EP1561096A1

EP1561096A1 - Sensor zur bestimmung von analyten sowie verfahren zur bestimmung von enzym-aktivitäten

Info

Publication number: EP1561096A1
Application number: EP03775322A
Authority: EP
Inventors: Stefan Spichiger; Ursula Spichiger-Keller; Michael Linnhoff; Gleb Zhylyak
Original assignee: C-Cit AG
Current assignee: C-Cit AG
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2005-08-10
Also published as: DE10251893A1; AU2003283375A1; WO2004042377A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Sensor (100, 200, 300) zur Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz, umfassend einen Träger (101, 202, 301), eine optisch transparente Schicht (102, 206, 302), die auf dem Träger angeordnet ist, Mittel (104, 105, 203, 204, 303, 304) zur Ein- und Auskopplung elektromagnetischer Strahlung (107, 109, 306, 308), wobei die optisch transparente Schicht einen Erkennungsbereich (103, 207) aufweist, der eine Erkennungssubstanz umfasst, die mit der Zielsubstanz spezifisch wechselwirkt. Weiter umfasst die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz umfassend einen Sensor, eine Quelle (208) für elektromagnetische Strahlung und einen Detektor (209) für elektromagnetische Strahlung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz, Verfahren zur Bestimmung von Enzymaktivitäten, sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Sensors sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Description

SENSOR ZUR BESTIMMUNG VON ANALYTEN SOWIE VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON

ENZYM-AKTIVITÄTEN

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Sensor zur Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz, einer Vorrichtung zur

Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters, Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz, Verfahren zur Bestimmung von Enzymaktivitäten, sowie die Verwendung des erfmdungsgemäßen Sensors sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Der Bedarf der direkten und zuverlässigen Bestimmung von Analyten bzw. Gasen in verschiedenen Medien, insbesondere Gasgemischen oder in Flüssigkeiten, nimmt ständig zu. Dies insbesondere auch bei Anwendung in der Medizin und der chemischen Analytik. Im Bereich des Bestimmens von Gasen, beispielsweise mittels Festelektrolyten, liefert der Artikel von I. Lundström "Sensors and Actuators", 1996, 35 - 36, S. 11 - 19 einen guten Überblick.

Die EP 0903573 A2 offenbart eine Optode zur Bestimmung von Gasen unter Verwendung einer gassensitiven Sensormembran. Diese Sensormembran umfasst sogenannte Ionophore, die selektiv mit einzelnen Gasen bzw. Gasbestandteilen wechselwirken und dabei ihre Farbe verändern, so dass über UV/NIS-Messungen die Absorptionsmaxima der Wirkungskomplexe zwischen Ionophor und Analyt gemessen werden können.

Weiter offenbart die WO 00/50446 Oligopeptidderivate zur elektrochemischen Messung der Aktivität von Proteasen, bei denen diese Oligopeptidderivate, an die ein amperogenes Anilin- bzw. Aminochinolinderivat gebunden ist, auf der Oberfläche von Elektroden fixiert sind und bei Reaktion mit einem Enzym durch die Abspaltung der elektrisch leitenden Anilin- bzw. Aminochinolinverbindung eine Änderung der Leitfähigkeit eintritt, die direkt von der Elektrode gemessen werden kann.

Des Weiteren offenbart das US-Patent Nr. 5,097,014 chromogene Verbindungen, die als Enzymsubstrate für diagnostische Anwendungen verwendet werden können. Insbesondere betrifft dies die Detektion proteolytischer Enzyme, die die Bindung zwischen dem chromogenen Substrat und dem Peptid spalten, so dass die freigesetzten Farbstoffe einer photometrischen Bestimmung zugänglich sind. Weiter sind in der EP-A-0358991 sogenannte optische chemische Sensoren (Optoden) basierend auf dem Prinzip der Transmissionsmessung durch die Schicht und die Probe hindurch vorgeschlagen worden.

Weiter ist bekannt, dass in optischen Sensoren mittels Reflektionsmessung über optische Fasern (Faserkopplung und Transmission des Lichtes der Lichtquelle und Rückstreuung des nicht-absorbierten Lichtes) Analyten bestimmbar sind. Jedoch geht bei dieser Messmethode viel Licht verloren. Nachteilig ist, dass der große Verlust an Lichtenergie dazu führt, dass die Empfindlichkeit dieser Messtechnik sehr gering ist.

Ebenso sind Optoden auf der Basis von Fluoreszenzmessungen bekannt. Hierbei ist nachteilig, dass spürende Hintergrundfluoreszenz von Polymermaterialien von der Probe selbst, insbesondere von biologischen Proben, auftritt. Die Intensitätsmessung ist schwer reproduzierbar, da die Emission ungerichtet ist.

Bei der Absorptionsmessung auf planaren optischen Wellenleitern, d.h. die sogenannte ATR-Technologie, bei Messungen im Evaneszenzfeld, wurde bislang die sogenannte Dickschichttechnologie (Dicke des Wellenleiters größer als 250 bis 400 nm) verwendet. Dies führt jedoch dazu, dass sich das Licht diskontinuierlich mit einer berechenbaren Anzahl von internen Reflexionen im Wellenleiter fortsetzt. Als Folge wird nur an den Stellen interner Reflexion Licht durch ein benachbartes Medium absorbiert. Damit wird wiederum eine submaximale Empfindlichkeit der optischen Absorptionsmessung in Abhängigkeit von der Anzahl der Reflexionen im Wellenleiter erreicht.

Es bestand daher das Bedürfnis, Intensitätsänderungen und spektrale Änderungen in optischen Sensorfilmen bzw. in Filmen aus biologisch-chemischen Komponenten, die mittels optischer Absorption detektiert werden können, empfindlicher zu gestalten und die Nachweisgrenze für zu erkennende Substanzen zu vermindern. Eine weitere Aufgabe der Erfindung bestand darin, einen optischen Sensor zur Verfügung zu stellen, bei dem das Licht nicht durch die Probe hindurchgeht.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird dadurch gelöst, dass ein Sensor zur Bestimmung eines chemischen und/oder biologischen und/oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz zur Verfügung gestellt wird, der Folgendes umfasst:

a) einen Träger

b) eine optisch transparente Schicht, die auf dem Träger angeordnet ist

c) Mittel zur Ein- und Auskopplung elektromagnetischer Strahlung, wobei die optisch transparente Schicht einen Erkennungsbereich aufweist, der eine Erkennungssubstanz umfasst, die mit der Zielsubstanz spezifisch wechselwirkt.

Der vorliegende erfindungsgemäße Sensor ermöglicht es, Licht von definierter Wellenlänge einzukoppeln und bereits bei unerwartet hoher Verdünnung von Erkennungssubstanzen das eingekoppelte Licht vollständig zu absorbieren, so dass weder an der Stirnfläche noch über zweite Einkopplungsmittel transmittiertes Licht festgestellt und gemessen werden kann, so dass der Verlust an eingekoppelten Licht wesentlich minimiert wird. Der Begriff "unerwartet hohe Verdünnung" bezeichnet vorliegend Konzentrationen von weniger als 10^"5 mol/1, bevorzugt von weniger als 10^"8 mol/1 und ganz besonders bevorzugt von weniger als 10^"10mol/l.

Ein Sensor kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich jede beliebige Art von Sensor sein, sofern er die oben genannten Merkmale aufweist. So kann der erfindungsgemäße Sensor beispielsweise ein elektrochemischer Sensor, optischer Sensor oder ein Biosensor sein.

Unter chemischen Sensoren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Vorrichtungen verstanden, die chemische Informationen, die beispielsweise von der Konzentration einer spezifischen Komponente bis zur Gesamtanalyse der Gesamtzusammensetzung reicht, in ein analytisch sinnvolles Signal umwandeln. Chemische Sensoren weisen eine hohe Selektivität gegenüber dem Analyt in der Probe auf, so dass oftmals gegenüber herkömmlichen Sensoren das Auftrennen bzw. das Aufarbeiten im Sinne einer herkömmlichen Analyse entfällt. Mit dem Begriff Selektivität wird die Fähigkeit des Sensors beschrieben, den Analyt auch zwischen sehr ähnlichen Komponenten im Untersuchungsgut eindeutig zu erkennen. Damit können somit auch sehr komplexe Proben analysiert werden. Chemische Sensoren umfassen zum Beispiel, sind aber nicht beschränkt auf, Optoden mit Ionophoren, wie lipophile, pH-sensitive Chromoionophore, die üblicherweise für den Ionenaustausch und Ionen-Koextraktions- Optoden eingesetzt werden. Bei chemischen Sensoren liegt die Empfindlichkeit bei einer Konzentration der Zielsubstanz von ca. 10^"5 mol/1.

