul-Molekul-Wechselwirkungen auf einem Biochip und dient insbesondere diagnostischen Aufgaben in der Medizin oder zur Entwicklung neuer Wirkstoffe, zum Beispiel für Medikamente oder selektiv wirkende Pflanzenschutzmittel, sowie für Aufgaben der kombinatorischen Chemie.
• Es ist bekannt, Bindungsereignisse im Bereich biologischer Moleküle durch Farbveränderungen des Reaktionsgemisches sichtbar zu machen, diese Farbveränderungen quantitativ zu erfassen und anschließend einer Computer gestützten Auswertung zuzuführen. So wird in der US 5,556,756 (Olsen, E., Olsvik, O., 1996: Gold sol of less than 5 mm test method and reagent kit therefor) die Bindung von mit Goldpartikeln(4,5 nm)-markiertem Immungammaglobulin an Degradationsprodukten von Fibrinpolymeren beschrieben. Die Bindung – erkennbar an einer rötlichen Färbung – wird mit einem Reflektometer (von Color Eye, Macbeth) erfaßt und mit einem IBM-PC ausgewertet. Desweiteren ist es für Analysen sehr verbreitet, Gemische aus gleichartigen Biomolekülen (DNA, Proteine) gelelektrophoretisch aufzutrennen und zu färben. Die erhaltenen Elektropherogramme werden fotographiert und die Negative mit Scannern ausgewertet. Alternativ dazu können die zu analysierenden Moleküle auch radioaktiv markiert werden, und man belichtet Röntgenfilme durch Auflegen der radioaktiven Elektropherogramme (Autoradiographie). So wird in der DE 199 14 808 A1 (Rauhe, H., Feldkamp, U., Banzhaf; W., Howard, J., 2000: Informationstragende Polymere) ein DNA-Computer vorgeschlagen, bei dem Elektrophoresegerät (4 % Agarose/0,001 % Ethidiumbromidfärbung, Sichtbarmachung der DNA-Moleküle im UV-Licht) und Scanner zwei der sieben wesentlichen Funktionseinheiten darstellen. In der US 5,666,435 (Burgi, D. S., Bartell, D. M., Sleeter, D. D., Mastro, L. P., 1997: System for analysis of X-ray films of nucletide sequences) wird gezeigt, daß nach Scanning von Autoradiogrammen solcher DNA-Fragmente, wie sie typischerweise bei Standardsequenzierungsverfahren Statistik-bedingt anfallen, gefolgt von einem ausgefeilten computergestützten Processing eine wesentlich höhere Präzision in der DNA-Sequenzierung erreicht werden kann als sie mit einer rein visuellen Labormethode möglich ist. Wegen seiner einfachen Realisierbarkeit bemerkenswert war die Anordnung von Sutherland und Mitarbeitern (Sutherland, J. C., Montelleone, D., C., Trunk., J., Ciarrocchi, G., 1984: Two-dimensional, computer-controlled film scanner: Quantitation of fluorescence from ethidium bromide-stained DNA gels. Analytical Biochemistry 139, 390–399). Die Autoren bauten einen handelsüblichen Bar-Code-Reader in einen digitalen Plotter ein und konnten anhand von Elektropherogrammnegativen bei hoher photometrischer Präzision einen ausgedehnten linearen Zusammenhang zwischen DNA-Menge und photometrischem Signal nachweisen. Alle diese hier skizzierten Verfahren sind jedoch nicht für die Auswertung der feinstrukturierten Bereiche von Biochips geeignet, sondern sie verbessern nur biochemische/molekularbiologische Standardverfahren. Die messtechnische Erfassung von Bindungsereignissen auf Biochips erfolgte deshalb bisher in der Regel unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern durch Chipreader. Diese beinhalten fluoreszenzmikroskopische Anordnungen sowie Mittel zur bildgebenden Erfassung und Darstellung der fluoreszierenden Bindungsorte des Chipassays.
• 1 zeigt beispielhaft den Aufbau eines Biochips und seine Funktion als Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies. Der Biochip besteht aus einem optisch transparenten Trägersubstrat 1, das mit mehreren, voneinander beabstandeten Bindungsorten 2 versehen ist. Diese vorgegebenen Bindungsorte sind die Bereiche, in denen das Vorliegen oder Fehlen einer Molekül-Molekül-Wechselwirkung durch den Chipreader festgestellt werden soll. Die Bindungsorte 2 sind durch feinstrukturierte Bereiche 11 auf dem transparenten Trägersubstrat 1 voneinander getrennt. Alle Bindungsorte der aktiven Fläche 22 zusammen bilden das Assay des Biochips.
