WO2004042377A1 - Sensor zur bestimmung von analyten sowie verfahren zur bestimmung von enzym-aktivitäten - Google Patents

Sensor zur bestimmung von analyten sowie verfahren zur bestimmung von enzym-aktivitäten Download PDF

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WO2004042377A1
WO2004042377A1 PCT/EP2003/012462 EP0312462W WO2004042377A1 WO 2004042377 A1 WO2004042377 A1 WO 2004042377A1 EP 0312462 W EP0312462 W EP 0312462W WO 2004042377 A1 WO2004042377 A1 WO 2004042377A1
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WO
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substance
sensor according
detection
sensor
optically transparent
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Application number
PCT/EP2003/012462
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English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Spichiger
Ursula Spichiger-Keller
Michael Linnhoff
Gleb Zhylyak
Original Assignee
C-Cit Ag
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection

Definitions

  • the present invention relates to a sensor for determining a chemical, biological or physical parameter of a target substance, a device for
  • EP 0903573 A2 discloses an optode for determining gases using a gas-sensitive sensor membrane.
  • This sensor membrane includes so-called ionophores, which interact selectively with individual gases or gas components and thereby change their color, so that the absorption maxima of the complexes of action between ionophore and analyte can be measured via UV / NIS measurements.
  • WO 00/50446 discloses oligopeptide derivatives for the electrochemical measurement of the activity of proteases, in which these oligopeptide derivatives, to which an amperogenic aniline or aminoquinoline derivative is bound, are fixed on the surface of electrodes and upon reaction with an enzyme by the elimination of the electrically conductive Aniline or aminoquinoline compound occurs a change in conductivity, which can be measured directly from the electrode.
  • U.S. Patent No. 5,097,014 discloses chromogenic compounds that can be used as enzyme substrates for diagnostic applications.
  • this relates to the detection of proteolytic enzymes which cleave the bond between the chromogenic substrate and the peptide, so that the dyes released are accessible for photometric determination.
  • so-called optical chemical sensors (optodes) based on the principle of transmission measurement through the layer and the sample have been proposed in EP-A-0358991.
  • analytes can be determined in optical sensors by means of reflection measurement via optical fibers (fiber coupling and transmission of the light from the light source and backscattering of the non-absorbed light).
  • optical fibers fiber coupling and transmission of the light from the light source and backscattering of the non-absorbed light.
  • a lot of light is lost with this measurement method.
  • the large loss of light energy means that the sensitivity of this measurement technique is very low.
  • Optodes based on fluorescence measurements are also known.
  • the disadvantage here is that there is a noticeable background fluorescence of polymer materials from the sample itself, in particular from biological samples.
  • the intensity measurement is difficult to reproduce because the emission is undirected.
  • the so-called thick-film technology has been used for the absorption measurement on planar optical waveguides, ie the so-called ATR technology, for measurements in the evanescent field.
  • ATR technology the so-called ATR technology
  • the light continues discontinuously with a calculable number of internal reflections in the waveguide.
  • light is absorbed by an adjacent medium only at the points of internal reflection. So that will again achieved a submaximal sensitivity of the optical absorption measurement depending on the number of reflections in the waveguide.
  • Another object of the invention was to provide an optical sensor in which the light does not pass through the sample.
  • a sensor for determining a chemical and / or biological and / or physical parameter of a target substance which comprises:
  • the optically transparent layer having a detection area which comprises a detection substance which specifically interacts with the target substance.
  • the present sensor according to the invention makes it possible to couple light of a defined wavelength and to completely absorb the coupled light even at an unexpectedly high dilution of detection substances, so that light transmitted neither on the end face nor via second coupling means can be determined and measured, so that the loss occurs coupled light is significantly minimized.
  • the term “unexpectedly high dilution” denotes concentrations of less than 10 "5 mol / 1, preferably less than 10 " 8 mol / 1 and very particularly preferably less than 10 "10 mol / l.
  • a sensor can in principle be any type of sensor, provided that it has the features mentioned above.
  • the sensor according to the invention can be an electrochemical sensor, an optical sensor or a biosensor.
  • chemical sensors are understood to be devices which convert chemical information, for example from the concentration of a specific component to the overall analysis of the overall composition, into an analytically meaningful signal.
  • Chemical sensors have a high selectivity towards the analyte in the sample, so that the separation or processing in the sense of a conventional analysis is often not necessary compared to conventional sensors.
  • selectivity describes the ability of the sensor to clearly identify the analyte even between very similar components in the test material. This means that even very complex samples can be analyzed.
  • chemical sensors include, but are not limited to, optodes with ionophores, such as lipophilic, pH-sensitive chromoionophores, which are commonly used for ion exchange and ion co-extraction optodes.
  • the sensitivity is at a concentration of the target substance of approx. 10 "5 mol / 1.
  • optical sensors are understood to be sensors which convert chemical information, for example the concentration, activity or the measurable presence of an analyte in a sample, into optical signals via a molecular recognition process. These optical signals are functionally related to the analyte concentration or analyte activity. In a further step, these optical signals are converted into electronic signals and provide data that, when processed, ultimately allow an interpretation of the measurement.
  • Optical sensors consume almost no reagents at all and are therefore more economical than conventional analysis systems. In optical sensors, the sensitivity is at a concentration of the target substance of approx. 10 "8 mol / 1.
  • biosensors are understood to be sensors that are based on a coupling of biomolecules that recognize specific analytes as receptors in the broadest sense with physicochemical transducers that convert a biologically generated signal into electrical measurement signals.
  • Bioactive recognition components include, but are not limited to, antibodies, enzymes, cell organelles, or whole microorganisms. Peptides and proteins are also referred to as biomolecules. However, peptides are not bioactive in that they can convert other molecules or promote specific bonds to other molecules.
  • biosensors on the one hand the so-called bioaffinity sensors and on the other hand the so-called metabolism sensors.
  • the bioaffinity sensors generate a signal by complexing bioactive molecules to form an analyte.
  • the initial state is again after the measurement. While the latter are based on a specific recognition and subsequent implementation of substrates. After the measurement process, this sensor must either be discarded or the initial state returned getting produced. With these sensors, sensitivities of 10 "10 mol / 1 and less of the target substance are achieved.
  • a molecular recognition process of the analyte or a chemical, biological or physical parameter of the target substance can be translated into a measurement signal using different techniques.
  • a chemical, biological or physical parameter to be determined is basically any change in an initial state which can be measured with a sensor according to the invention and which is triggered by the interaction of the target substance with the recognition substance.
  • the change can consist, for example, of a change in pH, change in ion concentration, change in a molecular structure, change in molecular distributions, change in conductivities or change in the absorption spectra of molecules.
  • the chemical, biological or physical parameter to be determined only affects changes that take place within the sensor, for example on the carrier or on the detection area.
  • interaction is understood to mean any interaction between molecular units, including the formation of a chemical bond (covalent or ionic), van-der-Waals interactions, hydrogen bonds, adsorption phenomena and the like.
  • a target substance has the property of being able to interact with a recognition substance of the sensor according to the invention.
  • target substances Basically there is no further restriction for target substances according to the invention.
  • a larger or smaller group of substances meet the criterion with the recognition substance to be able to interact.
  • the recognition substance can be such that only specific members of certain substance classes interact with the recognition substance.
  • the target substance can be a known substance, such as certain bacterial endotoxins, but it can also be a substance unknown to the person skilled in the art.
  • the senor according to the invention is used to screen, for example, in body fluids such as blood or plasma or in artificially produced solutions for scientific research or for medical purposes for potential target substances.
  • the sensor according to the invention further comprises a carrier.
  • carrier denotes any three-dimensional body on which an optically transparent layer according to the invention can be applied.
  • the carrier can in principle be made of any material that can withstand normal handling in the medical or chemical laboratory without the shape and nature of the carrier being significantly changed. This means that, for example, the carrier should not be sensitive to temperatures from approximately -30 ° C. to approximately 50 ° C., in particular in the range from approximately -20 ° C. to approximately 40 ° C. and in the range from approximately -10 ° C. to approximately 30 ° C.
  • the carrier is made of, for example, SiO 2 or a similar, optically transparent material which is known per se to the person skilled in the art.
  • the carrier can also consist, for example, of glass or suitable polymers.
  • suitable polymers are, for example, PVC, polyurethanes or polysiloxanes and their derivatives.
  • the refractive index is particularly preferably in the range from 605 nm to 680 nm.
  • the carrier usually has a thickness of about 0.5 mm to about 1.5 mm, preferably from 0.7 to 1.2 mm.
  • the carrier itself can consist of one layer and of 2, 3 or more layers.
  • the support on the side on which it adjoins the optically transparent layer also to have an optically transparent layer and for a further support layer to appear colored in visible light.
  • different carrier areas can be easily distinguished from one another by different colors of the carrier underside.
  • the carrier can therefore in principle be coated as desired, the coatings should not impair a sensible structure of the sensor according to the invention.
  • the carrier can furthermore be completely or partially electrically conductive or not electrically conductive.
  • the carrier is also optically transparent, so that it is possible to arrange the means for coupling and decoupling electromagnetic radiation on the carrier and to couple the light through the optically transparent carrier into the optically transparent layer.
  • the means for coupling and / or decoupling the electromagnetic radiation between the carrier and the optically transparent layer are preferably arranged, which are particularly preferably in the form of a lattice structure.
  • lattice structures such as Bragg gratings, for example, can be easily etched into substrates or carrier materials using known and simple etching techniques.
  • the carrier therefore has a lattice structure on the surface which adjoins the optical transparent layer.
  • a grating on one side of the surface, which adjoins the optical transparent layer is preferably used for coupling electromagnetic radiation, preferably light of visible wavelength.
  • a second grating is located behind the detection area and serves to couple out electromagnetic radiation, preferably light of visible wavelength.
  • the grating structure is preferably an optical grating, for example a Bragg grating. Depending on the application or the substrate, it may be advantageous to use so-called slanted Bragg gratings or similar types of gratings.
  • the optical grating is used to couple light on one side of the carrier via a grating, then to generate a so-called evanescent field due to the thin layer waveguide layer structure and to couple it out again on the other side of the carrier through the second grating.
  • optically transparent layer is arranged on the carrier.
  • “optically transparent” means that the layer has refractive indices from 1 to about 15 and has a light transmittance from about 80% to about 0%.
  • the optically transparent layer can be in the form of a single layer, but also in the form of a plurality of layers arranged one on top of the other (for example as a composite), for example 2, 3 or 4 different layers. It is only important that the multilayer composite also fulfills the properties of optical transparency as described above.
  • the optically transparent layer consists of tantalum pentoxide, silicon oxide or titanium dioxide or of mixtures thereof.
  • Ta 2 O 5 is preferably arranged on the carrier as an optically transparent layer using techniques known per se.
  • the thickness of the Ta 2 O 5 layer is approximately 100 to 500 nm, preferably 100 to 200 nm.
  • the optically transparent layer made of Ta 2 O 5 has a layer thickness of approximately 160 nm.
  • carrier and optical layer can form a so-called thin-film waveguide.
  • the optically transparent layer which is arranged on the carrier is preferably a so-called thin-film waveguide with a thickness of approximately 50 to approximately 500 nm, preferably of 100 to 200 nm, so that the so-called evanescent field is completely absorbed.
  • At least one detection area is attached to the optically transparent layer.
  • the detection area can be attached to the optically transparent layer as a further layer, or it can be an integral part of the optically transparent layer.
  • the recognition substance can be distributed in a medium, or else in pure form, on the optically transparent layer.
  • the recognition substance can already be distributed in the waveguide, or it can be enriched in a surface layer of the waveguide.
  • the detection area can be from a monolayer, for example from Peptides coupled to chromogens consist, however, of PVC / DOS, for example, in which recognition molecules are distributed.
  • Detection substances can in principle be all compounds, but in particular biomolecules such as antibodies, neutral, anionic, cationic or zwitterionic polymers or monomers, optically active molecules such as chromogens and the derivatives thereof are preferred.
  • the ensemble of carrier, optically transparent layer and detection and possibly reference area is also referred to here as a chip or optical chip.
  • the detection area itself is also an optically transparent layer which contains a detection substance. This allows the specific-acting recognition substance to be emitted in a simple manner, for example in customary known media, which ensure easy application as a film or as a layer.
  • the detection area itself essentially consists of a detection substance or a mixture of different detection substances, so that, for example, the formation of monolayers from a detection substance or from a mixture of different detection substances on the optically transparent layer is also possible in a simple manner, by anchoring the recognition substance or the mixture of different recognition substances to the optically transparent layer by means known per se.
  • the type of anchoring includes covalent bonds, ionic bonds, anchoring by Van der Waals forces, hydrogen bonds or magnetic attachments.
