OPTISCHER SENSOR MIT NANOPARTIKEL-TRANSFER
Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Meßprinzip zum Aufbau von Biochips, Teststicks, Sensoren, sensorischen Folien, Sensorlabel und Sensorarrays. Die Technologie beruht auf einem neuartigen clusteroptischen Sensoraufbau unter Nerwendung von leitfähigen zumeist metallischen Νanoclustern, mit welchem alle Moleküle mittels eines rekognitiven Bindungssystems mit einer Dissoziationskonstante kleiner 10"1 (zumeist 10"5 bis 10"π) insbesondere Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA oder artifizielle Analoga), Proteine, Peptide, Biotin, Avidin, DIG und Pharmaka in besonders einfacher und reproduzierbarer Weise erfasst werden können.
Das neuartige Prinzip nutzt dabei einige Elemente der bereits erteilten US Patente (des Anmelders und Erfinders) US 05611998 "Optochemical sensor and method for production" und US6669906 "Reinforced cluster optical sensors" und analoger bzw. korrespondierender europäischer Patente.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht den A ifbau eines Sensors, einer sensorischen Folie („intelligente Verpackung"), Arrays oder Teststicks der ein optisches Messsignal liefert und dabei keine Markierung der Reagenzien oder des Analyten (mit einem Label) mit gelösten Reagenzien (mit Ausnahme von Wasser und falls erforderlich Chemikalien zur Stabilisierung von biologischen Komponenten) benötigt.
Stand der Technik
Nahezu alle etablierten Testsysteme benötigen entweder:
1.) ein Bindungssystem und einen Label (zumeist am Analyten) oder
2.) zwei Bindungssysteme (Sandwich- Assay) wobei zumindest eine der beiden Komponenten markiert (Enzym, Fluorophor o.a.) ist.
Im ersten Fall ist es nötigt, den Analyten mit einem Label (z.B. Fluorophor, Enzym,.. ) zu versehen. Dies implementiert einen Zeitaufwand und Kosten und kann oft nicht vor Ort und von ungeübtem Personal durchgeführt werden. Der markierte Analyt wird dabei mit dem
Analysesystem in Kontakt gebracht (Biochip, Mikrotiterplatte, Teststick,..) und nach der
Bindung entweder über Fluoreszenz (teures Equipment) oder (bio)chemisch unter Zusatz von gelösten Reagenzien zumeist optisch ausgewertet.
Der zweite Aufbau benötigt keine Markierung des Analyten jedoch den Einsatz von zwei Bindungssystemen. Dies ist teuer und benötigt zwei zeitaufwendige Inkubationsschritte. Der Nachweis erfolgt wieder zumeist über Enzyme (ELISA) oder Fluoreszenz bzw. über verwandte Systeme wie z.B. Chemolumineszenz. Ein Analyt wird dabei z.B. durch einen Antikörper erkannt welcher seinerseits mit einem hoch aktiven Enzym gekoppelt ist. Die enzymatische Reaktion induziert sodann eine deutliche lokale Farbänderung die ausgewertet wird.
Eine weitere Gruppe von Instrumenten misst die Bindung einer Komponente an eine Oberfläche mit Hilfe eines Bindungssystems (DNA, Antikörper, Rezeptor, Lektin,..) indem die Änderung eines optischen Parameters verfolgt wird. Insbesondere die Messung der Änderung der Brechungsindices (SURFACE PLASMON RESONANCE, SPR) hat in den letzten Jahren weit reichende Anwendung erfahren. Dabei wird der resonante Reflexionswinkel eines Lichtstrahl an einer Oberflächen-Plasmonwelle durch die Bindung von Molekülen mit abweichendem Brechnungsindex verändert. Die Bindung des Analyten erfolgt durch Beschichtungen des Messchips mit einem Bindungssystem (Protein, DNA,..) SPR-Systeme benötigen eine komplexe Optik und können nur in reinen Lösungen eingesetzt werden, da jede Bindung an die Oberfläche das Signal verändert und damit unspezifische Bindungen das gleiche Signal wie der Analyt geben.
Erfindung
Alle genannten System weisen daher systembedingt eine der genannten Limitationen auf, da sie entweder:
* chemische Reaktionsschritte und damit Reagenzien (Markierung, enzymatische Reaktion) benötigen und/oder
* einen aufwendigen und teuren Messaufbau erfordern (SPR, Fluoreszenzscanner) und/oder
* 2 zeitaufwendige Diffusionsschritte (Analyte and Bindungssystemi und dann Bindungssystem 2) benötigen.
Im Folgenden wird das neuartiges Analysesystem beschrieben, das die genannten Nachteile nicht aufweist:
1.) Das neuartige erfindungsgemäße Messsystem ermöglicht die Generierung eines optischen visuellen und mit einer Kamera auswertbaren Messsignals.
2.) Das Signal entsteht durch die Resonanzverstärkung der Cluster bzw. Kolloide mit einer reflektierenden Oberfläche, wobei die Cluster am Chip oder nahe dem Chip gebunden sind
und damit keine Diffusion der Cluster bzw. eine sehr kurze Diffusionsstrecke nur über wenige
Mikrometer nötigt ist.
3.) Essentiell und erfindungsgemäß liegt eine Schicht von nicht permanent gebundenen
Clustern (Nanopartikeln, Kolloiden o.a.) vor, die entweder bereits an bzw. nahe der
Oberfläche oder auf einer zweiten Oberfläche (Kunststofffolie, Gelfilm o.a.) nicht permanent gebunden ist.
4.) Es werden vorzugsweise ein oder mehrere Bindungssysteme für den Analyten auf die
Oberfläche des Chips homogen oder als Array gebunden.
