WO2000046600A2 - Verfahren zum nachweis von analyten in einer messprobe sowie messträger hierfür - Google Patents

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    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof

Definitions

  • the invention is concerned with the detection of analytes in a measurement sample.
  • proteins, peptides, nucleic acids and their derivatives as well as molecules that can bind to them are suitable as analytes.
  • Any sample which is suspected to contain at least a part of the analytes sought can be used as a measurement sample. It can be z. B. a blood sample, a serum sample and / or a urine sample, or generally any solution that contains the analyte sought.
  • binding assays are known for the detection of analytes in a measurement sample. Such binding assays generally detect analytes through their specific interaction with receptors. Examples of such interactions are protein / protein interactions that occur, for example, during gene expression, enzyme / substrate or enzyme / effector interactions that occur in metabolism, or protein / DNA or protein / RNA interactions during gene expression . A systematic understanding of these molecular interactions is a basic requirement for the understanding of all biological processes in both normal and diseased cells.
  • Binding assays can also be used to detect nucleic acids. DNA / DNA interactions play a major role in that
  • Measurement samples are often to be examined for a large number of analytes. The problem arises here that large amounts of data are obtained during the evaluation. In order to be successful in practice, however, the evaluation must be possible within a reasonable time. Known analysis systems have proven to be only partially satisfactory here.
  • the thickness of the spacer layer is a decisive parameter for the function of this known sensor. This must be selected in a predetermined range, which depends on the wavelength of the light irradiated during the later evaluation. In particular, it must be ensured that the spacer layer has a uniform thickness over its entire extent. This requires a high level of manufacturing effort.
  • reading devices are already proposed for the optical evaluation of this sensor, which allow the handling of large amounts of data, including CD-ROM reading devices.
  • the object of the invention is to show a way, with little effort, not only with regard to the data-technical evaluation, but also with regard to the provision of the sensor, a measurement sample can be examined for a large abundance of analytes.
  • the invention is based on a first aspect of a method for the detection of analytes in a measurement sample, in which analyte-specific binders are immobilized in a plurality of detection fields on a flat substrate on one of its flat sides, then the measurement sample in contact with is brought to the detection fields and then the presence or / and the amount of the analytes to be detected is determined by optical evaluation of the detection fields.
  • a substrate made of an optically transparent material is used, that the detection fields are along at least one spiral line and / or a plurality concentric circular lines are arranged distributed on the substrate and that after the measurement sample has been brought into contact with the detection fields, an optical reflector is arranged adjacent to the flat side of the substrate carrying the detection fields.
  • the detection fields can be formed directly on the substrate. It may be advisable to pretreat the substrate surface chemically first or to effect a surface modification by pretreatment with an oxygen plasma. This modification can make it easier to apply the binders to form the analyte-specific detection fields.
  • no spacer layer with a precisely adhered-to thickness has to be applied to the substrate below the binder, as is absolutely necessary in the sensor known from Schaikhammer. In this respect, there is a reduced manufacturing outlay.
  • the reflector is required for the optical evaluation of the assay. It can be formed by a reflection layer, which is applied to the substrate above the detection fields after the molecular biological process steps have been completed. Due to their good reflectivity, metallic materials are recommended. In principle, other materials are also conceivable, such as dielectrics.
  • the reflection layer is preferably formed from aluminum. Silver is also conceivable as a material for the reflection layer.
  • the reflection layer can be formed by chemical vapor deposition. However, it is also possible to glue a prefabricated reflective film onto the substrate.
  • the reflector is arranged at a distance from the substrate, that is, it is not applied directly to the substrate.
  • the reflector can be formed by a mirror plate which is attached to an evaluation device which is used to evaluate the assay.
  • the optical transparency of the substrate, together with the reflector arranged on the side of the detection fields remote from the substrate, makes it possible to use the hardware of commercially available CD readers for the optical evaluation of this molecular biological sensor according to the invention.
  • a spiral arrangement of the detection fields and when the reflector is designed as a reflection layer applied directly to the substrate such commercially available CD readers can be modified with comparatively little effort so that the desired information can be filtered out of the returning light of the laser beam scanning the detection fields. It is conceivable that only software modifications are required for this.
  • the technology of such CD readers can basically be used, provided the design and software requirements for a jump of the laser beam scanning the detection fields from circular line to circular line are created.
  • a CD-ROM reader is particularly suitable as it allows the user to define the evaluation software himself when embedded in a computer architecture.
  • the evaluation of the detection fields can deliver quantitative as well as qualitative statements depending on the selected evaluation algorithm.
  • the optical properties, in particular the absorption behavior, of detection fields in which analytes have attached to receptors can be made distinguishable from detection fields to whose receptors no analytes have attached.
  • absorption measurements it is possible, for example, via absorption measurements to identify those detection fields which carry analytes after the molecular biological process steps have been completed. This would initially be a purely qualitative statement. If one also wants to make quantitative statements, it is conceivable to scan the detection fields several times and a threshold that is used in the evaluation as a decision boundary between The presence and absence of analytes is taken to change step by step from scan to scan. In this way, statements can also be made about the amount of analytes stuck in the individual detection fields.
  • a connected computer enables the user to further process the amount of data supplied by the drive, and the result of this further processing can be stored on external data memories, for example in databases To create patients.
  • Conventional standard storage such as hard disks or floppy disks can be used for data storage. With computer help, a quick evaluation of the data flood of the drive is possible.
  • the capacity of conventional computers and storage systems is usually sufficient to enable complex genetic analyzes to be carried out on them.
  • the detection fields are preferably even narrower than 1 ⁇ m radially, although it may be expedient to design them with a radial width which essentially corresponds to the width of the data depressions (so-called pits) embossed in conventional CDs, namely approximately 0.5 ⁇ m. Likewise, it is advisable to adjoin one another along the spiral line or a circular line Arrange detection fields at a distance from each other to enable their individual resolution by the evaluation system.
  • the detection fields can be designed as essentially square or circular areas. It is also conceivable to make them elongated in accordance with the shape of the data pits of conventional CDs in the circumferential direction, that is to say in the spiral or circular line direction, for example oval or rectangular.
  • microprint techniques In order to apply the binders to the substrate under the dimensional boundary conditions outlined above for the detection fields, microprint techniques, ink jet techniques or electrospray techniques are particularly suitable.
  • microprinting techniques To read about microprinting techniques, reference is made to: “Microfabrication, Microstructures and Microsystems” by Dong Qin et al., “Topics In Current Chemistry", Volume 1 94, 1 998, page 6ff., Springer-Verlag.
  • inkjet techniques reference is made to: "A new device for multifunctional dosage of liquids by a free jet” by N. Hey et al., Proceedings IEEE-Mems 1 998, CH 361 76.
  • Electrospray techniques in particular nanoelectrospray techniques, can be found, for example, in "Analytical Properties of the Nanoelectrospray Ion Source "by M. Wilm and M. Mann in Analytical Chemistry, Volume 68, No. 1, 1. January 1,996, pages 1-8, and in “Electrospray and Taylor-Cone theory, Dole's beam of macromolecuies at last?" by M. Wilm, M. Mann in International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 1 36 (1 994), pages 1 67-1 80. These techniques make it possible to specifically provide the detection fields with high spatial resolution with predetermined binders. The binders can be applied to the outer surface of the substrate wafer.
  • nucleic acids and / or proteins are particularly suitable as analytes.
  • the method according to the invention can thus be used to investigate protein / protein interactions, such as occur, for example, during gene expression or as cell signals, enzyme / substrate or enzyme / effect interactions during metabolism or protein / DNA or protein / RNA interactions to be detected during gene expression.
  • DNA / DNA interactions can also be detected, as is particularly important for gene identification and mapping of genes, for examining and quantifying gene expression and for molecular diagnosis and / or therapy of diseases.
  • RNA aptamers or small chemical compounds
  • Natural and synthetic effector molecules therefore often make it possible to manipulate biochemical processes by modulating or intervening in macromolecular interactions.
  • the substrate material is preferably a non-porous material.
  • a non-porous support enables the defined application of even small detection fields, so that miniaturization of the test format or the application of a large number of detection fields is possible.
  • Suitable materials for the disk-shaped substrate are e.g. B. plastics and glass.
  • it is preferably a focusing material, in particular polycarbonate.
  • the binders can be immobilized in the detection fields by methods known per se. The immobilization strategy depends on the type of molecule to be immobilized and the particular substrate.
  • binders can be bound directly to a matrix via a chemical reaction, for example via a special amino acid in a protein (in particular cysteine or lysine) or via the phosphate backbone of a DNA.
  • the immobilization can also be carried out with bifunctional chemical crosslinkers or via a specific, high-affinity interaction, such as the biotin / streptavidin interaction.
  • the analyte-specific binders can also be adsorbed on the surface, although a covalent bond is preferred. Substances and / or molecules which are able to bind the desired analyte specifically, in particular with high affinity, are applied as binders to the surface of the substrate.
  • a common method for analyzing molecular interactions consists of several steps: A first interaction partner, e.g. B. an analyte-specific binder or receptor is covalently or adsorptively linked to a solid support.
  • a second interaction partner e.g. B. the analyte
  • the presence of the analyte (or the absence of it in competitive test formats) is then demonstrated at the location where the receptor is immobilized.
  • the interaction between the two binding partners is preferably carried out under conditions in which both reactants are in a native, active configuration, preferably in a liquid reaction. Contacting under one is particularly preferred approximately physiological pH and carried out under ionic conditions.
  • detection takes place by detecting a change in the optical properties of the detection fields.
  • the optical change of the detection fields can e.g. B. by isotopes, enzymes, fluorochromes, dyes, metal colloids, beads or the like, which serve as a marker system.
  • One of the interaction partners i.e. H. the receptor or the analyte, directly or indirectly labeled.
  • proteins or nucleic acids are preferably derivatized with a biotin unit, after which recognition by streptavidin conjugates is possible.
  • the detection method preferably results in the precipitation of a dye or the localization of a fluorochrome at the site of the molecular interaction or in the addition of metal clusters with strong electromagnetic interaction.
  • Latex beads or plastic beads can also be attached. Due to their refractive behavior and their curved (spherical) surface, they cause a scattering of the incident reading light, which can be detected as a reduction in intensity. With suitable dimensioning of the beads, effects of destructive interference can be achieved.
  • the interacting molecules that is to say the receptor and the analyte, can either be detected directly via their specific binding sites or indirectly by providing them with a marker which contains a known specific binding site.
  • markers are epitopes for which monoclonal antibodies are known or a biotin group which is capable of binding to streptavidin.
  • the direct specific binding of an antibody to the analyte is also possible.
  • Antibodies and streptavidin are preferably conjugated with an enzyme to enable the detection fields to be evaluated. Examples of preferred Enzymes are horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and /? - galactosidase.
  • Suitable substrates for the above enzymes which enable an optical evaluation, for horseradish peroxidase are, for example, diaminobenzidine (DAB), which gives a brown product which is insoluble in water and ethanol, DAB + metal, which gives a gray to black insoluble product in the presence of cobalt or nickel , Chloronaphtol, which gives a blue-black, water-soluble color, Aminoethylcarbazol, which gives a red, water-insoluble product.
  • DAB diaminobenzidine
  • DAB + metal which gives a gray to black insoluble product in the presence of cobalt or nickel
  • Chloronaphtol which gives a blue-black, water-soluble color
  • Aminoethylcarbazol which gives a red, water-insoluble product.
