Analytische Plattform und Nachweisverfahren mit den in einer Probe nachzuweisenden Änalyten als immobilisierten spezifischen Bindungspartnern
Die vorliegende Erfindung betrifft eine analytische Plattform und ein damit ausgeführtes Nerfahren zur Untersuchung einer Nielzahl „natur-identischer" Proben auf in den Proben enthaltene, als Teilnehmer an spezifischen Bindungsreaktionen biologisch relevante Verbindungen als Änalyten, dadurch gekennzeichnet, dass
- besagte Proben oder Verdünnungen besagter Proben ohne Änderung der relativen molekularen Zusammensetzung, im Vergleich zur ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der Probe, mit den darin enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten, als einer ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern, in mindestens einem ein- oder zweidimensisonalen Array in diskreten Messbereichen auf einer Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger aufgetragen werden,
- eine oder mehrere Νachweissubstanzen, als eine zweite Vielzahl spezifischer Bindungspartner, zum spezifischen Nachweis von einem oder mehreren in den Proben enthaltenen Änalyten, aus besagter ersten Vielzahl spezifischer Bindungspartner, in einem einzigen oder mehreren Schritten einer spezifischen Bindungsreaktion mit den in besagten diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben in Kontakt gebracht werden,
- Änderungen von optoelektronischen Signalen als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, im evaneszenten Feld der Evaneszentfeld-Sensorplattform, ortsaufgelöst gemessen werden und aus der relativen Grosse der Änderungen besagter optoelektronischer Signale aus den jeweiligen Messbereichen qualitativ und / oder quantitativ das Vorhandensein der dort spezifisch nachzuweisenden Änalyten bestimmt wird.
Dabei können besagte Änderungen von optoelektronischen Signalen, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, im evaneszenten Feld der Evaneszentfeld-Sensorplattform, beispielsweise aus dem Vergleich der gleichzeitig gemessenen Signale aus unterschiedlichen Messbereichen, welche entsprechende nachzuweisende Änalyten enthalten (in bekannter oder unbekannter Konzentration bzw. Menge) mit den
Signalen aus Messbereichen, welche entsprechende nachzuweisende Änalyten nicht enthalten, bestimmt werden. Für die Bestimmung besagter Signaländerungen können auch die Signale aus Messbereichen mit unbekannter Konzentration mit denjenigen Messbereichen mit darin in bekannter Konzentration enthaltenen Änalyten benutzt werden. Für den Fall der kontinuierlichen Signalerfassung vor und während der Zugabe der entsprechenden Nachweissubstanzen und deren Bindung an die entsprechenden Änalyten enthaltenden Messbereiche kann eine entsprechende Änderung auch aus dem zeitlichen Verlauf der Signale aus den entsprechenden Messbereichen bestimmt werden.
Im folgenden (und insbesondere auch in den Ansprüchen dieser Patentanmeldungsschrift) bezieht sich die Bezeichnung "einer ("natur-identischen") Probe jeweils auch auf zwei oder mehr, d.h. auf eine Vielzahl ("natur-identischer") Proben, sofern nicht ausdrücklich anders vermerkt.
Für zahlreiche Anwendungsgebiete ist es erforderlich, eine Vielzahl von biologisch relevanten Änalyten in einer komplexen Probe zu bestimmen, beispielsweise in diagnostischen Verfahren zur Bestimmung des Gesundheitszustandes eines Individuums oder in der Pharmaforschung und -entwicklung zur Bestimmung der Beeinflussung eines Organismus und dessen komplexer Funktionsweise durch Zuführung biologisch aktiver Verbindungen.
Während bekannte analytische Trennverfahren im allgemeinen dahingehend optimiert sind, innerhalb möglichst kurzer Zeit eine möglichst grosse Anzahl von in einer gegebenen Probe enthaltenen Verbindungen gemäss eines vorgegebenen physikalisch-chemischen Parameters, wie beispielsweise des Molekulargewichts oder des Quotienten aus molekularer Ladung und Masse, aufzutrennen, beruhen Bioaffinitäts-Nachweisverfahren darauf, mit jeweils einem biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselement möglichst hoher Spezifizität den entsprechenden (einzelnen) Änalyten hochselektiv in einer komplex zusammengesetzten Probe zu erkennen und zu binden. Der Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen erfordert also die Verwendung einer entsprechenden Anzahl unterschiedlicher spezifischer Erkennungselemente.
Ein Nachweisverfahren basierend auf Bioaffinitätsreaktionen kann sowohl in einer homogenen Lösung als auch an der Oberfläche eines festen Trägers erfolgen. Je nach dem spezifischen Aufbau des Verfahrens sind nach Bindung der Änalyten an die entsprechenden Erkennungselemente und gegebenenfalls weitere Nachweissubstanzen sowie gegebenenfalls zwischen verschiedenen Verfahrensschritten jeweils Waschschritte notwendig, um die gebildeten Komplexe aus den Erkennungselementen und den nachzuweisenden Änalyten sowie gegebenenfalls weiteren Nachweissubstanzen vom Rest der Probe und der gegebenenfalls eingesetzten zusätzlichen Reagentien zu trennen.
Relativ weit verbreitet sind inzwischen Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Nukleinsäuren in einer Probe mithilfe entsprechender komplementärer, auf einem festen Träger in diskreten, räumlich getrennten Messbereichen immobiliserter Nukleinsäuren als Erkennungselementen. Beispielsweise sind, basierend auf einfachen Glas- oder Mikroskop-Plättchen, Arrays von Oligonukleotiden als Erkennungselementen mit einer sehr hohen Feature-Dichte (Dichte von Messbereichen auf einem gemeinsamen festen Träger) bekannt. Beispielsweise werden in der US -Patentschrift No. 5,445,934 (Affymax Technologies) Arrays von Oligonukleotiden mit einer Dichte von mehr als 1000 Features pro Quadratzentimeter beschrieben und beansprucht.
Seit kurzem häufen sich auch Beschreibungen von Arrays und damit ausgeführter Nachweisverfahren ähnlicher Art zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Proteinen, beispielsweise in der US-Patentschrift No. 6,365,418 Bl.
In den Patentschriften für derartige sogenannte „Mikroarrays", sowohl für den Nachweis von Nukleinsäuren als auch anderer Biopolymere, wie beispielsweise Proteine, wird jeweils beschrieben, dass eine Vielzahl unterschiedlicher spezifischer Erkennungselemente in diskreten Messbereichen zur Erzeugung eines Arrays für die Analyterkennung immobilisiert und anschliessend damit die zu untersuchende Probe mit den darin in einer (gegebenenfalls komplexen) Mischung vorhandenen Änalyten in Kontakt gebracht wird. Den bekannten Beschreibungen folgend, liegen unterschiedliche spezifische Erkennungselemente dabei jeweils in einer möglichst hochreinen Form in unterschiedlichen diskreten Messbereichen vor, so dass an
Messbereiche mit unterschiedlichen Erkennungselementen im allgemeinen unterschiedliche Änalyten aus der Probe binden.
Diese Art bekannter Assays erfordert, dass die in möglichst hochreiner Form zu immobilisierenden spezifischen Erkennungselemente mittels teilweise sehr aufwendiger Arbeitsschritte angereichert werden. Da sich unterschiedliche Erkennungselemente mehr oder minder stark in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften (z. B. in ihrer Polarität) unterscheiden, gibt es auch entsprechende Unterschiede in den Bedingungen für eine optimale Immobilisierung dieser Erkennungselemente, beispielsweise durch Adsorption oder kovalente Bindung, in diskreten Messbereichen auf einem gemeinsamen festen Träger, gegebenenfalls auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht. Demzufolge können die zur Immobilisierung einer Vielzahl unterschiedlicher Erkennungselemente gewählten Immobilisierungsbedingungen (wie z. B. Art der Haftvermittlungsschicht) kaum gleichzeitig für alle Erkennungselemente ein Optimum, sondern lediglich einen Kompromiss zwischen den Immobilisierungseigenschaften der verschiedenen Erkennungselemente darstellen.
Bei dieser Art des Assays ist ausserdem nachteilig, dass zum Nachweis von Änalyten in einer Vielzahl unterschiedlichen Proben im allgemeinen die Bereitstellung einer entsprechenden Anzahl diskreter Arrays von Erkennungselementen, denen die unterschiedlichen Proben zugeführt werden, auf gemeinsamen oder diskreten Trägern erforderlich ist. Zur Untersuchung einer Vielzahl unterschiedlicher Proben bedeutet dieses den Bedarf einer hohen Anzahl diskreter Arrays, deren Herstellung relativ aufwendig ist.
Zwar ist beschrieben worden, dass beispielsweise die von immobilisierten Oligonukleotiden und in einer zugeführten Probe enthaltenen, zu den immobilisierten komplementären Oligonukleotiden gebildeten Hybride unter geeigneten Dissoziationsbedingungen mit hoher Effizienz wieder dissoziiert werden können und so eine Erkennungsoberfläche regeneriert werden kann, jedoch kann kaum eine hundertprozentige Regenerierungsfähigkeit garantiert werden. Im Falle von Bioaffinitätskomplexen mit Proteinen besteht oft sogar keine Reversibilität des
Bindungschrittes, d.h. keine Möglichkeit zur Regenerierung der Erkennungsoberfläche.