Darüber hinaus zeigen chemische Sensoren eine kurze Ansprechzeit, was eine rasche Messung und einen hohen Probendurchsatz ermöglicht. Darüber hinaus sind chemische Sensoren reversibel, so dass auch on-line Messungen möglich sind. Unter optischen Sensoren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Sensoren verstanden, die chemische Informationen, beispielsweise die Konzentration, Aktivität oder überhaupt die messbare Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, über einen molekularen Erkennungsvorgang in optische Signale umwandeln. Dabei stehen diese optischen Signale in einem funktionellen Zusammenhang zur Analytkonzentration bzw. zur Analytaktivität. In einem weiteren Schritt werden diese optischen Signale in elektronische Signale umgewandelt und liefern Daten, die aufbereitet schließlich eine Interpretation der Messung erlauben. Optische Sensoren verbrauchen fast überhaupt keine Reagenzien und sind daher ökonomischer gegenüber herkömmlichen Analysesystemen. Bei optischen Sensoren liegt die Empfindlichkeit bei einer Konzentration der Zielsubstanz von ca. 10^"8 mol/1.

Unter Biosensoren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Sensoren verstanden, die auf einer Kopplung von Biomolekülen basieren, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifische Analyten erkennen mit physikochemischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal in elektrische Messsignale umwandeln. Bioaktive Erkennungskomponenten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt, auf Antikörper, Enzyme, Zellorganellen oder ganze Mikroorganismen. Auch Peptide bzw. Proteine werden als Biomoleküle bezeichnet. Jedoch sind Peptide nicht bioaktiv, indem sie andere Moleküle umsetzen können oder spezifische Bindungen an weitere Moleküle fördern. Bei Biosensoren werden zwei Grundtypen voneinander unterschieden: Einerseits die sogenannten Bioaffinitätssensoren und andererseits die sogenannten Metabolismussensoren. Die Bioaffinitätssensoren generieren ein Signal durch Komplexbildung von bioaktiven Molekülen zu einem Analyten. Hierbei liegt nach der Messung wieder der Ausgangszustand vor. Während letztere auf einer spezifischen Erkennung und anschließenden Umsetzung von Substraten beruhen. Nach dem Messvorgang muss dieser Sensor entweder verworfen oder der Ausgangszustand wieder hergestellt werden. Bei diesen Sensoren werden Empfindlichkeiten von 10^"10 mol/1 und weniger an Zielsubstanz erreicht.

Mit den unterschiedlichen Sensoren kann somit ein molekularer Erkennungsvorgang des Analyten bzw. ein chemischer, biologischer oder physikalischer Parameter der Zielsubstanz, mittels unterschiedlicher Techniken in ein Messsignal übersetzt werden.

Ein zu bestimmender chemische, biologische oder physikalische Parameter ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich jede Veränderung eines Ausgangszustandes, die mit einem erfindungsgemäßen Sensor messbar ist und die durch Wechselwirken der Zielsubstanz mit der Erkennungssubstanz ausgelöst wird. Die Veränderung kann dabei beispielsweise in einer pH-Änderung, Ionenkonzentrationsänderung, Veränderung einer Molekülstruktur, Änderung von Molekülverteilungen, Änderung von Leitfähigkeiten oder Änderung von Absorptionsspektren von Molekülen bestehen. Der zu bestimmende chemische, biologische oder physikalische Parameter betrifft dabei jedoch nur Veränderungen, die innerhalb des Sensors, beispielsweise am Träger oder am Erkennungsbereich stattfinden.

Unter Wechselwirkung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Wechselwirkung zwischen molekularen Einheiten verstanden, umfassend die Bildung einer chemischen Bindung (kovalent oder ionisch), van-der-Waals Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Adsorptionsphänomene und ähnliches.

Eine Zielsubstanz weist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Eigenschaft auf, mit einer Erkennungssubstanz des erfindungsgemäßen Sensors wechselwirken zu können. Grundsätzlich gibt es keine weitere Beschränkung für erfindungsgemäße Zielsubstanzen. Je nach Beschaffenheit und Spezifität der Erkennungssubstanz erfüllen eine größere oder kleinere Gruppe von Substanzen das Kriterium mit der Erkennungssubstanz wechselwirken zu können. So kann die Erkennungssubstanz beispielsweise so beschaffen sein, dass nur spezifische Mitglieder bestimmter Stoffklassen mit der Erkennungssubstanz wechselwirken. Die Zielsubstanz kann eine bekannte Substanz sein, wie bestimmte bakterielle Endotoxine sie kann aber auch eine dem Fachmann unbekannte Substanz sein.

Im Rahmen der einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mittels des erfindungsgemäßen Sensors beispielsweise in Körperflüssigkeiten wie Blut oder Plasma oder in künstlich hergestellten Lösungen für den wissenschaftlichen Forschungsbetrieb oder für medizinische Zwecke nach potentiellen Zielsubstanzen gescreent.

Der erfindungsgemäße Sensor umfasst weiterhin einen Träger. Der Ausdruck „Träger" bezeichnet jeden dreidimensionalen Körper, auf dem sich eine erfindungsgemäße optisch transparente Schicht aufbringen lässt.

Der Träger kann grundsätzlich aus jedem Material sein, das einer gewöhnlichen Handhabung im medizinischen oder chemischen Labor standhält, ohne dass die Form und Beschaffenheit des Trägers wesentlich verändert wird. Das bedeutet, dass der Träger beispielsweise nicht empfindlich sein sollte gegen Temperaturen von etwa - 30 ° C bis etwa 50 °C, insbesondere im Bereich von etwa -20 ° C bis etwa 40 ° C und im Bereich von etwa - 10 ° C bis etwa 30 ° C.

Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen, wenn der Träger aus beispielsweise SiO₂ oder einem ähnlichen, dem Fachmann an sich bekanntem, optisch transparentem Material, beschaffen ist. Der Träger kann aber auch beispielsweise aus Glas oder geeigneten Polymeren bestehen. Beispiele für geeignete Polymere sind beispielsweise PVC, Polyurethane oder Polysiloxane und deren Derivate. Der Brechungsindex des Trägers liegt im Bereich von etwa n₀= 550 nm bis etwa n₀= 750 nm, bevorzugt insbesondere von etwa n,, = 600 nm bis 680 nm. Besonders bevorzugt liegt der Brechungsindex im Bereich von 605 nm bis 680 nm.

Der Träger weist üblicherweise eine Dicke von etwa 0.5 mm bis etwa 1.5 mm auf, bevorzugt von 0.7 bis 1.2 mm.

Der Träger selbst kann aus einer Schicht sowie aus 2, 3 oder mehr Schichten bestehen. So ist es beispielsweise denkbar, den Träger an der Seite, an der er an die optisch transparente Schicht angrenzt, ebenfalls eine optisch transparente Schicht aufweist und eine weitere Trägerschicht im sichtbaren Licht farbig erscheint. So können beispielsweise durch unterschiedliche Farben der Trägerunterseite verschiedene Trägerbereiche einfach voneinander unterscheidbar gemacht werden.

Der Träger kann daher grundsätzlich beliebig beschichtet sein, wobei die Beschichtungen einen sinnvollen Aufbau des erfindungsgemäßen Sensors nicht beeinträchtigen sollten.

Der Träger kann weiterhin vollständig oder teilweise elektrisch leitfähig oder nicht elektrisch leitfähig sein.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auch der Träger optisch transparent, so dass es möglich ist, die Mittel zur Ein- und Auskopplung elektromagnetischer Strahlung auf dem Träger anzuordnen und durch den optisch transparenten Träger hindurch das Licht in die optisch transparente Schicht einzukuppeln.