  • Preferred substrates for alkaline phosphatase are naphthol-AS-BI-phosphate / New-Fuchsin, which gives a red, insoluble product, bromochloroindolyl phosphate / nitrotetrazolium, which gives a black-violet precipitate, and for? -Galactosidase bromochloroindolyl-bD-galactopyranosite (BCIG ), which results in an insoluble blue product.
  • BCIG bromochloroindolyl-bD-galactopyranosite
  • Another possibility for the detection of the interaction sites is the staining technique with gold colloids, whereby other types of metal clusters or beads can also be used.
  • Silver particles are particularly advantageous here because they can increase the sensitivity of an optical detection system due to nonlinear optical effects near a metal surface of the reflection layer.
  • dyes in particular colored latex particles. Glass beads made of silicon oxide which are filled with a dye in high concentration can also be used.
  • a measurement of the fluorescence is also possible, the detection wavelength here being different from the one used. radiated wavelength is.
  • CD drives in particular CD-ROM drives
  • constructive drive modifications may be necessary in addition to a corresponding adaptation of the software.
  • the invention makes it possible to write additional information on the flat side of the substrate carrying the detection fields, which information can be read out and evaluated at the same time as the detection fields. Accordingly, it is proposed that additional data fields are formed on the flat side of the substrate carrying the detection fields along the spiral line or at least one circular line, which contain measurement-sample-related and / or detection-field-related or / and evaluation-related information.
  • the information relating to the measurement sample can be, for example, information about the place and time of the measurement sample being taken, the type of measurement sample or the person from whom the measurement sample was taken.
  • the detection field-related information can contain molecular biological or biochemical information about the detection fields, in particular about the binder type of the individual detection fields.
  • the evaluation-related information can contain information about the detection principle used to detect the analytes, such as enzymatic detection, detection via dyes, detection via metal clusters or the like. They can also contain information about which physical scanning principle a reader should use, such as an absorption measurement or a fluorescence measurement.
  • the evaluation-related information can indicate to the reader the position and location of the detection fields on the substrate and thus signal to it when the reader should switch from software for reading the data fields to software for reading the detection fields.
  • the evaluation-related information already contains at least parts of an evaluation software that is processed by the reader when evaluating the detection fields. In this way, the user can be relieved of tedious programming tasks for software adaptation of his computer workstation.
  • the complete evaluation software can already be written into the sensor by the manufacturer, insofar as suitable software standards exist.
  • detection fields and the data fields are arranged separately along the spiral line.
  • detection fields and data fields may be advisable to arrange detection fields and data fields alternately along the spiral line, for example in such a way that a data field is assigned to an individual detection field or a group of detection fields, which precedes the detection field or the group of detection fields along the spiral line and the evaluation system Provides information about this detection field or this group of detection fields.
  • detection fields and data fields can also be arranged alternately along at least one circular line. However, it is also conceivable that detection fields and data fields are each formed on separate circular lines.
  • the data fields should expediently be able to be read from the same side of the substrate wafer as the detection fields.
  • One possibility here is to introduce depressions into the flat side of the substrate bearing the detection fields in order to form the data fields, the reflector being attached in such a way that it extends into the depression.
  • the coding of the data and the arrangement of the recesses are expediently carried out in accordance with a common CD format, in particular the CD-ROM format, so that the data fields can be read by means of conventional CD drives without software modifications. It is even conceivable to avoid deepening the data fields.
  • By connecting optically absorbing or scattering substances to the substrate it is also possible to influence the reflection of the light beam directed at the detection and data fields for reading.
  • the reflector is designed as a reflection layer applied to the substrate, the latter is only applied after all molecular biological or biochemical analysis steps have been completed, before and after measurements of the detection fields are not possible, i.e. measurements before and after the test sample is brought into contact with the detection fields.
  • these reference fields can have a known reference absorption level for the light of the scanning light beam, which is typical for analyte-free detection fields and which can be distinguished from an absorption level that detection fields with analysis typically have.
  • reference fields can also be formed which contain the analyte and / or marker and which, if the method is carried out correctly, serve as a positive control.
  • the reference fields can also be used for calibration and quantification of the measurements. In the area of the detection fields, a reduced adhesion of the reflection layer can occur if this is applied directly to the underlying molecular biological or biochemical level.
  • a cover layer made of an optically transparent material to the detection fields after the sample has been brought into contact with the detection fields before the reflection layer is applied.
  • the cover layer can also be used to fix the reagents in the detection fields.
  • the material and the thickness of the cover layer will be coordinated so that the optical properties of the sensor are not influenced by the cover layer, for example by focusing or absorption effects, or at least in a manageable manner.
  • a polymer-based material has been shown to be suitable for the top layer. You can e.g. B. be applied as a film or by means of a spray process.
  • the sensor also has depressions in data fields, it will be necessary to ensure that the depressions are not refilled by the material of the cover layer in order to avoid loss of the data information represented by the depressions.
  • Spray processes are conceivable for the local application of the top layer. It is also conceivable to mentally divide the surface of the substrate wafer into segments, for example circular sectors, of which a part is reserved exclusively for detection fields and another part is reserved exclusively for data fields. The segments with data fields can then be kept very easily free of the top layer.
  • the substrate with the binders immobilized on it can be packaged as a tradable unit and sent to users. It is conceivable that the manufacturer puts together a customer-specific set of binders and applies them to the substrate. It is also conceivable to apply a set of binders to a substrate in a customer-specific but application-specific manner, for example for certain genetic analyzes, and to offer this as a prepared measuring carrier. It is recommended to use this measuring carrier dry before packing and shipping. The test sample to be examined is then applied by the user, that is to say by the buyer of the measurement carrier. The same can also apply to marker-containing reagents.
  • the user can apply the reflection layer and, if applicable, the cover layer after completion of the molecular biological or biochemical detection method, which can also include washing steps, provided that suitable devices are available for this. It is also conceivable that the user sends the analyte-bearing measuring carrier back to the manufacturer or to another laboratory, where these layers are applied.
  • a protective layer can also be applied to the reflective layer, an acrylic-based material being suitable because of its impact and scratch resistance.
  • the measuring carrier protected in this way can be stored for long periods of time and can be read out again at any time.
  • the invention further relates to a measuring carrier for the detection of analytes in a measuring sample, which is particularly suitable for carrying out the method explained above.
  • the invention is based on a method for the detection of analytes in a measurement sample, in which analyte-specific binders are immobilized on a disk-shaped substrate on at least one of its flat sides in a large number of detection fields, then the measurement sample in Contact is made with the detection fields and then the presence or / and the amount of the analytes to be detected is determined by evaluating the detection fields. It is provided according to the invention that the detection fields are evaluated magnetically and for this purpose binders or the analytes to be detected are marked with magnetic and / or magnetizable markers and that the detection fields are along one A plurality of concentric circular lines and / or along at least one spiral line can be arranged distributed on the substrate.
  • the circular or spiral distribution of the detection fields on the substrate enables the use of commercially available magnetic disk readers, so-called hard disc drives.
  • Software adaptation of the drive control may be necessary.
  • the magnetic reading of the detection fields even makes it possible to form detection fields on both flat sides of the substrate, so that the packing density of the sensors with detection fields can be increased further.
  • the mutual distances the size and the arrangement of the detection fields and any data and reference fields on the substrate, the information that was previously given for the optically readable sensor essentially applies.
  • a fixing layer can be applied to the detection fields after the measurement sample has been brought into contact with the detection fields. This will expediently be applied to each flat side of the substrate bearing detection fields.
  • a polymer-based material has proven suitable for the fixing layer.
  • a magnetic layer containing magnetic and / or magnetizable particles can be applied to each flat side of the substrate carrying detection fields.
  • the magnetic layer enables additional data to be written into the sensor, which can be read out together with the detection fields.
  • the magnetic properties of the magnetic layer will be chosen so that the local fluctuations in the magnetic field strength or the magnetic flux density caused by the markers do not result the magnetic layer "blur" and become undetectable.
  • the magnetic layer is applied directly to the substrate below the molecular biological or biochemical layer of the sensor. However, it is expedient to apply it only after the molecular biological or biochemical process steps have been completed, since it can thus also serve as a fixing layer.
  • the invention further relates to a test kit for performing the method according to the first or second aspect described above.
  • the test kit comprises a measuring carrier prepared with immobilized binders, reagents for carrying out the detection method, in particular optically and / or magnetically detectable detection reagents, and optionally washing or / and buffer solutions.
  • the measuring carrier is preferably in dried form.
  • the invention relates to the use of a measuring carrier of the type described above in an immunoassay and / or nucleic acid hybridization assay or / and lectin-sugar assay or / and protein-nucleic acid assay.
  • Fig. 1 is a schematic sectional view of a molecular biological or biochemical sensor ("biosensor”) according to the invention with detection and data fields and
  • Fig. 2 shows schematically the distribution of the detection and data fields on the biosensor.
  • the biosensor is generally designated 1. It has the shape of a circular disk. Its size suitably corresponds to that of a conventional one Compact disc, the diameter of which is usually about 1 2 cm.
  • the biosensor 1 comprises a carrier substrate 3, which is made of an optically transparent material, preferably polycarbonate. Detection fields 5, 7 and data fields 9 are formed on the upper flat side of the substrate 3 in FIG. 1. Information about the measurement sample and / or about the detection fields and / and about the evaluation is stored in the data fields 9. As with conventional CDs, the information in the data fields 9 is represented by alternating recessed regions 11 and non-recessed regions 13 of the substrate 3.
  • each detection field 5, 7 carries a plurality of binders 1 5 of the same or different types.
  • the detection field 7 represents a detection field, to which no analytes have adhered after the measurement sample has come into contact with the detection fields 5, 7.
  • the detection field 5 represents a detection field to which analytes have adhered.
  • the detection fields 5, 7 are embedded in a cover layer 19, which is applied only in the regions of the substrate 3 which carry the detection fields 5, 7, but not in the areas of the substrate 3 which carry the data fields 9.
  • the cover layer 19 also consists of an optically transparent material, preferably a polymer material. It fixes the markers on the substrate 3 and at the same time serves as an adhesion promoter between the substrate 3 and a reflection layer 21, which is applied to the substrate 3 over a wide area, extends across all detection fields 5, 7 and all data fields 9 and into the depressions 11 of the data fields 9 reaches into it.
  • the reflection layer 21 is preferably made of aluminum, but can also consist of silver, for example, and is more expediently generated by chemical vapor deposition.
  • the reflection layer 21 serves as a reflector for the light of a laser beam 23, which is directed onto the biosensor 1 from the underside of the substrate 3 for reading out the detection fields 5, 7 and the data fields 9.
  • the reflected light is evaluated using common methods. For example, it is separated from the incident light by means of a polarization filter and then evaluated for its intensity.
  • the material of the substrate 3 advantageously has such a refractive index that the laser beam 23 is focused on its way in the substrate 3, so that the light spot ultimately incident on the detection fields 5, 7 and the data fields 9 can be kept very small.
  • the biosensor 1 is closed off by a flat top layer 25 which protects the biosensor 1 against harmful chemical or mechanical influences. It preferably consists of an acrylic material.
  • Fig. 2 shows a section of two successive turns of the spiral line. The latter is shown in Fig. 2 as a dashed line and designated 27. With d is also the radial distance between the two turns, ie the spiral pitch. For example, it is approximately 1.6 ⁇ m.
  • the depressions 11, which can have graduated variable circumferential lengths when using the coding customary for CDs, in particular CD-ROMs, are, for example, approximately 0.5 ⁇ m wide in the radial direction.