Es besteht daher das Bedürfnis nach einem geänderten Assay- Aufbau, welcher es ermöglicht, eine Vielzahl von Proben in einem Array auf einem gemeinsamen Träger gleichzeitig auf in den Proben enthaltene Änalyten zu untersuchen. Dazu wäre es zweckmässig, nicht die unterschiedlichen spezifischen Erkennungselemente, sondern die zu untersuchenden Proben selbst direkt, d.h. unbehandelt, oder nach möglichst wenigen Vorbereitungsschritten in diskreten Messbereichen in einem Array auf einem Träger aufzutragen. Ein solcher Assay-Aufbau soll nachfolgend als eine „invertierte Assay-Architektur" bezeichnet werden.
In der US-Patentschrift No. 6,316,267 wird ein Verfahren beschrieben, in dem PolyAminosäuren in einer Probenmischung (wobei es sich offensichtlich auch um eine komplex zusammengesetzte Probe handeln kann) beispielsweise auf einer festen oder quasi-festen („semi-solid") Probenmatrix aufgetragen werden. Der Nachweisschritt erfolgt jedoch nicht durch ein Bioaffinitätsassay, sondern durch Anfärbung mit einer Reagentienmischung, welche bestimmte, in der Patentschrift benannte Metallkomplexe enthält. Hierbei handelt es sich nicht um einen spezifischen Analytnachweis.
In der US -Patentschrift 6,287,768 wird ein Verfahren beschrieben, dem zufolge verschiedenartige nachzuweisende RNA-Moleküle aus einer biologischen Probe isoliert, der Grosse nach aufgetrennt, auf einem festen Träger aufgebracht und anschliessend dort, beispielsweise in einem Hybridisierungsassay durch Hybridisierung mit bekannten, komplementären Polynukleotiden, nachgewiesen werden. Gemäss der Beschreibung können die aus einem Organismus isolierten nachzuweisenden RNA-Moleküle dabei entweder direkt dem weiteren Nachweisverfahren unterzogen werden, wenn sie in hoher Konzentration vorhanden sind, oder müssen vor dem eigentlichen Nachweisverfahren noch mit bekannten Vervielfältigungsverfahren (z. B. mittels PCR, „Polymerase Chain Reaction") vermehrt werden.
Auch wenn das in dem US-Patent 6,287,768 vorgeschlagene Verfahren die Möglichkeit eröffnet, RNA aus verschiedenen Proben gleichzeitig zu bestimmen, erfordert es immer noch eine Reihe aufwendiger Probenaufbereitungsschritte und insbesondere die Isolation aus der biologischen Probenmatrix und eine nachfolgende Trennung nach der Molekülgrösse. Indem das beanspruchte Verfahren, welches nur am Beispiel von RNA beschrieben wird, mindestens die Isolation aus der ursprünglichen Probenmatrix und nachfolgende Auftrennung der nachzuweisenden Biopolymere nach deren Grosse voraussetzt, ist zu erwarten, dass die relative molekulare Zusammensetzung nach diesem Auftrennungsschritt, vor dem Nachweisschritt, unterschiedlich ist von der relativen molekularen Zusammensetzung in der ursprünglichen Probenmatrix.
Hierbei und im folgenden soll die Bezeichnung „unveränderte relative molekulare Zusammensetzung" bedeuten, dass das Konzentrationsverhältnis der in einer Analyse zu bestimmenden Änalyten unverändert bleibt. Änderungen des Inhalts an Lösungsmittel- oder Matrixmolekülen oder anderer Verbindungen, welche in dem betreffenden Nachweisverfahren nicht bestimmt werde, sind bei dieser Bezeichnungsweise nicht berücksichtigt.
Als Ursache für den Einbezug der genannten Trenn- oder Anreicherungsschritte in die genannten Nachweismethoden ist zu sehen, dass die dabei angewandten Detektionsschritte im allgemeinen keine ausreichende Empfindlichkeit aufweisen, um die in den Proben nachzuweisenden Änalyten mit den erwünschten Nachweisgrenzen zu bestimmen.
Die Anregung von zum Analytnachweis eingesetzten „Nachweiskomponenten" (wie beispielsweise radioaktiven Isotopen oder Chromophoren mit einer charakteristischen Absorption und / oder Lumineszenz bzw. Fluoreszenz) und das Auslesen der Signale von Arrays der genannten Art beruht auf klassischen, beispielweise optischen Anordnungen und Detektionsmethoden. Die klassischen Messmethoden, wie beispielsweise Absorptions- oder Fluoreszenzmessungen, beruhen im allgemeinen auf der direkten Beleuchtung eines Probevolumens in einem Probenbehältnis oder eines Messfeldes auf einer Innenwand eines Probenbehältnisses einer flüssigen Probe.
Diese Anordnungen haben den Nachteil, dass neben dem Anregungsvolumen oder der Anregungsfläche, innerhalb derer ein Signal zum Nachweis eines Änalyten erzeugt werden soll, im allgemeinen ein erheblicher Anteil der Umgebung von Anregungslicht erfasst wird, was zur nachteiligen Erzeugung von störenden Untergrundsignalen führen kann.
Zur Erreichung tieferer Nachweisgrenzen sind zahlreiche Messanordnungen entwickelt worden, in denen der Nachweis des Änalyten auf dessen Wechselwirkung mit dem evaneszenten Feld beruht, welches mit der Lichtleitung in einem optischen Wellenleiter verbunden ist. Koppelt man eine Lichtwelle in einen optischen Wellenleiter ein, der von optisch dünneren Medien, d.h. Medien mit niedrigerem Brechungsindex, umgeben ist, so wird sie durch Totalreflexion an den Grenzflächen der wellenleitenden Schicht geführt. In die optisch dünneren Medien tritt dabei ein Bruchteil des geführten Lichts ein. Diesen Anteil bezeichnet man als evaneszentes oder quergedämpftes Feld. Die Stärke des evaneszenten Feldes ist sehr stark abhängig von der Dicke der wellenleitenden Schicht selbst sowie vom Verhältnis der Brechungsindices der wellenleitenden Schicht und der sie umgebenden Medien. Bei dünnen Wellenleitern, d. h. Wellenleitern mit Schichtdicken von derselben oder niedrigerer Dicke als der zu führenden Wellenlänge, können diskrete Moden des geleiteten Lichts unterschieden werden. Derartige Verfahren haben den Vorteil, dass die Wechselwirkung des Anregungslichts mit dem Änalyten auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ins angrenzende Medium, in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometern, beschränkt ist und Störsignale aus der Tiefe des Mediums weitgehend vermieden werden können. Die ersten vorgeschlagenen derartigen Messanordnungen beruhten auf hochmultimodalen, selbsttragenden Einschichtwellenleitern, wie beispielsweise Fasern oder Plättchen aus transparentem Kunststoff oder Glas, mit Stärken von einigen hundert Mikrometern bis zu mehreren Millimetern.
Zur Verbesserung der Empfindlichkeit und gleichzeitig einfacheren Herstellung in Massenfabrikation wurden planare Dünnschichtwellenleiter vorgeschlagen. Ein planarer Dünnschichtwellenleiter besteht im einfachsten Fall aus einem Dreischichtsystem: Trägermaterial, wellenleitende Schicht, Superstrat ( bzw. zu
untersuchende Probe), wobei die wellenleitende Schicht den höchsten Brechungsindex besitzt.
Es sind verschiedene Verfahren für die Einkopplung von Anregungslicht in einen planaren Wellenleiter bekannt. Die am frühesten benutzten Verfahren beruhten auf Stirnflächenkopplung oder Prismenkopplung, wobei zur Verminderung von Reflexionen infolge von Luftspalten im allgemeinen eine Flüssigkeit zwischen Prisma und Wellenleiter aufgebracht wird. Diese beiden Methoden sind vor allem in Verbindung mit Wellenleitern relativ grosser Schichtdicke, d. h. insbesondere selbsttragenden Wellenleitern, sowie bei einem Brechungsindex des Wellenleiters von deutlich unter 2 geeignet. Zur Einkopplung von Anregungslicht in sehr dünne, hochbrechende wellenleitende Schichten ist demgegenüber die Verwendung von Koppelgittern eine wesentlich elegantere Methode.
Es können verschiedene Methoden zum Analytnachweis im evaneszenten Feld geführter Lichwellen in optischen Schichtwellenleitern unterschieden werden. Aufgrund des eingesetzten Messprinzips kann man beispielsweise zwischen Fluoreszenz- oder allgemeiner Lumineszenzmethoden auf der einen Seite und refraktiven Methoden andererseits unterscheiden. Hierbei können Verfahren zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz in einer dünnen Metallschicht auf einer dielektrischen Schicht mit niedrigerem Brechungsindex in die Gruppe der refraktiven Methoden mit einbezogen werden, sofern als Basis zur Bestimmung der Messgrösse der Resonanzwinkel des eingestrahlten Anregungslichts zur Erzeugung der Oberflächenplasmonenresonanz dient. Die Oberflächenplasmonenresonanz kann aber auch zur Verstärkung einer Lumineszenz oder zur Verbesserung des Signal-zu- Hintergrund- Verhältnisses in einer Lumineszenzmessung verwendet werden. Die Bedingungen zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz sowie zur Kombination mit Lumineszenzmessungen sowie mit wellenleitenden Strukturen sind vielfach in der Literatur beschrieben, beispielsweise in den US-Patenten US-P 5,478,755, US-P 5,841,143, US-P 5,006,716 und US-P 4,649,280.
Mit dem Begriff "Lumineszenz" wird in dieser Anmeldung die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Bereich nach optischer oder nichtoptischer, wie beispielsweise elektrischer oder chemischer oder biochemischer
oder thermischer Anregung, bezeichnet. Beispielsweise sind Chemilumineszenz, Biolumineszenz, Elektrolumineszenz und insbesondere Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter dem Begriff "Lumineszenz" mit eingeschlossen.