Bevorzugt sind die Mittel zur Ein- und/oder Auskopplung der elektromagnetischen Strahlung zwischen Träger und optisch transparenter Schicht angeordnet, die insbesondere weiter bevorzugt als Gitterstruktur ausgebildet sind. Derartige Gitterstrukturen, wie beispielsweise Bragg Gitter, können mittels an sich bekannter und einfacher Ätztechniken einfach in Substrate bzw. Trägermaterialien geätzt werden.

Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Träger daher an der Oberfläche, die an die optische transparente Schicht angrenzt eine Gitterstruktur auf. Vorzugsweise dient ein Gitter an der einen Seite der Oberfläche, die an die optische transparente Schicht angrenzt, zur Einkopplung elektromagnetischer Strahlung, bevorzugt Licht sichtbarer Wellenlänge. Ein zweites Gitter befindet sich hinter dem Erkennungsbereich und dient zur Auskopplung elektromagnetischer Strahlung, bevorzugt Licht sichtbarer Wellenlänge. Vorzugsweise handelt es sich bei der Gitterstruktur um ein optisches Gitter, beispielsweise ein Bragg Gitter. Je nach Anwendung bzw. je nach Substrat kann es vorteilhaft sein, auch sogenannte Slanted Bragg Gitter oder ähnliche Gitterarten zu verwenden.

Das optische Gitter dient dazu, Licht an der einen Seite des Trägers über ein Gitter einzukoppeln, anschließend aufgrund der dünnen Schichtwellenleiterschichtstruktur ein sogenanntes evaneszentes Feld zu erzeugen und an der anderen Seite des Trägers durch das zweite Gitter wieder auszukoppeln.

Auf dem Träger ist eine optisch transparente Schicht angeordnet. „Optisch transparent" bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass die Schicht Lichtbrechungsindizes von 1 bis etwa 15 aufweist und eine Lichtdurchlässigkeit von etwa 80% bis etwa 0 % aufweist. Der Brechungsindex der optisch transparenten Schicht liegt im Bereich von etwa n₀ = 550 nm bis etwa n₀= 750 nm, insbesondere bevorzugt von etwa n₀= 600 nm bis etwa n₀= 680 nm, wobei der Bereich von etwa n₀= 650 nm bis etwa n₀= 680 nm zumeist bevorzugt ist. Im Rahmen einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der Brechungsindex dieser Schicht etwa n = 2,21 (589 nm). Die optisch transparente Schicht kann in Form einer einzigen Schicht vorliegen, aber auch in Form mehrerer aufeinander angeordneter Schichten (z.B. als Verbund), beispielsweise 2, 3 oder 4 verschiedene Schichten. Wichtig ist nur, dass auch der Mehrschichtenverbund die Eigenschaften der optischen Transparenz wie oben beschrieben erfüllt.

Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen, wenn die optisch transparente Schicht aus Tantalpentoxid, Siliciumoxid bzw. Titandioxid besteht bzw. aus Mischungen davon. Bevorzugt wird beispielsweise Ta₂O₅ als optisch transparente Schicht mittels an sich bekannter Techniken auf dem Träger angeordnet. Die Dicke der Ta₂O ₅ -Schicht beträgt ca. 100 bis 500 nm, bevorzugt 100 bis 200 nm. Die optisch transparente Schicht aus Ta₂O ₅ weist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eine Schichtdicke von ca. 160 nm auf.

Träger und optische Schicht können im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung einen sogenannten Dünnschichtwellenleiter bilden. Bevorzugt ist die optisch transparente Schicht, die auf dem Träger angeordnet ist, ein sogenannter Dünnschichtwellenleiter mit einer Dicke von etwa 50 bis etwa 500 nm, bevorzugt von 100 bis 200 nm, so dass das sogenannte Evaneszenzfeld vollständig absorbiert wird.

Auf der optisch transparenten Schicht ist mindestens ein Erkennungsbereich angebracht. Der Erkennungsbereich kann dabei sowohl als weitere Schicht auf der optisch transparenten Schicht liegend angebracht sein, oder aber integraler Bestandteil der optisch transparenten Schicht sein. Im ersteren Fall kann die Erkennungssubstanz in einem Medium verteilt, oder aber in Reinform, auf der optisch transparenten Schicht angeordnet sein. Im letzteren Fall kann die Erkennungssubstanz schon im Wellenleiter verteilt vorliegen, oder aber in einer Oberflächenschicht des Wellenleiters angereichert sein. So kann der Erkennungsbereich beispielsweise aus einer Monolage, beispielsweise aus an Peptide gekoppelten Chromogenen bestehen, jedoch auch beispielsweise aus PVC/DOS sein, in der Erkennungsmoleküle verteilt sind.

Erkennungssubstanzen können grundsätzlich alle Verbindungen sein, insbesondere aber Biomoleküle, wie Antikörper, neutrale, anionische, kationische oder zwitterionische Polymere oder Monomere, bevorzugt sind optisch aktive Moleküle wie Chromogene und die Derivate davon.

Das Ensemble aus Träger, optisch transparenter Schicht und Erkennungs- und ggf. Referenzbereich wird vorliegend auch als Chip bzw. optischer Chip bezeichnet.

Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als günstig erwiesen, wenn der Erkennungsbereich selbst auch eine optisch transparente Schicht ist, die eine Erkennungssubstanz enthält. Damit kann in einfacher Weise die spezifisch wirkende Erkennungssubstanz, beispielsweise in übliche bekannte Medien begeben werden, die eine leichte Aufbringbarkeit als Film oder auch als Schicht gewährleisten.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Erkennungsbereich selbst im Wesentlichen aus einer Erkennungssubstanz bzw. aus einer Mischung verschiedener Erkennungssubstanzen, so dass auch beispielsweise die Bildung von Monolagen aus einer Erkennungssubstanz bzw. aus einer Mischung verschiedener Erkennungssubstanzen auf der optisch transparenten Schicht in einfacher Weise möglich ist, indem die Erkennungssubstanz bzw. die Mischung verschiedener Erkennungssubstanzen über an sich bekannte Mittel auf der optisch transparenten Schicht verankert werden.

Die Art der Verankerung umfasst kovalente Bindungen, ionische Bindungen, Verankerung durch Van-der Waals-Kräfte, Wasserstoffbrücken oder magnetische Befestigungen. Diese Aufzählung ist jedoch nicht abschließend. Die Erkennungsmoleküle können auch in einer Ionenaustausch-Membran, bzw. in einem Polymerfilm vorliegen, wobei sich insbesondere eine Kaliumselektive Ionenaustausch-Membran als besonders geeignet für eine spezielle Ausführungsform der Erfindung erwiesen hat. Die Membran, in der die Erkennungsmoleküle verankert sein können auch Coextraktionssysteme sein.

Weiter ist bevorzugt, dass der Erkennungsbereich einen niedrigeren oder den gleichen Brechungsindex wie die optisch transparente Schicht aufweist. Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Brechungsindex des Erkennungsbereichs etwa n = 1,33.

Besonders bevorzugt ist, wenn eine Vielzahl von Erkennungsbereichen vorhanden sind, so dass jeder Erkennungsbereich mit einer spezifischen Erkennungssubstanz versehen ist, so dass auf einem Sensor gleichzeitig eine Vielzahl von Zielsubstanzen spezifisch bestimmt werden kann, da jede Zielsubstanz nur mit einem Erkennungsbereich, der eine Erkennungssubstanz umfasst, spezifisch wechselwirken kann. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist ein Sensor mindestens 10, bevorzugt mindestens 100 und weiter bevorzugt mindestens 200 verschiedene Erkennungsbereiche

Weiter ist bevorzugt, dass ein weiterer Erkennungsbereich als Referenzbereich ausgestaltet wird, der einen sogenannten Standardreferenzbereich bildet. Damit kann in einfacher Weise die Durchführung von Differenzmessungen gegenüber den mit einer Erkennungssubstanz versehenen Erkennungsbereichen durchgeführt werden. Derartige Differenzmessungen beziehen sich insbesondere auf den Einfluss der Quellung der Erkennungsbereiche, insbesondere sofern in einem flüssigen oder dampfförmigen Medium gemessen wird, die Intensität des eingestrahlten Lichts und weitere unspezifische Variationen. Die Referenzbereiche können auch als Positivkontrolle und Negativkontrolle für den Nachweis des entsprechenden Zielanalyten ausgestaltet sein. Eine zentrale Eigenschaft des erfindungsgemäßen Sensors ist die Wechselwirkung zwischen Erkennungssubstanz und Zielsubstanz. Dabei müssen entsprechend der Art der Wechselwirkung angemessene Umgebungsbedingungen gegeben sein. Insbesondere wenn Enzyme an der Erkennungsreaktion der Zielsubstanz beteiligt sind, muss bei den Umgebungsbedingungen beispielsweise ein geeignete Lösungsmittel, geeignete Konzentrationen der zu untersuchenden Analyte, geeignete Puffer, geeignete Temperatur, geeignete Reaktionsdauer gewählt werden. Diese sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.