  • the detection fields 5, 7 are also designed to be radially narrow enough that there is a sufficient distance from the fields of the adjacent spiral turns.
  • the detection fields 5, 7 can also be about 0.5 ⁇ m wide. With such a dimensioning, "fraying" can easily be made be taken, which is frequently observed in the enzymatic detection of the analytes adhering to the detection fields 5.
  • the detection fields 5, 7 can be elongated in the circumferential direction, so that they can be formed with a sufficiently large total area. Also in the circumferential direction, the detection fields 5, 7 will have a sufficient distance from one another and from the data fields 9.
  • Reading out the data and detection fields CD drives with a spot diameter of the laser beam 23 of approximately 2 ⁇ m can be used.
  • Applications can vary according to the nature of the immobilized binding partner (A), the analyte-specific binding agent, and the nature of its "ligand", i.e. H. of the analyte (B).
  • Nucleic acids and / or proteins are preferably used as interaction partners, but other partners of specific binding pairs, such as lectins or sugar, can also be used.
  • the receptors or analytes are preferably derivatized with a biotin group, the biotin group then advantageously being detected with a streptavidin-enzyme conjugate, such as horseradish peroxidase.
  • a streptavidin-enzyme conjugate such as horseradish peroxidase.
  • the substrate of the enzyme reaction is selected in such a way that an intense, dark precipitate forms at the site of the molecular interaction, which squeezes the detection laser.
  • the detection can also be carried out by directly derivatizing an interaction partner with a fluorochrome in combination with a suitable laser.
  • the receptor (A) is an RNA aptamer, a peptide or a natural or synthetic effector molecule and the analyte (B) is a protein.
  • the properties of an enzyme or regulatory factor in gene expression are often modulated by the association of small effector or ligand molecules.
  • small effector or ligand molecules One example is hormone receptors, which are converted into an active conformation after binding to the hormone. Protein function can be modulated by interaction of a substrate analog or by allosteric effectors. In order to identify suitable small chemicals, screening procedures for ligands are carried out, with a large number of different chemicals being examined.
  • RNA aptamers or peptides can be screened, either isolated or incorporated into a fusion protein, for interactions with a protein in question.
  • the receptor (A) is a protein and the analyte (B) is a nucleic acid or a ligant.
  • Protein libraries can be used for certain binding properties, e.g. B. the interaction with a defined DNA sequence become.
  • Duplicated measuring carriers which contain defined regions of proteins, which together represent the products of a cDNA expression library, can be characterized with specific ligands or DNA binding sites.
  • the arranged proteins can be unknown as they are in the library and can only be assigned by the method according to the invention.
  • regions of known proteins or derivatives of a defined protein, such as the product of a random mutagenesis can be examined.
  • the receptor (A) is a DNA or RNA and the analyte (B) is a protein.
  • a large number of different double-stranded DNA fragments can be applied to the detection fields. These can either be small fragments, for example oligonucleotides, or larger DNA fragments up to very large DNA sections, which represent an ordered library of genomic DNA fragments.
  • the applications include the systematic search for possible genomic binding sites for DNA binding proteins, but also other DNA binding molecules can be detected, such as intercalators, small molecules with preference for certain sequences, PNAs and sequences that form a triple helix.
  • RNA molecules can be applied as receptor molecules in the detection fields, such as the transcripts of a cDNA library or the derivatives of a defined RNA, such as the product of a random mutagenesis.
  • the receptor (A) is a single-stranded DNA and the analyte (B) is a single-stranded DNA or RNA.
  • Example 2.1
  • measuring carriers according to the invention can be produced which contain entire genomes in ordered arrays or areas. This makes it possible to assign a cloned piece of DNA to its genomic localization in a single hybridization step and, depending on the resolution of the array (which is a function of the mean sequence length and the number of individual DNA molecules), even to identify the gene itself.
  • Arrays or ranges of diagnostic oligonucleotides which represent all known genes of a given species, allow the direct identification of a gene in question.
  • a gene in question e.g. B. cDNA arrays from Klontech or the DNA chips from Affimetrix, on which all yeast genes are applied, can be improved by transferring them to the measuring carriers according to the invention.
  • the expression profile can be examined by applying DNA to the measurement carrier according to the invention which shows all the genes of an organism.
  • a complex mixture of RNA which represents the expression state of a specific cell or a cDNA population derived therefrom, is applied to the measuring carrier.
  • the state of expression ascertained on the measuring carrier can easily be compared with the state of expression of other cells which originate from other tissues, represent other stages of development or other stages of metabolism.
  • DNA samples can be examined which represent certain selected DNA states, such as cell cycle genes, signal transmitter components etc. Since the measuring carriers according to the invention can be stored for a long time, expression profiles can be created which can be archived and used for comparison purposes.
  • the method of the invention can be used to diagnose common and rare DNA polymorphisms, including mapping mutations in proto-oncogenes that cause common tumors.
  • a suitable measuring carrier contains overlaying oligonucleotides which together comprise an entire gene (e.g. the wild-type sequence) together with oligonucleotides which contain all possible or frequently occurring mutations of this sequence.
  • the corresponding DNA fragment is isolated from patients by PCR and hybridized to the relevant gene measuring support under conditions under which the hybridization takes place only if there is a perfect sequence match.
  • a comparison of the hybridization of the experimental DNA to wild-type or mutant oligonucleotides makes it possible to determine exactly what type of mutation occurs in a sequence.
  • the method according to the invention can also be used in applications which involve more extensive treatments of the Measurement carriers require, such as PCR amplification, which is carried out analogously to in situ PCR amplifications. Infectious agents can also be detected in this way.

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Abstract

Es wird eine Verfahren zum Nachweis von Analyten in einer Messprobe vorgeschlagen, bei dem auf einem scheibenförmigen Substrat (3) auf einer seiner Flachseiten analytspezifische Binder (15) in einer Vielzahl von Nachweisfeldern (5, 7) immobilisiert werden, sodann die Messprobe in Kontakt mit den Nachweisfeldern (5, 7) gebracht wird und anschliessend das Vorhandensein oder/und die Menge der nachzuweisenden Analyten (17) durch optische Auswertung der Nachweisfelder (5, 7) ermittelt wird. Erfindungsgemäss wird ein aus einem optisch transparenten Material gefertigtes Substrat (3) verwendet, wobei die Nachweisfelder (5, 7) längs mindestens einer Spirallinie (27) verteilt auf dem Substrat (3) angeordnet werden. Nach Inkontaktbringung der Messprobe mit den Nachweisfeldern (5, 7) wird das Substrat (3) auf seiner die Nachweisfelder (5, 7) tragenden Flachseite flächig mit einer Reflexionsschicht (21) versehen. Alternativ ist statt der optischen Auslesung auch eine magnetische Auslesung des Substrats denkbar.

Description

Verfahren zum Nachweis von Analyten in einer Meßprobe sowie Meßträger hierfür
Beschreibung
Die Erfindung befaßt sich mit dem Nachweis von Analyten in einer Meßprobe. Als Analyten kommen beispielsweise Proteine, Peptide, Nukleinsäuren und deren Derivate sowie Moleküle, die an diesen binden können, in Frage.
Als Meßprobe kommt jede Probe in Frage, von der vermutet wird, daß sie mindestens einen Teil der gesuchten Analyten enthält. Es kann sich dabei z. B. um eine Blutprobe, eine Serumprobe oder/und eine Urinprobe handeln, oder allgemein um jede Lösung, die den gesuchten Analyten enthält.
Zum Nachweis von Analyten in einer Meßprobe ist der Einsatz sogenannter Bindungsassays bekannt. Bei solchen Bindungsassays werden im allgemeinen Analyten durch ihre spezifische Wechselwirkung mit Rezeptoren nachgewiesen. Beispiele für solche Wechselwirkungen sind Protein/Protein- Wechselwirkungen, die beispielsweise während der Genexpression auftreten, Enzym/Substrat- oder Enzym/Effektor-Wechselwirkungen, die im Stoffwechsel auftreten, oder Protein/DNA- oder Protein/RNA-Wechselwir- kungen während der Genexpression. Ein systematisches Verständnis dieser molekularen Wechselwirkungen ist eine Grundvoraussetzung für das Verständnis aller biologischen Vorgänge sowohl in normalen als auch in erkrankten Zellen.
Weiterhin können mit Bindungsassays auch Nukleinsäuren nachgewiesen werden. DNA/DNA-Wechselwirkungen spielen eine Hauptrolle in der
Molekularbiologie, insbesondere bei der Identifizierung von Genen und bei
Strategien zur Kartierung von DNA, beim Nachweis und der Quantifizierung der Genexpression sowie bei der molekularen Diagnose oder Therapie von Erkrankungen. In Frage kommen selbstverständlich auch DNA/RNA- und RNA/RNA- Wechsel Wirkungen.
Aufgrund der großen Anzahl von Genen, Proteinen, chemischen Effektoren oder RNA-Aptameren erfordert ein Verstehen oder Eingreifen in biochemische Prozesse häufig die Erkennung, Quantifizierung oder Klassifizierung einer Vielzahl von molekularen Wechselwirkungen oder die Identifizierung von wirksamen Wechselwirkungspartnern aus einer großen Anzahl von möglichen Kombinationen. Das Screening und Analysieren einer großen Anzahl von molekularen Wechselwirkungen ist bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren jedoch häufig begrenzt.
Meßproben sollen oftmals auf eine Vielzahl von Analyten hin untersucht werden. Dabei ergibt sich das Problem, daß bei der Auswertung große Datenmengen anfallen. Um in der Praxis erfolgreich zu bestehen, muß die Auswertung jedoch in vertretbarer Zeit möglich sein. Bekannte Analysesysteme haben sich hier als nur bedingt zufriedenstellend erwiesen.
Aus einem Artikel "Metal Nano Clusters as Transducers for Bioaffinity Interactions" von Thomas Schalkhammer in Monatshefte für Chemie 000, 1 - 26, Springer- Verlag 1998, Seiten 1 -26, ist ein Sensoraufbau für bioreko- gnitive Bindungsvorgänge und katalytisch-enzymatische Prozesse bekannt, bei dem auf einem Polycarbonat-Substrat eine Spiegelschicht aus Silber und darüber eine Abstandsschicht aus einem Poiymermaterial angeordnet sind. Die Abstandsschicht dient ihrerseits als Träger für die darauf immobilisierten Binder. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe von Metall-Clustern, mit denen die nachzuweisenden Analyten markiert werden und die in elektromagnetische Wechselwirkung mit der metallischen Spiegelschicht treten. In Sensorberei- chen starker Überdeckung mit gebundenen Metall-Clustern wird Licht, das von der dem Polycarbonat-Substrat abgewandten Seite der Spiegelschicht her eingestrahlt wird, stärker absorbiert als in Überdeckungsfreien oder schwächer überdeckten Sensorbereichen, was die optische Auslesung des Sensors über Absorptionsmessungen ermöglicht.
Für die Funktion dieses bekannten Sensors ist die Dicke der Abstands- schicht ein entscheidender Parameter. Diese muß in einem vorgegebenen Bereich gewählt werden, der von der Wellenlänge des bei der späteren Auswertung eingestrahlten Lichts abhängt. Es muß insbesondere sichergestellt sein, daß die Abstandsschicht auf ihrer gesamten Ausdehnung eine gleichmäßige Dicke besitzt. Hierfür ist ein hoher herstellungstechnischer Aufwand zu betreiben.
In dem angesprochenen Artikel werden für die optische Auswertung dieses Sensors schon Lesegeräte vorgeschlagen, die es erlauben, auch größere Datenmengen zu bewältigen, unter anderem CD-ROM-Lesegeräte.