Bei den refraktiven Messmethoden wird die Änderung des sogenannten effektiven Brechungsindex aufgrund molekularer Adsorption oder Desorption auf dem Wellenleiter zum Nachweis des Änalyten benutzt. Diese Änderung des effektiven Brechungsindex wird, im Falle von Gitterkoppler-Sensoren, bestimmt aus der Änderung des Koppelwinkels für die Ein- oder Auskopplung von Licht in oder aus dem Gitterkoppler-Sensor, und im Falle von interferometrischen Sensoren aus der Änderung der Phasendifferenz zwischen dem in einem Sensorarm und einem Referenzarm des Interferometers geführten Messlichts.
Die genannten refraktiven Methoden haben den Vorteil, dass sie ohne Verwendung zusätzlicher Markierungsmoleküle, sogenannter molekularer Labels, eingesetzt werden können. Der Nachteil dieser labelfreien Methoden ist jedoch, dass die damit erzielbaren Nachweisgrenzen aufgrund der geringen Selektivität des Messprinzips, in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht des Änalyten, auf pico- bis nanomolare Konzentrationsbereiche beschränkt sind, was für viele Anwendungen der modernen Spurenanalytik, beispielsweise für diagnostische Applikationen, nicht ausreichend ist.
Zur Erreichung noch tieferer Nachweisgrenzen erscheinen lumineszenz-basierende Methoden aufgrund grösserer Selektivität der Signalerzeugung besser geeignet. Dabei ist die Lumineszenzanregung auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in das optisch dünnere Medium, also auf die unmittelbare Umgebung des wellenleitenden Bereichs mit einer Eindringtiefe in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometern ins Medium beschränkt. Dieses Prinzip wird evaneszente Lumineszenzanregung genannt.
Mittels hochbrechender Dünnschichtwellenleiter, in Kombination mit Lumineszenzdetektion, basierend auf einem nur einige hundert Nanometer dünnen wellenleitenden Film auf einem transparenten Trägermaterial, konnte in den letzten Jahren die Empfindlichkeit deutlich gesteigert werden. Beispielsweise wird in der
WO 95/33197 eine Methode beschrieben, in der das Anregungslicht über ein Reliefgitter als diffraktives optisches Element in den wellenleitenden Film eingekoppelt wird. Die isotrop abgestrahlte Lumineszenz in der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes befindlicher lumineszenzfähiger Substanzen wird mittels geeigneter Messvorrichtungen, wie zum Beispiel Photodioden, Photomultiplier oder CCD-Kameras, gemessen. Es ist auch möglich, den in den Wellenleiter rückgekoppelten Anteil der evaneszent angeregten Strahlung über ein diffraktives optisches Element, zum Beispiel ein Gitter, auszukoppeln und zu messen. Diese Methode ist zum Beispiel in der WO 95/33198 beschrieben.
In den vergangenen Jahren sind Weiterentwicklungen von planaren Dünnschichtwellenleitern als Sensorplattformen für „Mikroarrays" bekannt geworden, beispielsweise in den Internationalen Patentanmeldungen WO 01/13096, WO 01/43875, teilweise in Kombination mit entsprechend angepassten Fluidikstrukturen. Diese Patentanmeldeschriften werden hiermit vollumfänglich als Bestandteil der vorliegenden Anmeldung eingeführt. In der WO 01/79821 wird eine Dünnschicht- Wellenleiterstruktur beschrieben, welche eine Zweiphotonen- Anregung an der Oberfläche des Wellenleiters ermöglicht. In der WO 01/88511 werden eine Gitter- Wellenleiter-Struktur und ein damit ausgeführtes Messverfahren beschrieben, welche ein bildgebendes Verfahren zur Analytbestimmung mithilfe einer refraktiven Messmethode ermöglichen. Beide Patentanmeldeschriften werden hiermit ebenfalls als Bestandteil der vorliegenden Anmeldung eingeführt.- Den genannten Anordnungen ist gemeinsam, dass jeweils bekannte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente für den Nachweis einer Vielzahl von Änalyten in diskreten Messbereichen bekannter Lage, als Bestandteile eines oder mehrerer Arrays von Messbereichen, auf dem Trägersubstrat immobilisiert sind.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass, bei geeigneter Wahl der physikalischchemischen Parameter (wie Schichtdicken, Brechungsindices der beteiligten Schichten) einer Evaneszentfeld-Sensorplattform, infolge der hohen Anregungslichtintensität an der Oberfläche und der gleichzeitigen Beschränkung dieses starken Anregungsfeldes auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in die benachbarten Medien, die erreichbare Empfindlichkeit für die Detektion molekularer Wechselwirkungen an der Oberfläche einer Evaneszentfeld-Sensorplattform
ausreichend hoch ist, um eine Vielzahl von Proben oder Verdünnungen dieser Proben auf die darin enthaltenen Änalyten, ohne eine Anreicherung der in den Proben enthaltenen Änalyten durch weitere Probenaufbreitungsschritte, nach direkter Auftragung dieser Proben oder von deren Verdünnungen auf besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform zu analysieren. Damit wird ein Verfahren mit invertierter Assay- Architektur möglich, bei welchem eine in einem Messbereich auf der Evaneszentfeld- Sensorplattform als festem Träger aufzubringende Probe eine „unveränderte relative molekulare Zusammensetzung" (gemäss obiger Definition) aufweist im Vergleich zur ursprünglichen Probe („Ursprungsprobe").
Als „natur-identische Probe" soll im Sinne dieser Erfindung ein einer Analyse zu unterziehendes Gemisch von Verbindungen bezeichnet werden, welches die gleiche relative molekulare Zusammensetzung der darin nachzuweisenden Änalyten („unveränderte relative molekulare Zusammensetzung" (gemäss obiger Definition)) aufweist wie die Ursprungsprobe, aus dem es gewonnen wurde. Die Ursprungsprobe fällt entsprechend dieser Definition ebenfalls unter die Bezeichnung „natur-identische Probe". Beispielsweise kann es sich bei der Ursprungsprobe um eine biologische Zelle handeln, in welcher unterschiedliche Moleküle oder Verbindungen heterogen verteilt sind. Als „Ursprungsprobe" soll auch eine von einer Gesamtheit von einer oder mehreren Zellen erstellte Probe bezeichnet werden, die zuvor aus einer grösseren Anzahl von Zellen selektiert werden, beispielsweise durch Zentrifugation, Filtration oder durch „Laser Capture Microdissection".
Im folgenden bezieht sich die Bezeichnung einer (einzelnen) Zelle für die auszuführenden Probenbehandlungsschritte jeweils auch auf eine Vielzahl von Zellen, sofern dieses nicht ausdrücklich anders vermerkt ist.
In einem ersten, für weitere Untersuchungsschritte im allgemeinen notwendigen Aufbereitungsschritt kann die Zelle lysiert werden. Das daraus gewonnene Lysat mit homogener Verteilung der enthaltenen Verbindungen soll ebenfalls als „naturidentische Probe" bezeichnet werden, wenn die relative molekulare Zusammensetzung der darin nachzuweisenden Änalyten unverändert geblieben ist. Eine „natur-identische Probe" ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie das gesamte Proteom der „Ursprungsprobe" enthält. Das Lysat kann in einem geeigneten
Lösungsmittel, beispielsweise einer Pufferlösung, gelöst sein und bekannte zugesetzte Beimischungen enthalten, beispielsweise Stabilisatoren wie Enzym-Inhibitoren, um einen Abbau enthaltener Biopolymere zu verhindern. Eine „natur-identische" Probe im definitionsgemässen Sinne kann auch Zusätze von bekannten Konzentrationen gleichartiger Verbindungen (als Standards) wie der nachzuweisenden Änalyten, vergleichbar mit einem „Spiken" von Proben in der Chromatographie, enthalten. Solche Zusätze können beispielsweise für Kalibrationszwecke dienlich sein. Ausserdem können die „natur-identischen" Proben Zusätze von der Probenmatrix ähnlichen, aber von den nachzuweisenden Änalyten verschiedenen Verbindungen, wie beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), enthalten, welche beispielsweise der kontrollierten Einstellung der Oberflächendichte immobilisierter Analytmoleküle in einem Messbereich dienen können. In den „natur-identischen" Proben enthaltene Änalyten, d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, können in nativer Form oder denaturierter Form, nach Behandlung der „Ursprungsprobe" beispielsweise mit Harnstoff oder Tensiden (z. B. SDS) vorliegen.
Bevorzugt liegen die in den „natur-identischen Proben" enthaltenen Änalyten, , d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, nach Behandlung mit Harnstoff, in denaturierter Form vor, wobei die Epitope dieser Änalyten für die Bindung ihrer jeweiligen Nachweissubstanzen, beispielsweise von Antikörpern, frei zugänglich sind. Dieses wird ermöglicht durch die Zerstörung der tertiären oder quarternären Struktur infolge der Behandlung mit Harnstoff.