5.) Das zweite Bindungssystem wird bevorzugter Weise auf die Nanocluster (Kolloide,
Partikel) gebunden, welche ihrerseits auf einer zweiten Schicht (8) und oder Oberfläche des
Films (11) reversibel gebunden sind.
6.) Eine oder beide mit rekognitiven Molekülen (6) beschichteten Oberflächen (8, 11) werden sodann mit einem Analyt in Kontakt gebracht, wobei der Analyt (7) an einen Teil der rekognitiven Moleküle (6) bindet.
7.) Sodann wird die Oberfläche des Films (11) mit der Oberfläche der Abstandschicht (3) entweder direkt in Kontakt gebracht und dabei die bindungsfähigen Cluster auf die Oberfläche der Abstandschicht (3) transferiert, oder der Kontakt von Film (11) und Oberfläche (3) erfolgt bereits vor Inkubation mit dem Analyten oder die Cluster werden von Oberfläche des Films
(11) unmittelbar über der Oberfläche der Abstandschicht (3) abgelöst, sodass sie in idealer räumlicher Nerteilung wenige Mikrometer bis zu rekognitiven System (5) auf Oberfläche der
Abstandsschicht (3) diffundieren.
8.) Sodann entfernt man die Νanopartikelträgerschicht (= Film (11)). Dies erfolgt bevorzugt durch Abziehen des Films (11) kann aber auch durch chemische oder physikalische Auflösung des Films erfolgen.
9.) Die nicht benötigten Cluster verbleiben entweder auf der Oberfläche (11), werden abgewaschen oder verbleiben in einem Abstand, dessen Resonanzfarbe eine andere als jene des Chips ist (siehe bereits zitierte Patente).
10.) Der außergewöhnliche Vorteil diese Messsystems ist der Einsatz ohne chemische Label und ohne lösliche Reagenzien.
Der "Nanocluster - Transfer Chip"- Aufbau löst hiermit ein grundlegendes Problem des in der Anmeldung EP00979408: "Reinforced cluster optical sensors" beschrieben Messaufbaus. Um eine sensitive und rasche Farbreaktion zu erhalten, müssen die Nanocluster in sehr hoher
Konzentration eingesetzt und/oder lange mit der Oberfläche inkubiert (in Kontakt gebracht) werden. Dabei ist der Assay entweder durch die Diffusionsgeschwindigkeit der Cluster limitiert oder durch die unspezifisch Adsorption bzw. Präzipitation der Cluster. Der neuartige Transferchip bringt die Cluster entweder direkt oder in mikrometernahe Umgebung ihrer Bindungspartner und kann damit grundlegenden Einschränkungen des Aufbaus überwinden. Der beschriebene Aufbau weist deutliche Vorzüge zu jenem in DE 19927051 AI beschriebenen Aufbau auf. In DE 19927051 AI werden zwei Oberflächen, eine mit Clustern und eine ohne Cluster, aneinandergepresst und sodann nicht mehr getrennt, darüber hinaus sind die Cluster fix an die Oberfläche des Films (11) gebunden und können nicht übertragen werden.
Erfindungsgemäß sind alle Nanopartikel Partikel mit einem Durchmesser von weniger als 1 μm aus einem leitfähigen Material. Nanopartikel werden auch oft Cluster, Nanocluster oder Kolloide genannt. Nanopartikel-Filme auf Oberflächen stellen eine Mehrzahl von Nanopartikeln dar die auf einer Oberfläche abgelagert sind. Oft werden diese Schichten auch Inselschichten oder Inselfilme genannt.
Der in diesem Patent beschriebene Nanocluster-Transfer-Aufbau ermöglicht einen Transfer von einzelnen Clustern von einer Oberfläche auf eine andere - abhängig von Gleichgewicht der Interaktionskräfte zwischen beiden Oberflächen. Es wird dabei nur durch jene Cluster ein optische Messsignal erzeugt, die von Oberfläche (11) auf die Oberfläche der Abstandsschicht (3) übertragen wurden und dort im Resonanzabstand zum Spiegel (2) gebunden wurden. Insbesondere die gezielte Wahl der (bio)rekognitiven Interaktionskonstanten auf beiden Oberfläche kann wenn nötig, eine spezifische Diskriminierung des unspezifischen Adso tionshintergrundes bewirken, da nur Cluster mit einer höheren Affinität zur Oberfläche (3 mit 5 belegt) die Oberfläche (11) verlassen können.
Die durch die Änderung des räumlichen Abstands induzierte räumliche Verschiebung am Sensorchip ( = Änderung des Abstands Spiegel zu Cluster-Schicht) wird in ein leicht meßbares optisches Signal umgewandelt.
Die optische Auslesung erfolgt durch Reflexion von Licht am Sensorchip in der Weise, dass das Licht die Abstandsschicht zumindest zwei mal durchquert und damit mit der eigenen rücklaufenden Welle in Resonanz treten kann. Die extrem geringe Schichtdicke zeigt dabei, dass es sich bei diesem Effekt nicht um eine normale Interferenz handelt, da diese bei Schichtdicken weit unter der Wellenlänge keine farbgebende Komponente aufweist. Erfindungsgemäß kann entweder der primäre Abstand der beiden Oberflächen außerhalb des
Resonanzabstandes im Abstand von mehr als 1 μm gewählt werden oder bei einem Abstand innerhalb der Resonanz, welcher einen anderen Farbton ergibt als jener nach der Kopplung der Cluster an die Oberfläche 11.