Aufgabe der Erfindung ist es, einen Weg aufzuzeigen, wie mit geringem Aufwand, nicht nur was die datentechnische Auswertung anbelangt, sondern auch was die Bereitstellung des Sensors anbelangt, eine Meßprobe auf eine große Fülle von Analyten hin untersucht werden kann.
Bei der Lösung dieser Aufgabe geht die Erfindung nach einem ersten Aspekt von einem Verfahren zum Nachweis von Analyten in einer Meßprobe aus, bei dem auf einem scheibenförmigen Substrat auf einer seiner Flachseiten analytspezifische Binder in einer Vielzahl von Nachweisfeldern immobilisiert werden, sodann die Meßprobe in Kontakt mit den Nachweisfeldern gebracht wird und anschließend das Vorhandensein oder/und die Menge der nachzuweisenden Analyten durch optische Auswertung der Nachweisfelder ermittelt wird.
Erfindungsgemäß ist hierbei vorgesehen, daß ein aus einem optisch transparenten Material gefertigtes Substrat verwendet wird, daß die Nachweisfelder längs mindestens einer Spirallinie oder/und einer Vielzahl konzentrischer Kreislinien verteilt auf dem Substrat angeordnet werden und daß nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern ein optischer Reflektor der die Nachweisfelder tragenden Flachseite des Substrats benachbart angeordnet wird.
Bei der Erfindung können die Nachweisfelder direkt auf dem Substrat ausgebildet werden. Hierbei kann es sich empfehlen, die Substratoberfläche zunächst chemisch vorzubehandeln oder durch Vorbehandlung mit einem Sauerstoffplasma eine Oberflächenmodifizierung zu bewirken. Diese Modifikation kann das Aufbringen der Binder zur Ausbildung der analyt- spezifischen Nachweisfelder erleichtern. Unterhalb der Binder ist bei der Erfindung demnach keine Abstandsschicht mit einer präzise einzuhaltenden Dicke auf das Substrat aufzubringen, wie dies bei dem von Schaikhammer bekannten Sensor zwingend erforderlich ist. Insofern ergibt sich ein reduzierter fertigungstechnischer Aufwand.
Der Reflektor wird für die optische Auswertung des Assays benötigt. Er kann von einer Reflexionsschicht gebildet werden, die nach Abschluß der molekularbiologischen Verfahrensschritte auf das Substrat über den Nachweisfeldern aufgebracht wird. Aufgrund ihres guten Reflexionsvermögens empfehlen sich metallische Werkstoffe. Grundsätzlich sind auch andere Materialien denkbar, etwa Dielektrika. Bevorzugt wird die Reflexionsschicht aus Aluminium gebildet. Denkbar ist auch Silber als Material für die Reflexionsschicht. Die Reflexionsschicht kann durch chemisches Auf- dampfen ausgebildet werden. Möglich ist aber auch, eine vorgefertigte reflektierende Folie auf das Substrat aufzukleben.
Alternativ ist es denkbar, daß der Reflektor im Abstand von dem Substrat angeordnet wird, er also nicht direkt auf das Substrat aufgebracht wird. Beispielsweise kann der Reflektor von einer Spiegelplatte gebildet sein, die in einem Auswertegerät angebracht ist, welches zur Auswertung des Assays verwendet wird. Die optische Transparenz des Substrats macht es zusammen mit dem auf der substratfernen Seite der Nachweisfelder angeordneten Reflektor möglich, zur optischen Auswertung dieses erfindungsgemäßen molekularbiologischen Sensors auf die Hardware handelsüblicher CD-Lesegeräte zurückzugreifen. Insbesondere bei spiraliger Anordnung der Nachweisfelder und bei Ausbildung des Reflektors als direkt auf das Substrat aufgebrachte Reflexionsschicht können solche handelsüblichen CD-Lesegeräte mit vergleichsweise geringem Aufwand so modifiziert werden, daß aus dem rückkehrenden Licht des die Nachweisfelder abtastenden Laserstrahls die gewünschten Informationen herausgefiltert werden können. Denkbar ist es, daß hierzu lediglich Software-Modifikationen erforderlich sind. Selbst bei kreisförmiger Anordnung der Nachweisfelder ist die Technik solcher CD- Lesegeräte grundsätzlich anwendbar, sofern die konstruktiven und softwaremäßigen Voraussetzungen für einen Sprung des die Nachweisfelder abtastenden Laserstrahls von Kreislinie zu Kreislinie geschaffen werden.
Besonders eignet sich ein CD-ROM-Lesegerät, das bei Einbettung in eine Computerarchitektur dem Anwender die Möglichkeit gibt, die Auswerte- Software selbst zu definieren.
Die Auswertung der Nachweisfelder kann abhängig vom gewählten Auswertealgorithmus quantitative wie auch qualitative Aussagen liefern. Mittels geeigneter Marker können die optischen Eigenschaften, insbesondere das Absorptionsverhalten, von Nachweisfeldern, in denen sich Analyten an Rezeptoren angeheftet haben, von Nachweisfeldern, an deren Rezeptoren sich keine Analyten angeheftet haben, unterscheidbar gemacht werden. Auf diese Weise ist es beispielsweise über Absorptionsmessungen möglich, diejenigen Nachweisfelderzu erkennen, die nach Abschlußder molekularbiologischen Verfahrensschritte Analyten tragen. Dies wäre zunächst eine rein qualitative Aussage. Will man darüber hinaus auch quantitative Aussagen treffen, so ist es denkbar, die Nachweisfelder mehrmals abzutasten und eine Schwelle, die bei der Auswertung als Entscheidungsgrenze zwischen Vorhandensein und NichtVorhandensein von Analyten genommen wird, von Abtastdurchgang zu Abtastdurchgang schrittweise zu verändern. Auf diese Weise können auch Aussagen über die Menge der in den einzelnen Nachweisfeldern hängengebliebenen Analyten getroffen werden.
Wenn der Assay mit einem ggf. geeignet angepaßten CD-ROM-Laufwerk ausgelesen wird, ermöglicht ein angeschlossener Computer dem Anwender die Weiterverarbeitung der von dem Laufwerk gelieferten Datenmenge, wobei er das Ergebnis dieser Weiterverarbeitung auf externen Daten- speichern abspeichern kann, beispielsweise um Datenbanken über Patienten zu erstellen. Zur Datenspeicherung können herkömmliche Standardspeicher, etwa Festplatten oder Floppy-Discs, verwendet werden. Mit Computerhilfe ist eine schnelle Auswertung der Datenflut des Laufwerks möglich. Die Kapazität herkömmlicher Computer und Speichersysteme ist in der Regel so ausreichend, daß auch komplexe Genanalysen darauf durchgeführt werden können.
In der Regel wird es erwünscht sein, scharf definierte Nachweisfelder zu erhalten, die zusätzlich sehr klein sein sollen, um eine hinreichende Zahl von Nachweisfeldern auf der Substratscheibe unterzubringen, die zweckmäßigerweise die Größe einer herkömmlichen CD (Compact Disc) besitzt. Wenn man davon ausgeht, daß der radiale Abstand zweier aufeinanderfolgender Spiralwindungen zweckmäßigerweise etwa 1 ,6 μm beträgt, so empfiehlt es sich, die Binder in Feldern aufzubringen, die radial nicht breiter als 1 //m sind, damit zwischen bezogen auf die Scheibenachse radial benachbarten Nachweisfeldern ein hinreichender Abstand besteht und jedes einzelne Nachweisfeld als solches ortsaufgelöst werden kann. Bevorzugt sind die Nachweisfelder radial sogar schmäler als 1 μm, wobei es zweckmäßig sein kann, sie mit einer radialen Breite auszubilden, die im wesentlichen der Breite der bei herkömmlichen CDs eingeprägten Datenvertiefungen (sogenannte Pits) entspricht, nämlich etwa 0,5 μm. Gleichfalls empfiehlt es sich, entlang der Spirallinie bzw. einer Kreislinie einander benachbarte Nachweisfelder mit Abstand voneinander anzuordnen, um deren individuelle Auflösung durch das Auswertesystem zu ermöglichen. Die Nachweisfelder können als im wesentlichen quadratische oder kreisförmige Flächen ausgebildet werden. Denkbar ist auch, sie entsprechend der Gestalt der Datenpits herkömmlicher CDs in Umfangsrichtung, also in Spiral- bzw. Kreislinienrichtung, länglich auszubilden, etwa oval oder rechteckig.
Um die Binder unter den vorstehend skizzierten dimensionellen Randbedingungen für die Nachweisfelder auf das Substrat aufzubringen, eignen sich insbesondere Mikroprinttechniken, Tintenstrahltechniken oder Elektrospray- techniken. Zum Nachlesen, was Mikroprinttechniken anbelangt, wird beispielhaft verwiesen auf: "Microfabrication, Microstructures and Microsystems" von Dong Qin et al., "Topics In Current Chemistry", Band 1 94, 1 998, Seite 6ff., Springer-Verlag. Bezüglich Tintenstrahltechniken wird beispielhaft verwiesen auf: "A new device for multifunctional dosage of liquids by a free jet" von N. Hey et al., Proceedings lEEE-Mems 1 998, CH 361 76. Elektrospraytechniken, insbesondere Nanoelektrospraytechniken, können beispielsweise in "Analytical Properties of the Nanoelectrospray Ion Source" von M. Wilm und M. Mann in Analytical Chemistry, Band 68, Nr. 1 , 1 . Januar 1 996, Seiten 1 -8, sowie in "Electrospray and Taylor-Cone theory, Dole's beam of macromolecuies at last?" von M. Wilm, M. Mann in International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 1 36 ( 1 994), Seiten 1 67-1 80, nachgelesen werden. Diese Techniken ermöglichen es, die Nachweisfelder mit hoher Ortsauflösung gezielt mit vorbestimmten Bindern zu versehen. Die Binder können auf die Außenoberfläche der Substratscheibe aufgebracht werden. Denkbar ist es auch, in Analogie zu den Datenpits herkömmlicher CDs kleine Vertiefungen in die Außenoberfläche des Substrats einzubringen und darin die analytspezifischen Binder zu immobilisieren. Falls solche Vertiefungen für die Binder vorgesehen werden, wird es zweckmäßig sein, diese mit einer radialen Breite von etwa 0,5 μm auszubilden, entsprechend der Breite der Datenpits herkömmlicher CDs. Um biologische Wechselwirkungen auf molekularer Ebene zu untersuchen, kommen als Analyten insbesondere Nukleinsäuren oder/und Proteine in Betracht. So kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um Protein/Protein-Wechselwirkungen, wie sie beispielsweise während der Genexpression oder als Zellsignale auftreten, Enzym/Substrat- oder Enzym/Effekt-Wechselwirkungen während des Stoffwechsels oder Protein/DNA- oder Protein/RNA-Wechselwirkungen während der Genexpression nachzuweisen.
Durch geeignete Wahl der Binder in den Nachweisfeldern können auch DNA/DNA-Wechselwirkungen nachgewiesen werden, wie es insbesondere zur Genidentifizierung und zur Kartierung von Genen, beim Untersuchen und Quantifizieren der Genexpression sowie bei der molekularen Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen von Bedeutung ist.
