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Die Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Messprinzip zum Aufbau von Biochips, Teststicks,
Sensoren und Sensorarrays. Die Technologie beruht auf einem neuartigen clusteroptischen
Sensoraufbau unter Verwendung von leitfähigen zumeist metallischen Nanoclustem, mit wel- chem alle Moleküle mittels eines rekognitiven Bindungssystems mit einer Dissoziationskonstante kleiner 10-1 (zumeist 10-5 bis 10-11) insbesondere Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA oder artifizielle Analoga), Proteine, Peptide, Biotin, Avidin, DIG und Pharmaka in besonders einfacher und reproduzierbarer Weise erfasst werden können.
Das neuartige Prinzip nutzt dabei einige Elemente der bereits erteilten bzw. in Erteilung stehenden (letter of allowance) US Patente US 05611998 "Optochemical sensor and method for production" und US 09/403.488 "Reinforced cluster optical sensors" und analoger bzw. korrespondierender europäischer Patente.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht den Aufbau eines Sensors, Arrays oder Teststicks der ein optisches Messsignal liefert und dabei keine Markierung der Reagenzien oder des Analyten (mit einem Label) mit gelösten Reagenzien (mit Ausnahme von Wasser und falls erforderlich Chemikalien zur Stabilisierung von biologischen Komponenten) benötigt.
Nahezu alle etablierten Testsysteme benötigen entweder: 1. ) ein Bindungssystem und einen Label (zumeist am Analyten) oder 2. ) zwei Bindungssysteme (Sandwich-Assay) wobei zumindest eine der beiden Komponenten markiert (Enzym, Fluorophor o.ä.) ist.
Im ersten Fall ist es nötigt, den Analyten mit einem Label (z. B. Fluorophor, Enzym,..) zu versehen. Dies implementiert einen Zeitaufwand und Kosten und kann oft nicht vor Ort und von ungeübtem Personal durchgeführt werden. Der markierte Analyt wird dabei mit dem Analysesystem in Kontakt gebracht (Biochip, Mikrotiterplatte, Teststick, ..) und nach der Bindung entweder über Fluoreszenz (teures Equipment) oder (bio) chemisch unter Zusatz von gelösten Reagenzien zumeist optisch ausgewertet.
Der zweite Aufbau benötigt keine Markierung des Analyten jedoch den Einsatz von zwei Bindungssystemen. Dies ist teuer und benötigt zwei zeitaufwendige Inkubationsschritte. Der Nachweis erfolgt wieder zumeist über Enzyme (ELISA) oder Fluoreszenz bzw. über verwandte Systeme wie z.B. Chemolumineszenz. Ein Analyt wird dabei z. B. durch einen Antikörper erkannt, welcher seinerseits mit einem hoch aktiven Enzym gekoppelt ist. Die enzymatische Reaktion induziert sodann eine deutliche lokale Farbänderung die ausgewertet wird.
Eine weitere Gruppe von Instrumenten misst die Bindung einer Komponente an eine Oberfläche mit Hilfe eines Bindungssystems (DNA, Antikörper, Rezeptor, Lektin,..) indem die Änderung eines optischen Parameters verfolgt wird. Insbesondere die Messung der Änderung der Brechungsindices (SURFACE PLASMON RESONANCE, SPR) hat in den letzten Jahren weit reichende Anwendung erfahren. Dabei wird der resonante Reflexionswinkel eines Lichtstrahl an einer Oberflächen-Plasmonwelle durch die Bindung von Molekülen mit abweichendem Brechnungsindex verändert.
Die Bindung des Analyten erfolgt durch Beschichtungen des Messchips mit einem Bindungssystem (Protein, DNA,..) SPR-Systeme benötigen eine komplexe Optik und können nur in reinen Lösungen eingesetzt werden, da jede Bindung an die Oberfläche das Signal verändert und damit unspezifische Bindungen das gleiche Signal wie der Analyt geben.
Alle genannten System weisen daher systembedingt eine der genannten Limitationen auf, da sie entweder: * chemische Reaktionsschritte und damit Reagenzien (Markierung, enzymatische Reaktion) benötigen und/oder . einen aufwendigen und teuren Messaufbau erfordern (SPR, Fluoreszenzscanner) und/oder
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* 2 zeitaufwendige Diffusionsschritte (Analyte and Bindungssystem 1 und dann Bindungssystem 2) benötigen.
Im Folgenden wird das neuartiges Analysesystem beschrieben, das die genannten Nachteile nicht aufweist: 1. ) Das neuartige erfindungsgemässe Messsystem ermöglicht die Generierung eines optischen visuellen und mit einer Kamera auswertbaren Messsignals.
2. ) Das Signal entsteht durch die Resonanzverstärkung der Cluster bzw. Kolloide mit einer reflektierenden Oberfläche, wobei die Cluster am Chip oder nahe dem Chip gebunden sind und damit keine Diffusion der Cluster bzw. eine sehr kurze Diffusionsstrecke nur über wenige Mikrometer nötigt ist.
3. ) Essentiell und erfindüngsgemäss liegt eine Schicht von nicht permanent gebundenen Clustern (Nanopartikeln, Kolloiden o.ä.) vor, die entweder bereits nahe der Oberfläche oder auf einer zweiten Oberfläche (Kunststofffolie, Gelfilm o.ä.) nicht permanent gebunden ist.
4. ) Es werden vorzugsweise ein oder mehrere Bindungssysteme für den Analyten auf die Oberfläche des Chips homogen oder als Array gebunden.