• 2 zeigt einen Teilbereich des Affinitätssensors nach 1 in seitlicher Ansicht, wobei gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen wie in l gekennzeichnet sind. Die nachzuweisende Substanz (DNA oder Protein) bindet einerseits durch hohe selektive Affinität im Bereich des Bindungsortes 2 und andererseits über die Kopplungspartner 4 mit einem Signalstoff 3, durch den das Vorliegen eines Bindungsereignisses am Bindungsort 2 angezeigt wird. Die Bindungsorte 2 innerhalb der aktiven Fläche 22 sind mit einer Vielzahl unterschiedlicher selektiver Affinitäten ausgestattet.
• Der Chipreader findet durch das Erkennen des Signalstoffes 3 die Position des Bindungsortes 2 innerhalb der aktiven Fläche 22 des Assays. Aus dieser Positionsangabe kann auf die Art der gefundenen Substanz rückgeschlossen werden, da die Art der zuvor an diesem Ort installierten selektiven Affinität bekannt ist.
• Ein gemeinsames Merkmal aller Chipreader-Anordnungen ist daher die bildmäßige Erfassung der aktiven Fläche 22 des Affinitätssensors.
• In der DE 19943704 C1 wird vorgeschlagen, den Signalstoff 3, der üblicherweise ein fluoreszierender Marker ist, durch funktionalisierte Nanopartikel zu ersetzen. Als Marker dienen dabei Goldpartikel, die durch Bindung über die Kopplungspartner 4 zur Erzeugung einer Nanopartikelschicht 31 (2) führen, die ihrerseits leicht durch Absorptionsmessungen nachweisbar ist (WO 9815748 A1). Nach der unveröffentlichen Patentanmeldung DE 10033360 ist es bei zu geringen Lösungskonzentrationen der nachzuweisenden Spezies möglich, eine stromlose Metallbeschichtung der Nanopartikelschicht 31 vorzunehmen, wodurch sich deren Absorptionsverhalten verbessert.
• Der Sachverhalt der Existenz einer neuen Generation von Biochips hat einen bedeutenden Einfluss auf die Art der zur Anwendung kommenden Anordnung eines Chipreaders. Anstelle einer fluoreszenzmikroskopischen Erfassung, wie sie in Chipreadern nach dem Stand der Technik verwirklicht ist, kann jetzt eine Erfassung mit einfachen lichtmikroskopischen Mitteln erfolgen. Dadurch kann eine deutliche Kostenreduktion im Readerbereich erreicht werden. Das Prinzip der Absorptionsdetektion bei Biochips hat jedoch auch weitere, die messtechnische Sicherheit betreffende Vorteile, die ihre Ursache in der wesentlich grösseren Stabilität der als Signalstoff 3 verwendeten Nanopartikel gegenüber den früher verwendeten Fluoreszenzmarkern haben.
• Ziel der Erfindung ist es, unter konsequenter Ausnutzung des neuen Nachweisprinzipes, ein Verfahren anzugeben, welches unter Verwendung der optischen Anordnung eines kommerziell erhältlichen Massenproduktes aus dem Konsumerbereich die Erfassung von molekularen Bindungsereignissen auf der zuvor beschriebenen Art von Affinitätssensoren ermöglicht. Dadurch sind nochmalige Kostenreduktionen möglich, sodass derartige Geräte über eine geeignete Software in die bereits bestehenden Computersysteme von Arztpraxen und Laboratorien eingebunden werden können. Die kostengünstige Auslesung von Biochips ermöglicht damit die breite Anwendung der Chiptechnologie zu diagnostischen Zwecken.
• Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen 1 und 2 angegebenen Verfahren gelöst. Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist im Anspruch 3 angegeben. Dabei wird ein ein Bildsignal generierender Apparat verwendet, der aus einer Beleuchtungseinrichtung und einem optischen System zur Fokussierung des Bildes einer photographischen Vorlage in eine vorher bestimmte Bildebene sowie aus einer Vorrichtung zum Scannen dieser Bildebene durch einen linearen Bilderfassungssensor besteht, sodass Ausgangssignale erzeugt werden, welche die Absorptionsverteilung der photographischen Vorlage wiedergeben. Derartige Anordnungen werden als Filmscanner oder Flachbettscanner verwendet.
• 3 zeigt als Beispiel das Prinzip einer optischen Anordnung eines Filmscanners, welcher einen linearen Bilderfassungssensor (Sensorzeile) enthält, der durch mechanisches Scannen die Abbildung des photographischen Films erfasst und ein elektrisches Signal zur Weiterverarbeitung in einem bildverarbeitenden Computersystem erzeugt. Die Lichtquelle 1 beleuchtet den entwickelten photographischen Film 7 über einen konkaven Spiegel 2, einen Planspiegel 3, ein Infrarotfilter 4, eine Diffusorplatte 5 und eine Kondensoroptik 6. Das Bild des photographischen Films 7 wird über ein optisches Abbildungssystem 8 in die Bildebene 9 fokussiert, in der sich der lineare Bilderfassungssensor 10 befindet, um die bezeichnete Bildebene 9 zu scannen.