Um einen resonanten Farbton (surface enhanced resonance = SER oder surface enhanced absorption = SEA, beide Namen bezeichnen den gleichen Effekt) zu erhalten, dürfen die Cluster nicht direkt auf die Oberfläche der Abstandsschicht (3) gebunden werden, da sodann die Felder der Nanopartikeln mit dem Nahfeld des Metalls überlappen und damit kein Farbton entsteht. Erst im Abstand von einigen zehn Nanometern beginnt die Zone starker Farbentwicklung die sich bis etwa 500 nm erstreckt. Dabei ist die Farbintensität bei dünnen Schichten größer, mit steigen Schichtdicke werden die Spektren komplexer und die maximalen Extinktions-Koeffizienten geringer. Sehr dünne Schichten (bis 100 nm) weisen oft eine größere spektrale Breite auf da die Form der Nanocluster die Banden verbreitert, Schichten zwischen 100 und 300 nm zeigen starke Farben bei relativ schmaler Linienbreite. Der nanometrische Aufbau bewirkt durch eine optische Resonanzverstärkung der Clusterabsorption mit der reflektierenden Oberfläche eine starke Färbung derselben. Dabei ist im Gegensatz zu Pigmentfarben im erfindungsgemäßen Aufbau die resultierende Farbe vom Abstand der Metallpartikel zum Spiegel und nicht (!) von der Eigenfarbe der Partikel abhängig. Ungleich jeder auf Interferenz basierenden Farbgebung tritt dieser Effekt nur an viel dünneren, nanometrischen Schichten auf und zeigt sich nur bei metallartigen Partikeln. Der Aufbau besteht zumeist aus einer sichtbares und infrarotes Licht spiegelnden Metallschicht auf einem Trägermaterial, einer inerten Abstandsschicht, dem Biointeraktionssystem (aus zumeist 2 oder 3 Komponenten, z.B. 2 Antikörper und der Analyt) und nach Ablauf der Interaktionsreaktion einer Partikel(Cluster)schicht. Um eine klare Farbgebung zu erhalten, wird der Durchmesser der Cluster vorzugsweise kleiner als 40 nm gewählt, für breitbandige und starke Absorption können auch größere und assymetrische Partikel mit Vorzug eingesetzt werden. Eine Änderung der Belegungsdichte der Partikelschicht im molekularen Maßstab oder Änderungen in der räumlichen Anordnung der gebundenen Cluster am Sensor führen zu den charakteristischen Änderungen der optischen Erscheinung der Oberfläche. Metallische oder metallartige Partikelfilme mit einem mittleren Clusterdurchmesser kleiner als 500 nm (vorzugsweise kleiner als 40 nm, da sehr große Partikel mehr streuen als absorbieren) weisen starke schmalbandige Reflexionsminima auf, deren spektrale Lagen extrem empfindlich von der räumlichen Anordnung, insbesondere dem Abstand zu einer elektronenleitenden Oberfläche, abhängen.
Der Aufbau kann selbst geringste Änderungen der Oberflächenbelegung mit Nanopartikeln
(Clustern, Kolloiden) in klar erkennbare Farbänderungen umwandeln, d.h. entweder in eine
Extinktionsänderung bei einer bestimmten Wellenlänge, oder in eine spektrale Verschiebung des Absoφtionsmaximums.
Im Folgenden soll auf die Bedeutung von neuartigen Messverfahren für die medizinische
Analytik wie auch DNA-Technologie hingewiesen werden.
Es besteht heute großer Bedarf an raschen, einfachen und billigen Testverfahren in der medizinischen Diagnostik und zur Untersuchung im Umwelt- und Lebensmittelbereich. Dabei werden immer größere Anforderungen an Empfindlichkeit, Selektivität und Verlässlichkeit gestellt. Seit Jahren ist daher die Suche nach neuen direkten Detektionsmethoden
(insbesondere im Bereich POC = point of care) ein zentrales Problem der biomedizinischen und lebensmittelchemischen Forschung. Chemische und biochemische Chips, Arrays,
Teststicks und Sensoren können hierzu einen wichtigen Beitrag leisten.
Die Erfindung zielt auch darauf ab ELISA-Technologie im POC-Markt zu verdrängen und durch den neuartigen Sensorchip zu ersetzten. Dabei werden die grundlegenden messtechnische Einschränkungen des ELISAs (viele Inkubationsschritte, Reagenzien,...) in optimaler Weise beseitigt.
Das neuartige Messprinzip kann in verschiedenen Anordnungen realisiert werden. Typische
Anordnungen sind in den Abbildungen 1-4 im Detail dargestellt.
Die Figuren 1 bis 4 zeigen unterschiedliche Ausfuhrungsbeispiele:
Fig 1: Chip zeigt den Chipaufbau mit flexiblem, elastischem Deckfilm
Fig 2: Chip zeigt den Chipaufbau mit externem Deckfilm
Fig 3: Chip zeigt den Chipaufbau mit integraler Gelschicht (8) als Clusterträger bzw.
Oberfläche und Film (gemäß Anspruch 1)
Fig 4: Chipaufbau zeigt den Chipaufbau mit kompetitivem Assay (= Verdrängungsassay, wobei der Analyt Nanopartikeln (welche mit Analyt-Analoga überzogen sind) von den
Bindungsstellen (5) verdrängt.
Figur 8 zeigt typische Spektren die durch konstruktive und/oder destruktive Interferenz von an der Clusterschicht (Schicht von 4) reflektierten und zweimal die Abstandsschicht (3)- durchlaufende und am Spiegel (2) reflektierte Wellen entstehen.
Die mit Bezugszeichen versehenen Teile des erfindungsgemäßen Aufbaus sind wie folgt zuzuordnen:
1 = Trägermaterial (CHIP, Folie, Substrat aus Metall, Keramik, Glas, biologischem
Material oder Kunststoff)
2 = selbst-reflektierende (= Oberfläche von 1) oder durch Beschichtung reflektierend- gemachte Oberfläche (Metallspiegel, teilreflektierende Clusterschicht, Phasengrenze,..)