5. ) Das zweite Bindungssystem wird auf die Nanocluster (Kolloide, Partikel) gebunden, welche ihrerseits auf einer zweiten Schicht (8) und oder Oberfläche des Films (11 ) reversibel gebunden sind.
6. ) Eine oder beide mit rekognitiven Molekülen (6) beschichteten Oberflächen (8; 11) werden sodann mit einem Analyt (7) in Kontakt gebracht, wobei der Analyt (7) an einen Teil der rekognitiven Moleküle (6) bindet.
7. ) Sodann wird die Oberfläche des Films (11) mit der Oberfläche der Abstandschicht (3) entweder direkt in Kontakt gebracht und dabei die bindungsfähigen Cluster auf die Oberfläche der Abstandschicht (3) transferiert oder die Cluster werden von Oberfläche des Films (11) unmittelbar über der Oberfläche der Abstandschicht (3) abgelöst, sodass sie in idealer räumlicher Verteilung wenige Mikrometer bis zu rekognitiven System (5) auf Oberfläche der Abstandsschicht (3) diffundieren.
8. ) Die nicht benötigten Cluster verbleiben entweder auf der Oberfläche (11), werden abgewaschen oder verbleiben in einem Abstand, dessen Resonanzfarbe eine andere ist als jene des Chips (siehe bereits zitierte Patente).
9. ) Der aussergewöhnliche Vorteil diese Messsystems ist der Einsatz ohne Label und ohne lösliche Reagenzien.
Der "Nanocluster - Transfer Chip"-Aufbau löst hiermit ein grundlegendes Problem des in der Anmeldung EP00979408: "Reinforced cluster optical sensors" beschrieben Messaufbaus. Um eine sensitive und rasche Farbreaktion zu erhalten, müssen die Nanocluster in sehr hoher Konzentration eingesetzt und/oder lange mit der Oberfläche inkubiert (in Kontakt gebracht) werden. Dabei ist der Assay entweder durch die Diffusionsgeschwindigkeit der Cluster limitiert oder durch die unspezifisch Adsorption bzw. Präzipitation der Cluster. Der neuartige Transferchip bringt die Cluster entweder direkt oder in mikrometemahe Umgebung ihrer Bindungspartner und kann damit grundlegenden Einschränkungen des Aufbaus überwinden.
Der beschriebene Aufbau weist deutliche Vorzüge zu jenem in DE 19927051 A1 beschriebenen Aufbau auf. In DE 19927051 A1 werden zwei Oberflächen, eine mit Clustem und eine ohne Cluster, aneinandergepresst und sodann nicht mehr getrennt, darüber hinaus sind die Cluster fix an die Oberfläche des Films (11 ) gebunden und können nicht übertragen werden.
Erfindungsgemäss sind alle Nanopartikel Partikel mit einem Durchmesser von weniger als 1 um aus einem leitfähigen Material. Nanopartikel werden auch oft Cluster, Nanocluster oder Kolloide genannt. Nanopartikel-Filme auf Oberflächen stellen eine Mehrzahl von Nanopartikeln dar die auf einer Oberfläche abgelagert sind. Oft werden diese Schichten auch Inselschichten oder Inselfilme genannt.
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Der in diesem Patent beschriebene Nanocluster-Transfer-Aufbau ermöglicht einen Transfer von einzelnen Clustern von einer Oberfläche auf eine andere - abhängig von Gleichgewicht der
Interaktionskräfte zwischen beiden Oberflächen. Es wird dabei nur durch jene Cluster ein opti- sche Messsignal erzeugt, die von Oberfläche (11) auf die Oberfläche der Abstandsschicht (3) übertragen wurden und dort im Resonanzabstand zum Spiegel (2) gebunden wurden. Insbe- sondere die gezielte Wahl der (bio)rekognitiven Interaktionskonstanten auf beiden Oberfläche kann wenn nötig, eine spezifische Diskriminierung des unspezifischen Adsorptionshintergrun- des bewirken, da nur Cluster mit einer höheren Affinität zur Oberfläche (3 mit 5 belegt) die
Oberfläche (11) verlassen können.
Die durch die Änderung des räumlichen Abstands induzierte räumliche Verschiebung am Sen- sorchip (= Änderung des Abstands Spiegel zu Cluster-Schicht) wird in ein leicht messbares optisches Signal umgewandelt.
Die optische Auslesung erfolgt durch Reflexion von Licht am Sensorchip in der Weise, dass das
Licht die Abstandsschicht zumindest zwei mal durchquert und damit mit der eigenen rücklau- fenden Welle in Resonanz treten kann. Die extrem geringe Schichtdicke zeigt dabei, dass es sich bei diesem Effekt nicht um eine normale Interferenz handelt, da diese bei Schichtdicken weit unter der Wellenlänge keine farbgebende Komponente aufweist. Erfindungsgemäss kann entweder der primäre Abstand der beiden Oberflächen ausserhalb des Resonanzabstandes im Abstand von mehr als 1 um gewählt werden oder bei einem Abstand innerhalb der Resonanz, welcher einen anderen Farbton ergibt als jener nach der Kopplung der Cluster an die Oberfläche 11.