Molekulare Wechselwirkungen und Enzymaktivitäten können durch die Bindung von RNA-Aptameren oder kleinen chemischen Verbindungen an Makromoleküle beeinflußt werden. Natürliche und synthetische Effektormoleküle erlauben es deshalb häufig, biochemische Verfahren durch Modulation von oder Eingreifen in makromolekulare Wechselwirkungen zu manipulieren.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Substratmaterial um ein nicht poröses Material. Die Verwendung eines nicht porösen Trägers ermöglicht das definierte Aufbringen auch kleiner Nachweisfelder, so daß eine Miniaturisierung des Testformats bzw. das Aufbringen einer Vielzahl von Nachweisfeldern möglich ist. Geeignete Materialien für das scheibenförmige Substrat sind z. B. Kunststoffe und Glas. Für CD-ROM-Laufwerksapplikationen handelt es sich bevorzugt um ein fokussierendes Material, insbesondere um Polycarbonat. Die Immobilisierung der Binder an den Nachweisfeldern kann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden. Die Immobilisierungsstrategie hängt von der Art des zu immobilisierenden Moleküls und des jeweiligen Substrats ab. Im allgemeinen können Binder direkt an eine Matrix über eine chemische Reaktion gebunden werden, beispielsweise über eine spezielle Aminosäure in einem Protein (insbesondere Cystein oder Lysin) oder über das Phosphatgrundgerüst einer DNA. Die Immobilisierung kann auch mit bifunktionellen chemischen Quervernetzern oder über eine spezifische hochaffine Wechselwirkung, wie etwa die Biotin/Streptavidin-Wechselwir- kung durchgeführt werden. Die analytspezifischen Binder können auf der Oberfläche auch adsorbiert werden, wobei eine kovalente Bindung jedoch bevorzugt ist. Als Binder werden auf die Oberfläche des Substrats Substanzen oder/und Moleküle aufgebracht, die in der Lage sind, den gewünschten Analyten spezifisch, insbesondere mit hoher Affinität, zu binden.
Nach Inkontaktbringen der Meßprobe mit den Nachweisfeldern wird das Vorhandensein oder/und die Menge der nachzuweisenden Analyten durch optische Auswertung der Nachweisfelder ermittelt. Hier können alle dem Fachmann bekannten Methoden herangezogen werden. Ein übliches Verfahren, um molekulare Wechselwirkungen zu analysieren, besteht aus mehreren Schritten: Ein erster Wechselwirkungspartner, z. B. ein analyt- spezifischer Binder oder Rezeptor, wird mit einem festen Träger kovalent oder adsorptiv verknüpft. Beim Inkontaktbringen der Meßprobe mit den Nachweisfeldern kann ein zweiter Wechselwirkungspartner, z. B. der Analyt, mit dem Rezeptor wechselwirken. Anschließend wird das Vorhandensein des Analyten (oder das NichtVorhandensein in kompetitiven Testformaten) an der Stelle, an der der Rezeptor immobilisiert ist, nachgewiesen. Die Wechselwirkung zwischen den zwei Bindepartnern wird bevorzugt unter Bedingungen durchgeführt, bei denen beide Reaktanten in einer nativen, aktiven Konfiguration vorliegen, bevorzugt in einer flüssigen Reaktion. Besonders bevorzugt wird das Inkontaktbringen unter einem annähernd physiologischen pH-Wert und bei ionischen Bedingungen durchgeführt.
Der Nachweis erfolgt beim erfindungsgemäßen Verfahren durch Detektion einer Änderung der optischen Eigenschaften der Nachweisfelder. Die optische Änderung der Nachweisfelder kann z. B. durch Isotope, Enzyme, Fluorochrome, Farbstoffe, Metallkolloide, Beads oder ähnliches herbeigeführt werden, die als Markersystem dienen. Zum Nachweis wird einer der Wechselwirkungspartner, d. h. der Rezeptor oder der Analyt, direkt oder indirekt markiert. Bevorzugt werden zur Detektion Proteine oder Nukleinsäuren mit einer Biotineinheit derivatisiert, wonach eine Erkennung durch Streptavidinkonjugate möglich ist.
Bevorzugt resultiert das Nachweisverfahren in der Präzipitation eines Farbstoffs oder der Lokalisierung eines Fluorochroms an der Stelle der molekularen Wechselwirkung oder in der Anlagerung von Metall-Clustern mit starker elektromagnetischer Wechselwirkung. Latex-Beads oder Kunststoff-Beads können ebenfalls angebunden werden. Sie bewirken aufgrund ihres Brechungsverhaltens und ihrer gekrümmten (sphärischen) Oberfläche eine Streuung des einfallenden Ausleselichts, die als Intensitätsminderung detektierbar ist. Bei geeigneter Dimensionierung der Beads können Effekte der destruktiven Interferenz erzielt werden.
Die wechselwirkenden Moleküle, also der Rezeptor und der Analyt, können entweder direkt über ihre spezifischen Bindestellen nachgewiesen werden oder indirekt, indem sie mit einem Marker versehen werden, der eine bekannte spezifische Bindestelle enthält. Beispiele für solche Marker sind Epitope, für die monoklonale Antikörper bekannt sind, oder eine Biotingrup- pe, die mit Streptavidin bindefähig ist. Daneben ist auch das direkte spezifische Binden eines Antikörpers an den Analyten möglich. Antikörper und Streptavidin werden bevorzugt mit einem Enzym konjugiert, um eine Auswertung der Nachweisfelder zu ermöglichen. Beispiele für bevorzugte Enzyme sind Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und /?-Galak- tosidase. Bei Zugabe geeigneter Substrate läuft eine enzymatische chromogene Reaktion ab, wobei gefärbte Produkte entstehen, die an den Orten präzipitieren, an denen die Enzyme gebunden sind und somit das Vorhandensein des Analyten anzeigen. Geeignete Substrate der obigen Enzyme, die eine optische Auswertung ermöglichen, sind für Meerrettichperoxidase beispielsweise Diaminobenzidin (DAB), welches ein in Wasser und Ethanol unlösliches braunes Produkt ergibt, DAB + Metall, welches in Gegenwart von Kobalt oder Nickel ein graues bis schwarzes unlösliches Produkt ergibt, Chlornaphtol, das eine blau-schwarze, wasserlösliche Färbung ergibt, Aminoethylcarbazol, das ein rotes, wasserunlösliches Produkt ergibt. Bevorzugte Substrate für alkalische Phosphatase sind Naphthol-AS-BI-Phosphat/New-Fuchsin, was ein rotes, unlösliches Produkt ergibt, Bromchlorindolylphosphat/Nitrotetrazolium, was ein schwarz- violettes Präzipitat ergibt, und für ?-Galaktosidase Bromchlorindolyl-b-D- Galaktpyranosit (BCIG), was ein unlösliches blaues Produkt ergibt. Der Nachweis der Analyten kann hier leicht durch optische Detektion des gefärbten Bereichs erfolgen.
Eine weitere Möglichkeit zum Nachweis der Wechselwirkungsstellen ist die Anfärbetechnik mit Goldkolloiden, wobei auch andere Typen von Metall- clustern bzw. -Beads verwendet werden können. Hier sind insbesondere Silberteilchen vorteilhaft, die die Sensitivität eines optischen Nachweissystems aufgrund nichtlinearer optischer Effekte nahe einer Metalloberfläche der Reflexionsschicht erhöhen können. Weiterhin bevorzugt ist die Verwendung von Farbstoffen als Marker, insbesondere von gefärbten Latexpartikeln. Es können auch Glas-Beads aus Siiiziumoxid verwendet werden, die mit einem Farbstoff in hoher Konzentration gefüllt sind.
Neben der Messung der Absorption ist bei Wahl geeigneter Marker, beispielsweise fluoreszierender Stoffe, auch eine Messung der Fluoreszenz möglich, wobei hier die Detektionswellenlänge eine andere als die einge- strahlte Wellenlänge ist. Sofern marktgängige CD-Laufwerke, insbesondere CD-ROM-Laufwerke, bei der Auswertung herangezogen werden sollen, können im Fall von Fluoreszenzmessungen konstruktive Laufwerksmodifikationen neben einer entsprechenden Anpassung der Software erforderlich sein. Insbesondere kann es notwendig sein, einen speziell auf die Fluoreszenzwellenlänge abgestimmten Detektor einzubauen.
Die Erfindung ermöglicht es, auf der die Nachweisfelder tragenden Flachseite des Substrats zusätzliche Informationen einzuschreiben, die zeitgleich mit den Nachweisfeldern ausgelesen und ausgewertet werden können. Demgemäß wird vorgeschlagen, daß auf der die Nachweisfelder tragenden Flachseite des Substrats entlang der Spirallinie bzw. mindestens einer Kreislinie zusätzlich Datenfelder ausgebildet werden, welche meß- probenbezogene oder/und nachweisfeldbezogene oder/und auswertungs- bezogene Informationen enthalten. Bei den meßprobenbezogenen Informationen kann es sich beispielsweise um Informationen über Ort und Zeit der Gewinnung der Meßprobe, über die Art der Meßprobe oder über die Person handeln, der die Meßprobe entnommen wurde. Die nachweisfeldbezogenen Informationen können molekularbiologische oder biochemische Angaben über die Nachweisfelder enthalten, insbesondere über den Bindertyp der einzelnen Nachweisfelder. Die auswertungsbezogenen Informationen können Angaben über das zum Nachweis der Analyten angewendete Detektions- prinzip, etwa enzymatische Detektion, Detektion über Farbstoffe, Detektion über Metall-Cluster oder dergleichen, enthalten. Ferner können sie Angaben darüber enthalten, welches physikalische Abtastprinzip ein Lesegerät anwenden soll, etwa eine Absorptionsmessung oder eine Fluoreszenzmessung. Zudem können die auswertungsbezogenen Informationen dem Lesegerät Lage und Ort der Nachweisfelder auf dem Substrat angeben und ihm damit signalisieren, wann das Lesegerät von einer Software zum Lesen der Datenfelder auf eine Software zum Lesen der Nachweisfelder umschalten soll. Insbesondere ist denkbar, daß die auswertungsbezogenen Informationen schon zumindest Teile einer Auswerte-Software enthalten, die vom Lesegerät bei der Auswertung der Nachweisfelder abgearbeitet wird. Auf diese Weise kann der Anwender von mühsamen Programmierungsaufgaben zur Softwareanpassung seines Computerarbeitsplatzes entlastet werden. Die vollständige Auswerte-Software kann bereits herstellerseitig, soweit geeignete Software-Standards existieren, in den Sensor eingeschrieben werden.
Grundsätzlich ist es denkbar, die Nachweisfelder und die Datenfelder längs der Spirallinie getrennt anzuordnen. Es kann aber zweckmäßig sein, Nachweisfelder und Datenfelder abwechselnd entlang der Spirallinie anzuordnen, beispielsweise in der Weise, daß einem einzelnen Nachweisfeld oder einer Gruppe von Nachweisfeldern ein Datenfeld zugeordnet wird, das dem Nachweisfeld bzw. der Gruppe von Nachweisfeldern längs der Spirallinie vorhergeht und dem Auswertesystem Informationen über dieses Nachweisfeld bzw. diese Gruppe von Nachweisfeldern liefert.
Sofern die Nachweisfelder längs konzentrischer Kreislinien angeordnet werden, können Nachweisfelder und Datenfelder ebenfalls abwechselnd entlang mindestens einer Kreislinie angeordnet werden. Denkbar ist aber auch, daß Nachweisfelder und Datenfelder jeweils auf gesonderten Kreislinien ausgebildet werden.