Überraschenderweise ist die Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens derart gross, dass eine „natur-identische" Probe auch noch stark verdünnt werden kann und in der Mischung enthaltene Verbindungen, trotz teilweiser nur sehr niedriger vorliegender Konzentration und entsprechend geringer verfügbarer Menge in einem einzelnen Messbereich, noch mit hoher Genauigkeit nachgewiesen werden können, was mit den bekannten herkömmlichen Methoden nicht möglich ist. Dabei ist es von einem ausserordentlichen Vorteil, dass bei dem erfindungsgemässen Verfahren die aufgebrachten, in einer Probe enthaltenen und nachzuweisenden Änalyten im allgemeinen auch nach ihrer Immobilisierung auf einer Evaneszenzfeld- Sensorplattform im allgemeinen noch in gleicher relativer molekularer Zusammensetzung vorliegen wie in der Ursprungsprobe. Das erfindungsgemässe
Verfahren kann daher Ergebnisse liefern, welche repräsentativ für die gesamthafte molekulare Zusammensetzung der Ursprungsprobe sind, da die sonst üblichen Anreicherungs- und Trennschritte vermieden werden können.
Als „Analyt" soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine solche molekulare Spezies bezeichnet werden, welche mithilfe einer hierfür eingesetzten spezifischen Nachweissubstanz von anderen in einer zu analysierenden Probe enthaltenen Verbindungen unterschieden und gebunden wird. Erfolgt beispielsweise die Bindung einer entsprechenden Nachweissubstanz nur an die phosphorylierte, aber nicht an die unphosphorylierte Form einer nachzuweisenden Verbindung oder Spezies, so stellen gemäss dieser Definition beide Formen dieser Verbindung bzw. Spezies zwei unterschiedliche Änalyten dar. Werden von einer entsprechenden Nachweissubstanz jegliche Verbindungen oder Spezies erkannt und gebunden, wenn sie phosphoryliert sind, so stellen entsprechend unter dieser Bedingung die entsprechenden phosphorylierten Verbindungen oder Spezies gemeinsam einen Änalyten dar. Spezifische Bindungspartner als Nachweissubstanzen eines Änalyten gemäss dieser Definition können beispielsweise so ausgewählt sein, dass sie ausschliesslich die phosphorylierte Form oder die glykolisierte Form (oder entsprechend die nicht phosphorylierte bzw. nicht glykolisierte Form) einer nachzuweisenden Verbindung erkennen und daran binden. Die Aktivität eines biologischen Signalwegs in einer Zelle oder einem Organismus kann mit dem Anteil phosphorylierter oder glykolisierter Verbindungen (abhängig von der Natur des Signalwegs), welche diesen Signalweg steuern, korreliert werden. Der relative Anteil der phosphorylierten bzw. glykolisierten Form an der Gesamtmenge, d.h. der Quotient der Menge einer Verbindung in ihrer phosphorylierten bzw. glykolisierten Form und der Gesamtmenge dieser Verbindung in phosphorylierter und nicht phosphorylierter Form bzw. glykolisierter und nicht glykolisierter Form, in einer Probe wird nachfolgend als Phosphorylierungssgrad bzw. Glykolisierungsgrad dieser Verbindung in der Probe bezeichnet. Phosphorylierungsgrad und Glykolisierungsgrad können unter dem Oberbegriff des Aktivierungsgrads einer Verbindung zusammengefasst werden, dessen numerischer Wert beispielsweise dem Phosphorylierungsgrad oder dem Glykolisierungsgrad entspricht. Der Aktivierungsgrad einer Verbindung kann aber auch andere chemisch veränderte Formen einer Verbindung bezeichnen.
Spezifische Bindungspartner als Nachweissubstanzen können auch so ausgewählt sein, dass sie nur dann an eine nachzuweisende Verbindung binden, wenn diese in einer bestimmten dreidimensionalen Struktur vorliegt. Beispielsweise erkennen und binden viele Antikörper nur an spezielle Teilbereiche (Epitope) einer nachzuweisenden Substanz mit einer speziellen dreidimensionalen Struktur. Je nach Konformationszustand der entsprechenden nachzuweisenden Verbindung können diese Teilbereiche (Epitope) für die Bindung der entsprechenden Nachweissubstanz zugänglich oder verborgen sein. Die spezifischen Bindungspartner können jedoch auch so ausgewählt sein, dass sie an Bereiche der nachzuweisenden Verbindung binden, deren Zugänglichkeit unabhängig von der dreidimensionalen Struktur dieser Verbindung ist. Durch den Einsatz entsprechend ausgewählter Nachweissubstanzen ist es daher möglich, den relativen Anteil an der Gesamtmenge einer in einer Probe nachzuweisenden Verbindung, welche einen spezifischen Konformationszustand aufweist, zu bestimmen.
Als „biologisch relevant" sollen solche Verbindungen bezeichnet werden, welche bekannt sind als Teilnehmer an spezifischen Bindungsreaktionen zu Molekülen oder Verbindungen biologischen Ursprungs oder zu deren synthetisch erzeugten Analogen. Beispiele für „biologisch relevante" Verbindungen sind daher nicht nur natürliche Proteine, wie Antikörper oder Rezeptoren, oder Nukleinsäuren, sondern auch deren Bindungspartner, wie beispielsweise Antigene, bei denen es sich auch um synthetische Verbindungen, auch sehr niedrigen Molekulargewichts, handeln kann.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen räumlich getrennte oder diskrete Messbereiche durch die geschlossene Fläche definiert werden, die dort immobilisierte Bindungspartner, zum Nachweis eines oder mehrerer Änalyten in einer oder mehreren Proben in einem Bioaffinitätsassay, einnehmen. Diese Flächen können dabei eine beliebige Geometrie, beispielsweise die Form von Kreisen, Rechtecken, Dreiecken, Ellipsen etc., haben.
Bei unterschiedlichen derartigen Messbereichen kann es sich beispielsweise um eine Vielzahl unterschiedlicher, auf dem Trägersubstrat aufgetragener Proben oder um aufgetragene unterschiedliche Verdünnungen einer oder mehrerer Proben (jeweils in unterschiedlichen diskreten Messbereichen) handeln. Das Material für die diskreten
Messbereiche kann beispielsweise durch selektive Mikropräparationen, wie beispielsweise das selektive Herauslösen einzelner Zellen aus einem Zellverband durch „Laser Capture Micro Dissection", bereitgestellt sein.
Allgemeiner kann die „natur-identische" Probe mit den darin nachzuweisenden Änalyten ausgewählt sein aus der Gruppe von Extrakten gesunder oder krankhafter Zellen, (z. B. von menschlichen, tierischen, bakteriellen oder pflanzlichen Zellextrakten), Extrakten von tierischem oder menschlichem Gewebe, wie beispielsweise Organ-, Haut-, Haar- oder Knochengewebe, oder von Pflanzengewebe, sowie von Körperflüssigkeiten oder deren Bestandteilen, wie beispielsweise Blut, Serum oder Plasma, Gelenkflüssigkeiten, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Gewebeflüssigkeit, Lymphe. Insbesondere kann eine „natur-identische" Probe auch ausgewählt sein aus der Gruppe, welche Extrakte stimulierter oder unbehandelter Zellen und Extrakte gesunden oder krankhaften Gewebes umf asst.
Entsprechend kann, ausser durch „Laser Capture Micro Dissection", eine „natur- . identische" Probe auch einem Organismus oder Gewebe- oder Zellverband oder Zelle mittels einer Methode aus der Gruppe von Gewebeschnitten, Biopsie entnommen sein.
In einem Messbereich werden im allgemeinen mehrere unterschiedliche Bindungspartner gleichzeitig immobilisiert sein. Meistens wird es sich um eine Vielzahl, d. h. mehrere hundert oder sogar mehrere tausend unterschiedliche Änalyten in einem Messbereich immobilisierte Änalyten handeln.
Erster Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Vielzahl „natur-identischer" Proben auf in den Proben enthaltene, als Teilnehmer an spezifischen Bindungsreaktionen biologisch relevante Verbindungen als Änalyten, dadurch gekennzeichnet, dass
- besagte Proben oder Verdünnungen besagter Proben ohne Änderung der relativen molekularen Zusammensetzung, im Vergleich zur ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der Probe, mit den darin enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten, als einer ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern, in mindestens einem ein- oder zweidimensisonalen Array in
diskreten Messbereichen auf einer Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger aufgetragen werden,
- eine oder mehrere Nachweissubstanzen, als eine zweite Vielzahl spezifischer Bindungspartner, zum spezifischen Nachweis von einem oder mehreren in den Proben enthaltenen Änalyten, aus besagter ersten Vielzahl spezifischer Bindungspartner, in einem einzigen oder mehreren Schritten einer spezifischen Bindungsreaktion mit den in besagten diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben in Kontakt gebracht werden,
- Änderungen von optoelektronischen Signalen als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, im evaneszenten Feld der Evaneszentfeld-Sensorplattform, ortsaufgelöst gemessen werden und aus der relativen Grosse der Änderungen besagter optoelektronischer Signale aus den jeweiligen Messbereichen qualitativ und / oder quantitativ das Vorhandensein der dort spezifisch nachzuweisenden Änalyten bestimmt wird.
Die einfachste Form der Immobilisierung von spezifischen Bindungspartnern für einen Analytnachweis in einer spezifischen Bindungsreaktion besteht in physikalischer Adsorption, beispielsweise infolge hydrophober Wechselwirkungen zwischen den zu immobilisierenden spezifischen Bindungspartnern und der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger. Diese Wechselwirkungen können jedoch durch die Zusammensetzung des Mediums und dessen physikalisch-chemische Eigenschaften, wie beispielsweise Polarität und Ionenstärke, in ihrem Ausmass stark verändert werden. Insbesondere im Falle sequentieller Zugabe verschiedener Reagentien in einem mehrstufigen Assay ist das Haftvermögen der Erkennungselemente nach rein adsorptiver Immobilisierung auf der Oberfläche oft unzureichend. Es wird daher bevorzugt, dass die Evaneszentfeld-Sensorplattform, zur Verbesserung des Haftvermögens der in diskreten Messbereichen aufgetragenen „natur-identischen" Proben oder von deren Verdünnungen, eine Haftvermittlungsschicht umfasst, auf welcher besagte Proben oder deren Verdünnungen aufgetragen werden.