Beispiele für mit dem erfindungsgemäßen Sensor nachzuweisende Zielsubstanzen sind jedoch neben Enzymen, beispielsweise auch Ionen und neutrale Moleküle.

So können beispielsweise Lactatdehydrogenase, Glucoseoxidase, Aminotransferase, Creatinkinase nachzuweisende Zielenzyme sein. Weiterhin können auch anorganische Ionen wie Lithium-. Kalium-, Magnesium-, Chlorid oder -sulfationen aber auch organische Ionen wie Acetat-, Lactat-, Taurin-, Glutamat-, oder Ammoniumionen Gegenstand der Zielsubstanz sein. Beispiele für neutrale Zielsubstanzen sind Zucker (Glucose), Alkohole, Amine, Aldehyde, Ketone aber auch Gase wie Kohlendioxid, Ammoniak, Stickoxide, Schwefeldioxid, Terpene, Geruchsstoffe und Aromen.

So können die Erkennungsbereiche beispielsweise in Kontakt mit einem Fluid stehen, das entweder ein Gas, eine Flüssigkeit, ein Dampf ein Gemisch, eine Emulsion oder ein Aerosol sein kann, in dem Zielsubstanzen verteilt sind.

Grundsätzlich kann die Wechselwirkung direkt zwischen der nachzuweisenden Zielsubstanz und der Erkennungssubstanz stattfinden, es ist jedoch auch möglich, dass als Folgereaktion auf eine erste Erkennungsreaktion eine oder mehrere weitere Reaktionen stattfinden, die erst die Bestimmung eines chemischen und/oder biologischen und/oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz ermöglicht. Die Wechselwirkung kann also in mehreren Schritten ablaufen.

So kann beispielsweise eine erste Reaktion zu einer selektiven Aufnahme oder Extraktion von Ionen in die Polymerschicht bewirken. Als Folge werden dann Ionen derselben Art aus der Polymerschicht ausgestoßen. Solche Ionen können beispielsweise Wasserstoff- oder Metallionen sein Das verwendete Chromogen kann in diesem Fall als pH- bw. Metallindikator wirken.

Eine weitere Möglichkeit der Wechselwirkung besteht z.B. darin, dass eine erste Reaktion die selektive Bildung von Ammoniak zur Folge hat. Mit der Folgereaktion wird die selektive Ammoniakbildung nachgewiesen.

Eine weitere Möglichkeit der Wechselwirkung bestaht darin, dass das Chromogen direkt an das Erkennungsmolekül gebunden ist. Die Zielsubstanz bewirkt dann eine Konformationsänderung der Erkennungssubstanz, wodurch eine Änderung der optischen Eigenschaften des Chromogens verursacht wird (z.B. durch optische Drehung, Änderung des Absorptionsspektrums oder Änderung des Brechungsindexes). So ist es auch möglich, dass Erkennungsmolekül reversibel mit der Zielsubtanz reagiert und eine kovalente bindung eingeht, bzw. bricht (nukleophile Addition der Zielsubstanz). Durch die selektive chemische Reaktion wird das konjugierte System, das Chromogen und Erkennungsmolekül verbindet, unterbrochen und es kommt zu einer Änderung der optischen Eigenschaften.

Es ist bevorzugt, dass die Erkennungssubstanz bei oder nach Wechselwirkung der Erkennungssubstanz mit der Zielsubstanz elektromagnetische Strahlung im UV/VIS- B ereich absorbiert. Damit ist eine einfache Detektion mittels der Messung des Absorptionsmaximums durch bekannte Messtechniken wie UV/VIS Spektroskopie oder Fluoreszenzspektroskopie bei oder während der Wechselwirkung der Erkennungssubstanz mit der Zielsubstanz möglich.

Die Erkennungssubstanz ist vorzugsweise in oder auf der optisch transparenten Schicht verankert. Die Verankerung kann beispielsweise durch Eintauchbeschichtung („dip coating") erfolgen.

Bevorzugt umfasst die Erkennungssubstanz selber ein Chromogen, das entweder schon im sichtbaren Bereich absorbiert bzw. dann absorbiert, wenn das Chromogen bzw. die ein Chromogen umfassende Erkennungssubstanz mit der Zielsubstanz wechselwirkt.

Unter Chromogenen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Moleküle verstanden, die elektromagnetische Strahlung, beispielsweise sichtbares Licht, UV oder IR, absorbieren können. Der Begriff "Chromogen" umfasst dabei erfindungsgemäß auch die sogenannte Leukoform, wie auch das eigentliche Chromophor, das insbesondere im Bereich des sichtbaren Lichtes absorbiert. Üblicherweise zeichnen sich Chromogene durch ausgedehnte konjugierte Verbindungssysteme aus, bei denen die π-π^*"Übergänge ins Sichtbare verschoben sind.

Bevorzugte Chromogene sind beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe von Chromogenen, die als Grundkörper Nilblau (15-Amino-9-diethyl amino)-benzo [a]- phenoazin-7-imuchlorid), Meldolablau (19-Dimethylamino-benzo [a] phenoxazimyliumchlorid), oder Naphthochinone und nitrierte Paracyclophane bzw. deren substituierte Derivate, aber nicht beschränkt darauf. Im Rahmen der Erfindung sind sämtliche den erfindungsgemäßen Zweck erfüllenden Chromophore einsetzbar. Insbesondere sind jedoch diejenigen, die in der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung Nr. 102 51 893.9 bzw. in der entsprechenden PCT-Anmeldung offenbart sind, besonders gut geeignet.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt solche Chromogene eingesetzt, die elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge von mehr als 480 nm absorbieren, so dass beispielsweise auch gefärbte Gase bzw. Flüssigkeiten bei der Messung nicht interferieren. Dies ist insbesondere dann bevorzugt, wenn beispielsweise in einem Medium wie Blut gemessen wird, das aufgrund des Hämoglobins bei ungefähr 450 nm absorbiert.

Bevorzugt ist das Chromogen an eine Aminosäuresequenz gebunden, die beispielsweise in einfacher Form als Linker auf einem Substrat dienen kann und mittels an sich bekannter Methoden einfach auf diesem Substrat bzw. einem Träger verankert werden kann.

Die Aminosäuresequenz umfasst vorzugsweise 1 bis etwa 15 Aminosäuren, bevorzugt 2 bis etwa 6 und am meisten bevorzugt 3 Aminosäuren. Grundsätzlich kann die Aminosäuresequenz aus einer beliebigen Reihenfolge beliebiger Aminosäuren bestehen. Geeigneterweise wird jedoch ein Oligopeptid verwendet, das eine für ein bestimmtes Enzym spezifische Erkennungssequenz aufweist. Im Rahmen einer bevorzugten

Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz insbesondere Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan oder ihre jeweiligen Homologen.