3 = Abstandsschicht = Resonanzschicht
4 = Nanometrische, leitfahige und bevorzugt metallische Nanopartikel (Ein Nanopartikel ist ein Partikel welches zumindest in eine Raumdimension nanometrisch bzw. nahezu nanometrisch ist, d.h. einen Achslänge unter einem Mikrometer aufweist.)
5 = Analyt-rekognitive Moleküle 1 (erkennen den Analyten oder werden von diesem erkannt)
6 = Analyt-rekognitive Moleküle 2 (erkennen den Analyten oder werden von diesem erkannt)
7 = Analyt (nachzuweisende Substanz)
8 = Gel (Analyt-poröse und auflösbare Schicht)
9 = Auflösung der Schicht (8), durch einen Pfeil angedeutet
10 = Entfernung überschüssiger Cluster durch z.B. Waschen, Absaugen, Elektrophorese o.a. 11 = Film, Oberfläche, z.B. eine Folie, Gelschicht, elastische oder plastische Membran, poröse Membran, ein- oder mehrschichtig
12 = Zusammenpressen beider Oberflächen, durch einen Pfeil angedeutet
13 = Auseinanderziehen beider Oberflächen, durch einen Pfeil angedeutet
14 = Verformung (bevorzugt elastische) einer der beiden Oberflächen
15 = "rekognitive Moleküle 1" bindende Moleküle
Sl bis S6 geben die sequenzielle Folge von Chipaufbau (S1,S2,S3) und Analyse (S4,S5,S6) wieder.
In Abbildung 6 ist die sequenzielle Änderung des Reflexionsspektrums bei Änderung des
Cluster-Spiegel-Abstandes gegeben (steigende Zahlen geben steigende Schichtdicken wieder, jedoch keine absoluten Eichwerte).
Die metallisch reflektierende oder durch den anormal optischen Effekt (SEA = SER) gefärbte
Oberfläche wird erfindungsgemäß durch den Transfer und die (bio)rekognitive Kopplung der
Cluster von Oberfläche des Films (11) an Oberfläche der Abstandsschicht (3) (nach Zugabe des Analyten (7) ) verändert. Das Messverfahren nutzt dabei die anormale Absorption von
Cluster-Spiegel-Systemen als hochsensitives optisches Indikatorsystem. Clusterschichten
(Kolloidschichten, oft auch Inselfilme genannt) weisen starke schmalbandige Reflexionsminima auf. Der Begriff "anormales Verhalten des Metallinselfilmes" bedeutet eine starke Bandabsorption im sichtbaren Bereich, welche durch die Lokalisierung des Leitungselektronen-Plasmas in den räumlichen Grenzen der nanometrischen Partikel bedingt wird. Diese räumliche Lokalisierung steht im Gegensatz zu der freien Beweglichkeit der Elektronen in einem makroskopisch ausgedehnten Stück Metall (die freie Bewegbarkeit der Elektronen ist für eine starke unspezifische Reflexion verantwortlich, die man allgemein als metallischen Glanz bezeichnet).
Die spektrale Lage der Absorptionsbande im resonanten System "Cluster + Spiegel" hängt extrem empfindlich von ihrer räumlichen Anordnung, insbesondere dem Abstand zur reflektierenden Oberfläche, ab. Ein metallischer Cluster, der sich in definiertem (nanometrischen!) Abstand zu einer reflektierenden Oberfläche befindet, kann mit seinem Spiegeldipol wechselwirken. Bei entsprechendem Abstand der absorbierenden Schicht zur metallischen Oberfläche haben elektrische Felder, die von einer Oberfläche reflektiert werden, in der absorbierenden Schicht dieselbe Phase, wie die eingestrahlten Felder. Der daraus resultierende Feedbackmechanismus verstärkt den effektiven Absorptionskoeffizienten der absorbierenden Schicht. Da aus einer vorgegebenen Schichtdicke die optimale Phase nur von der Wellenlänge abhängt, kann das System durch ein spektral sehr enges Reflexionsminimum charakterisiert werden. Aus Optimierungsrechnungen und Messungen resultiert, dass eine mittlere Massendicke von etwa 3-10 nm (= etwa 50% Transmission) das Signal mit dem höchsten Extinctionskoeffizienten ergibt.
Das visuelle Farbempfinden (nach dem Assay, nach Kopplung der Nanocluster) bei dicker werdender Abstandsschicht beginnt bei der Eigenfarbe des Metalls, dann braun, violett, dunkelblau, hellblau, hellgelb, rot, rotviolett, grün und sodann für das Auge wiederholte rotgrün, Abfolgen die sich aus der visuellen Umsetzung eines komplexen Spektrums ergeben. Da bereits Metall - Nanocluster die stärksten natürlichen Chromophore darstellen und darüber hinaus die Kopplung mit der Spiegelschicht die chromphore Wirkung noch einmal um nahe zu eine Zehnerpotenz steigern kann, ist das resonante System Cluster/Spiegel der stärkste und damit sensitivste natürliche Farbstoff. Das sensitive Messprinzip kann selbst geringe Änderungen der Belegungsdichte oder des räumlichen Abstands im Resonanzsystem in eine starke Extinktionsänderung und damit in ein visuell klar erkennbares optisches Signal umwandeln. Erfindungsgemäß ist es möglich, durch den Einsatz des Sensorchips mittels (bio)rekognitiver Erkennung des Analyten (7) in einem (bio)rekognitiven Sandwichaufbau
rasch und hochsensitiv ein optisches Signal (Farbänderung des Sensorchips) zu erhalten. Um eine weitere Steigerung der Sensitivität zu erreichen, können als Label nicht kleine Nanocluster sondern relativ große Nanopartikel von einigen zehn nm bis etwa einem μm Größe dienen. Unter diesen Bedingungen erlaubt das Messverfahren die optische Bestimmung von einzelnen Molekülen.