Um einen resonanten Farbton (surface enhanced resonance = SER oder surface enhanced absorption = SEA, beide Namen bezeichnen den gleichen Effekt) zu erhalten, dürfen die Cluster nicht direkt auf die Oberfläche der Abstandsschicht (3) gebunden werden, da sodann die Felder der Nanopartikeln mit dem Nahfeld des Metalls überlappen und damit kein Farbton entsteht. Erst im Abstand von einigen zehn Nanometern beginnt die Zone starker Farbentwicklung die sich bis etwa 500 nm erstreckt. Dabei ist die Farbintensität bei dünnen Schichten grösser, mit steigen Schichtdicke werden die Spektren komplexer und die maximalen ExtinktionsKoeffizienten geringer. Sehr dünne Schichten (bis 100 nm) weisen oft eine grössere spektrale Breite auf, da die Form der Nanocluster die Banden verbreitert, Schichten zwischen 100 und 300 nm zeigen starke Farben bei relativ schmaler Linienbreite.
Der nanometrische Aufbau bewirkt durch eine optische Resonanzverstärkung der Clusterabsorption mit der reflektierenden Oberfläche eine starke Färbung derselben. Dabei ist im Gegensatz zu Pigmentfarben im erfindungsgemässen Aufbau die resultierende Farbe vom Abstand der Metallpartikel zum Spiegel und nicht (! ) von der Eigenfarbe der Partikel abhängig. Ungleich jeder auf Interferenz basierenden Farbgebung tritt dieser Effekt nur an viel dünneren, nanometrischen Schichten auf und zeigt sich nur bei metallartigen Partikeln.
Der Aufbau besteht zumeist aus einer sichtbares und infrarotes Licht spiegelnden Metallschicht auf einem Trägermaterial, einer inerten Abstandsschicht, dem Biointeraktionssystem (aus zumeist 2 oder 3 Komponenten, z. B. 2 Antikörper und der Analyt) und nach Ablauf der Interaktionsreaktion einer Partikel(Cluster)schicht. Um eine klare Farbgebung zu erhalten, wird der Durchmesser der Cluster vorzugsweise kleiner als 40 nm gewählt, für breitbandige und starke Absorption können auch grössere und assymetrische Partikel mit Vorzug eingesetzt werden. Eine Änderung der Belegungsdichte der Partikelschicht im molekularen Massstab oder Änderungen in der räumlichen Anordnung der gebundenen Cluster am Sensor führen zu den charakteristischen Änderungen der optischen Erscheinung der Oberfläche.
Metallische oder metallartige Partikelfilme mit einem mittleren Clusterdurchmesser kleiner als 500 nm (vorzugsweise kleiner als 40 nm, da sehr grosse Partikel mehr streuen als absorbieren) weisen starke schmalbandige Reflexionsminima auf, deren spektrale Lagen extrem empfindlich von der räumlichen Anordnung, insbesondere dem Abstand zu einer elektronenleitenden Oberfläche, abhängen.
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Der Aufbau kann selbst geringste Änderungen der Oberflächenbelegung mit Nanopartikeln (Clustern, Kolloiden) in klar erkennbare Farbänderungen umwandeln, d. h. entweder in eine Extinktionsänderung bei einer bestimmten Wellenlänge, oder in eine spektrale Verschiebung des Absorptionsmaximums.
Im Folgenden soll auf die Bedeutung von neuartigen Messverfahren für die medizinische Analy- tik wie auch DNA-Technologie hingewiesen werden.
Es besteht heute grosser Bedarf an raschen, einfachen und billigen Testverfahren in der medizi- nischen Diagnostik und zur Untersuchung im Umwelt- und Lebensmittelbereich. Dabei werden immer grössere Anforderungen an Empfindlichkeit, Selektivität und Verlässlichkeit gestellt. Seit Jahren ist daher die Suche nach neuen direkten Detektionsmethoden (insbesondere im Bereich POC = point of care) ein zentrales Problem der biomedizinischen und lebensmittelchemischen Forschung. Chemische und biochemische Chips, Arrays, Teststicks und Sensoren können hierzu einen wichtigen Beitrag leisten.
Die Erfindung zielt auch darauf ab ELISA-Technologie im POC-Markt zu verdrängen und durch den neuartigen Sensorchip zu ersetzten. Dabei werden die grundlegenden messtechnische Einschränkungen des ELISAs (viele Inkubationsschritte, Reagenzien,...) in optimaler Weise beseitigt.
Das neuartige Messprinzip kann in verschiedenen Anordnungen realisiert werden. Typische Anordnungen sind in den Abbildungen 1-4 im Detail dargestellt.
Die Figuren 1 bis 4 zeigen unterschiedliche Ausführungsbeispiele: Fig. 1 : zeigt den Chipaufbau mit flexiblem, elastischem Deckfilm Fig. 2 : zeigt den Chipaufbau mit externem Deckfilm Fig. 3 : zeigt den Chipaufbau mit integraler Gelschicht (8) als Clusterträger bzw. Oberfläche und Film (gemäss Anspruch 1) Fig. 4 : zeigt den Chipaufbau mit kompetitivem Assay (= Verdrängungsassay, wobei der Analyt Nanopartikeln (welche mit Analyt-Analoga überzogen sind) von den Bindungsstellen (5) verdrängt.
Figur 5 zeigt typische Spektren die durch konstruktive und/oder destruktive Interferenz von an der Clusterschicht (Schicht von 4) reflektierten und zweimal die Abstandsschicht (3)- durchlaufende und am Spiegel (2) reflektierte Wellen entstehen.