• Um eine derartige Anordnung als Chipreader zu verwenden, wird erfindungsgemäß anstelle des entwickelten photographischen Films 7 ein transparentes Trägersubstrat entsprechend 1 eingebracht, welches die aktive Fläche 22 eines Affinitätssensors trägt, bei dem der Signalstoff 3 in Form von funktionalisierten Nanopartikeln vorliegt.
• Das Licht der mit definierter Intensität strahlenden Lichtquelle 1 (3) führt dann über die zuvor benannten Elemente 2, 3, 4, 5 und 6 zur Ausleuchtung der aktiven Fläche 22, die sich auf dem transparenten Trägersubstrat 1 des Affinitätssensors befindet (1). Das Bild der aktiven Fläche 22 des Affinitätssensors wird durch das optische System 8 in die Bildebene 9 (3) fokussiert und durch den linearen Bilderfassungssensor 10 in ein elektrisches Signal konvertiert. Die Bildebene 9 wird durch eine laterale Bewegung des Bilderfassungssensors 10 abgetastet. Das transparente Trägersubstrat 1 des Affinitätssensors kann innerhalb der Bildebene 9 senkrecht zur optischen Achse beweglich angeordnet sein und das optische System 8 kann zusätzlich über eine Zoomfunktion verfügen. Die Konvertierung der durch den linearen Bildsensor 10 erzeugten elektrischen Signale in eine digitalisierte Form ist ohne weitere Modifikation möglich. Sie erfolgt wie bisher durch die elektronischen Komponenten des Filmscanners und muss daher an dieser Stelle nicht mehr weiter erläutert werden.
• Die Erfassung molekularer Bindungsereignisse von Affinitätssensoren nach 1 und 2 ist jedoch auch durch Ausnutzung des Reflexionsverhaltens der Bindungsorte 2 möglich. In diesem Fall wird analog zu dem zuvor beschriebenen Verfahren des Einsatzes eines Filmscanners ein im Auflichtverfahren arbeitender Scanner (z.B. Flachbettscanner) benutzt. In diesem Fall ist es auch möglich, dass das transparente Substrat 1 aus 1 durch ein nichttransparentes Substrat ersetzt wird.

Claims (3)

1. Verfahren zur Erfassung molekularer Bindungsereignisse unter Verwendung eines im Durchlichtmodus arbeitenden Filmscanners, bestehend aus einer optischen Anordnung, bei der über eine Lichtquelle und eine Kondensoroptik ein photographischer Film ausgeleuchtet wird, und einem optischen Abbildungssystem, das in eine Bildebene fokussiert, in der sich ein linearer Bilderfassungssensor befindet, um diese Bildebene zu scannen, wobei anstelle des photographischen Films ein transparantes Trägersubstrat eingeführt wird, auf dem sich die aktive Fläche eines Affinitätssensors befindet, auf der im Bereich der einzelnen Bindungsorte über Kopplungspartner Signalstoffe gebunden sind, welche aus funktionalisierten Nanopartikeln bestehen und eine Nanopartikelschicht bilden, durch deren Absorptionsverhalten die Position der Bindungsorte nachgewiesen wird.
2. Verfahren zur Erfassung molekularer Bindungsereignisse unter Verwendung eines im Auflichtmodus arbeitenden Bildscanners, bestehend aus einer optischen Anordnung, die über eine Lichtquelle und eine Kondensoroptik eine Bildvorlage beleuchtet, und einem optischen Abbildungssystem, welches mit Hilfe eines linearen Bilderfassungssensors die Bildvorlage scannend abtastet, wobei anstelle der Bildvorlage ein transparantes oder intransparentes Trägersubstrat eingeführt wird, auf dem sich die aktive Fläche eines Affinitätssensors befindet, auf der im Bereich der einzelnen Bindungsorte über Kopplungspartner Signalstoffe gebunden sind, welche aus funktionalisierten Nanopartikeln bestehen und eine Nanopartikelschicht bilden, durch deren Reflexionsverhalten die Position der Bindungsorte nachgewiesen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass alle Komponenten des dazu verwendeten Filmscanners bzw. Bildscanners in der bisher üblichen Art benutzt werden und die Auswertung des Bildes der aktiven Fläche des Affinitätssensors durch eine geeignete Computersoftware erfolgt.