Erfindungsgemäß können die leitfähigen Nanopartikel (wobei in diesem Aufbau die starke Lichtabsoφtion durch die Leitungselektronen verwendet wird) auch durch Nanopartikel mit anregbaren aber nicht vollständig über das Nanopartikel delokalisierten Elektronen verwendet werden. Dies fuhrt zu keiner makroskopischen Leitfähigkeit aber zu einer nanometrischen Delokalisierung der Elektronen die erfindungsgemäß ebenfalls mit dem Spiegel koppeln und einen Farbeffekt mit geringerem Absoφtionskoeffizienten (d.h. geringerer Sensitivität) bewirken.
Erfindungsgemäß führt insbesondere der direkte (oder nahezu direkte) Kontakt der beschichteten Nanocluster mit der analytgekoppelten Oberfläche zu einer extrem raschen Reaktion, da keine (oder nahezu keine) Diffusion des Reagenzes notwendig ist. Ein geringfügige Beweglichkeit der Nanopartikel (4) in zumeist sub-nanometrischen Bereich, insbesondere die Drehung der Nanopartikel (4) ist zumeist zur effizienten (bio)chemischen Reaktion d.h. Kopplung notwendig.
Dennoch erlaubt der Einsatz von zwei rekognitiven System auf Oberfläche der Abstandsschicht (3) (= 5) und auf den Nanopartikeln (4) (=6) eine äußerst selektive Analyse mit einem geringen unspezifischen Hintergrund (der durch den Einsatz von nur einem Bindungssystem systemimmanent beobachtet würde).
Primär sind als Reagenz alle denkbaren biorekognitiv aktiven Komponente (Antiköφer, DNA,..) vorgesehen. Als Nanocluster dienen (neben dünnschichttechnologisch aufgedampften oder gesputterten Inseln) bevorzugt asymmetrische oder gefärbte Silber- bzw. Goldcluster, da sie technisch leicht zugänglich, chemisch hoch stabil und leicht zu derivatisieren sind. Jedoch sind alle Cluster und Nanopartikel zum Einsatz im Messsystem geeignet wobei metallische Cluster, insbesondere jene mit starken Plasmonen, einen größeren Verstärkungsfaktor durch die Resonanz erfahren.
Bedingt durch die Art des Messeffekts, der eine gerichtete Reflexion (und keinen Streuvorgang) voraussetzt, sind ebene Sensorstrukturen bevorzugt, da abhängig von Reflexionswinkel die Absoφtionsbanden (= Farbton des Chips) bei einer anderen Wellenlänge zu liegen kommen. Gerichtet reflektiertes Licht kann jedoch sekundär gestreut
werden, um damit den Messeffekt auch aus einer anderen Richtung auswerten zu können. Jedoch wird durch die sekundäre Streuung das Signal/Rausch- Verhältnis verschlechtert. Mit entsprechendem technischen Aufwand und unter Verzicht auf die direkte Erfassung mit dem Auge kann auch ein Scanner, ein Mikroskop, ein Photometer aber auch ein Fluorimeter (z.B. kleine metallische Nanopartikel fluoreszieren !) zur Detektion verwendet werden. Der Aufbau eines DNA-Sensorchips bzw. eines Protein - Sensorchips wird in den Anwendungsbeispielen genau beschrieben. Aufbauend auf dieser Technologie können rasche und sichere Schnelltests für Klinik und Labor verwirklicht werden. Als typischer Anwendungsbereiche kann z.B. die Diagnose von bakteriellen HNO-Infekten, die Identifizierung von Tumoren oder Viren genannt werden.
Erfindungsgemäß wurde diese Technologie in Richtung von Multianalytarrays weiterentwickelt, um damit ein neuartiges, hoch leistungsfähiges Verfahren für die Pharmaindustrie bereitstellen zu können. Es können Arrays sowohl auf Oberfläche der Abstandsschicht (3) als auch auf Oberfläche des Films (11) eingesetzt werden, welche gleichzeitig oder in Abfolge am gleichen oder an unterschiedlichen Gegen-Chips binden können. Damit kann das Messverfahren völlig automatisiert mit hohem Probendurchsatz ablaufen. Ein Multidruckverfahren erlaubt das Screening von Interaktionsbanken mit hoher Geschwindigkeit
Als Gelschicht gemäß Abbildung 3 können nahezu alle quellfähigen Polymere eingesetzt werden. Die Quellfähigkeit beruht dabei auf der Einlagerung von Wasser und in geladenen Polymergelen auf Ionen, analog einem Ionenaustauscher, und deren Abstoßung oder auf chaotropen bzw. kosmotropen d.h. oberflächenaktiven Effekten von Ionen, insbesondere Protonen. Die eingesetzten Gele müssen entweder eine Ablösung der Nanopartikel erlauben oder sich durch z.B. Temperaturerhöhung oder pH-Änderung auflösen lassen, um die Nanopartikel an der Chipoberfläche freisetzen zu können.
Das Verfahren kann auch zu sicherheitstechnischen Zwecken eingesetzt werden. Dabei wird ein Objekt (beliebiger Gegenstand von zumeist kommerziellem Wert) mit einem optisch nicht erkennbaren aber chemisch identifizierbaren Molekül (bzw. Molekülmuster) bedruckt. Zur Erkennung wird das Molekülmuster mit der entsprechenden und geeigneten (chemisch rekognitiven) Clusterfolie in Kontakt gebracht und diese wieder abgezogen. Es verbleibt ein optisch lesbarer Code auf dem Objekt. An Stelle einer Folie kann auch z.B. ein Roll-on Stift den Transfer der Cluster ermöglichen.