Ein Linker ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Atom oder Molekül, das zwischen Chromogen und Peptid angeordnet ist. Ein Linker ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere jede Verbindung, die in der Lage ist, mit der Aminosäuresequenz eine Peptidbindung auszubilden und den Abstand zwischen dem Chromogen und der Aminosäuresequenz vergrößert. Der Linker kann daher beispielsweise ein linearer oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter Alkyl(en)rest mit 1 bis etwa 40 C-Atomen sein, es ist jedoch ebenso möglich, dass der Linker Cycloalkyle enthält. Die Beschaffenheit des Linkers muss im wesentlichen nur die Vorraussetzung erfüllen, dass die proteolytische Aufspaltung der Peptidbindung zwischen Linker und Aminosäuresequenz durch ein geeignetes Enzym möglich ist. Im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Linker mindestens die Länge eines Ethyl-, insbesondere mindestens die eines Proyplrestes aufweist. Im Rahmen einer besonderen Ausführungsformen eignen sich beispielsweise 4-Aminobenzoesäure und 1,4-Phenylendiamin als Linker.

Weiter bevorzugt ist, dass zwischen Chromogen und Aminosäuresequenz ein Linkerbaustein angeordnet ist, der die Verlängerung der bindenden Aminosäuresequenz ermöglicht und weiter auch durch die Einführung geeigneter Linkerbausteine gewährleistet, dass Chromogen und Aminosäuresequenz zusammen ebenfalls optisch transparent sind.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiter durch eine Vorrichtung zur Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz gelöst, umfassend

b) einen erfindungsgemäßen Sensor

c) eine Quelle für elektromagnetische Strahlung

d) einen Detektor für elektromagnetische Strahlung.

Damit wird der erfindungsgemäße Sensor in einfacher Weise in herkömmliche übliche Apperaturen, beispielsweise zur photometrischen Messung bzw. zur Messung von UV/NIS-Absorption, integriert, so dass ein einfacher Aufbau resultiert.

Vorteilhafterweise ist der Sensor innerhalb der Vorrichtung in einer Durchflusszelle angeordnet, so dass damit besonders einfach kontinuierlich eine Zielsubstanz bestimmt werden kann, beispielsweise während eines Experimentes oder während einer Operation. Dabei ist bevorzugt, dass die Zielsubstanz in einem kontinuierlich durch die Durchflusszelle geführten Fluid enthalten ist.

Bevorzugt findet die erfindungsgemäße Vorrichtung Verwendung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von elektrisch geladenen und/oder elektrisch ungeladenen Zielsubstanzen. Da jede Zielsubstanz nur mit einem einzigen Erkennungsbereich spezifisch wechselwirkt, kann damit eine Vielzahl von Elektrolyten, d.h. elektrisch geladen oder allgemein Analyten, d.h. elektrisch ungeladenen Zielsubstanzen einfach bestimmt werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiter durch ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Enzymaktivitäten gelöst, das folgende Schritte umfasst:

a) In-Kontakt-bringen eines Fluids enthaltend ein Enzym mit einem erfindungsgemäßen Sensor, bei dem ein Erkennungsbereich ein an eine Aminosequenz gebundenes Chromogen umfasst

b) Einkoppeln von elektromagnetischer Strahlung einer ausgewählten Wellenlänge in den Sensor

c) Spalten der Bindung zwischen Chromogen und Aminosäuresequenz

d) Freisetzen des Chromogens

e) Bestimmen des Absorptionsmaximums für die gewählte elektromagnetische Strahlung des freigesetzten Chromophors,

wobei die Reihenfolge der Schritte a) und b) beliebig ist.

Die Quantifizierung eines Analyten bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Ermitteln einer Masse, Konzentration oder Aktivität von Analytmolekülen und Ionen. Bevorzugt ist zwischen Chromogen und Aminosäuresequenz ein Linkerbaustein angeordnet, der weiter bevorzugt eine Peptidbindung ausbildet. Dies gewährleistet, dass spezifisch diese Peptidbindung gespalten wird, wodurch anschließend das Chromophor freigesetzt wird.

In Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Spaltung des Chromogens von der Aminosäuresequenz enzymatisch.

Enzyme im Sinne der Erfindung sind hochspezialisierte Proteine, die biochemische Reaktionen katalysieren ohne dabei verbraucht zu werden. Ribozyme, die unter dem Begriff Enzyme subsumiert werden können, umfassen Ribonukleinsäuremoleküle. Enzyme übertreffen in ihren katalytischen Eigenschaften synthetische Katalysatoren. Enzyme weisen eine hohe Affinität und Selektivität zu bestimmten Substraten auf. Wichtig unter den Enzymen sind insbesondere Protestasen, die sogenannten Serinproteasen I, wie beispielsweise Trypsin, bakterielle Serinproteasen II, wie beispielsweise Subtilisin, Zysteinproteasen wie Papain, Aspertatproteasen, wie Penicilopepsin, Metalloproteasen I wie Borincoridoxidpeptidase A, bakterielle Metalloproteasen II, wie Thermolysin, umfassen. Proteasen verdauen stets an einer bestimmten Stelle an einem Peptid bzw. Protein. Endopeptidasen hydrolisieren innerhalb eines Proteins bestimmte Amidbindungen, während Exopeptidasen C oder N terminal eine bis drei Aminosäuren vom Peptid abspalten.

Nachfolgend ist die Erfindung anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen weiter erläutert. Es versteht sich von selbst, dass die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in Alleinstellung, sondern auch in beliebigen Kombinationen untereinander den Erfindungsgedanken veranschaulichen. Fig. 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Sensor;

Fig. 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung in einem Durchflusssystem;

Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors.

In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßer Sensor 100 dargestellt. Dieser umfasst einen Träger (Substrat) 101 aus beispielsweise SiO₂ oder einem ähnlichen, dem Fachmann an sich bekanntem, optisch transparentem Material, das für derlei Zwecke geeignet ist. Der Träger kann aber auch beispielsweise aus Kunststoff/Polymeren im Spritzgussverfahren mit aufgebrachten Wellenleiter (Hochvakuum Beschichtung) aus Tantalpentoxid, Siliciumoxid bzw. Titandioxid bestehen bzw. aus Mischungen davon. In diesem Falle spricht man von einem so genannten disposable Chip. In Folge Eigenfluoreszenz ist dieser Chiptyp bei Fluoreszenzmarkierung von Peptiden und anderen Molekülen üblicherweise nicht verwendbar. Dennoch kann er im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, da die Anregungswellenlänge üblicherweise im UV oder doch im blauen Anteil des Absorptionsspektrums liegt. Dies ist besonders vorteilhaft für Wegwerf-Bioassays (zum Einmal gebrauch). Der Brechungsindex des Trägers 101 beträgt n₀ = 1,45 (589 nm). Auf dem Träger 101 ist eine zweite Schicht aus einem optisch transparenten Material, wie beispielsweise Ta₂O₅, mittels an sich bekannter Techniken angeordnet. Die Dicke der Ta₂O₅ -Schicht beträgt ca. 100 bis 500 nm, bevorzugt 100 bis 200 nm. Träger 101 und die Schicht 102 stellen somit einen dem Fachmann an sich bekannten "Dünnschichtwellenleiter" dar. Die optisch transparente Schicht aus Υ fi _s weist im vorliegenden Fall eine Schichtdicke von ca. 160 nm auf. Der Brechungsindex dieser Schicht beträgt n = 2,21 (589 nm). Auf der optisch transparenten Schicht 102 aus Ta₂0₅ ist ein Erkennungsbereich 103 angeordnet. Dieser Erkennungsbereich 103 kann beispielsweise aus einer Monolage von Erkennungssubstanzen, beispielsweise von an Peptide gekoppelten Chromogenen bestehen, jedoch auch eine Schicht beispielsweise aus PVC/DOS sein, in der Erkennungsmoleküle verteilt sind. Der Brechungsindex des Erkennungsbereichs beträgt etwa n = 1,33 bis 15.