Die Datenfelder sollen zweckmäßigerweise von der gleichen Seite der Substratscheibe her ausgelesen werden können wie die Nachweisfelder. Dabei besteht eine Möglichkeit darin, zur Bildung der Datenfelder Vertiefungen in die Nachweisfelder tragende Flachseite des Substrats einzubringen, wobei der Reflektor so angebracht wird, daß er in die Vertiefung hineinreicht. Zweckmäßigerweise erfolgen die Codierung der Daten und die Anordnung der Vertiefungen nach Maßgabe eines gängigen CD-Formats, insbesondere des CD-ROM-Formats, so daß die Datenfelder mittels herkömmlicher CD-Laufwerke ohne Softwaremodifikationen gelesen werden können. Es ist sogar denkbar, zur Bildung der Datenfelder auf Vertiefungen zu verzichten. Durch Anbindung von optisch absorbierenden oder streuenden Substanzen an das Substrat kann ebenfalls Einfluß auf die Reflexion des zur Auslesung auf die Nachweis- und Datenfelder gerichteten Lichtstrahls genommen werden. So ist es denkbar, bei geeigneter Wahl von Metall- oder Kunststoff-Beads ähnliche Effekte destruktiver Interferenz zu erzielen, wie sie auch durch Vertiefungen in der Substratoberfläche erreicht werden. Es kann daher vorgesehen sein, daß zur Bildung der Datenfelder eine einfallendes Leselicht beeinflussende Substanz auf die die Nachweisfelder tragende Flachseite des Substrats aufgebracht wird.
Weil bei Ausbildung des Reflektors als auf das Substrat aufgebrachte Reflexionsschicht die letztere erst nach Abschluß sämtlicher molekularbiologischer oder biochemischer Analyseschritte aufgebracht wird, sind Vorher- Nachher-Messungen der Nachweisfelder nicht möglich, also Messungen vor und nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern. Um dennoch aus den Meßsignalen verläßliche Aussagen darüber zu gewinnen, ob und welche Nachweisfelder mit Analyten besetzt sind, kann es vorteilhaft sein, auf der die Nachweisfelder tragenden Flachseite des Substrats entlang der Spirallinie bzw. mindestens einer Kreislinie zusätzlich mindestens ein Referenzfeld auszubilden, dessen optische Eigenschaften als Referenz bei der Auswertung der Nachweisfelder verwendet werden. Beispielsweise können diese Referenzfelder einen bekannten, für analytfreie Nachweisfelder typischen Referenzabsorptionsgrad für das Licht des abtastenden Lichtstrahls besitzen, der von einem Absorptionsgrad unterscheidbar ist, den analytbehaftete Nachweisfelder typischerweise besitzen. Daneben können auch Referenzfelder ausgebildet sein, die den Analyten oder/und Marker enthalten und die bei korrekter Durchführung des Verfahrens als positive Kontrolle dienen. Die Referenzfelder können zudem zur Kalibrierung und zur Quantifizierung der Messungen herangezogen werden. Im Bereich der Nachweisfelder kann sich eine verminderte Haftung der Reflexionsschicht einstellen, wenn diese unmittelbar auf die darunterliegende molekularbiologische oder biochemische Ebene aufgebracht wird. In diesem Fall kann es günstig sein, nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern zunächst eine Deckschicht aus einem optisch transparenten Material auf die Nachweisfelder aufzubringen, bevor die Reflexionsschicht aufgebracht wird. Die Deckschicht kann auch zur Fixierung der Reagenzien in den Nachweisfeldern dienen. Das Material und die Dicke der Deckschicht wird man so aufeinander abstimmen, daß eine Beeinflussung der optischen Eigenschaften des Sensors durch die Deckschicht, etwa durch Fokussierungs- oder Absorptionseffekte, nicht oder zumindest in beherrschbarer Weise erfolgt. Ein Material auf Polymerbasis hat sich für die Deckschicht als geeignet gezeigt. Sie kann z. B. als Folie oder mittels eines Sprühverfahrens aufgebracht werden. Sofern der Sensor auch Vertiefungen in Datenfeldern aufweist, wird man sicherstellen müssen, daß die Vertiefungen nicht durch das Material der Deckschicht wieder aufgefüllt werden, um einen Verlust der durch die Vertiefungen repräsentierten Dateninformationen zu vermeiden. Sprühverfahren sind zur lokalen Aufbringung der Deckschicht denkbar. Vorstellbar ist es auch, die Ober- fläche der Substratscheibe gedanklich in Segmente, etwa Kreissektoren, aufzuteilen, von denen ein Teil ausschließlich für Nachweisfelder und ein anderer Teil ausschließlich für Datenfelder reserviert wird. Die Segmente mit Datenfeldern können dann sehr leicht von der Deckschicht freigehalten werden.
Das Substrat mit den darauf immobilisierten Bindern kann als handelbare Einheit verpackt und an Anwender verschickt werden. Denkbar ist es, daß der Hersteller einen kundenspezifischen Satz von Bindern zusammenstellt und auf das Substrat aufbringt. Vorstellbar ist auch, kundenunspezifisch, aber applikationsspezifisch, beispielsweise für bestimmte Genanalysen, einen Satz von Bindern auf ein Substrat aufzubringen und dieses als vorbereiteten Meßträger anzubieten. Es empfiehlt sich, diesen Meßträger zu trocknen, bevor er verpackt und verschickt wird. Die zu untersuchende Meßprobe wird dann vom Anwender, also vom Käufer des Meßträgers, aufgebracht. Gleiches kann auch für markerenthaltende Reagenzien gelten. Die Aufbringung der Reflexionsschicht und ggf. der Deckschicht nach Abschluß des molekularbiologischen bzw. biochemischen Nachweisverfahrens, das auch Waschschritte umfassen kann, kann beim Anwender erfolgen, sofern diesem hierfür geeignete Geräte zur Verfügung stehen. Denkbar ist auch, daß der Anwender den analytbehafteten Meßträger zum Hersteller oder zu einem anderen Labor zurücksendet, wo diese Schichten aufgebracht werden.
Auf der Reflexionsschicht kann noch eine Schutzschicht flächig aufgebracht werden, wobei sich wegen seiner Schlag- und Kratzfestigkeit ein Material auf Acrylbasis eignet. Der so geschützte Meßträger kann über lange Zeiträume hinweg aufbewahrt werden und jederzeit wieder ausgelesen werden.
Die Erfindung betrifft ferner einen Meßträger zum Nachweis von Analyten in einer Meßprobe, der sich insbesondere zur Durchführung des vorstehend erläuterten Verfahrens eignet.
Nach einem anderen Aspekt geht die Erfindung zur Lösung der eingangs gestellten Aufgabe von einem Verfahren zum Nachweis von Analyten in einer Meßprobe aus, bei dem auf einem scheibenförmigen Substrat auf mindestens einer seiner Flachseiten analytspezifische Binder in einer Vielzahl von Nachweisfeldern immobilisiert werden, sodann die Meßprobe in Kontakt mit den Nachweisfeldern gebracht wird und anschließend das Vorhandensein oder/und die Menge der nachzuweisenden Analyten durch Auswertung der Nachweisfelder ermittelt wird. Erfindungsgemäß ist hierbei vorgesehen, daß die Nachweisfelder magnetisch ausgewertet werden und hierzu Binder oder die nachzuweisenden Analyten mit magnetischen oder/und magneti- sierbaren Markern markiert werden und daß die Nachweisfelder längs einer Vielzahl konzentrischer Kreislinien oder/und längs mindestens einer Spirallinie verteilt auf dem Substrat angeordnet werden.
Die kreis- oder spiralförmige Verteilung der Nachweisfelder auf dem Substrat ermöglicht die Verwendung marktgängiger Magnetplatten-Lesegeräte, sogenannter Hard-Disc-Laufwerke. Gegebenenfalls wird eine softwaremäßige Adaption der Laufwerkssteuerung notwendig sein. Die magnetische Auslesung der Nachweisfelder ermöglich es sogar, auf beiden Flachseiten des Substrats Nachweisfeider auszubilden, so daß sich die Packungsdichte der Sensoren mit Nachweisfeldern weiter erhöhen läßt. Hinsichtlich der gegenseitigen Abstände, der Größe und der Anordnung der Nachweisfelder sowie etwaiger Daten- und Referenzfelder auf dem Substrat treffen im wesentlichen die Angaben zu, die zuvor für den optisch auslesbaren Sensor gemacht wurden.
Um zu verhindern, daß die Marker durch Kontakt mit einem Lesekopf des Auswertegeräts vom Substrat weggerissen werden, kann nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern eine Fixierschicht auf die Nachweisfelder aufgebracht werden. Diese wird man zweckmäßigerweise flächig auf jede Nachweisfelder tragende Flachseite des Substrats aufbringen. Für die Fixierschicht hat sich ein Material auf Polymerbasis als geeignet erwiesen.
Darüber hinaus kann vor der Ausbildung der Nachweisfelder oder nach Inkontaktbringung der Meßprobe mitden Nachweisfeldern eine magnetische oder/und magnetisierbare Partikel enthaltende Magnetschicht flächig auf jede Nachweisfeldertragende Flachseite des Substrats aufgebracht werden. Die Magnetschicht ermöglicht es, zusätzlich Daten in den Sensor einzuschreiben, die zusammen mit den Nachweisfeldern ausgelesen werden können. Die magnetischen Eigenschaften der Magnetschicht wird man so wählen, daß die durch die Marker hervorgerufenen lokalen Schwankungen der magnetischen Feldstärke oder der magnetischen Flußdichte nicht infolge der Magnetschicht "verschwimmen" und undetektierbar werden. Zwar ist es grundsätzlich denkbar, daß die Magnetschicht unterhalb der molekularbiologischen oder biochemischen Schicht des Sensors unmittelbar auf das Substrat aufgebracht wird. Zweckmäßig ist es jedoch, sie erst nach Abschluß der molekularbiologischen oder biochemischen Verfahrensschritte aufzubringen, da sie so zugleich als Fixierschicht dienen kann.
Die Erfindung betrifft ferner ein Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach dem vorstehend beschriebenen ersten oder zweiten Aspekt. Das Testkit umfaßt dabei einen mit immobilisierten Bindern vorbereiteten Meßträger, Reagenzien zur Durchführung des Nachweisverfahrens, insbesondere optisch oder/und magnetisch detektierbare Nachweisreagenzien, sowie ggf. Wasch- oder/und Pufferlösungen. Der Meßträger liegt bevorzugt in getrockneter Form vor.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung eines Meßträgers der vorstehend beschriebenen Art in einem Immunoassay oder/und Nukleinsäu- rehybridisierungsassay oder/und Lektin-Zucker-Assay oder/und Protein- Nukleinsäure-Assay.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es stellen dar:
Fig. 1 eine schematische Schnittdarstellung eines erfindungsgemäßen molekularbiologischen oder biochemischen Sensors ("Biosensor") mit Nachweis- und Datenfeldern und
Fig. 2 schematisch die Verteilung der Nachweis- und Datenfelder auf dem Biosensor.
In Fig. 1 , die die realen Größenverhältnisse nicht getreu wiedergibt, ist der Biosensor allgemein mit 1 bezeichnet. Er besitzt die Form einer Kreisscheibe. Seine Größe entspricht zweckmäßigerweise der einer herkömmlichen Compact Disc, deren Durchmesser üblicherweise etwa 1 2 cm beträgt. Der Biosensor 1 umfaßt ein Trägersubstrat 3, das aus einem optisch transparenten Material, vorzugsweise Polycarbonat, gefertigt ist. Auf der in Fig. 1 oberen Flachseite des Substrats 3 sind Nachweisfelder 5, 7 sowie Datenfelder 9 ausgebildet. In den Datenfeldern 9 sind Informationen über die Meßprobe oder/und über die Nachweisfelder oder/und über die Auswertung niedergelegt. Wie bei herkömmlichen CDs sind die Informationen in den Datenfeldern 9 durch abwechselnde vertiefte Bereiche 1 1 und nicht vertiefte Bereiche 1 3 des Substrats 3 repräsentiert.