Die technische Umsetzung ist nachfolgend in drei typischen Anwendungsbeispielen erläutert:
Beispiel 1 : Protein-Chip nach Anspruch 1
• Auf einen Glaschip oder eine Polymerfolie wird ein Metallspiegel (z.B. AI, Ti, Ag, Au, Pd, Cr, W, Sn) aufgedampft oder aufgesputtert. Oft ist eine Haftschicht (zumeist Cr, W oder Ti) nötig um den Spiegel mechanisch und chemisch stabil auf dem Trägermaterial zu fixieren.
• Auf die Metalloberfläche wird sodann eine Abstandsschicht zur Einstellung der Resonanzfarbe von zumeist 50-200 nm mittels Spin-coating (z.B. Acrylpolymer in Lösungsmittel), Aufdampfen (z.B. SiO, SiO2), CVD (Siliziumnitrid) oder reaktivem Sputtern (z.B. Zinn-Target in Stickstoff- oder Sauerstoffplasma) aufgebracht.
• Auf die Oberfläche des Films (11) (Gegenfolie 8) werden durch Aufsputtern metallische Inseln (Größe typischerweise etwa 10-400 nm) mit einer optimalen Dicke von etwa 5-10 nm (gemittelte Schichtdicke) aufgebracht. Dickere Cluster (dicker als die Eindringtiefe der Lichtwelle in das Material) geben kein stärkeres optisches Signal, sind aber oft verfahrenstechnisch nicht zu vermeiden.
• Alternativ kann die Oberfläche des Films (11) (Gegenfolie) mit Clustern durch Adsoφtion von Kolloiden über deren elektrostatische Ladung beschichtet werden (z.B. elektronegative Cluster und Folie mit positiv geladenen Polymer beschichtet). Die Adsoφtionsenergie muß erfindungsgemäß niedriger als die Assay-Interaktionsenergie gewählt werden.
• Biorekogmtive Proteine (z.B. Antiköφer) werden auf die Abstandsschicht mit einem Arrayer (Gerät zum Erzeugen vom kleinen Substanzflecken) in einem Array aufgebracht und dort kovalent (z.B. Aminosilan oder Epoxysilan) oder adsoφtiv gebunden. Es ist darauf zu achten, dass die geometrische Anordnung der Bindungssysteme eine direkte Brückenbildung mit dem Cluster ermöglicht.
• Auf der Clusterschicht werden ebenfalls biorekogmtive Proteine (z.B. Antiköφer) direkt an die Cluster adsorbiert oder biorekognitive Moleküle mittels chemischer Linker (Thiole, Disulfide, Phosphorverbindungen, Phosphate) an die Metallinseln gebunden.
• Die Oberfläche der Abstandsschicht (3) wird mit der Analytlösung in Kontakt gebracht und einige Sekunden bis zu einigen Stunden mit dem Analyt (7) inkubiert. Die Zeit ist
von der Konzentration des Analyten (7) und der Geometrie des System abhängig und kann stark variieren. Typische Zeiten sind 10 s - 30 min.
• Sodann wird die Oberfläche des Films (11) bzw. der Film elastisch auf die Oberfläche der Resonanzschicht (3) gepresst und nach vorzugsweise Sekunden bis wenigen Minuten wieder losgelassen. Es ist darauf zu achten, dass beiden Seiten sich vollflächig berühren um die Cluster gleichmäßig zu übertragen. Da es nahezu unmöglich ist, zwei Flächen völlig planparallel zu gestalten (und es überdies extrem kostenaufwendig ist), wird zumeist eine der beiden Oberflächen elastisch ausgeführt. Dies ist zumeist (aber nicht zwingender weise) die Oberfläche des Films (11) welche die Cluster trägt.
• Beim Zusammenpressen zeigen sich zuerst zumeist unklare Farben die spätestens nach dem Abheben der Deckfolie das Array klar in der eingestellten Resonanzfarbe sichtbar machen. Durch mechanischen Druck, unebene Oberflächen oder limitierte Präzision des Aufbaus zeigt sich beim Zusammenpressen (Kontakt der Oberfläche der Abstandsschicht (3) und des Films (11)) zumeist nicht die optimale Farbentwicklung - weiters können Cluster verschoben oder verschmiert werden und den optischen Eindruck beeinträchtigen. Idealerweise ist das beste optische Signal erst nach entfernen der überschüssigen Cluster oder zumindest des Films sichtbar, jedoch kann unter optimalen Bedingungen auch während des Kontaktiervorganges bereits ein Eindruck von der chemischen Interaktion (= Messsignal) erhalten werden.
• Die Zahl der gebundenen Cluster ist proportional der Menge des gebundenen Analyten (7).
Beispiel 2: DNA-Chip nach Anspruch 1
• Es wird eine kommerziell erhältliche Metall - bedampfte Folie (z.B. Titan - bedampftes Polycarbonat) verwendet.
• Auf die Metalloberfläche wird sodann eine Abstandsschicht zur Einstellung der Resonanzfarbe von zumeist 50-200 nm mittels Spin-coating (z.B. Acrylpolymer in Lösungsmittel, z.B. Polyhexylaethacrylat), Audampfen (z.B. SiO2), CVD (Siliziumnitrid) oder reaktivem Sputtern (z.B. Zinn-Target in Stickstoff- oder Sauerstoffplasma) aufgebracht.