Vorzugsweise beträgt dabei die Dicke der Haftvermittlungsschicht weniger als 200 nm, besonders bevorzugt weniger als 20 nm.
Für die Herstellung der Haftvermittlungsschicht eignen sich eine Vielzahl von Materialien. Beispielsweise kann die Haftvermittlungsschiht Verbindungen umfassen aus der Gruppe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten", Thiolen, Alkylphosphaten und - phosphonaten, multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen.
Es ist auch möglich, dass besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel I (A)
oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B)
und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Hetaryl- oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktionelle Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet. Diese Verbindungen sind genauer beschrieben in der internationalen Anmeldung PCT/EP 01/10077, welche hiermit vollumfänglich als Bestandteil dieser Anmeldung eingeführt wird.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemässe Verfahren so gestaltet, dass die relative molekulare Zusammensetzung einer in einem Messbereich immobilisierten ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern als Änalyten mit der ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der dort aufgebrachten Probe übereinstimmt. Diese Bedingung kann beispielsweise dadurch erfüllt werden, dass das Material einer in einem Messbereich aufgebrachten Probe gleich gross oder weniger ist, als zur Ausbildung einer Monoschicht auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als
festem Träger erforderlich ist. Im Falle einer Sub-Monolayerbedeckung der Oberfläche des festen Trägers ist zugleich eine bestmögliche Zugänglichkeit der als Änalyten immobilisierten ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern für die damit in Kontakt zu bringenden Nachweissubstanzen gewährleistet. Die Zugänglichkeit kann noch dadurch verbessert werden, dass eine zuvor aufgebrachte Haftvermittlungsschicht zu einer orientierten Immobilisierung führt, beispielsweise indem in der aufgebrachten Probe enthaltene Antikörper an ihrem Fc-Teil gebunden immobilisiert werden, so dass ihre spezifischen Bindungsepitope zugänglich sind.
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich, auch nur sehr geringe eingesetzten Probevolumina und -mengen zu analysieren. Als Probenmenge soll dabei die Gesamtmenge verstanden werden, welche in einem diskreten Messbereich aufgebracht ist. Es ist beispielsweise möglich, dass eine Probe das Material von weniger als 20000 Zellen umfasst und trotzdem noch mit hoher Genauigkeit analysiert werden kann. Eine aufzubringende Probe kann sogar das Material von weniger als 1000 Zellen umfassen. Die erforderliche Probenmenge kann sogar das Material von weniger als 100 Zellen, oder sogar von nur 1 - 10 Zellen umfassen und noch verlässlich analysiert werden. Das Material. welches dem Inhalt einer Zelle entspricht, soll auch als ein Zeil-Äquivalent bezeichnet werden. Die Notwendigkeit einer nur so kleinen Menge für eine Analyse benötigter Zeil- Äquivalente ist dann gegeben, wenn es sich bei den nachzuweisenden Änalyten um in relativ hoher Konzentration auftretende Inhaltsstoffe handelt. Ebenso ist es möglich, dass eine Probe ein Volumen von weniger als 1 μl hat. Eine aufzubringende Probe kann sogar ein Volumen von weniger als 10 nl oder sogar weniger als 1 nl haben.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht, dass die in einer „natur-identischen" Probe enthaltenen relativen Gesamtmengen von einer oder mehreren Verbindungen als Änalyten, als Summe von deren Vorkommen in phosphorylierter oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form, bestimmt werden. Vorzugsweise werden die in einer „naturidentischen" Probe enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen als Änalyten, jeweils von deren Vorkommen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form, für eine oder mehrere besagter Formen bestimmt.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es, gemäss obiger Definition den Aktivierungsgrad eines oder mehrerer in einer "natur-identischen" Probe enthaltenen Änalyten zu bestimmen. Insbesonder kann mit besagtem Verfahren der Phosphorylierunsgrad und / oder Glykolisierungsgrad eines oder mehrerer in einer „naturidentischen" Probe enthaltenen Änalyten bestimmt werden. Charakteristisch füt das erfindungsgemässe Vefahren ist ausserdem aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und hohen Genauigkeit und Reproduzierberkait, insbesondere aufgrund einer Vielzahl gleichzeitig oder alternativ einsetzbarer, voneinander unabhängiger Referenzierungs- und Kalibrationsmethoden, dass Unterschiede von weniger als 20 %m bevozugt von weniger als 10 %, von den in einer „naturidentischen" Probe und in einer oder mehreren Vergleichsproben enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form als Änalyten, für eine oder mehrere besagter Formen nachgewiesen werden.
Ein grosser Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens aufgrund seiner inhärenten, methodenspezifischen hohen Empfindlichkeit und vielfältigen Möglichkeiten der Referenzierung und / oder Kalibration unter Benutzung ein- und derselben analytischen Plattform (bzw. Evaneszentfeld-Sensorplattform) ist , dass die Variation der damit gewonnnen Messergebnisse sehr niedrig ist. Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher auch geeignet zur Untersuchung des zeitlichen Verlaufs (d. h. der Veränderungen) der relativen Mengen oder Konzentrationen von biologisch relevanten Substanzen unter Einfluss der Erkrankung eines biologischen Organismus oder einer Zellkultur und / oder der äusseren Beeinflussung eines Organismus oder einer Zellkultur.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist daher dadurch gekennzeichnet, dass besagte „naturidentische" Probe und eine oder mehrere Vergleichsproben dem gleichen Ursprungsort zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen sind und dass zeitliche Veränderungen der in diesen Proben enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht
glykolisierter Form als Änalyten, bestimmt werden. Unter „dem gleichen Ursprungsort" soll dabei der gleiche Organismus oder ein gleichartiger Organismus oder die gleiche Zellkultur bzw. gleichartige Zellkultur (jeweils nach unterschiedlich langer gleichartiger Erkrankung oder Beeinflussung) verstanden werden. Vorzugsweise ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren, zeitliche Änderungen der relativen Konzentration bzw. Menge besagter Änalyten von weniger als 20 % , bevorzugt von weniger als 10 %, nachzusweisen.
Besagte Proben können bei geeignet hoher Ausgangskonzentration der darin enthaltenen Änalyten vor der Auftragung auf besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und / oder verdünnt werden und unterschiedliche Verdünnungen einer Probe in unterschiedlichen diskreten Messbereichen auf besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform aufgetragen werden. Die Proben können dabei um mindestens einen Faktor 10, ja sogar um einen Faktor 30 oder 100 verdünnt werden.
Unterschiedliche Proben können dem gleichen Organismus oder der gleichen Zellkultur entnommen werden. Dann kann durch die Analyse auf mehreren Messbereichen mit darin enthaltenem Material aus dem gleichen Organismus oder aus gleichartigen Zellkulturen ( bzw. aus der gleichen Zellkultur) beispielsweise statistische Information über die Reproduzierbarkeit der in diesen Messbereichen bestimmten relativen molekularen Zusammensetzung der aufgebrachten Proben gewonnen werden.
Unterschiedliche Proben können insbesondere an verschiedenen Positionen des gleichen Organismus entnommen werden. Dann kann aus den Analysen auf den entsprechenden diskreten Messbereichen beispielsweise Information über Inhomogenitäten der relativen molekularen Zusammensetzung der nachzuweisenden Änalyten in dem Organismus, aus dem besagte Proben entnommen wurden, gewonnen werden. Ein solches Vorgehen ist beispielsweise für die Untersuchung krebsbehafteter Organismen von grosser Bedeutung.
Unterschiedliche Proben können aber auch verschiedenen Organismen oder verschiedenen Zellkulturen entnommen sein. Beispielsweise kann es sich dabei um
Proben von mit einem pharmazeutischen Wirkstoff behandelten und unbehandelten Organismen handeln. Ähnlich einer Expressionsanalyse in der Nukleinsäure- Analytik kann dann der Einfluss des jeweiligen Wirkstoffes auf die relative molekulare Zusammensetzung der Proben untersucht werden.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Proben vor ihrer Auftragung auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger (zur Verbesserung des Haftvermögens auf besagtem festem Träger und Erhöhung der Gleichmässigkeit der Auftragung) mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) gemischt werden. Diese Variante des Verfahrens kann beispielsweise dazu beitragen, die Ausbildung von Inhomogenitäten der Verteilung des Probenmaterials innerhalb eines Messbereichs beim Prozess der Verdampfung der Probenflüssigkeit zu vermeiden, was zu einer besseren „Spot-Morphologie" führt und damit die Auswertung der Ergebnisse erleichtert. Dabei wird bevorzugt, dass besagte Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren oder chemischen „Cross- Linkern" ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Lösungen von Polysacchariden, wie z. B. Agarose, oder von Acrylamiden oder von Glutaralehyd etc.umfasst.