Die mit Bezugszeichen versehenen Teile des erfindungsgemässen Aufbaus sind wie folgt zuzu- ordnen : 1 = Trägermaterial (CHIP, Folie, Substrat aus Metall, Keramik, Glas, biologischem Material oder Kunststoff) 2= selbst-reflektierende (= Oberfläche von 1) oder durch Beschichtung reflektierend- gemachte Oberfläche (Metallspiegel, teilreflektierende Clusterschicht, Phasengrenze,..) 3 = Abstandsschicht = Resonanzschicht 4 = Nanometrische, leitfähige und bevorzugt metallische Cluster 5 = Analyt-rekognitive Moleküle 1 6 = Analyt-rekognitive Moleküle 2 7 = Analyt (nachzuweisende Substanz) 8 = Gel (Analyt-poröse und auflösbare Schicht) 9 = Auflösung der Schicht (8), durch einen Pfeil angedeutet 10 = Entfernung überschüssiger Cluster durch z. B. Waschen, Absaugen, Elektrophorese o.ä.
11 = Film, Oberfläche, z. B. eine Folie, Gelschicht, elastische Membran 12 = Zusammenpressen beider Oberflächen, durch einen Pfeil angedeutet 13 = Auseinanderziehen beider Oberflächen, durch einen Pfeil angedeutet
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14 = Verformung (bevorzugt elastische) einer der beiden Oberflächen
15 = "rekognitive Moleküle 1" bindende Moleküle S1 bis S6 geben die sequenzielle Folge von Chipaufbau (S1,S2,S3) und Analyse (S4,S5,S6) wieder.
In Abbildung 5 ist die sequenzielle Änderung des Reflexionsspektrums bei Änderung des Cluster-Spiegel-Abstandes gegeben (steigende Zahlen geben steigende Schichtdicken wieder, jedoch keine absoluten Eichwerte).
Die metallisch reflektierende oder durch den anormal optischen Effekt (SEA = SER) gefärbte Oberfläche wird erfindungsgemäss durch den Transfer und die (bio)rekognitive Kopplung der Cluster von Oberfläche des Films (11 ) an Oberfläche der Abstandsschicht (3) (nach Zugabe des Analyten (7) ) verändert. Das Messverfahren nutzt dabei die anormale Absorption von ClusterSpiegel-Systemen als hochsensitives optisches Indikatorsystem. Clusterschichten (Kolloidschichten, oft auch Inselfilme genannt) weisen starke schmalbandige Reflexionsminima auf. Der Begriff "anormales Verhalten des Metallinselfilmes" bedeutet eine starke Bandabsorption im sichtbaren Bereich, welche durch die Lokalisierung des Leitungselektronen-Plasmas in den räumlichen Grenzen der nanometrischen Partikel bedingt wird.
Diese räumliche Lokalisierung steht im Gegensatz zu der freien Beweglichkeit der Elektronen in einem makroskopisch ausgedehnten Stück Metall (die freie Bewegbarkeit der Elektronen ist für eine starke unspezifische Reflexion verantwortlich, die man allgemein als metallischen Glanz bezeichnet).
Die spektrale Lage der Absorptionsbande im resonanten System "Cluster + Spiegel" hängt extrem empfindlich von ihrer räumlichen Anordnung, insbesondere dem Abstand zur reflektierenden Oberfläche, ab. Ein metallischer Cluster, der sich in definiertem (nanometrischen!) Abstand zu einer reflektierenden Oberfläche befindet, kann mit seinem Spiegeldipol wechselwirken. Bei entsprechendem Abstand der absorbierenden Schicht zur metallischen Oberfläche haben elektrische Felder, die von einer Oberfläche reflektiert werden, in der absorbierenden Schicht dieselbe Phase, wie die eingestrahlten Felder. Der daraus resultierende Feedbackmechanismus verstärkt den effektiven Absorptionskoeffizienten der absorbierenden Schicht.
Da aus einer vorgegebenen Schichtdicke die optimale Phase nur von der Wellenlänge abhängt, kann das System durch ein spektral sehr enges Reflexionsminimum charakterisiert werden. Aus Optimierungsrechnungen und Messungen resultiert, dass eine mittlere Massendicke von etwa 3-10 nm (= etwa 50% Transmission) das Signal mit dem höchsten Extinktionskoeffizienten ergibt.
Das visuelle Farbempfinden (nach dem Assay, nach Kopplung der Nanocluster) bei dicker werdender Abstandsschicht beginnt bei der Eigenfarbe des Metalls, dann braun, violett, dunkelblau, hellblau, hellgelb, rot, rotviolett, grün und sodann für das Auge wiederholte rotgrün, Abfolgen die sich aus der visuellen Umsetzung eines komplexen Spektrums ergeben.
Da bereits Metall - Nanocluster die stärksten natürlichen Chromophore darstellen und darüber hinaus die Kopplung mit der Spiegelschicht die chromphore Wirkung noch einmal um nahe zu eine Zehnerpotenz steigern kann, ist das resonante System Cluster/Spiegel der stärkste und damit sensitivste natürliche Farbstoff. Das sensitive Messprinzip kann selbst geringe Änderungen der Belegungsdichte oder des räumlichen Abstands im Resonanzsystem in eine starke Extinktionsänderung und damit in ein visuell klar erkennbares optisches Signal umwandeln. Erfindungsgemäss ist es möglich, durch den Einsatz des Sensorchips mittels (bio) rekognitiver Erkennung des Analyten (7) in einem (bio)rekognitiven Sandwichaufbau rasch und hochsensitiv ein optisches Signal (Farbänderung des Sensorchips) zu erhalten.
Um eine weitere Steigerung der Sensitivität zu erreichen, können als Label nicht kleine Nanocluster sondern relativ grosse Nanopartikel von einigen zehn nm bis etwa einem um Grösse dienen. Unter diesen Bedingungen erlaubt das Messverfahren die optische Bestimmung von einzelnen Molekülen.