Auf die Oberfläche des Films (11) (Gegenfolie z.B. Teflon, PVDF) werden durch Aufsputtern metallische Inseln (Größe typischerweise etwa 10-40 nm) mit einer optimalen Dichte von etwa 5-7 nm (gemittelte Schichtdicke) aufgebracht. Alternativ kann die Oberfläche des Films (11) (Gegenfolie) mit Clustern durch Adsoφtion von Kolloiden über deren elektrostatische Ladung beschichtet werden (z.B. elektronegative Cluster und Folie mit positiv geladenen Polymer beschichtet). Oligonucleotide oder PCR-Produkte werden auf die Abstandsschicht mit einem Dotting-Roboter (Gerät zum Erzeugen vom kleinen Substanzflecken) in einem Array aufgebracht. Die DNA ist dabei amino- oder thiolmodifiziert, um eine chemische Kopplung mit der Chipoberfläche zu ermöglichen. Der Chip (Schichten 1,2 + Abstandsschicht (3)) ist entsprechend chemisch aktiviert (Gläser z.B. über silanisieren mit Epoxysilan, Polymere durch Sauerstoffplasma oder partielle Hydrolyse und ein aktivierendes und bifunktionelles Reagens). Dabei wird z.B. wasserlösliches Carbodiimid als Reagenz zur Kopplung verwendet. Es kann die DNA auch durch UV- Vernetzung an die Oberfläche gebunden werden, dies ist jedoch für kurze Oligonukleotide nicht ratsam, da die räumliche Orientierung dann sterisch äußerst ungünstig ist .
Auf der Clusterschicht werden ebenfalls Oligonucleotide oder PCR-Produkte direkt an die Cluster gebunden, wobei bevorzugt thiolmodifizierte Oligonukleotide eingesetzt werden, die als chemisch-kovalent die DNA an die Metallinseln binden. Es können auch die Cluster zuerst mit DNA modifiziert werden und sodann auf die Oberfläche aufgebracht werden. Dies kann adsoφtiv, durch Auftrocknen, Aufdrucken, Aufspinnen oder ähnlich geschehen.
Oberfläche der Abstandsschicht (3) wird mit der Analytlösung in Kontakt gebracht einige Sekunden bis zu einigen Stunden mit dem Analyt (7) inkubiert, dabei hybridisiert die Proben-DNA oder RNA mit der DNA auf der Oberfläche der Abstandsschicht (3). Die Zeit ist von der Konzentration des Analyten (7) und der Geometrie des System abhängig und kann stark variieren.
Sodann wird die Oberfläche des Films (11) auf die Oberfläche der Abstandsschicht (3) gepresst und nach einigen Sekunden bis wenigen Minuten wieder abgehoben. Wie bereits erwähnt zeigen sich beim Zusammenpressen zuerst unklare Farben die spätestens nach dem Abheben der Deckfolie das Array klar in der eingestellten Resonanzfarbe sichtbar machen.
• Die Zahl der gebundenen Cluster ist proportional der Menge des gebundenen DNA bzw. RNA.
• Das Aneinandeφressen der beiden Oberflächen kann entweder in Anwesenheit eines Lösungsmittels, bevorzugt wässrig, aber auch trocken erfolgen,
Beispiel 3: Multiarrays
• In analoger Weise kann durch Aufbringen von Arrays unterschiedlicher Moleküle (z.B. mit Siebdruck, Ink-jet, Photolitho-Technologie, o.ä.) auf beide Seiten (Oberfläche der Abstandsschicht (3) und Oberfläche des Films (11)) gleichzeitig ein ganzer Fingeφrint unterschiedlicher Reaktionen vorgenommen und dies z.B. im Bereich funktioneller Proteomics oder Genomics eingesetzt werden.
• Insbesondere ist die Tatsache, dass die Reagenzien auf der Festphase vorliegen und sich nicht vermischen können von großem Vorteil in heterogenen Arrays unterschiedlicher Proteine oder Protein plus DNA, da es parallele Assays ohne Vermischung der Reagenzien erlaubt.
Beispiel 4: Aufbau von des Films
Der Film hat erfindungsgemäß die Ablösung der Cluster oder das Auflösen des Films unter Freisetzung der Cluster zu ermöglichen.
• Ablösbare Cluster können z.B. durch thermisches Aufdampfen oder Sputtern von Metallinseln auf Kunststofffolien erzeugt werden. Dabei kann entweder ein Material mit geringer Interaktion (z.B. Teflon, Polystyrol o.ä) gewählt werden oder die Folie mit einer wasserlöslichen oder pufferlöslichen Schicht (Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylakohol o.ä.) überzogen werden.
• Beim Aneinandeφressen der Oberflächen wird dabei entweder die Bindungsstärke der biorekognitiven Bindung an Oberfläche der Abstandsschicht (3) (mit 5 beschichtet) höher als jene der Bindung an Oberfläche des Films (11) oder die Cluster werden in wenigen Nanometer bis Mikrometer von der Oberfläche durch Auflösen der Trägerschicht in der Analytlösung freigesetzt und können sodann in wenigen Sekunden bis Minuten ihre Bindungspartner an der Schicht 1 erreichen und dort binden.
• Alternativ kann die Oberfläche des Films (11) wie in Beispiel 2 mit Hilfe elektrostatischer Wechselwirkungen reversible mit Clustern beschichtet werden, wobei z.B. Polymere wie Polyethylenimin, Chitosan als positiv geladen Bindungssysteme und Polyacrylsäure oder Polymethacrylsäure als negativ geladene Beschichtungspolymere eingesetzt werden können.
• Eine weitere Option Cluster reversible auf eine Oberfläche aufzubringen ist der Einsatz von in wässrigen Medien instabilen chemischen Beschichtungen, die über Löse-, Redox oder Korrosionsvorgänge die gebundenen Cluster freigeben.