Diese besondere Variante des erfindungsgemässen Verfahrens ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung der einen oder mehreren Proben mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) in der Immobilisierung einer dreidimensionalen Netzwerkstruktur mit darin eingebundenen, für Nachweissubstanzen in dem nachfolgenden Schritt einer Bioaffinitätsreaktion zugänglichen Probenbestandteilen, auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger resultiert. Damit kann ein höherer Grad der Oberflächenbedeckung der Evaneszentfeld-Sensorplattform als eine Monoschicht erreicht werden, was zu einer weiteren Erhöhung der messbaren Signale beim Schritt des Analytnachweises führen kann. Wichtig ist dabei, dass die geschaffene Polymeren-Netzwerkstruktur sich nicht über die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ins Medium hinaus erstreckt, da ein Analytnachweis jenseits dieser Entfernung von der Oberfläche der Evaneszentfeld- Sensorplattform nicht möglich ist und damit nicht mehr gewährleistet wäre, dass das
Ergebnis der Analyse die ursprüngliche relative molekulare Zusammensetzung der Probe widerspiegeln würde.
Die Proben können in diskreten Messbereichen auf der Evaneszentfeld- Sensorplattform direkt oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht räumlich selektiv mithilfe eines Verfahrens aufgebracht werden, welches ausgewählt ist aus der Gruppe von Verfahren, die von "InkJet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, „Micro contact printing", fluidischer Kontaktierung der Messbereiche mit besagten Probe, durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen sowie photochemischen oder photolithographischen Immobilisierungsverfahren gebildet wird.
Es ist von Vorteil, wenn Bereiche zwischen den diskreten Messbereichen zur Minimierung unspezifischer Bindung von Nachweissubstanzen "passiviert werden", d.h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten "chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten aufgebracht sind.
Besagte gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten „chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten können ausgewählt sein aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Änalyten unspezifischen Antikörpern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycolen oder Dextranen, gebildet werden.
Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann es sich bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten beispielsweise um Verbindungen aus der Gruppe handeln, die von Proteinen, beispielsweise mono- oder polyklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten, Peptiden, Enzymen, Glycopeptiden, Oligosacchariden, Lektinen, Antigenen für Antikörper, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag- Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA) gebildet wird. Bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten kann es sich auch um Verbindungen aus der Gruppe handeln, welche cytosolische oder membrangebundene Zellproteine, insbesondere an den Prozessen der Signaltransduktion in Zellen beteiligte Proteine, wie z. B. Kinasen, umfasst. Die Änalyten können auch biotechnisch modifizierte, beispielsweise mit lumineszenten bzw. fluoreszenten Gruppen und biologisch expremierte Biopolymere, wie beispielsweise mit „blue fluorescent proteins" (BFP), „green fluorescent proteins" (GFP) oder „red fluorescent proteins" (RFP) sein.
Abhängig von der physikalischen Ausgestaltung der Evaneszentfeld-Sensorplattform gibt es für die messtechnische Art der Signalerzeugung beim Analytnachweis verschiedene Möglichkeiten. Eine mögliche Variante ist dadurch gekennzeichnet, dass die ortsaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, durch lokale Änderungen der Resonanzbedingungen zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform hervorgerufen werden.
Messtechnisch sind für die Bestimmung von Änderungen der Resonanzbedingungen der Resonanzwinkel (bei Variation des Einstrahlungswinkels bei konstanter Wellenlänge des eingestrahlten Lichts) und die Resonanzwellenlänge (bei konstantem Einstrahlungswinkel und Variation der eingestrahlten Anregungswellenlänge) zugänglich. Entsprechend kann besagte Änderung der Resonanzbedingungen in einer Änderung des Resonanzwinkels für die Einstrahlung eines Anregungslichts zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter
Evaneszentfeld-Sensoφlattform bestehen. Entsprechend kann auch besagte Änderung der Resonanzbedingungen in einer Änderung der Resonanzwellenlänge eines eingestrahlten Anregungslichts zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform bestehen.
Die ortaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, können durch lokale Änderungen des effektiven Brechungsindex in diesen Bereichen auf besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform hervorgerufen werden.
Eine andere wichtige Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die ortaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, durch lokale Änderungen einer oder mehrerer Lumineszenzen von innerhalb des evaneszenten Feldes besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform befindlichen lumineszenzfähigen Molekülen hervorgerufen werden.
Es wird bevorzugt, dass besagte Änderungen einer oder mehrerer Lumineszenzen von lumineszenzfähigen Molekülen oder lumineszenzfähigen Nanopartikeln stammen, welche als Lumineszenzlabel an eine oder mehrere Nachweissubstanzen für die in diskreten Messbereichen enthaltenen Änalyten gebunden sind.
Von besonderem Vorteil ist, wenn zum Analytnachweis zwei oder mehr Lumineszenzlabel mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen und / oder unterschiedlichen Anregungsspektren, bevorzugt mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen und gleicher Anregungswellenlänge, eingesetzt werden. Wenn mehrere Lumineszenzlabel mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, insbesondere unterschiedlichen Emissionswellenlängen an unterschiedliche Nachweissubstanzen aus der zweiten Vielzahl spezifischer Bindungspartner, welche mit den Messbereichen in Kontakt gebracht wird, gebunden sind, können beispielsweise unterschiedliche Änalyten in einem einzigen Nachweisschritt, d.h.
Kontaktierung der Messbereiche mit besagten Nachweissubstanzen und gleichzeitige oder nachfolgende Detektion der erzeugten Lumineszenzen, bestimmt werden.
Beispielsweise ist eine solche Variante des erfindungsgemässen Verfahrens besonders gut dafür geeignet, gleichzeitig zum Beispiel die phoshorylierte und die nicht phosphorylierte Form einer Verbindung, insbesondere auch innerhalb eines einzelnen (gemeinsamen) Messbereiches nachzuweisen, mithilfe zweier entsprechender unterschiedlicher, in diesem Fall direkt (z. B. mit grün bzw. rot emittierenden Lumineszenzlabeln) markierter spezifischer Bindungspartner als Nachweissubstanzen.
In ähnlicher Weise können gleichzeitig zwei oder mehr verschiedene Änalyten detektiert werden, wenn zum Analytnachweis zwei oder mehr Lumineszenzlabel mit unterschiedlichen Emissionsabklingzeiten eingesetzt werden.
Für das erfindungsgemässe Verfahren wird also bevorzugt, dass zum Nachweis unterschiedlicher Änalyten in einer Probe zwei oder mehr Lumineszenzlabel verwendet werden. Ebenso wird bevorzugt, dass zum Nachweis unterschiedlicher Änalyten in einem Messbereich zwei oder mehr Lumineszenzlabel verwendet werden.
Von Vorteil ist ausserdem, wenn die Einstrahlung des Anregungslichts in Pulsen mit einer Dauer zwischen 1 fsec und 10 Minuten erfolgt und das Emissionslicht aus den Messbereichen zeitlich aufgelöst gemessen wird.
Vorzugsweise umfasst die Evaneszentfeld-Sensorplattform als fester Träger einen optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten. Es kann sich dabei beispielsweise um einen faseroptischen Wellenleiter, bestehend aus mehreren Schichten handeln. Bevorzugt handelt es sich jedoch um einen planaren optischen Wellenleiter, welcher durchgehend über eine Oberfläche der Evaneszentfeld- Sensorplattform ausgebildet ist oder auch in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilt sein kann, wie dieses beispielsweise in der Patentanmeldung WO 96/35940 beschrieben ist, deren Inhalt hiermit vollumfänglich in die vorliegende Anmeldung eingeführt wird.
Besonders bevorzugt wird eine solche Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Evaneszentfeld- Sensorplattform als fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.
Das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen kann in eine wellenleitende Schicht der Evaneszentfeld-Sensorplattform über ein oder mehrere optische Koppelemente eingekoppelt werden, welche ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.
Es wird bevorzugt, dass die Einkopplung von Anregungslicht in eine wellenleitende Schicht der Evaneszentfeldsensorplattform mithilfe von einer oder mehreren Gitterstrukturen (c) erfolgt, die in der besagten wellenleitenden Schicht ausgeprägt sind.
Ausserdem wird bevorzugt, dass die Auskopplung von in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensorplattform geführtem Licht mithilfe von einer oder mehreren Gitterstrukturen (c') erfolgt, die in besagter wellenleitender Schicht ausgeprägt sind und gleiche oder unterschiedliche Periode und Gittertiefe wie Gitterstrukturen (c) haben.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen über eine Gitterstruktur (c) in eine wellenleitende Schicht besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform eingekoppelt und zu auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform befindlichen Messbereichen als geführte Welle geleitet wird, dass weiterhin die im evaneszenten Feld besagter geführter Welle erzeugte Lumineszenz von
lumineszenzfähigen Molekülen mit einem oder mehreren Detektoren ortsaufgelöst erfasst und die relative Konzentration eines oder mehrerer Änalyten aus der relativen Intensität dieser Lumineszenzsignale bestimmt wird.
Eine besondere Variante besteht dabei darin, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.
Für eine weitere Verbesserung der Empfindlichkeit kann dabei vorteilhaft sein, wenn die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden. Dabei wird bevorzugt, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine analytische Plattform zur Untersuchung einer Vielzahl „natur-identischer" Proben auf in den Proben enthaltene, als Teilnehmer an Bioaffinitätsreaktionen biologisch relevante Verbindungen als Änalyten, umfassend
- eine Evaneszentfeld-Sensorplattform als festen Träger
- mindestens ein ein- oder zweidimensionales Array von diskreten Messbereichen mit darin immobilisierten Bindungspartnern auf besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform für den Nachweis besagter Änalyten in einer Bioaffinitätsreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass besagte diskrete Messbereiche durch die Auftragung besagter „natur-identischer" Proben oder daraus hergestellter Verdünnungen, ohne Änderung der relativen molekularen Zusammensetzung, im Vergleich zur ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der Probe, mit den darin nachzuweisenden Änalyten, als einer ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern, erzeugt werden und es sich bei dem einen oder den mehreren immobilisierten Bindungspartnern, welche besagte erste Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern bilden, um den einen oder um die mehreren Änalyten selbst handelt, welche in besagten „natur-identischen" Probe enthalten sind.