  • the recognition molecules can also be present in an ion exchange membrane or in a polymer film, with in particular a potassium selective ion exchange membrane has proven to be particularly suitable for a specific embodiment of the invention.
  • the membrane in which the recognition molecules are anchored can also be co-extraction systems.
  • the detection area has a lower or the same refractive index as the optically transparent layer.
  • a sensor has at least 10, preferably at least 100 and more preferably at least 200 different detection areas
  • a further detection area is designed as a reference area, which forms a so-called standard reference area.
  • Differential measurements can thus be carried out in a simple manner with respect to the detection areas provided with a detection substance.
  • Such differential measurements relate in particular to the influence of the swelling of the detection areas, in particular if the measurement is in a liquid or vapor medium, the intensity of the incident light and other non-specific variations.
  • the reference ranges can also be designed as positive controls and negative controls for the detection of the corresponding target analyte.
  • a central property of the sensor according to the invention is the interaction between the recognition substance and the target substance. Appropriate environmental conditions must be given depending on the type of interaction.
  • a suitable solvent suitable concentrations of the analytes to be examined, suitable buffers, suitable temperature, suitable reaction time must be selected under the ambient conditions.
  • target substances to be detected with the sensor according to the invention are, for example, also ions and neutral molecules.
  • lactate dehydrogenase glucose oxidase, aminotransferase, creatine kinase can be target enzymes to be detected.
  • inorganic ions such as lithium. Potassium, magnesium, chloride or sulfate ions but also organic ions such as acetate, lactate, taurine, glutamate or ammonium ions can be the subject of the target substance.
  • neutral target substances are sugar (glucose), alcohols, amines, aldehydes, ketones but also gases such as carbon dioxide, ammonia, nitrogen oxides, sulfur dioxide, terpenes, odorants and flavors.
  • the detection areas can be in contact with a fluid, which can either be a gas, a liquid, a vapor, a mixture, an emulsion or an aerosol, in which target substances are distributed.
  • a fluid which can either be a gas, a liquid, a vapor, a mixture, an emulsion or an aerosol, in which target substances are distributed.
  • the interaction can take place directly between the target substance to be detected and the recognition substance, but it is also possible that, as a follow-up reaction to a first recognition reaction, one or more further reactions take place which only require the determination of a chemical and / or biological and / or physical parameters of a target substance.
  • the interaction can therefore take place in several steps.
  • a first reaction to selectively absorb or extract ions into the polymer layer can result.
  • ions of the same type are then ejected from the polymer layer.
  • Such ions can be, for example, hydrogen or metal ions.
  • the chromogen used in this case can be used as pH or. Metal indicator act.
  • Another way of interacting is e.g. in that a first reaction results in the selective formation of ammonia.
  • the subsequent reaction detects the selective formation of ammonia.
  • the chromogen is bound directly to the recognition molecule.
  • the target substance then causes the conformation of the recognition substance to change, which causes a change in the optical properties of the chromogen (e.g. by optical rotation, change in the absorption spectrum or change in the refractive index).
  • the recognition molecule can react reversibly with the target substance and for a covalent bond to form or break (nucleophilic addition of the target substance). The selective chemical reaction disrupts the conjugated system that connects the chromogen and the recognition molecule, and the optical properties change.
  • the recognition substance absorbs electromagnetic radiation in the UV / VIS range during or after the interaction of the recognition substance with the target substance. This enables simple detection by measuring the absorption maximum using known measurement techniques such as UV / VIS spectroscopy or fluorescence spectroscopy during or during the interaction of the recognition substance with the target substance.
  • the detection substance is preferably anchored in or on the optically transparent layer.
  • the anchoring can be done, for example, by dip coating.
  • the recognition substance itself preferably comprises a chromogen, which either already absorbs in the visible region or absorbs when the chromogen or the recognition substance comprising a chromogen interacts with the target substance.
  • chromogens are understood to be molecules which can absorb electromagnetic radiation, for example visible light, UV or IR. According to the invention, the term “chromogen” also includes the so-called leuco form, as well as the actual chromophore, which absorbs particularly in the range of visible light. Chromogens are usually characterized by extensive conjugated connection systems in which the ⁇ - ⁇ * " transitions are shifted into the visible.
  • Preferred chromogens are selected, for example, from the group of chromogens which are based on Nile blue (15-amino-9-diethylamino) -benzo [a] - phenoazin-7-imuchlorid), Meldola blue (19-dimethylamino-benzo [a] phenoxazimylium chloride) , or naphthoquinones and nitrated paracyclophanes or their substituted derivatives, but not limited thereto. All chromophores which fulfill the purpose according to the invention can be used within the scope of the invention. In particular, however, are those in the unpublished German Patent application No. 102 51 893.9 or disclosed in the corresponding PCT application are particularly suitable.
  • chromogens which absorb electromagnetic radiation with a wavelength of more than 480 nm, so that, for example, colored gases or liquids do not interfere with the measurement. This is particularly preferred when, for example, measurements are carried out in a medium such as blood which absorbs at approximately 450 nm due to the hemoglobin.
  • the chromogen is preferably bound to an amino acid sequence which, for example, can serve in a simple form as a linker on a substrate and can simply be anchored on this substrate or a support by methods known per se.
  • the amino acid sequence preferably comprises 1 to about 15 amino acids, preferably 2 to about 6 and most preferably 3 amino acids.
  • the amino acid sequence can consist of any order of any amino acids.
  • an oligopeptide which has a recognition sequence specific for a particular enzyme is suitably used. As part of a preferred
  • Embodiment comprises the amino acid sequence in particular arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan or their respective homologues.
  • a linker is an atom or molecule which is arranged between the chromogen and the peptide.
  • a linker is in particular any compound which is capable of forming a peptide bond with the amino acid sequence and which increases the distance between the chromogen and the amino acid sequence.
  • the linker can therefore be, for example, a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl (s) radical with 1 to about 40 C atoms, but it is also possible for the linker to contain cycloalkyls.
  • the nature of the linker essentially only has to meet the requirement that the proteolytic breakdown of the peptide bond between Linker and amino acid sequence is possible through a suitable enzyme.
  • the linker has at least the length of an ethyl, in particular at least that of a propylene residue.
  • the linker for example, 4-aminobenzoic acid and 1,4-phenylenediamine are suitable as linkers.
  • a linker block is arranged between the chromogen and the amino acid sequence, which enables the binding amino acid sequence to be extended and furthermore also ensures by the introduction of suitable linker blocks that the chromogen and amino acid sequence together are likewise optically transparent.
  • the object of the present invention is further achieved by a device for determining a chemical, biological or physical parameter of a target substance, comprising
  • the sensor according to the invention is thus easily integrated into conventional equipment, for example for photometric measurement or for measuring UV / NIS absorption, so that a simple structure results.
  • the sensor is advantageously arranged in a flow cell within the device, so that a target substance can be continuously and particularly easily determined, for example during an experiment or during an operation. It is preferred that the target substance is contained in a fluid that is continuously passed through the flow cell.
  • the device according to the invention is preferably used for the qualitative and / or quantitative determination of electrically charged and / or electrically uncharged target substances. Since each target substance only specifically interacts with a single detection area, a large number of electrolytes, i.e. electrically charged or generally analytes, i.e. electrically uncharged target substances can be easily determined.
  • the object of the present invention is further achieved by a method for the quantitative determination of enzyme activities, which comprises the following steps:
  • a fluid containing an enzyme into contact with a sensor according to the invention, in which a recognition area comprises a chromogen bound to an amino sequence
  • steps a) and b) is arbitrary.
  • the quantification of an analyte means the determination of a mass, concentration or activity of analyte molecules and ions.
  • a linker building block which more preferably forms a peptide bond, is preferably arranged between the chromogen and the amino acid sequence. This ensures that this peptide bond is specifically cleaved, which subsequently releases the chromophore.
  • the chromogen is cleaved enzymatically from the amino acid sequence.
  • Enzymes in the sense of the invention are highly specialized proteins that catalyze biochemical reactions without being consumed in the process.
  • Ribozymes which can be subsumed under the term enzymes, comprise ribonucleic acid molecules. Enzymes outperform synthetic catalysts in their catalytic properties. Enzymes have a high affinity and selectivity for certain substrates.
  • serine proteases I such as trypsin
  • bacterial serine proteases II such as subtilisin
  • cysteine proteases such as papain
  • aspartate proteases such as penicilopepsin
  • metalloproteases I such as boron coride oxide peptidase A
  • bacterial metallopoleases II such as thermopoleases.
  • Proteases always digest at a certain point on a peptide or protein. Endopeptidases hydrolyze certain amide bonds within a protein, while exopeptidases C or N terminate one to three amino acids from the peptide.
  • FIG. 2 shows a device according to the invention in a flow system
  • FIG 3 shows a further embodiment of a sensor according to the invention.
  • a sensor 100 shows a sensor 100 according to the invention.
  • This comprises a carrier (substrate) 101 made of, for example, SiO 2 or a similar, optically transparent material which is known per se to the person skilled in the art and is suitable for such purposes.
  • the carrier can also consist, for example, of plastic / polymers by injection molding with an applied waveguide (high vacuum coating) made of tantalum pentoxide, silicon oxide or titanium dioxide, or of mixtures thereof.
  • an applied waveguide high vacuum coating
  • tantalum pentoxide silicon oxide or titanium dioxide
  • a second layer of an optically transparent material, such as Ta 2 O 5 is arranged on the carrier 101 by means of techniques known per se.
  • the thickness of the Ta 2 O 5 layer is about 100 nm to 500, preferably 100 to 200 nm.
  • Carrier 101 and the layer 102 thus represent a the person skilled in the known "thin-film waveguide".
  • the optically transparent layer of ⁇ fi s has a layer thickness of approx. 160 nm in the present case.
  • a detection region 103 is arranged on the optically transparent layer 102 made of Ta 2 0 5 .
  • This recognition area 103 can consist, for example, of a monolayer of recognition substances, for example chromogens coupled to peptides, but can also consist of a layer, for example PVC / DOS, in which recognition molecules are distributed.
  • a grating structure 104 for coupling electromagnetic radiation, preferably light of visible wavelength, is attached to the substrate 101 made of SeO 2 .
  • a second grating is located behind the detection area 103 and is also designed as a Bragg grating.
  • the detection areas 103 are in contact with a fluid 106, which can either be a gas or a liquid or a vapor, in which target substances are distributed, which can interact with the detection area or the detection substance in the detection area 103.
  • Light of visible wavelength represented by arrow 107
  • a Bragg grating 104 is coupled in via a Bragg grating 104 during the measurement by means of the sensor 100 according to the invention and, due to the thin layer waveguide layer structure, generates a so-called evanescent field, of which the guided light wave 108 is shown in FIG.
  • the light then couples out at the decoupling grating 105 and is represented by the arrow 109.
  • the changing transparency of the optical layer structure of the layer 102 with the detection regions 103 is measured. Due to the simultaneous change in refractive index and absorption, which can be measured by means of the evanescent field, the properties of the two layers change in the course of the measurement, which can be determined mathematically, for example by a Kramers-Kronig transformation. Changes caused by the interaction of a target substance in fluid 106 with the Detection area 103, which comprises a target substance, which is not shown in FIG. 1, is thus simply optically detected. These changes are, for example, in particular color changes, which can then be measured by weakening the evanescent field of light.
  • the device 200 comprises a sensor according to the invention, comprising a carrier 202, for example consisting of silicon dioxide as described above in FIG. 1, arranged on it an optically transparent layer 206, for example made of Ta 2 O 5 , which comprises a further coating 207.
  • the ensemble of carrier 202, optically transparent layer 206 and the further coating is also referred to here as a “chip” or “optical chip”.
  • the detection substances are located in the coating 207, which can also be optically transparent.
  • the detection substances are applied to the optically transparent layer 206 directly on a monolayer, with different types of substances also being applied in different detection areas, which can be separated from one another, and the coating 207 only serves to ensure that the substances applied are in the flow mode of layer 206 are not washed away by the fluid.
  • the coating 207 can be made of any material suitable for this type of coating.
  • Means for coupling in electromagnetic radiation 203, for example Bragg gratings as described above and coupling-out gratings 204, which may also be Bragg gratings as described above, are arranged on the carrier 202.
  • the fluid to be examined flows through the inlet 210 into the flow cell 201 and on the surface of the coating 207 will come into contact and interact with the detection substances in the detection areas.
  • the fluid continues to flow back into the circuit through outlet 211.
  • the device 200 is also referred to as a “measuring cell”.
  • the measuring cell can be formed such that the chip that contains more than one trace of the applied chemical selective components (detection area) or the reference / blind components (reference area) next to one another, with a (micro- or mini-structured second plate, for example made of glass, plastic, metal, ceramic or another suitable Material / chip is covered.