Mittels an sich bekannter Methoden, wie beispielsweise Ätzen mit HF oder ähnlich geeigneten fluorierten Mitteln, ist an dem Substrat 101 aus SeO₂ eine Gitterstruktur 104 (Bragg Gitter) zur Einkopplung elektromagnetischer Strahlung, bevorzugt Licht sichtbarer Wellenlänge, angebracht. Ein zweites Gitter befindet sich hinter dem Erkennungsbereich 103 und ist ebenfalls als Bragg Gitter ausgestaltet. Je nach Anwendung bzw. je nach Substrat kann es vorteilhaft sein, auch sogenannte Slanted Bragg Gitter oder ähnliche Gitterarten zu verwenden. Die Erkennungsbereiche 103 stehen in Kontakt mit einem Fluid 106, das entweder ein Gas oder eine Flüssigkeit oder ein Dampf sein kann, in dem Zielsubstanzen verteilt sind, die mit dem Erkennungsbereich bzw. der Erkennungssubstanz im Erkennungsbereich 103 wechselwirken können. Licht sichtbarer Wellenlänge wird, dargestellt durch den Pfeil 107, bei der Messung mittels des erfindungsgemäßen Sensors 100 über ein Bragg Gitter 104 eingekoppelt und erzeugt aufgrund der dünnen Schichtwellenleiterschichtstruktur ein sogenanntes evaneszentes Feld, von dem die geführte Lichtwelle 108 in Fig. 1 dargestellt ist. Der Einkopplungswinkel Θ beträgt bei einer Wellenlänge von 674 nm - 3,3378° und bei einer Wellenlänge von Θ = 641 nm + 2,5987°. Das Licht koppelt anschließend am Auskopplungsgitter 105 aus und ist mit dem Pfeil 109 dargestellt. Mittels des evaneszenten Feldes 108 wird die sich ändernde Transparenz der optischen Schichtstruktur der Schicht 102 mit dem Erkennungsbereichen 103, die ebenfalls in einer anderen Ausführungsform integraler Bestandteil der Schicht 102 sein können, gemessen. Durch die gleichzeitige Änderung von Brechungsindex und Absorption, die mittels des evaneszenten Feldes gemessen werden kann, ändern sich die Eigenschaften der beiden Schichten im Verlaufe der Messung, die mathematisch beispielsweise durch eine Kramers-Kronig-Transformation erfasst werden können. Änderungen, die durch die Wechselwirkung einer Zielsubstanz im Fluid 106 mit dem Erkennungsbereich 103, der eine Zielsubstanz umfasst, die in Fig. 1 nicht dargestellt ist, werden somit einfach optisch erfasst. Diese Änderungen sind beispielsweise insbesondere Farbänderungen, die anschließend durch Abschwächung des evaneszenten Feldes des Lichtes gemessen werden können.

Fig. 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung im Durchflussmodus zur Messung chemischer, biologischer und physikalischer Eigenschaften von Zielsubstanzen. Die Vorrichtung 200 umfasst dabei einen erfindungsgemäßen Sensor, umfassend einen Träger 202, beispielsweise bestehend aus Siliziumdioxid wie vorstehend bei Fig. 1 geschildert, darauf angeordnet eine optisch transparente Schicht 206, beispielsweise aus Ta₂O₅, die eine weitere Beschichtung 207 umfasst. Das Ensemble aus Träger 202, optisch transparenter Schicht 206 und der weiteren Beschichtung wird vorliegend auch als „Chip" oder „optischer Chip" bezeichnet. In der Beschichtung 207, die ebenfalls optisch transparent sein kann, befinden sich die Erkennungssubstanzen. In einer weiteren Ausführungsform sind die Erkennungssubstanzen auf der optisch transparenten Schicht 206 direkt an einer Monolage aufgebracht, wobei auch verschiedenartige Substanzen in verschiedenen Erkennungsbereichen, die voneinander getrennt sein können, aufgebracht sind und die Beschichtung 207 dient nur dazu, dass im Durchflussmodus die aufgebrachten Substanzen auf der Schicht 206 nicht vom Fluid weggespült werden. Die Beschichtung 207 kann aus jedem für diese Art von Beschichtung geeignetem Material bestehen. Am Träger 202 sind Mittel zum Einkoppeln elektromagnetischer Strahlung 203, beispielsweise wie vorstehend beschriebene Bragg Gitter sowie Auskoppelgitter 204, die ebenfalls wie vorstehend beschrieben Bragg Gitter sein können, angeordnet. Das zu untersuchende Fluid strömt durch den Eingang 210 in die Durchflusszelle 201 und wird an der Oberfläche der Beschichtung 207 in Kontakt mit den Erkennungssubstanzen in den Erkennungsbereichen kommen und wechselwirken. Das Fluid strömt durch den Ausgang 211 weiter in den Kreislauf zurück. Die Vorrichtung 200 wird auch als „Messzelle" bezeichnet. Die Messzelle kann in einer weiteren Ausführungsform so gebildet werden, dass der Chip, der mehr als eine Spur der aufgebrachten chemischen selektiven Komponenten (Erkennungsbereich) bzw. der Referenz-/ Blindkomponenten (Referenzbereich) nebeneinander enthält, mit einem (mikro- bzw. mini- strukturierten zweiten Plättchen beispielsweise aus Glas, Plastik, Metall, Keramik oder einem sonstigen geeigneten Material / Chip gedeckt wird. Unter „Spur" wird verstanden, dass der Erkennungsbereich bzw. der Referenzbereich in Form einer im Wesentlichen geraden Linie ausgebildet ist. Natürlich ist auch jede andere geometrische Abbildung an Stelle einer Linie, sofern sie für den gemeinsamen Zweck geeignet ist erfindungsgemäß einsetzbar. Die Struktur des Plättchen/Chip entspricht den Spuren. Das heißt, dass in der den Spuren zugewandten Teils des Plättchens/Chip entsprechende Vertiefungen (Rillen) angebracht sind, die zu der jeweiligen geometrischen Struktur der Spuren auf dem Chip komplementär sind. Die Rillen bilden die eine Seite des Fliesskanals, durch welchen die Probe fliesst. Sie trennen gleichzeitig die Spuren voneinander und isolieren sie gegen das Ausfliessen von Lösung. Die Probe kommt im Fliesskanal in direkten Kontakt mit den chemisch selektiven Komponenten. So können nebeneinander Blindreaktion, Kalibratoren, positive und negative Kontrollen bzw. verschiedene Proben oder verschieden selektive Spuren parallel bzw. gleichzeitig ausgemessen werden.

Die Proben werden über entsprechende Nippel, Ventile, Spritzen etc in die Kanäle/Rillen am Eingang bzw. den Eingängen 210 eingeführt. Flüssigkeiten bzw. Gase (LAL-Enzym, Konditionierlösungen (z.B. Puffer), Lösungsmittel, Reinigungslösungen, Kalibrierlösungen) können auf demselben Wege PC gesteuert, automatisch (oder vor Hand) in Kontakt mit den selektiven chemischen Komponenten gebracht werden. Entsprechendes gilt für den bzw. die Ausgänge 211.

Die Lichtquelle 208 kann alle Kanäle/Rillen umfassend die Erkennungs-/Referenzbereiche gleichzeitig beleuchten und analysieren oder seriell arbeiten (periodische Umlenkung des

Lichtstrahls). Eine intermittierender Beleuchtung wird vorgezogen um die Photostabilität der Chromogene nicht zu strapazieren. Dasselbe gilt für den Lichtstrahl zur Detektion, der wieder aus dem Chip ausgekoppelt wird.

Während des Durchflusses liegt am optischen Sensor der Vorrichtung 200 ein evaneszentes Feld an. Dieses stammt von einer Lichtquelle 208, die in einem ersten Winkel Φ eingestrahlt wird, wodurch ein evaneszentes Feld mit einer geführten Lichtwelle 205 im evaneszenten Feld resultiert, die in dem Substrat und der optischen Schicht 202 bzw. 206 geführt wird. An den Bragg Gittern 204 koppelt die Lichtwelle 205 in einem ersten Winkel Φ₂ wieder aus. Das abgeschwächte Licht wird am Detektor 209 registriert und einer Messgröße zugeordnet.

Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors 300. Der Sensor 300 besteht dabei aus einem wie vorstehend definierten Träger 301, auf dem eine wie vorstehend definierte optisch transparente Schicht 302 angeordnet ist. Bragg Gitter 303 und 304 sind zwischen dem Träger 301 und der optisch transparenten Schicht 302 mittels an sich bekannter Methoden angeordnet und ermöglichen das Ein- bzw. Auskoppeln elektromagnetischer Strahlung, insbesondere von sichtbarem Licht. Das eingekoppelte Licht erzeugt eine geführte Lichtwelle 307 im derart entstehenden evaneszenten Feld des Dünnschichtwellenleiters .