Erfindungsgemäss führt insbesondere der direkte (oder nahezu direkte) Kontakt der beschichte-
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ten Nanocluster mit der analytgekoppelten Oberfläche zu einer extrem raschen Reaktion, da keine (oder nahezu keine) Diffusion des Reagenzes notwendig ist. Dennoch erlaubt der Einsatz von zwei rekognitiven System auf Oberfläche der Abstandsschicht (3) (= 5) und auf den Glustern (4) (=6) eine äusserst selektive Analyse mit einem geringen unspezifischen Hintergrund (der durch den Einsatz von nur einem Bindungssystem systemimmanent beobachtet würde).
Primär sind als Reagenz alle denkbaren biorekognitiv aktiven Komponente (Antikörper, DNA,..) vorgesehen. Als Nanocluster dienen (neben dünnschichttechnologisch aufgedampften oder gesputterten Inseln) bevorzugt asymmetrische oder gefärbte Silber- bzw. Goldcluster, da sie technisch leicht zugänglich, chemisch hoch stabil und leicht zu derivatisieren sind. Jedoch sind alle Cluster und Nanopartikel zum Einsatz im Messsystem geeignet wobei metallische Cluster einen grösseren Verstärkungsfaktor durch die Resonanz erfahren.
Bedingt durch die Art des Messeffekts, der eine gerichtete Reflexion (und keinen Streuvorgang) voraussetzt, sind ebene Sensorstrukturen bevorzugt, da abhängig von Reflexionswinkel die Absorptionsbanden (= Farbton des Chips) bei einer anderen Wellenlänge zu liegen kommen.
Gerichtet reflektiertes Licht kann jedoch sekundär gestreut werden, um damit den Messeffekt auch aus einer anderen Richtung auswerten zu können. Jedoch wird durch die sekundäre Streuung das Signal/Rausch-Verhältnis verschlechtert.
Der Aufbau eines DNA-Sensorchips bzw. eines Protein - Sensorchips wird in den Anwendungsbeispielen genau beschrieben. Aufbauend auf dieser Technologie können rasche und sichere Schnelltests für Klinik und Labor verwirklicht werden. Als typischer Anwendungsbereiche kann z. B. die Diagnose von bakteriellen HNO-Infekten, die Identifizierung von Tumoren oder Viren genannt werden.
Erfindungsgemäss wurde diese Technologie in Richtung von Multianalytarrays weiterentwickelt, um damit ein neuartiges, hoch leistungsfähiges Verfahren für die Pharmaindustrie bereitstellen zu können. Es können Arrays sowohl auf Oberfläche der Abstandsschicht (3) als auch auf Oberfläche des Films (11) eingesetzt werden, welche gleichzeitig oder in Abfolge am gleichen oder an unterschiedlichen Gegen-Chips binden können. Damit kann das Messverfahren völlig automatisiert mit hohem Probendurchsatz ablaufen. Ein Multidruckverfahren erlaubt das Screening von Interaktionsbanken mit hoher Geschwindigkeit.
Als Gelschicht gemäss Abbildung 3 können nahezu alle quellfähigen Polymere eingesetzt werden. Die Quellfähigkeit beruht dabei auf der Einlagerung von Wasser und in geladenen Polymergelen auf Ionen, analog einem Ionenaustauscher, und deren Abstossung oder auf chaotropen bzw. kosmotropen d. h. oberflächenaktiven Effekten von Ionen, insbesondere Protonen. Die eingesetzten Gele müssen entweder eine Ablösung der Nanopartikel erlauben oder sich durch z. B. Temperaturerhöhung oder pH-Änderung auflösen lassen, um die Nanopartikel an der Chipoberfläche freisetzen zu können.
Das Verfahren kann auch zu sicherheitstechnischen Zwecken eingesetzt werden. Dabei wird ein Objekt (beliebiger Gegenstand von zumeist kommerziellem Wert) mit einem optisch nicht erkennbaren aber chemisch identifizierbaren Molekül (bzw. Molekülmuster) bedruckt. Zur Erkennung wird das Molekülmuster mit der entsprechenden und geeigneten (chemisch rekognitiven) Clusterfolie in Kontakt gebracht und diese wieder abgezogen. Es verbleibt ein optisch lesbarer Code auf dem Objekt. An Stelle einer Folie kann auch z. B. ein Roll-on Stift den Transfer der Cluster ermöglichen.
Die technische Umsetzung ist nachfolgend in drei typischen Anwendungsbeispielen erläutert : Beispiel 1: Protein-Chip nach Anspruch 1 # Auf einen Glaschip oder eine Polymerfolie wird ein Metallspiegel (z. B. AI, Ag, Au, Pd, Cr,
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W, Sn) aufgedampft oder aufgesputtert.
. Auf die Metalloberfläche wird sodann eine Abstandsschicht zur Einstellung der Resonanz- farbe von zumeist 50-200 nm mittels Spin-coating (z.B. Acrylpolymer in Lösungsmittel), Au- dampfen (z.B. Si02), CVD (Siliziumnitrid) oder reaktivem Sputtem (z. B. Zinn-Target in
Stickstoff- oder Sauerstoffplasma) aufgebracht.
# Auf die Oberfläche des Films (11) (Gegenfolie 8) werden durch Aufsputtern metallische
Inseln (Grösse typischerweise etwa 10-40 nm) mit einer optimalen Dichte von etwa 5-7 nm (gemittelte Schichtdicke) aufgebracht.