  • “Track” is understood to mean that the detection area or the reference area is in the form of an essentially straight line.
  • any other geometrical illustration is instead of a line, provided that it is suitable for the common purpose
  • the structure of the plate / chip corresponds to the tracks, which means that corresponding recesses (grooves) are provided in the part of the plate / chip facing the tracks, which are complementary to the respective geometric structure of the tracks on the chip Grooves form one side of the flow channel through which the sample flows They simultaneously separate the traces from one another and isolate them from the leakage of solution. The sample comes into direct contact with the chemically selective components in the flow channel.
  • calibrators, positive and negative controls or different samples or different selective traces can be measured in parallel or simultaneously.
  • Liquids or gases can be PC controlled in the same way, automatically (or manually) brought into contact with the selective chemical components.
  • conditioning solutions e.g. buffers
  • solvents e.g. solvents
  • cleaning solutions e.g. cleaning solutions
  • calibration solutions e.g. solvents, solvents, cleaning solutions, calibration solutions
  • the light source 208 can simultaneously illuminate and analyze all channels / grooves comprising the detection / reference areas or work in series (periodic deflection of the
  • an evanescent field is present on the optical sensor of the device 200. This comes from a light source 208, which is irradiated at a first angle,, which results in an evanescent field with a guided light wave 205 in the evanescent field, which is guided in the substrate and the optical layer 202 or 206. At the Bragg grids 204, the light wave 205 couples out again at a first angle ⁇ 2 . The attenuated light is registered at the detector 209 and assigned to a measured variable.
  • the sensor 300 consists of a carrier 301, as defined above, on which an optically transparent layer 302, as defined above, is arranged.
  • Bragg gratings 303 and 304 are arranged between the carrier 301 and the optically transparent layer 302 by means of methods known per se and enable electromagnetic radiation, in particular visible light, to be coupled in and out.
  • the coupled-in light generates a guided light wave 307 in the evanescent field of the thin-film waveguide that arises in this way.
  • thermostable semiconductor laser with integrated, adjusted and balanced optics and electronics is preferably used as the light source for the coupled light 306.
  • the module has a light frequency stability of less than 0.2 nm and preferably has digital temperature and current outputs. Preferred working temperatures are 15 ° to 40 ° C.
  • the flow measuring cell comprises two chambers and is optimized for small sample volumes. It has an adjustable positioning of the optical sensor and can preferably be closed by means of a so-called swivel lock.
  • the flow measuring cell is thermally decoupled and thermostable.
  • the thermostatic range is 20 ° C to 40 ° C at an ambient temperature of 15 ° C to 40 ° C.
  • the peptide substrate To embed the peptide substrates in a polymer membrane, the peptide substrate must have amphiphilic properties so that it aligns itself at the interface between the membrane and the sample solution. As in the present case, this is done by attaching one of the lipophilic chromogens, but not by attaching one or more lipophilic groups to the peptide end of the substrate. In this case the dye together with the peptide chain would reach into the sample solution, be split off with the peptide and diffuse away from the membrane. Since the chromogen of the uncleaved substrate is already outside the range of the evanescent field, approx. 100 nm, digestion of the substrate would not weaken the modes in the waveguide and the cleavage reaction would go unnoticed.
  • the recognition substance according to the invention is in a PVC / DOS membrane and the dye is predominantly distributed in the membrane due to its lipophilicity or the linked lipophilic groups, this can also lead to a weakening of the mode in the evanescent field.
  • the distribution takes place quickly and evenly. If the distribution were slow, the activity of the proteases in the sample solution would no longer be measured, but rather the distribution kinetics of the cleaved chromogen in the membrane.
  • a chromogen is unsuitable, the absorption maximum of which does not shift when it is split off from the substrate if there are no undissolved substrate molecules in the form of reverse micelles in the membrane. Exclusion of such reverse cells can be controlled by a content below the critical mixed micelle binding concentration.
  • only molecules that have a hydrophyl / lipophilic (hlb) ratio of 3-6 act as water in oil (WO) emulsifiers.
  • Lipophilic membrane components are used as membrane components in the context of the present invention, so that they are not washed out in, for example, aqueous samples.
  • high molecular weight polyvinyl chloride PVC
  • PVC has high chemical resistance and low gas and vapor permeability. All of the polymers used in sensor membranes according to the invention have a gas transition temperature T g which is lower than room temperature. Therefore high molecular weight PVC with a T g of approx. 80 ° C can only be used together with plasticizers for the production of optode membranes. Otherwise, a brittle, amorphous, inflexible substance would arise, which would also show no adhesion to a waveguide.
  • Further preferred compounds for the formation of membranes or matrices are polyurethanes, poly (vinylidene chloride) and polysiloxane.
  • Plasticizers are non-volatile liquids that, due to their affinity, are inserted between the matrix molecules and weaken intermolecular forces. The result of these interactions are improved membrane properties with regard to flexibility, adhesion and plasticity. All plasticizers that are not too lipophilic, since otherwise the response time would be undesirably extended, can be used according to the invention. However, the plasticizers should also not be too hydrophilic, since otherwise, for example when used in a flow system with analyte solutions can be washed out and the membrane would have a very short lifespan. For example, bis (2-ethylhexyl) sebacate (dioctyl sebacate, DOS) is preferred.
  • Tetrahydrofuran has generally been used as the solvent to apply the membrane to waveguides, although any other solvent which evaporates just as quickly can be used in exactly the same way.
  • the peptide substrate can be immobilized on the surface of the optically transparent layer. If a monolayer of the recognition substance is covalently or by other techniques, e.g. by attachment of substrate-derivatized biotin to avidin on the surface, i.e. is immobilized directly on the waveguide surface, the evanescent field penetrates into the sample solution. In this case, there should be no interfering components in the sample solution that absorb in the range of the wavelength of the incident light. The choice of light sources in the range of approx. 600 - 800 nm already eliminates the danger for biological samples. In this case, the chromogen does not diffuse into the Evaneszensfeld, but is removed after the cleavage. This leads to signal blocking in contrast to the described signal weakening in membranes.
  • Peptide sequence substrates can be attached to the waveguide surface, for example, covalently or by biotin-avidin coupling.
  • biotin-avidin coupling In order to prevent these substrates from being able to be converted by the proteases because the proteases are so close to the waveguide surface, due to spherical obstacles, they are unable to enclose the substrate to the required extent, it may be advantageous to place a linker module between them to integrate the attachment site on the waveguide and the peptide sequence of the substrate, so that the substrate molecules extend into the sample solution so that the proteases can access the substrate and cleave it.
  • Methods of covalent anchoring or via biotin-avedin coupling are well known to the person skilled in the art from the prior art.
  • This example explains the optical measurement technology on a planar thin-film optical waveguide.
  • the measured absorbance is directly proportional to the absorption coefficient of the absorbent substance, the length of the irradiated layer thickness and the concentration of the absorbent substance.
  • the absorbance measurement is particularly sensitive if the analyte has a high absorption coefficient, if the analysis wavelength contributes to discrimination between the background and the analyte and if the layer thickness / Penetration depth of the light beam can be worked without the sample having to be irradiated (non-specific absorption).
  • the layer thickness is replaced by the depth of penetration of the evanescent field (d p / nm) into the sample and the length of the waveguide (l / m) along which the light is guided. Additional parameters are the coupling angle of the light beam into the waveguide, the refractive indices of the neighboring media and the wavelength of the light, which directly determine the depth of penetration of the evanescent field.
  • the penetration depth increases with the long ripple of the analytical light source (directly proportional) and decreases with the refractive index of the waveguide relative to the refractive index of the sample.
  • Typical ATR devices / ATR crystals / ATR waveguides have a thickness in the range from 100 micrometers to a few millimeters. The thicker a waveguide, the less internal reflections result. In the case of classic ATR technology, however, an evanescence field is only formed where there is internal light refraction / reflection. The absorption adds up over the finite number of reflections (e.g. 1 to 50 reflections along several millimeters or centimeters in length of the waveguide).
  • the light beam ideally propagates in a single" mode "(monomodal wave) and in a way infinite number of reflections. This creates a quasi-continuous evanscence field along the waveguide and results in a higher absorption in just a few millimeters than along a few cm of the traditional ATR crystals.
  • the use of this technique for absorption measurement is therefore particularly attractive, but it requires a very advanced know-how.
  • the light is ideally coupled in via refraction gratings (alternative: face of the crystal).
  • waveguide film optically transparent layer of tantalum pentoxide with a thickness of 150 nm and a grating period of 360 nm
  • the refractive index of the detection area PVC / DOS film
  • the refractive index of the waveguide 2,114
  • the refractive index of the carrier material silicon dioxide
  • the total absorption signal in the NIR range is amplified by a factor of 10 to 100 times compared to the absorption signal that is obtained when a 4-6 micrometer thick selective membrane is irradiated.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Sensor (100, 200, 300) zur Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz, umfassend einen Träger (101, 202, 301), eine optisch transparente Schicht (102, 206, 302), die auf dem Träger angeordnet ist, Mittel (104, 105, 203, 204, 303, 304) zur Ein- und Auskopplung elektromagnetischer Strahlung (107, 109, 306, 308), wobei die optisch transparente Schicht einen Erkennungsbereich (103, 207) aufweist, der eine Erkennungssubstanz umfasst, die mit der Zielsubstanz spezifisch wechselwirkt. Weiter umfasst die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz umfassend einen Sensor, eine Quelle (208) für elektromagnetische Strahlung und einen Detektor (209) für elektromagnetische Strahlung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz, Verfahren zur Bestimmung von Enzymaktivitäten, sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Sensors sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Description

SENSOR ZUR BESTIMMUNG VON ANALYTEN SOWIE VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON
ENZYM-AKTIVITÄTEN
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Sensor zur Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz, einer Vorrichtung zur
Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters, Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz, Verfahren zur Bestimmung von Enzymaktivitäten, sowie die Verwendung des erfmdungsgemäßen Sensors sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Der Bedarf der direkten und zuverlässigen Bestimmung von Analyten bzw. Gasen in verschiedenen Medien, insbesondere Gasgemischen oder in Flüssigkeiten, nimmt ständig zu. Dies insbesondere auch bei Anwendung in der Medizin und der chemischen Analytik. Im Bereich des Bestimmens von Gasen, beispielsweise mittels Festelektrolyten, liefert der Artikel von I. Lundström "Sensors and Actuators", 1996, 35 - 36, S. 11 - 19 einen guten Überblick.
Die EP 0903573 A2 offenbart eine Optode zur Bestimmung von Gasen unter Verwendung einer gassensitiven Sensormembran. Diese Sensormembran umfasst sogenannte Ionophore, die selektiv mit einzelnen Gasen bzw. Gasbestandteilen wechselwirken und dabei ihre Farbe verändern, so dass über UV/NIS-Messungen die Absorptionsmaxima der Wirkungskomplexe zwischen Ionophor und Analyt gemessen werden können.
Weiter offenbart die WO 00/50446 Oligopeptidderivate zur elektrochemischen Messung der Aktivität von Proteasen, bei denen diese Oligopeptidderivate, an die ein amperogenes Anilin- bzw. Aminochinolinderivat gebunden ist, auf der Oberfläche von Elektroden fixiert sind und bei Reaktion mit einem Enzym durch die Abspaltung der elektrisch leitenden Anilin- bzw. Aminochinolinverbindung eine Änderung der Leitfähigkeit eintritt, die direkt von der Elektrode gemessen werden kann.
Des Weiteren offenbart das US-Patent Nr. 5,097,014 chromogene Verbindungen, die als Enzymsubstrate für diagnostische Anwendungen verwendet werden können. Insbesondere betrifft dies die Detektion proteolytischer Enzyme, die die Bindung zwischen dem chromogenen Substrat und dem Peptid spalten, so dass die freigesetzten Farbstoffe einer photometrischen Bestimmung zugänglich sind. Weiter sind in der EP-A-0358991 sogenannte optische chemische Sensoren (Optoden) basierend auf dem Prinzip der Transmissionsmessung durch die Schicht und die Probe hindurch vorgeschlagen worden.
Weiter ist bekannt, dass in optischen Sensoren mittels Reflektionsmessung über optische Fasern (Faserkopplung und Transmission des Lichtes der Lichtquelle und Rückstreuung des nicht-absorbierten Lichtes) Analyten bestimmbar sind. Jedoch geht bei dieser Messmethode viel Licht verloren. Nachteilig ist, dass der große Verlust an Lichtenergie dazu führt, dass die Empfindlichkeit dieser Messtechnik sehr gering ist.