In den „natur-identischen" Proben enthaltene Proteine können in nativer Form oder denaturierter Form, nach Behandlung der „Ursprungsprobe" beispielsweise mit Harnstoff oder Tensiden (z. B. SDS) vorliegen.
Bevorzugt liegen die „natur-identischen Proben", nach Behandlung mit Harnstoff, in denaturierter Form vor, wobei die Epitope der enthaltenen Änalyten für die Bindung ihrer jeweiligen Nachweissubstanzen, beispielsweise von Antikörpern, frei zugänglich sind. Dieses wird ermöglicht durch die Zerstörung der tertiären oder quarternären Struktur infolge der Behandlung mit Harnstoff.
Es wird bevorzugt, dass die Evaneszentfeld-Sensorplattform, zur Verbesserung des Haftvermögens der in diskreten Messbereichen aufgetragenen „natur-identischen" Proben oder von deren Verdünnungen, eine Haftvermittlungsschicht umfasst, auf welcher besagte Proben oder deren Verdünnungen aufgetragen werden.
Vorzugsweise beträgt dabei die Dicke der Haftvermittlungsschicht weniger als 200 nm, besonders bevorzugt weniger als 20 nm.
Die Haftvermittlungsschicht kann Verbindungen umfassen aus der Gruppe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten", Thiolen, Alkylphosphaten und -phosphonaten, multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen.
Als besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, wenn besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel I (A)
oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B)
und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Hetaryl- oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktioneile Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet.
Es wird bevorzugt, dass die relative molekulare Zusammensetzung einer in einem Messbereich immobilisierten ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern als Änalyten mit der ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der dort aufgebrachten Probe übereinstimmt.
Eine aufgebrachte „natur-identische" Probe kann ausgewählt sein aus der Extrakten gesunder oder krankhafter Zellen, (z. B. von menschlichen, tierischen, bakteriellen oder pflanzlichen Zellextrakten), Extrakten von tierischem oder menschlichem Gewebe, wie beispielsweise Organ-, Haut-, Haar- oder Knochengewebe, oder von Pflanzengewebe, sowie von Körperflüssigkeiten oder deren Bestandteilen, wie beispielsweise Blut, Serum oder Plasma, Gelenkflüssigkeiten, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Gewebeflüssigkeit, Lymphe.
Insbesondere kann eine „natur-identische" Probe auch ausgewählt sein aus der Gruppe, welche Extrakte stimulierter oder unbehandelter Zellen und Extrakte gesunden oder krankhaften Gewebes umfasst.
Besagte Proben können Proben aus einem Organismus oder Gewebe- oder Zellverband oder Zelle mittels einer Methode aus der Gruppe von Gewebeschnitten, Biopsie oder „Laser Capture Micro Dissection" entnommen sein.
Eine aufgebrachte Probe kann das Material von weniger als 20000 Zellen, ja sogar von weniger als 1000 Zellen umfassen. Die Probe kann ein Volumen von weniger als 1 μl, ja sogar von weniger als 10 nl haben.
Die erforderliche Probenmenge kann sogar das Material von weniger als 100 Zellen umfassen und noch verlässlich analysiert werden. Dieses ist dann der Fall, wenn es sich bei den nachzuweisenden Änalyten um in relativ hoher Konzentration auftretende Inhaltsstoffe handelt.
Eine oder mehrere besagter „natur-identischer" Proben können biologischen Organismen oder Gewebe- oder Zellverbänden oder Zellen entnommen und direkt (d.h. nach Lyse der Zellen) ohne weitere Verdünnung, auf besagtem festen Träger aufgetragen worden sein
Es ist auch möglich, dass eine oder mehrere besagter Proben vor der Auftragung auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und / oder verdünnt wurden und unterschiedliche Verdünnungen einer Probe in unterschiedlichen diskreten Messbereichen auf besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform aufgetragen wurden. Dabei können die Proben um mindestens eine Faktor 10 verdünnt werden. Die hohe Empfindlichleit der erfindungsgemässen analytischen Plattform ermöglicht es sogar, die Proben um einen Faktor 30 oder sogar 100 zu verdünnen und trotz dieser starken Verdünnung eine Vielzahl unterschiedlicher Änalyten jeweils innerhalb eines Messbereichs quantitativ zu bestimmen.
Unterschiedliche aufgetragene Proben können dem gleichen Organismus oder gleichen Zellkulturen entnommen sein. Dabei können die Proben an verschiedenen Positionen des gleichen Organismus entnommen sein.
Unterschiedliche aufgetragene Proben können auch verschiedenen Organismen oder verschiedenen Zellkulturen entnommen sein.
Eine besondere Ausführungsform der erfindungsgemässen analytischen Plattform ist dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Proben vor ihrer Auftragung auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger (zur Verbesserung des Haftvermögens auf besagtem festem Träger und Erhöhung der Gleichmässigkeit der Auftragung) mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern"
(z. B. Glutaraldehyd) gemischt werden. Diese Variante des Verfahrens kann beispielsweise dazu beitragen, die Ausbildung von Inhomogenitäten der Verteilung des Probenmaterials innerhalb eines Messbereichs beim Prozess der Verdampfung der Probenflüssigkeit zu vermeiden, was zu einer besseren „Spot-Morphologie" führt und damit die Auswertung der Ergebnisse erleichtert. Dabei wird bevorzugt, dass besagte Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren oder chemischen „Cross- Linkern" ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Lösungen von Polysacchariden, wie z. B. Agarose, oder von Acrylamiden oder von Glutaradehyd etc.umfasst.
Eine solche spezielle Ausführungsform einer erfindungsgemässen analytischen Plattform ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung der einen oder mehreren Proben mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) in der Immobilisierung einer dreidimensionalen Netzwerkstruktur mit darin eingebundenen, für Nachweissubstanzen in dem nachfolgenden Schritt einer Bioaffinitätsreaktion zugänglichen. Damit kann ein höherer Grad der Oberflächenbedeckung der Evaneszentfeld-Sensoφlattform als eine Monoschicht erreicht werden, was zu einer weiteren Erhöhung der messbaren Signale beim Schritt des Analytnachweises führen kann. Wichtig ist dabei, dass die geschaffene Polymeren-Netzwerkstruktur sich nicht über die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ins Medium hinaus erstreckt, da ein Analytnachweis jenseits dieser Entfernung von der Oberfläche der Evaneszentfeld- Sensoφlattform nicht möglich ist und damit nicht mehr gewährleistet wäre, dass das Ergebnis der Analyse die ursprüngliche relative molekulare Zusammensetzung der Probe widerspiegeln würde.
Vorteilhaft sind solche Ausführungsformen einer erfindungsgemässen analytischen Plattform, bei denen ein Array mehr als 50, bevorzugt mehr als 500, besonders bevorzugt mehr als 5000 Messbereiche umfasst.
Dabei kann jeder Messbereich eine zu anderen Messbereichen gleiche oder unterschiedliche immobilisierte „natur-identische" Probe oder immobilisierte Vergleichsprobe enthalten.
Die Messbereiche eines Arrays sind in einer Dichte von mehr als 10, bevorzugt von mehr als 100, besonders bevorzugt von mehr als 1000 Messbereichen pro Quadratzentimeter angeordnet.
Vorteilhaft ist auch eine solche Ausführungsform einer erfindungsgemässen analytischen Plattform, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass auf der Evaneszenzfeld-Sensoφlattform als festem Träger eine Vielzahl von Arrays von Messbereichen angeordnet sind. Insbesondere können auf der Evaneszenzfeld- Sensoφlattform mindestens 5, bevorzugt mindestens 50 Arrays von Messbereichen angeordnet sein. Besonders vorteihaft ist es, wenn unterschiedliche Arrays von Messbereichen einer solchen Variante einer erfindungsgemässen analytischen Plattform in unterschiedlichen Probenbehältnissen angeordnet sind. Beispielsweise in den Internationalen Patentanmeldungen WO 01/13096 und WO 01/43875 ist beschrieben, wie eine Evaneszentfeld-Sensoφlattform, welche für eine erfindungsgemässe analytische Plattform geeignet ist, als Bodenplatte mit einem geeigneten Aufsatzköφer zur Erzeugung eines geeigneten Arrays von Probenbehältnissen, jeweils für die Aufnahme eines Arrays von Messbereichen, kombiniert werden kann.
Mit einer solchen Ausführungsform einer erfindungsgemässen analytischen Plattform wird eine experimentelle Konzeption ermöglicht, welche man als „multidimensional" bezeichnen kann: Beispielsweise können in den Zeilen und Spalten eines Arrays verschiedene Proben, beispielsweise von unterschiedlichen Organismen (z. B. entsprechend Spalten), in unterschiedlicher Verdünnung (z. B. entsprechend Zeilen) aufgebracht sein. Unterschiedliche Arrays von Messbereichen, in unterschiedlichen Probenbehältnissen, können dann mit unterschiedlichen zweiten Vielzahlen von spezifischen Bindungspartnern als Nachweissubstanzen zur Bestimmung unterschiedlicher immobilisierter Änalyten in unterschiedlichen Arrays in Kontakt gebracht werden. Es ist offensichtlich, dass sich mit einer solchen Variante einer erfindungsgemässen analytischen Plattform eine nahezu unbegrenzte Anzahl verschiedener Experimente durchführen lässt.