Als Lichtquelle für das eingekoppelte Licht 306 wird bevorzugt ein thermostabiler Halbleiterlaser mit integrierter, justierter und abgeglichener Optik und Elektronik verwendet. Das Modul verfügt über eine Lichtfrequenzstabilität von weniger als 0,2 nm und hat bevorzugt digitale Temperatur- und Stromausgänge. Bevorzugte Arbeitstemperaturen betragen 15° bis 40°C.

Die Durchflussmesszelle umfasst zwei Kammern und ist für kleine Probenvolumina optimiert. Sie verfügt über eine justierbare Positionierung des optischen Sensors und kann bevorzugt mittels eines sogenannten Schwenkverschlusses geschlossen werden. Die Durchflussmesszelle ist thermisch entkoppelt und thermostabil. Der Thermostatisierungsbereich umfasst 20°C bis 40°C bei einer Umgebungstemperatur von 15°C bis 40 °C.

Ausführungsbeispiele

Ausführungsbeispiel 1

Einbettung der Peptidsubstrate in eine Polymermembran

Zur Einbettung der Peptidsubstrate in eine Polymermembran muss das Peptidsubstrat ampiphile Eigenschaften aufweisen, damit es sich an der Grenzfläche zwischen Membran und Probelösung ausrichtet. Dies erfolgt wie vorliegend durch die Anknüpfung eines der lipophilen Chromogene, nicht aber durch Anknüpfen eines oder mehrerer lipophiler Gruppen an das Peptidende des Substrates. In diesem Falle würde der Farbstoff mitsamt der Peptidkette in die Probelösung hineinreichen, mit dem Peptid abgespalten werden und von der Membran weg diffundieren. Da bereits das Chromogen des ungespaltenen Substrats außerhalb der Reichweite des Evaneszensfeldes, ca. 100 nm, liegt, würde sich mit der Verdauung des Substrates keine Abschwächung der Moden im Wellenleiter ergeben und die Spaltungsreaktion unbemerkt ablaufen. Wichtig ist also, dass sich, sofern die erfindungsgemäße Erkennungssubstanz in einer PVC/DOS Membran befindet und sich der Farbstoff aufgrund seiner Lipophilie oder den angeknüpften lipophilen Gruppen vorwiegend in der Membran verteilt, was damit auch im evaneszenten Feld zu einer Abschwächung des Modes führen kann. Die Verteilung erfolgt dabei rasch und gleichmäßig. Bei langsamer Verteilung würde sonst nicht mehr die Aktivität der Proteasen in der Probelösung, sondern vielmehr die Verteilungskinetik des abgespaltenen Chromogens in der Membran gemessen. Ungeeignet ist ein Chromogen, dessen Absorptionsmaximum sich bei der Abspaltung vom Substrat nicht verschiebt, falls keine ungespaltenen Substratmoleküle in Form von Umkehrmizellen in der Membran vorhanden sind. Ein Ausschluss solcher Umkehrmtzellen lässt jedoch durch ein Gehalt unterhalb der kritischen Mischmizellbindungskonzentration steuern. Außerdem wirken nur Moleküle, die ein Verhältnis von hydrophyl/lipophil (hlb) von 3 - 6 aufweisen als Wasser in Öl (W-O) Emulgatoren.

Als Membrankomponenten im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden lipophile Membrankomponenten verwendet, damit sie nicht in beispielsweise wässrigen Proben ausgewaschen werden. Insbesondere wird als lipophile Wahlmatrix bevorzugt hochmolekulares Polyvinylchlorid (PVC) verwendet. PVC hat eine hohe Chemikalienbeständigkeit und niedrige Gas- und Dampfdurchlässigkeit. Sämtliche Polymere, die in erfindungsgemäßen Sensormembranen zum Einsatz kommen, weisen eine Gasübergangstempertur T_g auf, die tiefer als die Raumtemperatur ist. Daher kann hochmolekulares PVC mit einer T_g von ca. 80°C nur zusammen mit Weichmachern zur Herstellung von Optodenmembranen eingesetzt werden. Ansonsten würde eine spröde, amorphe, unflexible Substanz entstehen, die auch keine Haftung auf einem Wellenleiter zeigen würde. Weitere bevorzugte Verbindungen zur Ausbildung von Membranen bzw. Matrizes sind Polyurethane, Poly(vinylidenchlorid) und Polysiloxan.

Weichmacher sind schwerflüchtige Flüssigkeiten, die sich aufgrund ihrer Affinität zwischen die Matrixmoleküle einschieben und intermolekularen Kräfte abschwächen. Das Resultat dieser Wechselwirkungen sind verbesserte Membraneigenschaften bezüglich Flexibilität, Haftfähigkeit und Plastizität. Sämtliche Weichmacher, die nicht zu lipophil sind, da sonst die Ansprechzeit unerwünscht verlängert würde, können erfindungsgemäß verwendet werden. Jedoch sollen die Weichmacher auch nicht zu hydrophil sein, da es sonst, beispielsweise beim Einsetzen in einem Durchflusssystem mit Analytlösungen ausgewaschen werden kann und die Membran eine sehr kurze Lebensdauer hätte. Bevorzugt ist beispielsweise Bis(2-Ethylhexyl)sebacat(dioctylsebacat,DOS).

Zur Aufbringung der Membran auf Wellenleitern wurde allgemein als Lösungsmittel Tetrahydrofuran verwendet, obgleich jedes andere ebenso schnell verdunstende Lösungsmittel genau so eingesetzt werden kann.

Die Immobilisierung des Peptidsubstrates kann in einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung auf der Oberfläche der optisch transparenten Schicht erfolgen. Sofern ein Monolayer der Erkennungssubstanz kovalent oder durch andere Techniken, z.B. durch Anlagerung von substratderivatisierten Biotin an Avidin auf der Oberläche, d.h. direkt auf der Wellenleiteroberfläche immobilisiert wird, so dringt das evaneszente Feld in die Probelösung ein. Es dürfen in diesem Fall in der Probelösung keine Störkomponenten vorhanden sein, die im Bereich der Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes absorbieren. Durch die Wahl von Lichtquellen im Bereich von ca. 600 - 800 nm wird die Gefahr für biologische Proben bereits ausgeschlossen. In diesem Fall diffundiert das Chromogen nicht in das Evaneszensfeld hinein, sondern entfernt sich nach der Abspaltung. Dies führt zu einer Signalversperrung im Gegensatz zur beschriebenen Signalabschwächung bei Membranen.

Peptidsequenzsubstrate können auf der Wellenleiteroberfläche z.B. kovalent oder durch Biotin-Avidin-Kopplung angebunden werden. Um zu verhindern, dass diese Substrate nicht mehr von den Proteasen umgesetzt werden können, weil die Proteasen so dicht an der Wellenleiteroberfläche durch sphärische Hinderungen nicht in der Lage sind, das Substrat in der erforderlichen Maß zu umschließen, kann es vorteilhaft sein, einen Linkerbaustein zwischen die Anheftungsstelle auf dem Wellenleiter und der Peptidsequenz des Substrates einzubinden, damit die Substratmolekule soweit in die Probelösung hineinreichen, damit die Proteasen Zugang zum Substrat erhalten und es spalten können. Methoden der kovalenten Verankerung bzw. via Biotin-Avedin-Kopplung sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik gut bekannt.

Ausführungsbeispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die optische Messtechnik auf einem planaren optischen Dünnfilm- Wellenleiter.

2.1 Grundlagen und Definition von verwendeten Größen:

Absorptionsmessung gemäss IUPAC - Definition wird wie folgt definiert:

Absorptionsfaktor α a = Φ_abs / Φ₀„ Φ = Strahlungsenergie Dekadische Absorption: A₁₀ = - lg (l - α)

Linearer dekadischer Absorptionskoeffizient, : A₁₀ / l (m^"1)

Molarer (linearer dekadischer) Absorptionskoeffizient ε : A₁₀ / c ^■ l (m² • mol^"1)

Absorbanz als Messgrösse für die Konzentration einer Substanz / eines Analyten infolge der Absorption von Licht einer definierten Wellenlänge:

-A,₀ = lg (Φ₀ / Φtrans ) = £ . C . I

Dies bedeutet, dass die gemessene Absorbanz direkt proportional dem Absorptionskoeffizienten der absorbierenden Substanz, der Länge der durchsstrahlten Schichtdicke und der Konzentration der absorbierenden Substanz ist.