Ebenso sind Optoden auf der Basis von Fluoreszenzmessungen bekannt. Hierbei ist nachteilig, dass spürende Hintergrundfluoreszenz von Polymermaterialien von der Probe selbst, insbesondere von biologischen Proben, auftritt. Die Intensitätsmessung ist schwer reproduzierbar, da die Emission ungerichtet ist.
Bei der Absorptionsmessung auf planaren optischen Wellenleitern, d.h. die sogenannte ATR-Technologie, bei Messungen im Evaneszenzfeld, wurde bislang die sogenannte Dickschichttechnologie (Dicke des Wellenleiters größer als 250 bis 400 nm) verwendet. Dies führt jedoch dazu, dass sich das Licht diskontinuierlich mit einer berechenbaren Anzahl von internen Reflexionen im Wellenleiter fortsetzt. Als Folge wird nur an den Stellen interner Reflexion Licht durch ein benachbartes Medium absorbiert. Damit wird wiederum eine submaximale Empfindlichkeit der optischen Absorptionsmessung in Abhängigkeit von der Anzahl der Reflexionen im Wellenleiter erreicht.
Es bestand daher das Bedürfnis, Intensitätsänderungen und spektrale Änderungen in optischen Sensorfilmen bzw. in Filmen aus biologisch-chemischen Komponenten, die mittels optischer Absorption detektiert werden können, empfindlicher zu gestalten und die Nachweisgrenze für zu erkennende Substanzen zu vermindern. Eine weitere Aufgabe der Erfindung bestand darin, einen optischen Sensor zur Verfügung zu stellen, bei dem das Licht nicht durch die Probe hindurchgeht.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird dadurch gelöst, dass ein Sensor zur Bestimmung eines chemischen und/oder biologischen und/oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz zur Verfügung gestellt wird, der Folgendes umfasst:
a) einen Träger
b) eine optisch transparente Schicht, die auf dem Träger angeordnet ist
c) Mittel zur Ein- und Auskopplung elektromagnetischer Strahlung, wobei die optisch transparente Schicht einen Erkennungsbereich aufweist, der eine Erkennungssubstanz umfasst, die mit der Zielsubstanz spezifisch wechselwirkt.
Der vorliegende erfindungsgemäße Sensor ermöglicht es, Licht von definierter Wellenlänge einzukoppeln und bereits bei unerwartet hoher Verdünnung von Erkennungssubstanzen das eingekoppelte Licht vollständig zu absorbieren, so dass weder an der Stirnfläche noch über zweite Einkopplungsmittel transmittiertes Licht festgestellt und gemessen werden kann, so dass der Verlust an eingekoppelten Licht wesentlich minimiert wird. Der Begriff "unerwartet hohe Verdünnung" bezeichnet vorliegend Konzentrationen von weniger als 10"5 mol/1, bevorzugt von weniger als 10"8 mol/1 und ganz besonders bevorzugt von weniger als 10"10mol/l.
Ein Sensor kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich jede beliebige Art von Sensor sein, sofern er die oben genannten Merkmale aufweist. So kann der erfindungsgemäße Sensor beispielsweise ein elektrochemischer Sensor, optischer Sensor oder ein Biosensor sein.
Unter chemischen Sensoren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Vorrichtungen verstanden, die chemische Informationen, die beispielsweise von der Konzentration einer spezifischen Komponente bis zur Gesamtanalyse der Gesamtzusammensetzung reicht, in ein analytisch sinnvolles Signal umwandeln. Chemische Sensoren weisen eine hohe Selektivität gegenüber dem Analyt in der Probe auf, so dass oftmals gegenüber herkömmlichen Sensoren das Auftrennen bzw. das Aufarbeiten im Sinne einer herkömmlichen Analyse entfällt. Mit dem Begriff Selektivität wird die Fähigkeit des Sensors beschrieben, den Analyt auch zwischen sehr ähnlichen Komponenten im Untersuchungsgut eindeutig zu erkennen. Damit können somit auch sehr komplexe Proben analysiert werden. Chemische Sensoren umfassen zum Beispiel, sind aber nicht beschränkt auf, Optoden mit Ionophoren, wie lipophile, pH-sensitive Chromoionophore, die üblicherweise für den Ionenaustausch und Ionen-Koextraktions- Optoden eingesetzt werden. Bei chemischen Sensoren liegt die Empfindlichkeit bei einer Konzentration der Zielsubstanz von ca. 10"5 mol/1.
Darüber hinaus zeigen chemische Sensoren eine kurze Ansprechzeit, was eine rasche Messung und einen hohen Probendurchsatz ermöglicht. Darüber hinaus sind chemische Sensoren reversibel, so dass auch on-line Messungen möglich sind. Unter optischen Sensoren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Sensoren verstanden, die chemische Informationen, beispielsweise die Konzentration, Aktivität oder überhaupt die messbare Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, über einen molekularen Erkennungsvorgang in optische Signale umwandeln. Dabei stehen diese optischen Signale in einem funktionellen Zusammenhang zur Analytkonzentration bzw. zur Analytaktivität. In einem weiteren Schritt werden diese optischen Signale in elektronische Signale umgewandelt und liefern Daten, die aufbereitet schließlich eine Interpretation der Messung erlauben. Optische Sensoren verbrauchen fast überhaupt keine Reagenzien und sind daher ökonomischer gegenüber herkömmlichen Analysesystemen. Bei optischen Sensoren liegt die Empfindlichkeit bei einer Konzentration der Zielsubstanz von ca. 10"8 mol/1.
Unter Biosensoren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Sensoren verstanden, die auf einer Kopplung von Biomolekülen basieren, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifische Analyten erkennen mit physikochemischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal in elektrische Messsignale umwandeln. Bioaktive Erkennungskomponenten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt, auf Antikörper, Enzyme, Zellorganellen oder ganze Mikroorganismen. Auch Peptide bzw. Proteine werden als Biomoleküle bezeichnet. Jedoch sind Peptide nicht bioaktiv, indem sie andere Moleküle umsetzen können oder spezifische Bindungen an weitere Moleküle fördern. Bei Biosensoren werden zwei Grundtypen voneinander unterschieden: Einerseits die sogenannten Bioaffinitätssensoren und andererseits die sogenannten Metabolismussensoren. Die Bioaffinitätssensoren generieren ein Signal durch Komplexbildung von bioaktiven Molekülen zu einem Analyten. Hierbei liegt nach der Messung wieder der Ausgangszustand vor. Während letztere auf einer spezifischen Erkennung und anschließenden Umsetzung von Substraten beruhen. Nach dem Messvorgang muss dieser Sensor entweder verworfen oder der Ausgangszustand wieder hergestellt werden. Bei diesen Sensoren werden Empfindlichkeiten von 10"10 mol/1 und weniger an Zielsubstanz erreicht.
Mit den unterschiedlichen Sensoren kann somit ein molekularer Erkennungsvorgang des Analyten bzw. ein chemischer, biologischer oder physikalischer Parameter der Zielsubstanz, mittels unterschiedlicher Techniken in ein Messsignal übersetzt werden.
Ein zu bestimmender chemische, biologische oder physikalische Parameter ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich jede Veränderung eines Ausgangszustandes, die mit einem erfindungsgemäßen Sensor messbar ist und die durch Wechselwirken der Zielsubstanz mit der Erkennungssubstanz ausgelöst wird. Die Veränderung kann dabei beispielsweise in einer pH-Änderung, Ionenkonzentrationsänderung, Veränderung einer Molekülstruktur, Änderung von Molekülverteilungen, Änderung von Leitfähigkeiten oder Änderung von Absorptionsspektren von Molekülen bestehen. Der zu bestimmende chemische, biologische oder physikalische Parameter betrifft dabei jedoch nur Veränderungen, die innerhalb des Sensors, beispielsweise am Träger oder am Erkennungsbereich stattfinden.
Unter Wechselwirkung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Wechselwirkung zwischen molekularen Einheiten verstanden, umfassend die Bildung einer chemischen Bindung (kovalent oder ionisch), van-der-Waals Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Adsorptionsphänomene und ähnliches.
Eine Zielsubstanz weist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Eigenschaft auf, mit einer Erkennungssubstanz des erfindungsgemäßen Sensors wechselwirken zu können. Grundsätzlich gibt es keine weitere Beschränkung für erfindungsgemäße Zielsubstanzen. Je nach Beschaffenheit und Spezifität der Erkennungssubstanz erfüllen eine größere oder kleinere Gruppe von Substanzen das Kriterium mit der Erkennungssubstanz wechselwirken zu können. So kann die Erkennungssubstanz beispielsweise so beschaffen sein, dass nur spezifische Mitglieder bestimmter Stoffklassen mit der Erkennungssubstanz wechselwirken. Die Zielsubstanz kann eine bekannte Substanz sein, wie bestimmte bakterielle Endotoxine sie kann aber auch eine dem Fachmann unbekannte Substanz sein.
Im Rahmen der einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mittels des erfindungsgemäßen Sensors beispielsweise in Körperflüssigkeiten wie Blut oder Plasma oder in künstlich hergestellten Lösungen für den wissenschaftlichen Forschungsbetrieb oder für medizinische Zwecke nach potentiellen Zielsubstanzen gescreent.
Der erfindungsgemäße Sensor umfasst weiterhin einen Träger. Der Ausdruck „Träger" bezeichnet jeden dreidimensionalen Körper, auf dem sich eine erfindungsgemäße optisch transparente Schicht aufbringen lässt.
Der Träger kann grundsätzlich aus jedem Material sein, das einer gewöhnlichen Handhabung im medizinischen oder chemischen Labor standhält, ohne dass die Form und Beschaffenheit des Trägers wesentlich verändert wird. Das bedeutet, dass der Träger beispielsweise nicht empfindlich sein sollte gegen Temperaturen von etwa - 30 ° C bis etwa 50 °C, insbesondere im Bereich von etwa -20 ° C bis etwa 40 ° C und im Bereich von etwa - 10 ° C bis etwa 30 ° C.
Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen, wenn der Träger aus beispielsweise SiO2 oder einem ähnlichen, dem Fachmann an sich bekanntem, optisch transparentem Material, beschaffen ist. Der Träger kann aber auch beispielsweise aus Glas oder geeigneten Polymeren bestehen. Beispiele für geeignete Polymere sind beispielsweise PVC, Polyurethane oder Polysiloxane und deren Derivate. Der Brechungsindex des Trägers liegt im Bereich von etwa n0= 550 nm bis etwa n0= 750 nm, bevorzugt insbesondere von etwa n,, = 600 nm bis 680 nm. Besonders bevorzugt liegt der Brechungsindex im Bereich von 605 nm bis 680 nm.
Der Träger weist üblicherweise eine Dicke von etwa 0.5 mm bis etwa 1.5 mm auf, bevorzugt von 0.7 bis 1.2 mm.
Der Träger selbst kann aus einer Schicht sowie aus 2, 3 oder mehr Schichten bestehen. So ist es beispielsweise denkbar, den Träger an der Seite, an der er an die optisch transparente Schicht angrenzt, ebenfalls eine optisch transparente Schicht aufweist und eine weitere Trägerschicht im sichtbaren Licht farbig erscheint. So können beispielsweise durch unterschiedliche Farben der Trägerunterseite verschiedene Trägerbereiche einfach voneinander unterscheidbar gemacht werden.
Der Träger kann daher grundsätzlich beliebig beschichtet sein, wobei die Beschichtungen einen sinnvollen Aufbau des erfindungsgemäßen Sensors nicht beeinträchtigen sollten.
Der Träger kann weiterhin vollständig oder teilweise elektrisch leitfähig oder nicht elektrisch leitfähig sein.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auch der Träger optisch transparent, so dass es möglich ist, die Mittel zur Ein- und Auskopplung elektromagnetischer Strahlung auf dem Träger anzuordnen und durch den optisch transparenten Träger hindurch das Licht in die optisch transparente Schicht einzukuppeln.
Bevorzugt sind die Mittel zur Ein- und/oder Auskopplung der elektromagnetischen Strahlung zwischen Träger und optisch transparenter Schicht angeordnet, die insbesondere weiter bevorzugt als Gitterstruktur ausgebildet sind. Derartige Gitterstrukturen, wie beispielsweise Bragg Gitter, können mittels an sich bekannter und einfacher Ätztechniken einfach in Substrate bzw. Trägermaterialien geätzt werden.
Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Träger daher an der Oberfläche, die an die optische transparente Schicht angrenzt eine Gitterstruktur auf. Vorzugsweise dient ein Gitter an der einen Seite der Oberfläche, die an die optische transparente Schicht angrenzt, zur Einkopplung elektromagnetischer Strahlung, bevorzugt Licht sichtbarer Wellenlänge. Ein zweites Gitter befindet sich hinter dem Erkennungsbereich und dient zur Auskopplung elektromagnetischer Strahlung, bevorzugt Licht sichtbarer Wellenlänge. Vorzugsweise handelt es sich bei der Gitterstruktur um ein optisches Gitter, beispielsweise ein Bragg Gitter. Je nach Anwendung bzw. je nach Substrat kann es vorteilhaft sein, auch sogenannte Slanted Bragg Gitter oder ähnliche Gitterarten zu verwenden.