# Alternativ kann die Oberfläche des Films (11) (Gegenfolie) mit Clustern durch Adsorption von Kolloiden über deren elektrostatische Ladung beschichtet werden (z.B. elektronegative
Cluster und Folie mit positiv geladenen Polymer beschichtet).
# Biorekognitive Proteine (z. B. Antikörper) werden auf die Abstandsschicht mit einem Dot- ting-Roboter (Gerät zum Erzeugen vom kleinen Substanzflecken) in einem Array aufge- bracht und dort kovalent (z. B. Aminosilan oder Epoxysilan) oder adsorptiv gebunden. Es ist darauf zu achten, dass die geometrische Anordnung der Bindungssysteme eine direkte
Brückenbildung mit dem Cluster ermöglicht.
. Auf der Clusterschicht werden ebenfalls biorekognitive Proteine (z.BAntikörper) direkt an die Cluster adsorbiert oder biorekognitive Moleküle mittels chemischer Linker (Thiole, Disul- fide, Phosphorverbindungen, Phosphate) an die Metallinseln gebunden.
# Die Oberfläche der Abstandsschicht (3) wird mit der Analytlösung in Kontakt gebracht und einige Sekunden bis zu einigen Stunden mit dem Analyt (7) inkubiert. Die Zeit ist von der
Konzentration des Analyten (7) und der Geometrie des System abhängig und kann stark variieren. Typische Zeiten sind 10 s - 30 min.
. Sodann wird die Oberfläche des Films (11) bzw. der Film elastisch auf die Oberfläche der
Resonanzschicht (3) gepresst und nach einigen Sekunden bis wenigen Minuten wieder losgelassen. Es ist darauf zu achten, dass beiden Seiten sich vollflächig berühren um die
Cluster gleichmässig zu übertragen. Da es nahezu unmöglich ist, zwei Flächen völlig plan- parallel zu gestalten (und überdies extrem kostenaufwendig ist), wird zumeist eine der bei- den Oberflächen elastisch ausgeführt. Dies ist zumeist (aber nicht zwingender weise) die
Oberfläche des Films (11), welche die Cluster trägt.
# Wie in Abbildung 1 durch ein schwarzes Quadrate angedeutet, zeigen sich beim Zusam- menpressen zuerst zumeist unklare Farben die spätestens nach dem Abheben der Deckfo- lie (angedeutet durch ein Muster schwarzer ausgefüllter Kreise im Quadrat) das Array klar in der eingestellten Resonanzfarbe sichtbar machen. Durch mechanischen Druck, unebene
Oberflächen oder limitierte Präzision des Aufbaus zeigt sich beim Zusammenpressen {Kon- takt der Oberfläche der Abstandsschicht (3) und des Films (11)) zumeist nicht die optimale
Farbentwicklung - weiters können Cluster verschoben oder verschmiert werden und den optischen Eindruck beeinträchtigen.
Idealerweise ist das beste optische Signal erst nach entfernen der überschüssigen Cluster oder zumindest des Films sichtbar, jedoch kann un- ter optimalen Bedingungen auch während des Kontaktiervorganges bereits ein Eindruck von der chemischen Interaktion (= Messsignal) erhalten werden.
# Die Zahl der gebundenen Cluster ist proportional der Menge des gebundenen Analyten (7).
Beispiel 2 : nach Anspruch 1 # Es wird eine kommerziell erhältliche Metall - bedampfte Folie (z. B. Titan - bedampftes
Polycarbonat) verwendet.
# Auf die Metalloberfläche wird sodann eine Abstandsschicht zur Einstellung der Resonanz- farbe von zumeist 50-200 nm mittels Spin-coating (z.B. Acrylpolymer in Lösungsmittel, z.B.
Polyhexylaethacrylat), Audampfen (z.B. Si02), CVD (Siliziumnitrid) oder reaktivem Sputtern (z. B. Zinn-Target in Stickstoff- oder Sauerstoffplasma) aufgebracht.
# Auf die Oberfläche des Films (11) (Gegenfolie z. B. Teflon, PVDF) werden durch Aufsput- tern metallische Inseln (Grösse typischerweise etwa 10-40 nm) mit einer optimalen Dichte von etwa 5-7 nm (gemittelte Schichtdicke) aufgebracht.
# Alternativ kann die Oberfläche des Films (11) (Gegenfolie) mit Clustern durch Adsorption
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von Kolloiden über deren elektrostatische Ladung beschichtet werden (z.B. elektronegative
Cluster und Folie mit positiv geladenen Polymer beschichtet).
. Oligonucleotide oder PCR-Produkte werden auf die Abstandsschicht mit einem Dotting-
Roboter (Gerät zum Erzeugen vom kleinen Substanzflecken) in einem Array aufgebracht.
Die DNA ist dabei amino- oder thiolmodifiziert, um eine chemische Kopplung mit der Chip- oberfläche zu ermöglichen. Der Chip (Schichten 1,2 + Abstandsschicht (3)) ist entspre- chend chemisch aktiviert (Gläser z. B. über silanisieren mit Epoxysilan, Polymere durch
Sauerstoffplasma oder partielle Hydrolyse und ein aktivierendes und bifunktionelles Rea- gens). Dabei wird z.B. wasserlösliches Carbodiimid als Reagenz zur Kopplung verwendet.
Es kann die DNA auch durch UV-Vernetzung an die Oberfläche gebunden werden, dies ist jedoch für kurze Oligonukleotide nicht ratsam, da die räumliche Orientierung dann sterisch äusserst ungünstig ist.