In den Nachweisfeldern 5, 7 sind analytspezifische Binder bzw. Rezeptoren immobilisiert. Diese Binder sind in Fig. 1 schematisch durch kurze Striche 1 5 symbolisiert. Jedes Nachweisfeld 5, 7 trägt eine Vielzahl von Bindern 1 5 gleichen oder unterschiedlichen Typs. Das Nachweisfeld 7 repräsentiert in Fig. 1 ein Nachweisfeld, an dem nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern 5, 7 keine Analyten haftengeblieben sind. Dagegen repräsentiert das Nachweisfeld 5 ein Nachweisfeld, an dem Analyten haftengeblieben sind. Diese Analyten sind in Fig. 1 schematisch durch kleine Kreise 1 7 dargestellt, die zugleich die Marker symbolisieren, anhand deren die optische Detektion des Vorhandenseins der Analyten möglich ist.
Die Nachweisfelder 5, 7 sind in eine Deckschicht 1 9 eingebettet, die nur in den die Nachweisfelder 5, 7 tragenden Bereichen des Substrats 3 aufgebracht ist, nicht jedoch in den die Datenfelder 9 tragenden Bereichen des Substrats 3. Die Deckschicht 1 9 besteht ebenfalls aus einem optisch transparenten Material, vorzugsweise einem Polymermaterial. Sie fixiert die Marker auf dem Substrat 3 und dient zugleich als Haftvermittler zwischen dem Substrat 3 und einer Reflexionsschicht 21 , die flächig auf das Substrat 3 aufgebracht ist, über sämtliche Nachweisfelder 5, 7 und sämtliche Datenfelder 9 hinwegreicht und in die Vertiefungen 1 1 der Datenfelder 9 hineinreicht. Die Reflexionsschicht 21 besteht vorzugsweise aus Aluminium, kann aber beispielsweise auch aus Silber bestehen und wird zweckmäßiger- weise durch chemisches Aufdampfen erzeugt. Die Reflexionsschicht 21 dient als Reflektor für das Licht eines Laserstrahls 23, der von der Unterseite des Substrats 3 her zur Auslesung der Nachweisfelder 5, 7 und der Datenfelder 9 auf den Biosensor 1 gerichtet wird. Das reflektierte Licht wird mittels gängiger Methoden ausgewertet. Beispielsweise wird es mittels eines Polarisationsfilters von dem eingestrahlten Licht getrennt und sodann auf seine Intensität hin ausgewertet. Das Material des Substrats 3 hat vorteilhafterweise einen solchen Brechungsindex, daßder Laserstrahl 23 auf seinem Hinweg im Substrat 3 fokussiert wird, so daß der letztlich auf die Nachweisfelder 5, 7 und die Datenfelder 9 einfallende Lichtfleck sehr klein gehalten werden kann.
Zur Oberseite hin ist der Biosensor 1 durch eine flächig aufgebrachte Deckschicht 25 abgeschlossen, die den Biosensor 1 vor schädlichen chemischen oder mechanischen Einflüssen schützt. Vorzugsweise besteht sie aus einem Acrylmaterial.
Die Nachweisfelder 5, 7 und die Datenfelder 9 sind in abwechselnder Reihenfolge längs einer Spirallinie auf dem Substrat 3 angeordnet. Fig. 2 zeigt einen Ausschnitt zweier aufeinanderfolgender Windungen der Spirallinie. Letztere ist in Fig. 2 als gestrichelte Linie dargestellt und mit 27 bezeichnet. Mit d ist ferner der radiale Abstand zwischen den beiden Windungen, also die Spiralsteigung, bezeichnet. Er beträgt beispielsweise etwa 1 ,6 μm. Die Vertiefungen 1 1 , die bei Anwendung der für CDs, insbesondere CD-ROMs, gängigen Codierung abgestuft variable Umfangs- länge besitzen können, sind beispielsweise etwa 0,5 μm in radialer Richtung breit. Um radiale Überlappungen mit den Nachweis- oder Datenfeldern benachbarter Spiraiwindungen zu vermeiden, sind die Nachweisfelder 5, 7 ebenfalls radial so schmal ausgebildet, daß ein hinreichender Abstand zu den Feldern der benachbarten Spiralwindungen besteht. Insbesondere können die Nachweisfelder 5, 7 gleichfalls etwa 0,5 μm breit sein. Bei derartiger Bemessung kann ohne weiteres auch das "Ausfransen" in Kauf genommen werden, das bei enzymatischem Nachweis der in den Nachweisfeldern 5 anhaftenden Analyten häufig zu beobachten ist. In Umfangs- richtung können die Nachweisfelder 5, 7 länglich sein, so daß sie mit einer hinreichend großen Gesamtfläche ausgebildet werden können. Auch in Umfangrichtung werden die Nachweisfelder 5, 7 hinreichenden Abstand voneinander und von den Datenfeldern 9 aufweisen.
Die vorstehenden Maßangaben empfehlen sich insbesondere, wenn zur
Auslesung der Daten- und Nachweisfelder CD-Laufwerke mit einem Fleckdurchmesser des Laserstrahls 23 von etwa 2 μm verwendet werden.
Nachfolgend werden noch einige molekularbiologische oder biochemische Anwendungsbeispiele der Erfindung erläutert.
Beispiel 1
Anwendungen
Die Anwendungen können gemäß der Natur des immobilisierten Bindepartners (A), des analytspezifischen Binders, und der Natur seines "Liganden", d. h. des Analyten (B), klassifiziert werden. Als Wechselwirkungspartner werden bevorzugt Nukleinsäuren und/oder Proteine verwendet, es können jedoch auch andere Partner von spezifischen Bindepaaren, wie etwa Lektine oder Zucker eingesetzt werden.
Bevorzugt werden die Rezeptoren bzw. Analyte, insbesondere Proteine und Nukleinsäuren, mit einer Biotingruppe derivatisiert, wobei die Biotingruppe dann vorteilhaft mit einem Streptavidin-Enzymconjugat, wie etwa Meerret- tichperoxidase, nachgewiesen wird. Das Substrat der Enzymreaktion wird derart ausgewählt, daß sich an der Stelle der molekularen Wechselwirkung ein intensives, dunkles Prezipitat bildet, das den Detektionslaser quentscht. Daneben kann der Nachweis auch durch direkte Derivatisierung eines Wechselwirkungspartners mit einem Fluorochrom in Kombination mit einem geeigneten Laser erfolgen. Beispiel 1 . 1
Der Rezeptor (A) ist ein RNA-Aptamer, ein Peptid oder ein natürliches oder synthetisches Effektormolekül und der Analyt (B) ist ein Protein.
Die Eigenschaften eines Enzyms oder Regulationsfaktors bei der Genexpression werden häufig durch die Assoziation kleiner Effektor- oder Ligandmoleküle moduliert. Ein Beispiel sind Hormonrezeptoren, die nach Bindung an das Hormon in eine aktive Konformation überführt werden. Die Proteinfunktion kann durch Wechselwirkung eines Substratanalogons oder durch allosterische Effektoren moduliert werden. Um geeignete kleine Chemikalien zu identifizieren, werden Screening-Verfahren für Liganden durchgeführt, wobei eine große Anzahl an verschiedenen Chemikalien untersucht wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, chemische Bibliotheken durchzutesten. Dabei wird eine Vielzahl von verschiedenen kleinen Chemikalien in einer definierten Ordnung auf dem Meßträger immobilisiert, wobei das fragliche Protein unter verschiedenen Stringentbedingungen damit in Kontakt gebracht wird. Gebundenes Protein wird, wenn es mit einem geeigneten Fluorochrom, beispielsweise einem Latexpartikel, markiert ist, direkt nachgewiesen oder indirekt unter Verwendung einer Enzym- amplifikationskaskade. In entsprechender weise können große Bibliotheken von RNA-Aptameren oder Peptiden gescreent werden, entweder isoliert oder in ein Fusionsprotein eingebunden, hinsichtlich Wechselwirkungen mit einem in Frage stehenden Protein.
Beispiel 1 .2
Der Rezeptor (A) ist ein Protein und der Analyt (B) ist eine Nukleinsäure oder ein Ligant.
Proteinbibliotheken können hinsichtlich bestimmter Bindeeigenschaften, z. B. der Wechselwirkung mit einer definierten DNA-Sequenz gescreent werden. Vervielfältigte Meßträger, die definierte Bereiche von Proteinen enthalten, die zusammen die Produkte einer cDNA-Expressionsbibliothek darstellen, können mit spezifischen Liganten oder DNA-Bindestellen charakterisiert werden. Die angeordneten Proteine können so, wie sie in der Bibliothek sind, unbekannt sein und erst durch das erfindungsgemäße Verfahren zugeordnet werden. Alternativ können Bereiche von bekannten Proteinen oder Derivate eines definierten Proteins, wie etwa das Produkt einer zufälligen Mutagenese, untersucht werden.
Beispiel 1 .3
Der Rezeptor (A) ist eine DNA oder RNA und der Analyt (B) ist ein Protein.
Eine große Anzahl von verschiedenen doppelsträngigen DNA-Fragmenten kann auf den Nachweisfeldern aufgebracht werden. Dabei kann es sich entweder um kleine Fragmente, beispielsweise um Oligonukleotide oder um größere DNA-Fragmente bis zu sehr großen DNA-Abschnitten handeln, die eine geordnete Bibliothek von genomischen DNA-Fragmenten darstellen. Die Anwendungen umfassen die systematische Suche nach möglichen genomischen Bindestellen für DNA-Bindeproteine, aber auch andere DNA- Bindemoleküle können nachgewiesen werden, wie etwa Interkalatoren, kleine Moleküle mit Bevorzugung bestimmter Sequenzen, PNAs und Sequenzen, die eine Trippelhelix bilden. Ebenso können als Rezeptormoleküle in den Nachweisfeldern RNA-Moleküle aufgebracht werden, wie etwa die Transskripte einer cDNA-Bibliothek oder die Derivate einer definierten RNA, wie etwa das Produkt einer zufälligen Mutagenese.
Beispiel 2 Nukleinsäureuntersuchungen
Der Rezeptor (A) ist eine einzelsträngige DNA und der Analyt (B) ist eine einzelsträngige DNA oder RNA. Beispiel 2.1
DNA-Kartierung
Es ist inzwischen möglich, ganze Genome zu sequenzieren und die Genome von höheren Eukarionten, wie etwa Menschen, Mäusen und Fliegen, werden kartiert und durch geordnete Klone (wie etwa P1 -Phagenklone) abgedeckt, wobei davon ausgegangen wird, daß die Sequenzen aller Genome in absehbarer Zeit erhältlich sind. Hier können erfindungsgemäße Meßträger hergestellt werden, die ganze Genome in geordneten Arrays oder Bereichen enthalten. Damit ist es möglich, ein kloniertes Stück DNA in einem einzigen Hybridisierungsschritt seiner genomischen Lokalisierung zuzuordnen und abhängig von der Auflösung des Arrays (welche eine Funktion der mittleren Sequenzlänge und der Zahl an einzelnen DNA-Molekülen ist) sogar das Gen selbst zu identifizieren. Ein Beispiel einer solchen Anwendung sind die P1 - Arrays von Genome Systems, welche bisher schlecht zu screenen sind, da sie nur auf Membranen erhältlich sind. Ein Aufbringen dieser P1 -Arrays auf den erfindungsgemäßen Meßträgern ermöglicht eine einfache und unkomplizierte Anwendung. Translokationen und andere genomische Umordnungen, die häufige Ursache genetischer Erkrankungen sind, können ebenfalls auf einfache Weise kartiert werden, einschließlich Deletionen des mitochon- drialen Genoms. Darüber hinaus können Insertionen von Transgenen leicht kartiert werden, wenn die insertierte DNA zusammen mit einer kleinen Menge an flankierender genomischer DNA nachgewiesen wird.