Das optische Gitter dient dazu, Licht an der einen Seite des Trägers über ein Gitter einzukoppeln, anschließend aufgrund der dünnen Schichtwellenleiterschichtstruktur ein sogenanntes evaneszentes Feld zu erzeugen und an der anderen Seite des Trägers durch das zweite Gitter wieder auszukoppeln.
Auf dem Träger ist eine optisch transparente Schicht angeordnet. „Optisch transparent" bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass die Schicht Lichtbrechungsindizes von 1 bis etwa 15 aufweist und eine Lichtdurchlässigkeit von etwa 80% bis etwa 0 % aufweist. Der Brechungsindex der optisch transparenten Schicht liegt im Bereich von etwa n0 = 550 nm bis etwa n0= 750 nm, insbesondere bevorzugt von etwa n0= 600 nm bis etwa n0= 680 nm, wobei der Bereich von etwa n0= 650 nm bis etwa n0= 680 nm zumeist bevorzugt ist. Im Rahmen einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der Brechungsindex dieser Schicht etwa n = 2,21 (589 nm). Die optisch transparente Schicht kann in Form einer einzigen Schicht vorliegen, aber auch in Form mehrerer aufeinander angeordneter Schichten (z.B. als Verbund), beispielsweise 2, 3 oder 4 verschiedene Schichten. Wichtig ist nur, dass auch der Mehrschichtenverbund die Eigenschaften der optischen Transparenz wie oben beschrieben erfüllt.
Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen, wenn die optisch transparente Schicht aus Tantalpentoxid, Siliciumoxid bzw. Titandioxid besteht bzw. aus Mischungen davon. Bevorzugt wird beispielsweise Ta2O5 als optisch transparente Schicht mittels an sich bekannter Techniken auf dem Träger angeordnet. Die Dicke der Ta2O 5 -Schicht beträgt ca. 100 bis 500 nm, bevorzugt 100 bis 200 nm. Die optisch transparente Schicht aus Ta2O 5 weist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eine Schichtdicke von ca. 160 nm auf.
Träger und optische Schicht können im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung einen sogenannten Dünnschichtwellenleiter bilden. Bevorzugt ist die optisch transparente Schicht, die auf dem Träger angeordnet ist, ein sogenannter Dünnschichtwellenleiter mit einer Dicke von etwa 50 bis etwa 500 nm, bevorzugt von 100 bis 200 nm, so dass das sogenannte Evaneszenzfeld vollständig absorbiert wird.
Auf der optisch transparenten Schicht ist mindestens ein Erkennungsbereich angebracht. Der Erkennungsbereich kann dabei sowohl als weitere Schicht auf der optisch transparenten Schicht liegend angebracht sein, oder aber integraler Bestandteil der optisch transparenten Schicht sein. Im ersteren Fall kann die Erkennungssubstanz in einem Medium verteilt, oder aber in Reinform, auf der optisch transparenten Schicht angeordnet sein. Im letzteren Fall kann die Erkennungssubstanz schon im Wellenleiter verteilt vorliegen, oder aber in einer Oberflächenschicht des Wellenleiters angereichert sein. So kann der Erkennungsbereich beispielsweise aus einer Monolage, beispielsweise aus an Peptide gekoppelten Chromogenen bestehen, jedoch auch beispielsweise aus PVC/DOS sein, in der Erkennungsmoleküle verteilt sind.
Erkennungssubstanzen können grundsätzlich alle Verbindungen sein, insbesondere aber Biomoleküle, wie Antikörper, neutrale, anionische, kationische oder zwitterionische Polymere oder Monomere, bevorzugt sind optisch aktive Moleküle wie Chromogene und die Derivate davon.
Das Ensemble aus Träger, optisch transparenter Schicht und Erkennungs- und ggf. Referenzbereich wird vorliegend auch als Chip bzw. optischer Chip bezeichnet.
Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als günstig erwiesen, wenn der Erkennungsbereich selbst auch eine optisch transparente Schicht ist, die eine Erkennungssubstanz enthält. Damit kann in einfacher Weise die spezifisch wirkende Erkennungssubstanz, beispielsweise in übliche bekannte Medien begeben werden, die eine leichte Aufbringbarkeit als Film oder auch als Schicht gewährleisten.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Erkennungsbereich selbst im Wesentlichen aus einer Erkennungssubstanz bzw. aus einer Mischung verschiedener Erkennungssubstanzen, so dass auch beispielsweise die Bildung von Monolagen aus einer Erkennungssubstanz bzw. aus einer Mischung verschiedener Erkennungssubstanzen auf der optisch transparenten Schicht in einfacher Weise möglich ist, indem die Erkennungssubstanz bzw. die Mischung verschiedener Erkennungssubstanzen über an sich bekannte Mittel auf der optisch transparenten Schicht verankert werden.
Die Art der Verankerung umfasst kovalente Bindungen, ionische Bindungen, Verankerung durch Van-der Waals-Kräfte, Wasserstoffbrücken oder magnetische Befestigungen. Diese Aufzählung ist jedoch nicht abschließend. Die Erkennungsmoleküle können auch in einer Ionenaustausch-Membran, bzw. in einem Polymerfilm vorliegen, wobei sich insbesondere eine Kaliumselektive Ionenaustausch-Membran als besonders geeignet für eine spezielle Ausführungsform der Erfindung erwiesen hat. Die Membran, in der die Erkennungsmoleküle verankert sein können auch Coextraktionssysteme sein.
Weiter ist bevorzugt, dass der Erkennungsbereich einen niedrigeren oder den gleichen Brechungsindex wie die optisch transparente Schicht aufweist. Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Brechungsindex des Erkennungsbereichs etwa n = 1,33.
Besonders bevorzugt ist, wenn eine Vielzahl von Erkennungsbereichen vorhanden sind, so dass jeder Erkennungsbereich mit einer spezifischen Erkennungssubstanz versehen ist, so dass auf einem Sensor gleichzeitig eine Vielzahl von Zielsubstanzen spezifisch bestimmt werden kann, da jede Zielsubstanz nur mit einem Erkennungsbereich, der eine Erkennungssubstanz umfasst, spezifisch wechselwirken kann. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist ein Sensor mindestens 10, bevorzugt mindestens 100 und weiter bevorzugt mindestens 200 verschiedene Erkennungsbereiche
Weiter ist bevorzugt, dass ein weiterer Erkennungsbereich als Referenzbereich ausgestaltet wird, der einen sogenannten Standardreferenzbereich bildet. Damit kann in einfacher Weise die Durchführung von Differenzmessungen gegenüber den mit einer Erkennungssubstanz versehenen Erkennungsbereichen durchgeführt werden. Derartige Differenzmessungen beziehen sich insbesondere auf den Einfluss der Quellung der Erkennungsbereiche, insbesondere sofern in einem flüssigen oder dampfförmigen Medium gemessen wird, die Intensität des eingestrahlten Lichts und weitere unspezifische Variationen. Die Referenzbereiche können auch als Positivkontrolle und Negativkontrolle für den Nachweis des entsprechenden Zielanalyten ausgestaltet sein. Eine zentrale Eigenschaft des erfindungsgemäßen Sensors ist die Wechselwirkung zwischen Erkennungssubstanz und Zielsubstanz. Dabei müssen entsprechend der Art der Wechselwirkung angemessene Umgebungsbedingungen gegeben sein. Insbesondere wenn Enzyme an der Erkennungsreaktion der Zielsubstanz beteiligt sind, muss bei den Umgebungsbedingungen beispielsweise ein geeignete Lösungsmittel, geeignete Konzentrationen der zu untersuchenden Analyte, geeignete Puffer, geeignete Temperatur, geeignete Reaktionsdauer gewählt werden. Diese sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
Beispiele für mit dem erfindungsgemäßen Sensor nachzuweisende Zielsubstanzen sind jedoch neben Enzymen, beispielsweise auch Ionen und neutrale Moleküle.
So können beispielsweise Lactatdehydrogenase, Glucoseoxidase, Aminotransferase, Creatinkinase nachzuweisende Zielenzyme sein. Weiterhin können auch anorganische Ionen wie Lithium-. Kalium-, Magnesium-, Chlorid oder -sulfationen aber auch organische Ionen wie Acetat-, Lactat-, Taurin-, Glutamat-, oder Ammoniumionen Gegenstand der Zielsubstanz sein. Beispiele für neutrale Zielsubstanzen sind Zucker (Glucose), Alkohole, Amine, Aldehyde, Ketone aber auch Gase wie Kohlendioxid, Ammoniak, Stickoxide, Schwefeldioxid, Terpene, Geruchsstoffe und Aromen.
So können die Erkennungsbereiche beispielsweise in Kontakt mit einem Fluid stehen, das entweder ein Gas, eine Flüssigkeit, ein Dampf ein Gemisch, eine Emulsion oder ein Aerosol sein kann, in dem Zielsubstanzen verteilt sind.
Grundsätzlich kann die Wechselwirkung direkt zwischen der nachzuweisenden Zielsubstanz und der Erkennungssubstanz stattfinden, es ist jedoch auch möglich, dass als Folgereaktion auf eine erste Erkennungsreaktion eine oder mehrere weitere Reaktionen stattfinden, die erst die Bestimmung eines chemischen und/oder biologischen und/oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz ermöglicht. Die Wechselwirkung kann also in mehreren Schritten ablaufen.
So kann beispielsweise eine erste Reaktion zu einer selektiven Aufnahme oder Extraktion von Ionen in die Polymerschicht bewirken. Als Folge werden dann Ionen derselben Art aus der Polymerschicht ausgestoßen. Solche Ionen können beispielsweise Wasserstoff- oder Metallionen sein Das verwendete Chromogen kann in diesem Fall als pH- bw. Metallindikator wirken.
Eine weitere Möglichkeit der Wechselwirkung besteht z.B. darin, dass eine erste Reaktion die selektive Bildung von Ammoniak zur Folge hat. Mit der Folgereaktion wird die selektive Ammoniakbildung nachgewiesen.
Eine weitere Möglichkeit der Wechselwirkung bestaht darin, dass das Chromogen direkt an das Erkennungsmolekül gebunden ist. Die Zielsubstanz bewirkt dann eine Konformationsänderung der Erkennungssubstanz, wodurch eine Änderung der optischen Eigenschaften des Chromogens verursacht wird (z.B. durch optische Drehung, Änderung des Absorptionsspektrums oder Änderung des Brechungsindexes). So ist es auch möglich, dass Erkennungsmolekül reversibel mit der Zielsubtanz reagiert und eine kovalente bindung eingeht, bzw. bricht (nukleophile Addition der Zielsubstanz). Durch die selektive chemische Reaktion wird das konjugierte System, das Chromogen und Erkennungsmolekül verbindet, unterbrochen und es kommt zu einer Änderung der optischen Eigenschaften.
Es ist bevorzugt, dass die Erkennungssubstanz bei oder nach Wechselwirkung der Erkennungssubstanz mit der Zielsubstanz elektromagnetische Strahlung im UV/VIS- B ereich absorbiert. Damit ist eine einfache Detektion mittels der Messung des Absorptionsmaximums durch bekannte Messtechniken wie UV/VIS Spektroskopie oder Fluoreszenzspektroskopie bei oder während der Wechselwirkung der Erkennungssubstanz mit der Zielsubstanz möglich.
Die Erkennungssubstanz ist vorzugsweise in oder auf der optisch transparenten Schicht verankert. Die Verankerung kann beispielsweise durch Eintauchbeschichtung („dip coating") erfolgen.
Bevorzugt umfasst die Erkennungssubstanz selber ein Chromogen, das entweder schon im sichtbaren Bereich absorbiert bzw. dann absorbiert, wenn das Chromogen bzw. die ein Chromogen umfassende Erkennungssubstanz mit der Zielsubstanz wechselwirkt.
Unter Chromogenen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Moleküle verstanden, die elektromagnetische Strahlung, beispielsweise sichtbares Licht, UV oder IR, absorbieren können. Der Begriff "Chromogen" umfasst dabei erfindungsgemäß auch die sogenannte Leukoform, wie auch das eigentliche Chromophor, das insbesondere im Bereich des sichtbaren Lichtes absorbiert. Üblicherweise zeichnen sich Chromogene durch ausgedehnte konjugierte Verbindungssysteme aus, bei denen die π-π*"Übergänge ins Sichtbare verschoben sind.