# Auf der Clusterschicht werden ebenfalls Oligonucleotide oder PCR-Produkte direkt an die
Cluster gebunden, wobei bevorzugt thiolmodifizierte Oligonukleotide eingesetzt werden, die als chemisch-kovalent die DNA an die Metallinseln binden. Es können auch die Cluster zu- erst mit DNA modifiziert werden und sodann auf die Oberfläche aufgebracht werden. Dies kann adsorptiv, durch Auftrocknen, Aufdrucken, Aufspinnen oder ähnlich geschehen.
. Oberfläche der Abstandsschicht (3) wird mit der Analytlösung in Kontakt gebracht einige
Sekunden bis zu einigen Stunden mit dem Analyt (7) inkubiert, dabei hybridisiert die Pro- ben-DNA oder RNA mit der DNA auf der Oberfläche der Abstandsschicht (3). Die Zeit ist von der Konzentration des Analyten (7) und der Geometrie des System abhängig und kann stark variieren.
# Sodann wird die Oberfläche des Films (11) auf die Oberfläche der Abstandsschicht (3) gepresst und nach einigen Sekunden bis wenigen Minuten wieder abgehoben.
# Wie bereits erwähnt zeigen sich beim Zusammenpressen zuerst unklare Farben die spä- testens nach dem Abheben der Deckfolie das Array klar in der eingestellten Resonanzfarbe sichtbar machen.
. Die Zahl der gebundenen Cluster ist proportional der Menge des gebundenen DNA bzw.
RNA.
. Das Aneinanderpressen der beiden Oberflächen kann entweder in Anwesenheit eines
Lösungsmittels, bevorzugt wässrig, aber auch trocken erfolgen, Beispiel 3 : Multiarrays . In analoger Weise kann durch Aufbringen von Arrays unterschiedlicher Moleküle (z. B. mit
Siebdruck, Ink-jet, Photolitho-Technologie, o.ä.) auf beide Seiten (Oberfläche der Ab- standsschicht (3) und Oberfläche des Films (11)) gleichzeitig ein ganzer Fingerprint unter- schiedlicher Reaktionen vorgenommen und dies z.B. im Bereich funktioneller Proteomics oder Genomics eingesetzt werden.
. Insbesondere ist die Tatsache, dass die Reagenzien auf der Festphase vorliegen und sich nicht vermischen können von grossem Vorteil in heterogenen Arrays unterschiedlicher Pro- teine oder Protein plus DNA, da es parallele Assays ohne Vermischung der Reagenzien er- laubt.
Beispiel 4 : Aufbau von des Films Der Film hat erfindungsgemäss die Ablösung der Cluster oder das Auflösen des Films unter Freisetzung der Cluster zu ermöglichen.
# Ablösbare Cluster können z. B. durch thermisches Aufdampfen oder Sputtern von Metallin- seln auf Kunststofffolien erzeugt werden. Dabei kann entweder ein Material mit geringer In- teraktion (z.B. Teflon, Polystyrol o. ä) gewählt werden oder die Folie mit einer wasserlösli- chen oder pufferlöslichen Schicht (Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylakohol o.ä.) überzogen werden.
# Beim Aneinanderpressen der Oberflächen wird dabei entweder die Bindungsstärke der
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biorekognitiven Bindung an Oberfläche der Abstandsschicht (3) (mit 5 beschichtet) höher als jene der Bindung an Oberfläche des Films (11 ) oder die Cluster werden in wenigen Na- nometer bis Mikrometer von der Oberfläche durch Auflösen der Trägerschicht in der Analyt- lösung freigesetzt und können sodann in wenigen Sekunden bis Minuten ihre Bindungs- partner an der Schicht 1 erreichen und dort binden.
# Alternativ kann die Oberfläche des Films (11) wie in Beispiel 2 mit Hilfe elektrostatischer
Wechselwirkungen reversible mit Clustern beschichtet werden, wobei z.B. Polymere wie
Polyethylenimin, Chitosan als positiv geladen Bindungssysteme und Polyacrylsäure oder
Polymethacrylsäure als negativ geladene Beschichtungspolymere eingesetzt werden kön- nen.
# Eine weitere Option Cluster reversible auf eine Oberfläche aufzubringen ist der Einsatz von in wässrigen Medien instabilen chemischen Beschichtungen, die über Löse-, Redox oder
Korrosionsvorgänge die gebundenen Cluster freigeben.
# Für selektive Bindungsstudien können Cluster über einen schwach bindenden Antikörper an die Oberfläche des Films (11) gebunden werden und nach Reaktion mit dem Analyten (7) (Höhere Bindungsaffinität) selektiv abgelöst werden.
Beispiel 5 : Vorrichtung zur Messung des optischen Messsignals # Primär kann jede Kamera (CCD, CMOS) zur Erfassung des Farbmusters auf der Oberflä- che der Abstandsschicht (3) eingesetzt werden. Selbst eine einfache Web-Kamera (Pro- duktionskosten unter 1#) kann als Auswertesystem Verwendung finden.
# Zur optimalen Quantifizierung und Eichung kann ein Reflexionsphotometer eingesetzt werden.
# Teststicks und niederdichte Arrays können mit einem Photometer aus Leuchtdiode (Laser- diode) und Photodiode (Phototransistor) kostengünstig erfasst werden.