• Für selektive Bindungsstudien können Cluster über einen schwach bindenden Antiköφer an die Oberfläche des Films (11) gebunden werden und nach Reaktion mit dem Analyten (7) (Höhere Bindungsaffinität) selektiv abgelöst werden.
Beispiel 5: Vorrichtung zur Messung des optischen Messsignals
• Primär kann jede Kamera (CCD, CMOS) zur Erfassung des Farbmusters auf der Oberfläche der Abstandsschicht (3) eingesetzt werden. Selbst eine einfache Web- Kamera (Produktionskosten unter l€) kann als Auswertesystem Verwendung finden.
• Zur optimalen Quantifizierung und Eichung kann ein Reflexionsphotometer eingesetzt werden.
• Teststicks und niederdichte Arrays können mit einem Photometer aus Leuchtdiode (Laserdiode) und Photodiode (Phototransistor) kostengünstig erfasst werden.
• Typische Spektren sind in Figur 8 ersichtlich, die X-Achse gibt die Wellenlänge von 400 bis 1100 nm wieder, die Y-Achse die Extinktion von 0 - 2 Einheiten. Der bevorzugte Messbereich beträgt 500 - 1000 nm. Kurzwelliger sind die Spektren von Interbandübergängen überlagert. Langwelliger ist die Messtechnik zumeist aufwendig. Die Zahlen, die den Spektren links beigefügt sind, entsprechen steigenden Schichtdicken der Abstandsschicht (3) - aber ohne absolute Dickenrelation der fortlaufenden Zahlen von eins bis 5.
Beispiel 6: Chip mit flexibler Deckmembran - Aufbau gemäß Figur 1
• Aufbau gemäß Anspruch 1.
• Der zeitliche Ablauf der Messung ist durch die Bezugszeichen S 1 bis S6 dargestellt.
Beispiel 7: Chip mit externer Deckmembran - Aufbau gemäß Figur 2
• Aufbau gemäß Anspruch 1. • Der zeitliche Ablauf der Messung ist durch die Bezugszeichen Sl bis S6 dargestellt. • Der Assay erfolgt durch Kontakt mit dem Analyten (7), Auflegen und Abziehen der Clusterfolie.
Beispiel 8: Chip mit integraler Gelschicht als Clusterträgeroberfläche - Aufbau gemäß Figur 3
• Aufbau gemäß Anspruch 5 und 6. • Der zeitliche Ablauf der Messung ist durch die Bezugszeichen Sl bis S6 dargestellt. • Die Cluster, Nanopartikel oder Kolloide sind entweder auf der Filmoberfläche oder im Film eingebettet. Ein allfälliges Abwaschen der überschüssigen Cluster ist durch die horizontalen Pfeile angedeutet.
Beispiel 9: Kompetitiver Assay - Aufbau gemäß Figur 4
• Schritte Sl bis S3 zeigen den zeitlichen Aufbau des Chips. • Der zeitliche Ablauf der Messung ist durch die Bezugszeichen Sl bis S6 dargestellt. • Die Bindung der Cluster erfolgt kompetitiv zur Bindung des Analyten (7). Das Bindungssystem am Cluster und oder der Oberfläche der Abstandsschicht (3) bindet kompetitiv mit dem Analyt (7). Der Cluster ist nicht Linker sondern Verdrängungsagens.
Beispiel 10: Aufbau gemäß Ansprüche 13 bis 17 Aufbau gemäß Figur 5
• Dieser Aufbau nimmt den Kontakt der beiden Oberflächen vorweg.
• Der Analyt reagiert mit den biorekognitiven Molekülen (5; 6) der bereits kontaktierten Oberflächen und verändert die chemische Bindung der Cluster, Nanopartikel oder Kolloide an einer der beiden Oberflächen.
• Es können an Stelle von zwei unterschiedlichen Molekülen (5 und 6) auch eine Molekülspezies zur Bindung der beiden Oberflächen eingesetzt werden. Der Assay ist dann in der Weise aufgebaut, dass die Interaktion mit dem Analyt dieses Molekül spaltet und so die Verteilung der Cluster zwischen denn beiden Oberflächen nach Ablösung des Films ändert.
• Es kann dabei auch die Position von Nanopartikel (4) und Bindungsmolekül (5) ausgetauscht werden, wobei nach Analytreaktion das Nanopartikel an der Oberfläche adsorbiert bleibt und alle an die Folie via Bindungsmoleküle (5) gebundenen Nanopartikel (4) abgezogen werden.
• Der Sensor kann auch das chemische Gleichgewicht der Bindung zweier Bindungssysteme nutzen indem der Nanopartikel ihrerseits mit einem (bio)rekognitiven bzw. chemisch-reversiblen Molekül oder Molekülkomplex an die Folie (11) gebunden ist. Beim Auseinanderziehen des Films werden die Nanopartikel an jener Oberfläche verbleiben die die größere Affinität zu den Nanopartikeln aufweist. Der Analyt kann in die Bindung der Nanopartikel (4) an die gegenüberliegende Oberfläche der Abstandsschicht (3) verändern aber auch die Bindung der Nanopartikel (4) an die Trägerfolie, gegebenenfalls beide.
• Figur 6 und 7 zeigen die möglichen Abwandlungen des Aufbaus laut Anspruch 18. Das Prinzip des „Abziehens" des Deckfilm (mit jenem Teil der Nanopartikel der icht an die Oberfläche der Abstandschicht (3) gebunden hat) erfolgt jeweils ident - das Bindungsgleichgewicht zwischen Deckfilm und Oberfläche der Abstandschicht wird jedoch durch unterschiedliche Anordnung der chemischen Komponenten erreicht.