Die Absorbanzmessung dann besonders sensitiv, wenn der Analyt einen hohen Absorptionskoeffizienten aufweist, wenn die Analysenwellenlänge zur Diskriminierung zwischen Hintergrund und Analyt beiträgt und wenn mit hoher Schichtdicke / Eindringtiefe des Lichtstrahls gearbeitet werden kann ohne dass die Probe durchstrahlt werden muss (unspezifische Absorption).

Dies ist bei der sog. ATR-Technik (attenuated reflection) gewährleistet, bei der das Licht in einem planaren Wellenleiter entlang der Probe geführt werden kann und nur eine geringer Anteil des Lichtes innerhalb des Evaneszenzfeldes mit der Probe bzw. dem Analyten in Kontakt steht.

Im Falle des planaren Wellenleiters wird die Schichtdicke ersetzt durch die Eindringtiefe des Evaneszenzfeldes (d_p / nm) in die Probe und die Länge des Wellenleiters (l / m) entlang dem das Licht geführt wird. Zusätzliche Parameter sind der Einkopplungswinkel des Lichtstrahl in den Wellenleiter, die Brechungsindices der benachbarten Medien und die Wellenlänge des Lichtes, die die Eindringtiefe des Evaneszenzfeldes direkt mitbestimmen. Die Eindringtiefe steigt mit der Langwelligkeit der analytischen Lichtquelle (direkt proportional) und sinkt mit der Brechzahl des Wellenleiters relativ zur Brechzahl der Probe.

Ein weiterer Faktor, der die Absorbanz beeinflusst, ist die Querschnitt-Dicke des Wellenleiters. Typische ATR-Einrichtungen / ATR-Kristalle / ATR- Wellenleiter weisen eine Dicke im Bereich von 100 Mikro- bis einigen Millimetern auf. Je dicker ein Wellenleiter ist, desto weniger interne Reflektionen resultieren. Im Falle der klassischen ATR-Technologie bildet sich jedoch nur dort ein Evaneszenzfeld aus, wo interne Lichtbrechung / Reflektion erfolgt. Die Absorption summiert sich über die endliche Anzahl Reflektionen auf (z.B. 1 bis 50 Reflektionen entlang mehreren Milli- bzw. Zentimetern Länge des Wellenleiters).

Im Gegensatz dazu beträgt die Querschnittdicke eines Dünnfilm- Wellenleiters nur einige zehn Nanometer (z.B. 60 bis 150 nm (1 nm = 10^"9 m)). In diesen Filmen breitet sich der Lichtstrahl idealerweise in einem einzigen „mode" aus (monomodale Welle) und in quasi unendlich vielen Reflektionen. Dadurch bildet sich ein quasi kontinuierliches Eveanszenzfeld entlang des Wellenleiters aus und es resultiert bereits auf wenigen Millimetern eine höhere Absorption als entlang einigen cm der traditionellen ATR- Kristalle. Die Verwendung dieser Technik zur Absorptionsmessung ist deshalb besonders attraktiv, beansprucht jedoch ein sehr fortgeschrittenes Know-how. Das Licht wird dabei idealerweise über Brechungsgitter eingekoppelt (Alternative: Stirnseite des Kristalles).

2.2 Spezielles Ausführungsbeispiel:

physikalische Randbedingungen: Wellenleiterfilm (optisch transparente Schicht aus Tantalpentoxid mit einer Dicke von 150 nm und einer Gitterperiode von 360 nm; Die Brechzahl des Erkennungsbereichs (PVC/DOS Film) wer 1.440; Die Brechzahl des Wellenleiters = 2.114; die Brechzahl des Trägermaterials (Siliciumdioxid) = 1.5238; Absorbanz der elektrischen Feldkomponente (mode, m = 0):

Aufgrund der wesentlich höheren Anzahl Reflektionen ist das totale Absorptionssignal im Bereich des NIR um einen Faktor von 10 bis 100-fach verstärkt gegenüber dem Absorptionssignal, das bei Durchstrahlung einer 4 - 6 Mikrometer dicken selektiven Membran gewonnen wird.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1 . Sensor zur Bestimmung eines chemischen und/oder biologischen und/oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz, umfassend

a) einen Träger

b) eine optisch transparente Schicht, die auf dem Träger angeordnet ist

c) Mittel zur Ein- und Auskopplung elektromagnetischer Strahlung

dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht einen Erkennungsbereich aufweist, der eine Erkennungssubstanz umfasst, die mit der

Zielsubstanz wechselwirkt.

2. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger optisch transparent ist.

3 . Sensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Erkennungsbereich eine optisch transparente Schicht ist, die eine Erkennungssubstanz enthält.

4 . Sensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Erkennungsbereich im wesentlichen aus einer Erkennungssubstanz oder aus einer Mischung verschiedener Erkennungssubstanzen besteht.

5 . Sensor nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Erkennungsbereich einen niedrigeren Brechungsindex als die optisch transparente Schicht aufweist.

6 . Sensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Erkennungsbereichen vorhanden sind.

7. Sensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Erkennungsbereich eine unterschiedliche Erkennungssubstanz oder Mischungen von Erkennungssubstanzen umfaßt.

8. Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiterer Erkennungsbereich als Referenzbereich ausgestaltet ist.

9. Sensor nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Ein- und/oder Auskopplung der elektromagnetischen Strahlung zwischen Substrat und optisch transparenter Schicht angeordnet sind.

10. Sensor nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkung zwischen Erkennungssubstanz und Zielsubstanz in einem oder mehreren Schritten abläuft.

11. Sensor nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkung zwischen Erkennungssubstanz und Zielsubstanz reversibel oder nicht reversibel ist.

12. Sensor nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungssubstanz in oder auf der optisch transparenten Schicht verankert ist.

13. Sensor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Ein- und/oder Auskopplung der elektromagnetischen Strahlung als Gitterstruktur ausgebildet sind.

14. Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungssubstanz ein Chromophor umfaßt.

15. Sensor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Chromophor elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge von mehr als 480 nm absorbiert.

16. Sensor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Chromophor an eine Aminosäuresequenz gebunden ist.

17. Sensor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Chromophor und Aminosäuresequenz ein Linkerbaustein angeordnet ist.

18. Vorrichtung zur Bestimmung eines chemischen und oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz umfassend a) einen Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, b) eine Quelle für elektromagnetische Strahlung, c) einen Detektor für elektromagnetische Strahlung.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor in einer Durchflusszelle angeordnet ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, weiter umfassend Mittel zum kontinuierlichen Durchführen einer Zielsubstanz durch die Durchflusszelle.

21. Vorrichtung, nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielsubstanz in einem Fluid enthalten ist.

22. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21 zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von elektrisch geladenen und/oder elektrisch ungeladenen Zielsubstanzen.

23. Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz mit einem Biosensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis

17, umfassend die Schritte

a. Bestimmung eines Ausgangszustandes vor der Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz

b . Bestimmung des Zustandes nach der Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz

4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Enzymaktivitäten, umfassend die Schritte

a) in-Kontakt-bringen eines Fluids enthaltend ein Enzym mit einem Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 17 bei dem ein Erkennungsbereich ein an eine Aminosequenz gebundenes Chromophor umfaßt b) Einkoppeln von elektromagnetischer Strahlung einer ausgewählten Wellenlänge in den Sensor c) Spalten der Bindung zwischen Chromophor und Aminosäuresequenz d) Freisetzen des Chromophors e) Bestimmen des Absorptionsmaximums für die gewählte elektromagnetische

Strahlung des freigesetzten Chromophors

wobei die Reihenfolge der Schritte a) und b) beliebig ist.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Chromophor und Aminosäuresequenz ein Linkerbaustein angeordnet ist.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Linkerbaustein zu der Aminosäuresequenz eine Peptidbindung ausbildet.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Peptidbindung zwischen Linkerbaustein und Aminosäuresequenz gespalten wird.