Bevorzugte Chromogene sind beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe von Chromogenen, die als Grundkörper Nilblau (15-Amino-9-diethyl amino)-benzo [a]- phenoazin-7-imuchlorid), Meldolablau (19-Dimethylamino-benzo [a] phenoxazimyliumchlorid), oder Naphthochinone und nitrierte Paracyclophane bzw. deren substituierte Derivate, aber nicht beschränkt darauf. Im Rahmen der Erfindung sind sämtliche den erfindungsgemäßen Zweck erfüllenden Chromophore einsetzbar. Insbesondere sind jedoch diejenigen, die in der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung Nr. 102 51 893.9 bzw. in der entsprechenden PCT-Anmeldung offenbart sind, besonders gut geeignet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt solche Chromogene eingesetzt, die elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge von mehr als 480 nm absorbieren, so dass beispielsweise auch gefärbte Gase bzw. Flüssigkeiten bei der Messung nicht interferieren. Dies ist insbesondere dann bevorzugt, wenn beispielsweise in einem Medium wie Blut gemessen wird, das aufgrund des Hämoglobins bei ungefähr 450 nm absorbiert.
Bevorzugt ist das Chromogen an eine Aminosäuresequenz gebunden, die beispielsweise in einfacher Form als Linker auf einem Substrat dienen kann und mittels an sich bekannter Methoden einfach auf diesem Substrat bzw. einem Träger verankert werden kann.
Die Aminosäuresequenz umfasst vorzugsweise 1 bis etwa 15 Aminosäuren, bevorzugt 2 bis etwa 6 und am meisten bevorzugt 3 Aminosäuren. Grundsätzlich kann die Aminosäuresequenz aus einer beliebigen Reihenfolge beliebiger Aminosäuren bestehen. Geeigneterweise wird jedoch ein Oligopeptid verwendet, das eine für ein bestimmtes Enzym spezifische Erkennungssequenz aufweist. Im Rahmen einer bevorzugten
Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz insbesondere Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan oder ihre jeweiligen Homologen.
Ein Linker ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Atom oder Molekül, das zwischen Chromogen und Peptid angeordnet ist. Ein Linker ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere jede Verbindung, die in der Lage ist, mit der Aminosäuresequenz eine Peptidbindung auszubilden und den Abstand zwischen dem Chromogen und der Aminosäuresequenz vergrößert. Der Linker kann daher beispielsweise ein linearer oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter Alkyl(en)rest mit 1 bis etwa 40 C-Atomen sein, es ist jedoch ebenso möglich, dass der Linker Cycloalkyle enthält. Die Beschaffenheit des Linkers muss im wesentlichen nur die Vorraussetzung erfüllen, dass die proteolytische Aufspaltung der Peptidbindung zwischen Linker und Aminosäuresequenz durch ein geeignetes Enzym möglich ist. Im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Linker mindestens die Länge eines Ethyl-, insbesondere mindestens die eines Proyplrestes aufweist. Im Rahmen einer besonderen Ausführungsformen eignen sich beispielsweise 4-Aminobenzoesäure und 1,4-Phenylendiamin als Linker.
Weiter bevorzugt ist, dass zwischen Chromogen und Aminosäuresequenz ein Linkerbaustein angeordnet ist, der die Verlängerung der bindenden Aminosäuresequenz ermöglicht und weiter auch durch die Einführung geeigneter Linkerbausteine gewährleistet, dass Chromogen und Aminosäuresequenz zusammen ebenfalls optisch transparent sind.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiter durch eine Vorrichtung zur Bestimmung eines chemischen, biologischen oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz gelöst, umfassend
b) einen erfindungsgemäßen Sensor
c) eine Quelle für elektromagnetische Strahlung
d) einen Detektor für elektromagnetische Strahlung.
Damit wird der erfindungsgemäße Sensor in einfacher Weise in herkömmliche übliche Apperaturen, beispielsweise zur photometrischen Messung bzw. zur Messung von UV/NIS-Absorption, integriert, so dass ein einfacher Aufbau resultiert.
Vorteilhafterweise ist der Sensor innerhalb der Vorrichtung in einer Durchflusszelle angeordnet, so dass damit besonders einfach kontinuierlich eine Zielsubstanz bestimmt werden kann, beispielsweise während eines Experimentes oder während einer Operation. Dabei ist bevorzugt, dass die Zielsubstanz in einem kontinuierlich durch die Durchflusszelle geführten Fluid enthalten ist.
Bevorzugt findet die erfindungsgemäße Vorrichtung Verwendung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von elektrisch geladenen und/oder elektrisch ungeladenen Zielsubstanzen. Da jede Zielsubstanz nur mit einem einzigen Erkennungsbereich spezifisch wechselwirkt, kann damit eine Vielzahl von Elektrolyten, d.h. elektrisch geladen oder allgemein Analyten, d.h. elektrisch ungeladenen Zielsubstanzen einfach bestimmt werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiter durch ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Enzymaktivitäten gelöst, das folgende Schritte umfasst:
a) In-Kontakt-bringen eines Fluids enthaltend ein Enzym mit einem erfindungsgemäßen Sensor, bei dem ein Erkennungsbereich ein an eine Aminosequenz gebundenes Chromogen umfasst
b) Einkoppeln von elektromagnetischer Strahlung einer ausgewählten Wellenlänge in den Sensor
c) Spalten der Bindung zwischen Chromogen und Aminosäuresequenz
d) Freisetzen des Chromogens
e) Bestimmen des Absorptionsmaximums für die gewählte elektromagnetische Strahlung des freigesetzten Chromophors,
wobei die Reihenfolge der Schritte a) und b) beliebig ist.
Die Quantifizierung eines Analyten bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Ermitteln einer Masse, Konzentration oder Aktivität von Analytmolekülen und Ionen. Bevorzugt ist zwischen Chromogen und Aminosäuresequenz ein Linkerbaustein angeordnet, der weiter bevorzugt eine Peptidbindung ausbildet. Dies gewährleistet, dass spezifisch diese Peptidbindung gespalten wird, wodurch anschließend das Chromophor freigesetzt wird.
In Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Spaltung des Chromogens von der Aminosäuresequenz enzymatisch.
Enzyme im Sinne der Erfindung sind hochspezialisierte Proteine, die biochemische Reaktionen katalysieren ohne dabei verbraucht zu werden. Ribozyme, die unter dem Begriff Enzyme subsumiert werden können, umfassen Ribonukleinsäuremoleküle. Enzyme übertreffen in ihren katalytischen Eigenschaften synthetische Katalysatoren. Enzyme weisen eine hohe Affinität und Selektivität zu bestimmten Substraten auf. Wichtig unter den Enzymen sind insbesondere Protestasen, die sogenannten Serinproteasen I, wie beispielsweise Trypsin, bakterielle Serinproteasen II, wie beispielsweise Subtilisin, Zysteinproteasen wie Papain, Aspertatproteasen, wie Penicilopepsin, Metalloproteasen I wie Borincoridoxidpeptidase A, bakterielle Metalloproteasen II, wie Thermolysin, umfassen. Proteasen verdauen stets an einer bestimmten Stelle an einem Peptid bzw. Protein. Endopeptidasen hydrolisieren innerhalb eines Proteins bestimmte Amidbindungen, während Exopeptidasen C oder N terminal eine bis drei Aminosäuren vom Peptid abspalten.
Nachfolgend ist die Erfindung anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen weiter erläutert. Es versteht sich von selbst, dass die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in Alleinstellung, sondern auch in beliebigen Kombinationen untereinander den Erfindungsgedanken veranschaulichen. Fig. 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Sensor;
Fig. 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung in einem Durchflusssystem;
Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors.
In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßer Sensor 100 dargestellt. Dieser umfasst einen Träger (Substrat) 101 aus beispielsweise SiO2 oder einem ähnlichen, dem Fachmann an sich bekanntem, optisch transparentem Material, das für derlei Zwecke geeignet ist. Der Träger kann aber auch beispielsweise aus Kunststoff/Polymeren im Spritzgussverfahren mit aufgebrachten Wellenleiter (Hochvakuum Beschichtung) aus Tantalpentoxid, Siliciumoxid bzw. Titandioxid bestehen bzw. aus Mischungen davon. In diesem Falle spricht man von einem so genannten disposable Chip. In Folge Eigenfluoreszenz ist dieser Chiptyp bei Fluoreszenzmarkierung von Peptiden und anderen Molekülen üblicherweise nicht verwendbar. Dennoch kann er im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, da die Anregungswellenlänge üblicherweise im UV oder doch im blauen Anteil des Absorptionsspektrums liegt. Dies ist besonders vorteilhaft für Wegwerf-Bioassays (zum Einmal gebrauch). Der Brechungsindex des Trägers 101 beträgt n0 = 1,45 (589 nm). Auf dem Träger 101 ist eine zweite Schicht aus einem optisch transparenten Material, wie beispielsweise Ta2O5, mittels an sich bekannter Techniken angeordnet. Die Dicke der Ta2O5 -Schicht beträgt ca. 100 bis 500 nm, bevorzugt 100 bis 200 nm. Träger 101 und die Schicht 102 stellen somit einen dem Fachmann an sich bekannten "Dünnschichtwellenleiter" dar. Die optisch transparente Schicht aus Υ fi s weist im vorliegenden Fall eine Schichtdicke von ca. 160 nm auf. Der Brechungsindex dieser Schicht beträgt n = 2,21 (589 nm). Auf der optisch transparenten Schicht 102 aus Ta205 ist ein Erkennungsbereich 103 angeordnet. Dieser Erkennungsbereich 103 kann beispielsweise aus einer Monolage von Erkennungssubstanzen, beispielsweise von an Peptide gekoppelten Chromogenen bestehen, jedoch auch eine Schicht beispielsweise aus PVC/DOS sein, in der Erkennungsmoleküle verteilt sind. Der Brechungsindex des Erkennungsbereichs beträgt etwa n = 1,33 bis 15.
Mittels an sich bekannter Methoden, wie beispielsweise Ätzen mit HF oder ähnlich geeigneten fluorierten Mitteln, ist an dem Substrat 101 aus SeO2 eine Gitterstruktur 104 (Bragg Gitter) zur Einkopplung elektromagnetischer Strahlung, bevorzugt Licht sichtbarer Wellenlänge, angebracht. Ein zweites Gitter befindet sich hinter dem Erkennungsbereich 103 und ist ebenfalls als Bragg Gitter ausgestaltet. Je nach Anwendung bzw. je nach Substrat kann es vorteilhaft sein, auch sogenannte Slanted Bragg Gitter oder ähnliche Gitterarten zu verwenden. Die Erkennungsbereiche 103 stehen in Kontakt mit einem Fluid 106, das entweder ein Gas oder eine Flüssigkeit oder ein Dampf sein kann, in dem Zielsubstanzen verteilt sind, die mit dem Erkennungsbereich bzw. der Erkennungssubstanz im Erkennungsbereich 103 wechselwirken können. Licht sichtbarer Wellenlänge wird, dargestellt durch den Pfeil 107, bei der Messung mittels des erfindungsgemäßen Sensors 100 über ein Bragg Gitter 104 eingekoppelt und erzeugt aufgrund der dünnen Schichtwellenleiterschichtstruktur ein sogenanntes evaneszentes Feld, von dem die geführte Lichtwelle 108 in Fig. 1 dargestellt ist. Der Einkopplungswinkel Θ beträgt bei einer Wellenlänge von 674 nm - 3,3378° und bei einer Wellenlänge von Θ = 641 nm + 2,5987°. Das Licht koppelt anschließend am Auskopplungsgitter 105 aus und ist mit dem Pfeil 109 dargestellt. Mittels des evaneszenten Feldes 108 wird die sich ändernde Transparenz der optischen Schichtstruktur der Schicht 102 mit dem Erkennungsbereichen 103, die ebenfalls in einer anderen Ausführungsform integraler Bestandteil der Schicht 102 sein können, gemessen. Durch die gleichzeitige Änderung von Brechungsindex und Absorption, die mittels des evaneszenten Feldes gemessen werden kann, ändern sich die Eigenschaften der beiden Schichten im Verlaufe der Messung, die mathematisch beispielsweise durch eine Kramers-Kronig-Transformation erfasst werden können. Änderungen, die durch die Wechselwirkung einer Zielsubstanz im Fluid 106 mit dem Erkennungsbereich 103, der eine Zielsubstanz umfasst, die in Fig. 1 nicht dargestellt ist, werden somit einfach optisch erfasst. Diese Änderungen sind beispielsweise insbesondere Farbänderungen, die anschließend durch Abschwächung des evaneszenten Feldes des Lichtes gemessen werden können.