Beispiel 2.2 Genidentifizierung und/oder Genklonen
Arrays oder Bereiche von diagnostischen Oligonukleotiden, die alle bekannten Gene einer gegebenen Spezies darstellen, ermöglichen die direkte Identifizierung eines in Frage stehenden Gens. Hierzu können z. B. cDNA- Arrays von Klontech oder die DNA-Chips von Affimetrix, auf denen alle Hefegene aufgetragen sind, durch Übertragung auf die erfindungsgemäßen Meßträger verbessert werden. Beispiel 2.3
Expressions-Profiluntersuchungen
Durch Aufbringen von DNA auf erfindungsgemäße Meßträger, die alle Gene eines Organismus zeigen, kann das Expressionsprofil untersucht werden. Auf den Meßträger wird ein komplexes Gemisch von RNA aufgebracht, die den Expressionszustand einer bestimmten Zelle darstellen oder eine davon abgeleitete cDNA-Population. Der auf dem Meßträger festgestellte Expressionszustand kann leicht mit dem Expressionszustand anderer Zellen verglichen werden, die von anderen Gewebe stammen, andere Entwick- lungsstadien oder andere Stoffwechselstadien darstellen. Alternativ können DNA-Proben untersucht werden, die bestimmte ausgewählte DNA-Zustände darstellen, wie etwa Zellzyklusgene, Signalübermittlerkomponenten usw. Da die erfindungsgemäßen Meßträger über lange Zeit gelagert werden können, können Expressionsprofile erstellt werden, die archiviert und zu Vergleichs- zwecken herangezogen werden können.
Beispiel 2.4
Molekulare Diagnose von DNA-Polymorphismen
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Diagnose von üblichen und seltenen DNA-Polymorphismen verwendet werden, einschließlich der Kartierung von Mutationen in Proto-Onkogenen, die übliche Tumore hervorrufen. Ein geeigneter Meßträger enthält überlagernde Oligonukleotide, die zusammen ein gesamtes Gen (z. B. die Wildtypsequenz) umfassen, zusammen mit Oligonukleotiden, die alle möglichen oder häufig auftretende Mutationen dieser Sequenz enthalten. Das entsprechende DNA-Fragment wird von Patienten durch PCR isoliert und an den relevanten Gen-Meßträger unter Bedingungen hybridisiert, unter denen die Hybridisierung nur bei einer perfekten Sequenzübereinstimmung stattfindet. Ein Vergleich der Hybridisierung der experimentellen DNA an Wildtyp- bzw. Mutantoligonukleotide ermöglicht es, exakt festzustellen, welche Art von Mutation in einer Sequenz auftritt. Beispiel 3
Neben den oben beschriebenen Anwendungen, bei denen ein einfacher Bindevorgang nachgewiesen wird, der Signale ergibt, die ggf. durch eine Enzymkaskade verstärkt werden können, um die Sensitivität der Detektion zu erhöhen, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Anwendungen verwendet werden, die umfangreichere Behandlungen des Meßträgers erfordern, wie etwa eine PCR-Amplifizierung, die analog zu in situ PCR- Amplifikationen durchgeführt wird. Auf diese Weise können auch infizierende Mittel nachgewiesen werden.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zum Nachweis von Analyten in einer Meßprobe, bei dem auf einem scheibenförmigen Substrat (3) auf einer seiner Flachseiten analytspezifische Binder ( 1 5) in einer Vielzahl von Nachweisfeldern (5, 7) immobilisiert werden, sodann die Meßprobe in Kontakt mit den Nachweisfeldern (5, 7) gebracht wird und anschließend das Vorhandensein oder/und die Menge der nachzuweisenden Analyten ( 1 7) durch optische Auswertung der Nachweisfelder (5, 7) ermittelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus einem optisch transparenten Material gefertigtes Substrat (3) verwendet wird, daß die Nachweisfelder (5, 7) längs mindestens einer Spirallinie (27) oder/und längs einer Vielzahl konzentrischer Kreislinien verteilt auf dem Substrat (3) angeordnet werden und daß nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern (5, 7) ein optischer Reflektor (21 ) der die Nachweisfelder (5, 7) tragenden Flachseite des Substrats (3) benachbart angeordnet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Reflektor von einer Reflexionsschicht (21 ) gebildet wird, welche auf das Substrat (3) über den Nachweisfeldern (5, 7) aufgebracht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reflexionsschicht (21 ) aus Aluminium gebildet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Reflektor im Abstand von dem
Substrat angeordnet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß bezogen auf die Scheibenachse radial benachbarte Nachweisfelder (5, 7) mit radialem Abstand voneinander angeordnet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß entlang der Spirallinie (27) bzw. einer Kreislinie einander benachbarte Nachweisfelder (5, 7) mit Abstand voneinander angeordnet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß auf der die Nachweisfelder (5, 7) tragenden Flachseite des Substrats (3) entlang der Spirallinie (27) bzw. mindestens einer Kreislinie zusätzlich Datenfelder (9) ausgebil- det werden, welche meßprobenbezogene oder/und nachweisfeldbezo- gene oder/und auswertungsbezogene Informationen enthalten.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Nachweisfelder (5, 7) und Datenfelder (9) abwechselnd entlang der Spirallinie (27) bzw. mindestens einer
Kreislinie angeordnet werden.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Nachweisfelder und Datenfelder jeweils auf gesonderten Kreislinien ausgebildet werden.
1 0. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bildung der Datenfelder (9) Vertiefungen ( 1 1 ) in die die Nachweisfelder (5, 7) tragende Flachseite des Substrats (3) eingebracht werden und daß der Reflektor (21 ) so angebracht wird, daß er in die Vertiefungen (1 1 ) hineinreicht.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bildung der Datenfelder eine einfallendes Leselicht beeinflussende Substanz auf die die Nachweisfelder tragende Flachseite des Substrats aufgebracht wird.
1 2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß auf der die Nachweisfelder (5, 7) tragenden Flachseite des Substrats (3) entlang der Spirallinie (27) bzw. mindestens einer Kreislinie zusätzlich mindestens ein Referenz- feld ausgebildet wird, dessen optische Eigenschaften als Referenz bei der Auswertung der Nachweisfelder (5, 7) verwendet werden.
1 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern (5, 7), unterhalb des Reflektors eine
Deckschicht ( 1 9) aus einem optisch transparenten Material auf die Nachweisfelder (5, 7) aufgebracht wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß für die Deckschicht ( 1 9) ein Material auf Polymerbasis verwendet wird.
1 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Substrat (3) aus Polycarbonat verwendet wird.
1 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat (3) an einem Herstellungsort mit den Bindern ( 1 5) versehen, getrocknet und verpackt wird und daß das so präparierte Substrat (3) sodann zu einem von dem
Herstellungsort entfernten Anwendungsort gebracht wird, an dem die Meßprobe von einem Anwender in Kontakt mit den Nachweisfeldern (5, 7) gebracht wird.
1 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Analyten durch eine
Detektion einer Änderung der optischen Eigenschaften der Nachweisfelder erfolgt.
1 8. Verfahren nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Änderung der Nachweisfelder durch Isotope, Enzyme, Fluorochrome, Farbstoffe, Metallkolloide oder/und Beads herbeigeführt wird.
1 9. Verfahren nach Anspruch 1 8, dadurch gekennzeichnet, daß Latex-Beads, Kunststoff-Beads, Glas-
Beads oder/und Metall-Beads verwendet werden.
20. Meßträger zum Nachweis von Analyten in einer Meßprobe, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 1 9, gekennzeichnet durch ein scheibenförmiges, aus einem optisch transparenten Material gefertigtes Substrat (3), auf dem auf einer seiner Flachseiten analytspezifische Binder ( 1 5) in einer Vielzahl von Nachweisfeldern (5, 7) immobilisiert sind, wobei die Nachweisfelder (5, 7) längs mindestens einer Spirallinie (27) oder/und einer Vielzahl konzentrischer Kreislinien verteilt auf dem Substrat (3) angeordnet sind.
21 . Meßträger nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß über den Nachweisfeldern (5, 7) eine nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern (5, 7) flächig auf das Substrat (3) aufgebrachte Reflexionsschicht (21 ) angeordnet ist.
22. Meßträger nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß auf der Reflexionsschicht (21 ) eine
Schutzschicht (25) flächig aufgebracht ist.
23. Meßträger nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzschicht (25) aus einem Material auf Acrylbasis gefertigt ist.
24. Meßträger nach Anspruch 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß er als Handelseinheit verpackt ist.
25. Meßträger nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß er getrocknet verpackt ist.
26. Verfahren zum Nachweis von Analyten in einer Meßprobe, bei dem auf einem scheibenförmigen Substrat auf mindestens einer seiner Flachseiten analytspezifische Binder in einer Vielzahl von Nachweisfeldern immobilisiert werden, sodann die Meßprobe in Kontakt mit den Nachweisfeldern gebracht wird und anschließend das Vorhandensein oder/und die Menge der nachzuweisenden Analyten durch Auswertung der Nachweisfelder ermittelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisfelder magnetisch ausgewertet werden und hierzu Binder oder die nachzuweisenden Analyten mit magnetischen oder/und magnetisierbaren Markern markiert werden und daß die Nachweisfelder längs einer Vielzahl konzentrischer Kreislinien oder/und längs mindestens einer Spirallinie verteilt auf dem Substrat angeordnet werden, gewünschtenfalls in
Verbindung mit weiteren Merkmalen mindestens einer der Ansprüche 1 bis 25.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern eine Fixierschicht auf die Nachweisfelder aufgebracht wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierschicht flächig auf jede Nachweisfelder tragende Flachseite des Substrats aufgebracht wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß für die Fixierschicht ein Material auf Polymerbasis verwendet wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Ausbildung der Nachweisfelder oder nach Inkontaktbringung der Meßprobe mit den Nachweisfeldern eine magnetische oder/und magnetisierbare Partikel enthaltende Magnetschicht flächig auf jede Nachweisfelder tragende Flachseite des Substrats aufgebracht wird.
31 . Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 1 9 und 26 bis 30, umfassend a) einen mit immobilisierten Bindern ( 1 5) vorbereiteten Meßträger (3), b) Reagenzien zur Durchführung des Nachweisverfahrens, insbesondere optisch oder/und magnetisch detektierbare Nachweisreagenzien, und c) ggf. Wasch- oder/und Pufferlösungen.
32. Testkit nach Anpruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß der Meßträger (3) in getrockneter Form vorliegt.
3. Verwendung eines Meßträgers nach einem der Ansprüche 20 bis 25 in einem Immunoassay oder/und Nukleinsäurehybridisierungsassay oder/und Lektin-Zucker-Assay oder/und Protein-Nukleinsäureassay.
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