# Typische Spektren sind in Figur 5 ersichtlich, die X-Achse gibt die Wellenlänge von 400 bis
1100 nm wieder, die Y-Achse die Extinktion von 0 - 2 Einheiten. Der bevorzugte Messbe- reich beträgt 500 - 1000 nm. Kurzwelliger sind die Spektren von tnterbandübergängen überlagert. Langwelliger ist die Messtechnik zumeist aufwendig. Die Zahlen, die den Spekt- ren links beigefügt sind, entsprechen steigenden Schichtdicken der Abstandsschicht (3) - aber ohne absolute Dickenrelation der fortlaufenden Zahlen von eins bis 5.
Beispiel 6 : Chip mit flexibler Deckmembran - Aufbau gemäss Figur 1 Aufbau gemäss Anspruch 1.
Schritte S1 bis S3 zeigen den zeitlichen Aufbau des Chips (die weissen Quadrate symbolisieren eine schwache zumeist rosa Farbe der dünnen Clusterschicht über der zumeist metallisch reflektierenden Oberfläche) Schritte S4 bis S6 zeigen den Ablauf der Messung Die Quadrate unterhalb der Beschriftungsreihe S1-S6 zeigen das optische Erscheinungsbild des Sensorchips. Von Schritt S1-S4 ist der Sensor unverändert, im Schritt S5 nicht genau definiert, im Schritt 6 erscheint das Array in der durch die Abstandsschicht voreingestellten Resonanzfarbe.
Beispiel 7 : Chip mit externer Deckmembran - Aufbau gemäss Figur 2 Aufbau gemäss Anspruch 1.
Der Assay erfolgt durch Kontakt mit dem Analyten (7), Auflegen und Abziehen der Clusterfolie.
Schritte S1 bis S3 zeigen den zeitlichen Aufbau des Chips.
Schritte S4 bis S6 zeigen den Ablauf der Messung Die Quadrate unterhalb der Beschriftungsreihe S1-S6 zeigen das optische Erscheinungsbild des Sensorchips. Von Schritt S1-S4 ist der Sensor unverändert, im Schritt S5 nicht genau definiert, im Schritt 6 erscheint das Array in der durch die Abstandsschicht voreingestellten Resonanzfarbe.
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Beispiel 8 : Chip mit integraler Gelschicht als Clusterträgeroberfläche - Aufbau gemäss Figur 3 Aufbau gemäss Anspruch 5 und 6.
Schritte S1 bis S3 zeigen den zeitlichen Aufbau des Chips.
Schritte S4 bis S6 zeigen den Ablauf der Messung Die Cluster, Nanopartikel oder Kolloide sind entweder auf der Filmoberfläche oder im Film eingebettet.
Die Quadrate unterhalb der Beschriftungsreihe S1-S6 zeigen das optische Erscheinungsbild des Sensorchips. Von Schritt S1-S4 ist der Sensor unverändert, im Schritt S5 nicht genau definiert (bzw. das Signal wird sukzessive ausgebildet), im Schritt 6 erscheint das Array in der durch die Abstandsschicht voreingestellten Resonanzfarbe.
Ein allfälliges Abwaschen der überschüssigen Cluster ist durch die horizontalen Pfeile angedeutet.
Beispiel 9 : Kompetitiver Assay - Aufbau gemäss Figur 4 Schritte S1 bis S3 zeigen den zeitlichen Aufbau des Chips.
Schritte S4 bis S6 zeigen den Ablauf der Messung Die Quadrate unterhalb der Beschriftungsreihe S1-S6 zeigen das optische Erscheinungsbild des Sensorchips. Von Schritt S1-S4 ist der Sensor unverändert, im Schritt S5 nicht genau definiert, im Schritt 6 erscheint das Array in der durch die Abstandsschicht voreingestellten Resonanzfarbe.
Die Bindung der Cluster erfolgt kompetitiv zur Bindung des Analyten (7). Das Bindungssystem am Cluster und oder der Oberfläche der Abstandsschicht (3) bindet kompetitiv mit dem Analyten (7). Der Cluster ist nicht Linker sondern Verdrängungsagens.
Patentansprüche : 1.Verfahren zur Identifizierung vom Molekülen und Objekten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Messsystem aufgebaut aus a) einer sichtbares und/oder infrarotes Licht spiegelnden Oberfläche (2), die mit einer Ab- standsschicht (3) von 5 bis 500 nm Dicke überzogen ist, auf der rekognitive Moleküle (5) gebunden sind und b) einem Film (11), der leitfähige Nanopartikel (4) mit einem Durchmesser von kleiner als einem Mikrometer, welche rekognitive Moleküle (6) tragen, nicht permanent gebunden an seiner Oberfläche oder nicht permanent in seinem Innem trägt, c) zuerst mit einem Analyten (7) in der Weise zur Reaktion gebracht wird, dass entweder die rekognitiven Moleküle (5;
6) der Oberfläche der Abstandsschicht (3) bzw. des Films (11 ) oder jene der Nanopartikel (4) oder beide den Analyten (7) binden d) sodann Oberfläche (2) mit der Abstandschicht (3) und der Film (11) in Kontakt gebracht werden und e) daraufhin der Film (11) entfernt wird, um f) an der Oberfläche (2) mit der Abstandschicht (3) rekognitiv gebundene Nanopartikel (4) aus dem Film (11) durch Erfassung der Änderung der Eigenschaften von an der spiegeln- den Oberfläche (2) reflektierten elektromagnetischen Wellen in der Weise zu messen, dass g) das Messlicht die Abstandsschicht (3) und die gebundenen Nanopartikel (4) zumindest zwei mal passiert und sich durch konstruktive oder destruktive Interferenz ein Farbe zeigt welche von der Zahl der gebundenen Nanopartikel (4) und der Dicke der Abstandschicht (3) abhängt.