Fig. 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung im Durchflussmodus zur Messung chemischer, biologischer und physikalischer Eigenschaften von Zielsubstanzen. Die Vorrichtung 200 umfasst dabei einen erfindungsgemäßen Sensor, umfassend einen Träger 202, beispielsweise bestehend aus Siliziumdioxid wie vorstehend bei Fig. 1 geschildert, darauf angeordnet eine optisch transparente Schicht 206, beispielsweise aus Ta2O5, die eine weitere Beschichtung 207 umfasst. Das Ensemble aus Träger 202, optisch transparenter Schicht 206 und der weiteren Beschichtung wird vorliegend auch als „Chip" oder „optischer Chip" bezeichnet. In der Beschichtung 207, die ebenfalls optisch transparent sein kann, befinden sich die Erkennungssubstanzen. In einer weiteren Ausführungsform sind die Erkennungssubstanzen auf der optisch transparenten Schicht 206 direkt an einer Monolage aufgebracht, wobei auch verschiedenartige Substanzen in verschiedenen Erkennungsbereichen, die voneinander getrennt sein können, aufgebracht sind und die Beschichtung 207 dient nur dazu, dass im Durchflussmodus die aufgebrachten Substanzen auf der Schicht 206 nicht vom Fluid weggespült werden. Die Beschichtung 207 kann aus jedem für diese Art von Beschichtung geeignetem Material bestehen. Am Träger 202 sind Mittel zum Einkoppeln elektromagnetischer Strahlung 203, beispielsweise wie vorstehend beschriebene Bragg Gitter sowie Auskoppelgitter 204, die ebenfalls wie vorstehend beschrieben Bragg Gitter sein können, angeordnet. Das zu untersuchende Fluid strömt durch den Eingang 210 in die Durchflusszelle 201 und wird an der Oberfläche der Beschichtung 207 in Kontakt mit den Erkennungssubstanzen in den Erkennungsbereichen kommen und wechselwirken. Das Fluid strömt durch den Ausgang 211 weiter in den Kreislauf zurück. Die Vorrichtung 200 wird auch als „Messzelle" bezeichnet. Die Messzelle kann in einer weiteren Ausführungsform so gebildet werden, dass der Chip, der mehr als eine Spur der aufgebrachten chemischen selektiven Komponenten (Erkennungsbereich) bzw. der Referenz-/ Blindkomponenten (Referenzbereich) nebeneinander enthält, mit einem (mikro- bzw. mini- strukturierten zweiten Plättchen beispielsweise aus Glas, Plastik, Metall, Keramik oder einem sonstigen geeigneten Material / Chip gedeckt wird. Unter „Spur" wird verstanden, dass der Erkennungsbereich bzw. der Referenzbereich in Form einer im Wesentlichen geraden Linie ausgebildet ist. Natürlich ist auch jede andere geometrische Abbildung an Stelle einer Linie, sofern sie für den gemeinsamen Zweck geeignet ist erfindungsgemäß einsetzbar. Die Struktur des Plättchen/Chip entspricht den Spuren. Das heißt, dass in der den Spuren zugewandten Teils des Plättchens/Chip entsprechende Vertiefungen (Rillen) angebracht sind, die zu der jeweiligen geometrischen Struktur der Spuren auf dem Chip komplementär sind. Die Rillen bilden die eine Seite des Fliesskanals, durch welchen die Probe fliesst. Sie trennen gleichzeitig die Spuren voneinander und isolieren sie gegen das Ausfliessen von Lösung. Die Probe kommt im Fliesskanal in direkten Kontakt mit den chemisch selektiven Komponenten. So können nebeneinander Blindreaktion, Kalibratoren, positive und negative Kontrollen bzw. verschiedene Proben oder verschieden selektive Spuren parallel bzw. gleichzeitig ausgemessen werden.
Die Proben werden über entsprechende Nippel, Ventile, Spritzen etc in die Kanäle/Rillen am Eingang bzw. den Eingängen 210 eingeführt. Flüssigkeiten bzw. Gase (LAL-Enzym, Konditionierlösungen (z.B. Puffer), Lösungsmittel, Reinigungslösungen, Kalibrierlösungen) können auf demselben Wege PC gesteuert, automatisch (oder vor Hand) in Kontakt mit den selektiven chemischen Komponenten gebracht werden. Entsprechendes gilt für den bzw. die Ausgänge 211.
Die Lichtquelle 208 kann alle Kanäle/Rillen umfassend die Erkennungs-/Referenzbereiche gleichzeitig beleuchten und analysieren oder seriell arbeiten (periodische Umlenkung des
Lichtstrahls). Eine intermittierender Beleuchtung wird vorgezogen um die Photostabilität der Chromogene nicht zu strapazieren. Dasselbe gilt für den Lichtstrahl zur Detektion, der wieder aus dem Chip ausgekoppelt wird.
Während des Durchflusses liegt am optischen Sensor der Vorrichtung 200 ein evaneszentes Feld an. Dieses stammt von einer Lichtquelle 208, die in einem ersten Winkel Φ eingestrahlt wird, wodurch ein evaneszentes Feld mit einer geführten Lichtwelle 205 im evaneszenten Feld resultiert, die in dem Substrat und der optischen Schicht 202 bzw. 206 geführt wird. An den Bragg Gittern 204 koppelt die Lichtwelle 205 in einem ersten Winkel Φ2 wieder aus. Das abgeschwächte Licht wird am Detektor 209 registriert und einer Messgröße zugeordnet.
Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors 300. Der Sensor 300 besteht dabei aus einem wie vorstehend definierten Träger 301, auf dem eine wie vorstehend definierte optisch transparente Schicht 302 angeordnet ist. Bragg Gitter 303 und 304 sind zwischen dem Träger 301 und der optisch transparenten Schicht 302 mittels an sich bekannter Methoden angeordnet und ermöglichen das Ein- bzw. Auskoppeln elektromagnetischer Strahlung, insbesondere von sichtbarem Licht. Das eingekoppelte Licht erzeugt eine geführte Lichtwelle 307 im derart entstehenden evaneszenten Feld des Dünnschichtwellenleiters .
Als Lichtquelle für das eingekoppelte Licht 306 wird bevorzugt ein thermostabiler Halbleiterlaser mit integrierter, justierter und abgeglichener Optik und Elektronik verwendet. Das Modul verfügt über eine Lichtfrequenzstabilität von weniger als 0,2 nm und hat bevorzugt digitale Temperatur- und Stromausgänge. Bevorzugte Arbeitstemperaturen betragen 15° bis 40°C.
Die Durchflussmesszelle umfasst zwei Kammern und ist für kleine Probenvolumina optimiert. Sie verfügt über eine justierbare Positionierung des optischen Sensors und kann bevorzugt mittels eines sogenannten Schwenkverschlusses geschlossen werden. Die Durchflussmesszelle ist thermisch entkoppelt und thermostabil. Der Thermostatisierungsbereich umfasst 20°C bis 40°C bei einer Umgebungstemperatur von 15°C bis 40 °C.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1
Einbettung der Peptidsubstrate in eine Polymermembran
Zur Einbettung der Peptidsubstrate in eine Polymermembran muss das Peptidsubstrat ampiphile Eigenschaften aufweisen, damit es sich an der Grenzfläche zwischen Membran und Probelösung ausrichtet. Dies erfolgt wie vorliegend durch die Anknüpfung eines der lipophilen Chromogene, nicht aber durch Anknüpfen eines oder mehrerer lipophiler Gruppen an das Peptidende des Substrates. In diesem Falle würde der Farbstoff mitsamt der Peptidkette in die Probelösung hineinreichen, mit dem Peptid abgespalten werden und von der Membran weg diffundieren. Da bereits das Chromogen des ungespaltenen Substrats außerhalb der Reichweite des Evaneszensfeldes, ca. 100 nm, liegt, würde sich mit der Verdauung des Substrates keine Abschwächung der Moden im Wellenleiter ergeben und die Spaltungsreaktion unbemerkt ablaufen. Wichtig ist also, dass sich, sofern die erfindungsgemäße Erkennungssubstanz in einer PVC/DOS Membran befindet und sich der Farbstoff aufgrund seiner Lipophilie oder den angeknüpften lipophilen Gruppen vorwiegend in der Membran verteilt, was damit auch im evaneszenten Feld zu einer Abschwächung des Modes führen kann. Die Verteilung erfolgt dabei rasch und gleichmäßig. Bei langsamer Verteilung würde sonst nicht mehr die Aktivität der Proteasen in der Probelösung, sondern vielmehr die Verteilungskinetik des abgespaltenen Chromogens in der Membran gemessen. Ungeeignet ist ein Chromogen, dessen Absorptionsmaximum sich bei der Abspaltung vom Substrat nicht verschiebt, falls keine ungespaltenen Substratmoleküle in Form von Umkehrmizellen in der Membran vorhanden sind. Ein Ausschluss solcher Umkehrmtzellen lässt jedoch durch ein Gehalt unterhalb der kritischen Mischmizellbindungskonzentration steuern. Außerdem wirken nur Moleküle, die ein Verhältnis von hydrophyl/lipophil (hlb) von 3 - 6 aufweisen als Wasser in Öl (W-O) Emulgatoren.
Als Membrankomponenten im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden lipophile Membrankomponenten verwendet, damit sie nicht in beispielsweise wässrigen Proben ausgewaschen werden. Insbesondere wird als lipophile Wahlmatrix bevorzugt hochmolekulares Polyvinylchlorid (PVC) verwendet. PVC hat eine hohe Chemikalienbeständigkeit und niedrige Gas- und Dampfdurchlässigkeit. Sämtliche Polymere, die in erfindungsgemäßen Sensormembranen zum Einsatz kommen, weisen eine Gasübergangstempertur Tg auf, die tiefer als die Raumtemperatur ist. Daher kann hochmolekulares PVC mit einer Tg von ca. 80°C nur zusammen mit Weichmachern zur Herstellung von Optodenmembranen eingesetzt werden. Ansonsten würde eine spröde, amorphe, unflexible Substanz entstehen, die auch keine Haftung auf einem Wellenleiter zeigen würde. Weitere bevorzugte Verbindungen zur Ausbildung von Membranen bzw. Matrizes sind Polyurethane, Poly(vinylidenchlorid) und Polysiloxan.
Weichmacher sind schwerflüchtige Flüssigkeiten, die sich aufgrund ihrer Affinität zwischen die Matrixmoleküle einschieben und intermolekularen Kräfte abschwächen. Das Resultat dieser Wechselwirkungen sind verbesserte Membraneigenschaften bezüglich Flexibilität, Haftfähigkeit und Plastizität. Sämtliche Weichmacher, die nicht zu lipophil sind, da sonst die Ansprechzeit unerwünscht verlängert würde, können erfindungsgemäß verwendet werden. Jedoch sollen die Weichmacher auch nicht zu hydrophil sein, da es sonst, beispielsweise beim Einsetzen in einem Durchflusssystem mit Analytlösungen ausgewaschen werden kann und die Membran eine sehr kurze Lebensdauer hätte. Bevorzugt ist beispielsweise Bis(2-Ethylhexyl)sebacat(dioctylsebacat,DOS).
Zur Aufbringung der Membran auf Wellenleitern wurde allgemein als Lösungsmittel Tetrahydrofuran verwendet, obgleich jedes andere ebenso schnell verdunstende Lösungsmittel genau so eingesetzt werden kann.
Die Immobilisierung des Peptidsubstrates kann in einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung auf der Oberfläche der optisch transparenten Schicht erfolgen. Sofern ein Monolayer der Erkennungssubstanz kovalent oder durch andere Techniken, z.B. durch Anlagerung von substratderivatisierten Biotin an Avidin auf der Oberläche, d.h. direkt auf der Wellenleiteroberfläche immobilisiert wird, so dringt das evaneszente Feld in die Probelösung ein. Es dürfen in diesem Fall in der Probelösung keine Störkomponenten vorhanden sein, die im Bereich der Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes absorbieren. Durch die Wahl von Lichtquellen im Bereich von ca. 600 - 800 nm wird die Gefahr für biologische Proben bereits ausgeschlossen. In diesem Fall diffundiert das Chromogen nicht in das Evaneszensfeld hinein, sondern entfernt sich nach der Abspaltung. Dies führt zu einer Signalversperrung im Gegensatz zur beschriebenen Signalabschwächung bei Membranen.
Peptidsequenzsubstrate können auf der Wellenleiteroberfläche z.B. kovalent oder durch Biotin-Avidin-Kopplung angebunden werden. Um zu verhindern, dass diese Substrate nicht mehr von den Proteasen umgesetzt werden können, weil die Proteasen so dicht an der Wellenleiteroberfläche durch sphärische Hinderungen nicht in der Lage sind, das Substrat in der erforderlichen Maß zu umschließen, kann es vorteilhaft sein, einen Linkerbaustein zwischen die Anheftungsstelle auf dem Wellenleiter und der Peptidsequenz des Substrates einzubinden, damit die Substratmolekule soweit in die Probelösung hineinreichen, damit die Proteasen Zugang zum Substrat erhalten und es spalten können. Methoden der kovalenten Verankerung bzw. via Biotin-Avedin-Kopplung sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Ausführungsbeispiel 2
Dieses Beispiel erläutert die optische Messtechnik auf einem planaren optischen Dünnfilm- Wellenleiter.
2.1 Grundlagen und Definition von verwendeten Größen:
Absorptionsmessung gemäss IUPAC - Definition wird wie folgt definiert:
Absorptionsfaktor α a = Φabs / Φ0„ Φ = Strahlungsenergie Dekadische Absorption: A10 = - lg (l - α)
Linearer dekadischer Absorptionskoeffizient, : A10 / l (m"1)
Molarer (linearer dekadischer) Absorptionskoeffizient ε : A10 / c ■ l (m2 • mol"1)
Absorbanz als Messgrösse für die Konzentration einer Substanz / eines Analyten infolge der Absorption von Licht einer definierten Wellenlänge:
-A,0 = lg (Φ0 / Φtrans ) = £ . C . I
Dies bedeutet, dass die gemessene Absorbanz direkt proportional dem Absorptionskoeffizienten der absorbierenden Substanz, der Länge der durchsstrahlten Schichtdicke und der Konzentration der absorbierenden Substanz ist.
Die Absorbanzmessung dann besonders sensitiv, wenn der Analyt einen hohen Absorptionskoeffizienten aufweist, wenn die Analysenwellenlänge zur Diskriminierung zwischen Hintergrund und Analyt beiträgt und wenn mit hoher Schichtdicke / Eindringtiefe des Lichtstrahls gearbeitet werden kann ohne dass die Probe durchstrahlt werden muss (unspezifische Absorption).
Dies ist bei der sog. ATR-Technik (attenuated reflection) gewährleistet, bei der das Licht in einem planaren Wellenleiter entlang der Probe geführt werden kann und nur eine geringer Anteil des Lichtes innerhalb des Evaneszenzfeldes mit der Probe bzw. dem Analyten in Kontakt steht.
Im Falle des planaren Wellenleiters wird die Schichtdicke ersetzt durch die Eindringtiefe des Evaneszenzfeldes (dp / nm) in die Probe und die Länge des Wellenleiters (l / m) entlang dem das Licht geführt wird. Zusätzliche Parameter sind der Einkopplungswinkel des Lichtstrahl in den Wellenleiter, die Brechungsindices der benachbarten Medien und die Wellenlänge des Lichtes, die die Eindringtiefe des Evaneszenzfeldes direkt mitbestimmen. Die Eindringtiefe steigt mit der Langwelligkeit der analytischen Lichtquelle (direkt proportional) und sinkt mit der Brechzahl des Wellenleiters relativ zur Brechzahl der Probe.
Ein weiterer Faktor, der die Absorbanz beeinflusst, ist die Querschnitt-Dicke des Wellenleiters. Typische ATR-Einrichtungen / ATR-Kristalle / ATR- Wellenleiter weisen eine Dicke im Bereich von 100 Mikro- bis einigen Millimetern auf. Je dicker ein Wellenleiter ist, desto weniger interne Reflektionen resultieren. Im Falle der klassischen ATR-Technologie bildet sich jedoch nur dort ein Evaneszenzfeld aus, wo interne Lichtbrechung / Reflektion erfolgt. Die Absorption summiert sich über die endliche Anzahl Reflektionen auf (z.B. 1 bis 50 Reflektionen entlang mehreren Milli- bzw. Zentimetern Länge des Wellenleiters).
Im Gegensatz dazu beträgt die Querschnittdicke eines Dünnfilm- Wellenleiters nur einige zehn Nanometer (z.B. 60 bis 150 nm (1 nm = 10"9 m)). In diesen Filmen breitet sich der Lichtstrahl idealerweise in einem einzigen „mode" aus (monomodale Welle) und in quasi unendlich vielen Reflektionen. Dadurch bildet sich ein quasi kontinuierliches Eveanszenzfeld entlang des Wellenleiters aus und es resultiert bereits auf wenigen Millimetern eine höhere Absorption als entlang einigen cm der traditionellen ATR- Kristalle. Die Verwendung dieser Technik zur Absorptionsmessung ist deshalb besonders attraktiv, beansprucht jedoch ein sehr fortgeschrittenes Know-how. Das Licht wird dabei idealerweise über Brechungsgitter eingekoppelt (Alternative: Stirnseite des Kristalles).
2.2 Spezielles Ausführungsbeispiel:
physikalische Randbedingungen: Wellenleiterfilm (optisch transparente Schicht aus Tantalpentoxid mit einer Dicke von 150 nm und einer Gitterperiode von 360 nm; Die Brechzahl des Erkennungsbereichs (PVC/DOS Film) wer 1.440; Die Brechzahl des Wellenleiters = 2.114; die Brechzahl des Trägermaterials (Siliciumdioxid) = 1.5238; Absorbanz der elektrischen Feldkomponente (mode, m = 0):
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Aufgrund der wesentlich höheren Anzahl Reflektionen ist das totale Absorptionssignal im Bereich des NIR um einen Faktor von 10 bis 100-fach verstärkt gegenüber dem Absorptionssignal, das bei Durchstrahlung einer 4 - 6 Mikrometer dicken selektiven Membran gewonnen wird.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Sensor zur Bestimmung eines chemischen und/oder biologischen und/oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz, umfassend
a) einen Träger
b) eine optisch transparente Schicht, die auf dem Träger angeordnet ist
c) Mittel zur Ein- und Auskopplung elektromagnetischer Strahlung
dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht einen Erkennungsbereich aufweist, der eine Erkennungssubstanz umfasst, die mit der
Zielsubstanz wechselwirkt.
2. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger optisch transparent ist.
3 . Sensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Erkennungsbereich eine optisch transparente Schicht ist, die eine Erkennungssubstanz enthält.
4 . Sensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Erkennungsbereich im wesentlichen aus einer Erkennungssubstanz oder aus einer Mischung verschiedener Erkennungssubstanzen besteht.
5 . Sensor nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Erkennungsbereich einen niedrigeren Brechungsindex als die optisch transparente Schicht aufweist.
6 . Sensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Erkennungsbereichen vorhanden sind.
7. Sensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Erkennungsbereich eine unterschiedliche Erkennungssubstanz oder Mischungen von Erkennungssubstanzen umfaßt.
8. Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiterer Erkennungsbereich als Referenzbereich ausgestaltet ist.
9. Sensor nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Ein- und/oder Auskopplung der elektromagnetischen Strahlung zwischen Substrat und optisch transparenter Schicht angeordnet sind.
10. Sensor nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkung zwischen Erkennungssubstanz und Zielsubstanz in einem oder mehreren Schritten abläuft.
11. Sensor nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkung zwischen Erkennungssubstanz und Zielsubstanz reversibel oder nicht reversibel ist.
12. Sensor nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungssubstanz in oder auf der optisch transparenten Schicht verankert ist.
13. Sensor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Ein- und/oder Auskopplung der elektromagnetischen Strahlung als Gitterstruktur ausgebildet sind.
14. Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungssubstanz ein Chromophor umfaßt.
15. Sensor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Chromophor elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge von mehr als 480 nm absorbiert.
16. Sensor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Chromophor an eine Aminosäuresequenz gebunden ist.
17. Sensor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Chromophor und Aminosäuresequenz ein Linkerbaustein angeordnet ist.
18. Vorrichtung zur Bestimmung eines chemischen und oder physikalischen Parameters einer Zielsubstanz umfassend a) einen Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, b) eine Quelle für elektromagnetische Strahlung, c) einen Detektor für elektromagnetische Strahlung.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor in einer Durchflusszelle angeordnet ist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 19, weiter umfassend Mittel zum kontinuierlichen Durchführen einer Zielsubstanz durch die Durchflusszelle.
21. Vorrichtung, nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielsubstanz in einem Fluid enthalten ist.
22. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21 zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von elektrisch geladenen und/oder elektrisch ungeladenen Zielsubstanzen.
23. Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz mit einem Biosensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis
17, umfassend die Schritte
a. Bestimmung eines Ausgangszustandes vor der Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz
b . Bestimmung des Zustandes nach der Wechselwirkungen zwischen einer Zielsubstanz und einer Erkennungssubstanz
4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Enzymaktivitäten, umfassend die Schritte
a) in-Kontakt-bringen eines Fluids enthaltend ein Enzym mit einem Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 17 bei dem ein Erkennungsbereich ein an eine Aminosequenz gebundenes Chromophor umfaßt b) Einkoppeln von elektromagnetischer Strahlung einer ausgewählten Wellenlänge in den Sensor c) Spalten der Bindung zwischen Chromophor und Aminosäuresequenz d) Freisetzen des Chromophors e) Bestimmen des Absorptionsmaximums für die gewählte elektromagnetische
Strahlung des freigesetzten Chromophors
wobei die Reihenfolge der Schritte a) und b) beliebig ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Chromophor und Aminosäuresequenz ein Linkerbaustein angeordnet ist.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Linkerbaustein zu der Aminosäuresequenz eine Peptidbindung ausbildet.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Peptidbindung zwischen Linkerbaustein und Aminosäuresequenz gespalten wird.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006075163A (ja) * 2004-09-08 2006-03-23 Bayer Corp 平板導波管を用いる酵素活性の定量
CN100432235C (zh) * 2004-09-08 2008-11-12 美国拜尔公司 利用平面波导管定量测定酶活性

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004045902B4 (de) * 2004-09-22 2006-08-31 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung zur Messung der Lichtabsorption
DE102005056225B4 (de) * 2005-11-25 2008-12-18 Petter, Jürgen Elektro-optischer Sensor und Verfahren zur Bestimmung physikalischer Eigenschaften einer Zielsubstanz über deren Brechungsindex
DE102007033124B4 (de) 2007-07-16 2012-12-06 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung zur optischen Detektion von Substanzen in einem flüssigen oder gasförmigen Medium
DE102011085394B4 (de) 2011-10-28 2015-04-02 INSTITUT FüR MIKROTECHNIK MAINZ GMBH Vorrichtung zur Analyse eines Fluids mittels Evaneszenzfeldspektroskopie und Dielektrophorese
EP3370058A1 (de) * 2017-03-01 2018-09-05 Danmarks Tekniske Universitet Planare wellenleitervorrichtung mit filter in nanogrösse
DE102020129522A1 (de) 2020-11-10 2022-05-12 Endress+Hauser Conducta Gmbh+Co. Kg Indikator für die Bestimmung eines pH-Werts einer Lösung

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4510241A (en) * 1981-09-03 1985-04-09 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
DE3701833A1 (de) * 1986-02-03 1987-08-06 Avl Ag Verfahren zur optischen bestimmung der katalytischen enzymaktivitaet einer probe, und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrens
US5097014A (en) * 1986-08-28 1992-03-17 Behringwerke Aktiengesellschaft Chromogenic tripeptides
WO2001013096A1 (de) * 1999-08-13 2001-02-22 Zeptosens Ag Vorrichtung und verfahren zur multianalytbestimmung
CH692120A5 (de) * 1997-01-14 2002-02-15 Schweizerische Eidgenossenschaft Technische Hochschule Eth Multidimensionale modulare Sensorvorrichtung für die Prozess-Messtechnik.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4510241A (en) * 1981-09-03 1985-04-09 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
DE3701833A1 (de) * 1986-02-03 1987-08-06 Avl Ag Verfahren zur optischen bestimmung der katalytischen enzymaktivitaet einer probe, und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrens
US5097014A (en) * 1986-08-28 1992-03-17 Behringwerke Aktiengesellschaft Chromogenic tripeptides
CH692120A5 (de) * 1997-01-14 2002-02-15 Schweizerische Eidgenossenschaft Technische Hochschule Eth Multidimensionale modulare Sensorvorrichtung für die Prozess-Messtechnik.
WO2001013096A1 (de) * 1999-08-13 2001-02-22 Zeptosens Ag Vorrichtung und verfahren zur multianalytbestimmung

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006075163A (ja) * 2004-09-08 2006-03-23 Bayer Corp 平板導波管を用いる酵素活性の定量
US7410784B2 (en) 2004-09-08 2008-08-12 Bayer Corporation Quantitation of enzyme activity using planar waveguides
CN100432235C (zh) * 2004-09-08 2008-11-12 美国拜尔公司 利用平面波导管定量测定酶活性
JP2012070756A (ja) * 2004-09-08 2012-04-12 Bayer Healthcare Llc 平板導波管を用いる酵素活性の定量

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