Von Vorteil ist weiterhin, wenn Bereiche zwischen den diskreten Messbereichen zur Minimierung unspezifischer Bindung von Nachweissubstanzen "passiviert sind", d.h.
dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten "chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten aufgebracht sind.
Besagte gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten „chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten können ausgewählt sein aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Änalyten unspezifischen Antiköφern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycolen oder Dextranen, gebildet werden.
Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann dass es sich bei den in diskreten Messbereichen einer erfindungsgemässen analytischen Plattform aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten um Verbindungen aus der Gruppe handeln, die von Proteinen, beispielsweise mono- oder polyklonalen Antiköφern und Antiköφerfragmenten, Peptiden, Enzymen, Glycopeptiden, Oligosacchariden, Lektinen, Antigenen für Antiköφer, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag- Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA) gebildet wird.
Insbesondere kann es sich bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten um Verbindungen aus der Gruppe handeln, welche cytosolische oder membrangebundene Zellproteine, insbesondere an den Prozessen der Signaltransduktion in Zellen beteiligte Proteine, wie z. B. Kinasen, umfasst. . Die Änalyten können auch biotechnisch modifizierte, beispielsweise mit lumineszenten bzw. fluoreszenten Gruppen und biologisch expremierte Biopolymere,
wie beispielsweise mit „blue fluorescent proteins" (BFP), „green fluorescent proteins" (GFP) oder „red fluorescent proteins" (RFP) sein.
Eine spezielle Variante einer erfindungsgemässen analytischen Plattform ist dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform, als Bestandteil der analytischen Plattform, eine dünne Metallschicht, gegebenenfalls auf einer darunter befindlichen Zwischenschicht mit Brechungsindex vorzugsweise < 1.5, wie beispielsweise Siliciumdioxid oder Magnesiumfluorid, umfasst, wobei die Dicke der Metallschicht und der eventuellen Zwischenschicht so ausgewählt ist, dass ein Oberflächenplasmon bei der Wellenlänge eines eingestrahlten Anregungslichts und / oder bei der Wellenlänge einer erzeugten Lumineszenz angeregt werden kann.
Dabei wird bevorzugt, dass das Metall ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Gold und Silber umfasst. Ausserdem wird bevorzugt, dass die Metallschicht eine Dicke zwischen 10 nm und 1000 nm, bevorzugt zwischen 30 nm und 200 nm, hat.
Vorzugsweise umfasst die Evaneszentfeld-Sensoφlattform als fester Träger einen optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten. Es kann sich dabei beispielsweise um einen faseroptischen Wellenleiter, bestehend aus mehreren Schichten handeln. Bevorzugt handelt es sich jedoch um einen planaren optischen Wellenleiter, welcher durchgehend über eine Oberfläche der Evaneszentfeld- Sensoφlattform ausgebildet ist oder auch in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilt sein kann, wie dieses beispielsweise in der Patentanmeldung WO 96/35940 beschrieben ist.
Besonders bevorzugt wird eine solche Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Evaneszentfeld- Sensoφlattform als fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemässe analytische Plattform so gestaltet, dass eine wellenleitende Schicht der Evaneszenzfeld-Sensoφlattform mit einem oder mehreren optischen Koppelelementen in optischem Kontakt steht, welche die Einkopplung von Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in die besagte wellenleitende Schicht ermöglichen, wobei besagte optische Koppelelemente ausgewählt sind aus der Gruppe von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der besagten wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensoφlattform angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern.
Besonders bevorzugt wird, wenn in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld- Sensoφlattform eine oder mehrere Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Einkopplung von Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen ermöglichen.
Vorteilhaft ist ausserdem, wenn in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld- Sensoφlattform eine oder mehrere Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Gitteφeriode und Gittertiefe wie Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Auskopplung von in besagter wellenleitender Schicht geführtem Licht ermöglichen.
Weitere Ausführungsformen von Evaneszenzfeld-Sensoφlattformen, welche für eine erfindungsgemässe analytische Plattform geeignet sind, sind beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 95/33197, WO 95/33198 und WO96/35940 beschrieben, welche hiermit ebenfalls vollumfänglich als Bestandteil der vorliegenden Erfindung eingeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemässen Verfahrens oder einer erfindungsgemässen analytischen Plattform zu quantitativen und / oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Änalyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen
Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik und die Bestimmung von genomischen oder proteomischen Unterschieden im Genom, wie beispielsweise Einzelnukleotid-Polymoφhismen, zur Messung von Protein-DNA- wechselwirkungen, zur Bestimmung von Steuerungsmechanismen für die m-RNA- Expression und für die Protein(bio)synthese, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen, insbesondere zur Bestimmung von biologischen und chemischen Markerstoffen, wie mRNA, Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen organischen (Boten-)Stoffen, sowie zum Nachweis von Antiköφern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktforschung und -entwicklung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktforschung und -entwicklung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischehn Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregem, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, insbesondere in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen weiter erläutert, wobei die dort beschriebenen Ausführungsformen keine Einschränkung der Allgemeinheit bedeuten.
Beispiele
1. Analytische Plattform
1.1. Evaneszentfeld-Sensorplattform
Als analytische Plattform dient eine Evaneszentfeld-Sensoφlattform als fester Träger mit den Abmessungen 14 mm Breite x 57 mm Länge x 0.7 mm Dicke. Die Evaneszentfeld-Sensoφlattform ist als ein Dünnschichtwellenleiter ausgeprägt, umfassend ein Glasssubstrat (AF 45) und eine darauf aufgebrachte 150-nm dünne, hochbrechende Schicht aus Tantalpentoxid. In dem Glassubstrat sind, parallel zur Länge, zwei Oberflächenreliefgitter (Gitteφeriode: 318 nm, Gittertiefe: (12 +/- 2) nm) im Abstand von 9 mm moduliert. Bei der nachfolgenden Auftragung der hochbrechenden Schicht wurden diese Strukturen, die als diffraktive Gitter der Lichteinkopplung in die hochbrechende Schicht dienen sollen, in die Oberfläche der Tantalpentoxidschicht übertragen.
Nach sorgfältiger Reinigung der Evaneszentfeld-Sensoφlattform wird auf der Oberfläche der Metalloxidschicht eine Monoschicht aus Mono-Dodecylphosphat (DDP) durch spontane Selbstorganisation als Haftvermittlungsschicht erzeugt, mittels Abscheidung aus wässriger Lösung (0.5 mM DDP). Diese Oberflächenmodifikation der zuvor hydrophilen Metalloxidoberfläche führt zu einer hydrophoben Oberfläche (mit einem Kontaktwinkel von etwa 100° gegenüber Wasser), auf der eine Vielzahl „natur-identischer" Proben mit darin enthaltenen Änalyten als spezifischen Bindungspartnern für den Analytnachweis in einer spezifischen Bindungsreaktion aufgetragen werden sollen.
Auf den mit der hydrophoben Haftvermittlungsschicht versehenen Evaneszentfeld- Sensoφlattformen werden 6 identische Mikroarrays von je 90 Messbereichen (Spots), ihrerseits in einer Anordnung von jeweils 10 Reihen und 9 Spalten, mit einem Inkjet- Spotter (Modell BCA1, Perkin Eimer, Boston, MA,USA) aufgetragen. Jeder Spot wird durch die Auftragung eines einzelnen Tröpfchens von 280 pL Volumen auf die Chipoberfläche erzeugt.
1.2. Reagentien und Erzeugung der Arrays von Messbereichen
Für den Nachweis von biologisch relevanten Proteinanalyten in „natur-identischen" Proben werden humane T-Zell-Kulturen (Jurkat, DMZ # ACC282) benutzt. Diese Zellen werden in einer Lösung enthaltend RPMI 1640, 10% FCS (Fötales Rinderserum), 2mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin, 50 / g/ml Streptamycin bei 37°C kultiviert (Zelldichte ca. 0.5-1.0 x 106 Zellen/ml). Diese Zellen werden dann mit Antiköφern, nämlich „Maus-anti-human-CD3" („mouse-α-human-CD3") bzw. („Maus-anti-Human-CD28") („mouse-α-human-CD28"), gegen die Oberflächenrezeptoren CD3 bzw. CD28 (in einer Lösung von je 1 μg/ml für 10 min) inkubiert. Für eine Vergleichsprobe zu den mit den Antiköφern behandelten Zellkulturen wird eine ansonsten gleichartige Zellkultur benutzt, die unbehandelt blieb und im analytischen Nachweisverfahren als Negativ-Kontrolle dienen wird. Eine weitere ansonsten gleichartige Zellkultur wird mit Staurosporin (Konzentration: 10 μM), einem starken Proteinkinase-Inhibitor, 180 min lang behandelt.
Anschliessend werden die so behandelten bzw. unbehandelten Zellkulturen auf 4°C gekühlt und 2 Minuten bei einer Zentrifugationskraft von 350 x g pelletiert (Zellzahl ca. 107). Dabei werden die Zellen lediglich, ohne Schädigung, vom Medium getrennt. Danach wird der Überstand dekantiert und Lysepuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 1% DTT, 4 mM Sper idin und Complete (Proteaseinhibitor, Röche AG, 1 Tablette/50 ml)) zugegeben, wobei die Totalproteinkonzentration auf etwa 10 mg/ml eingestellt wird.. Alle proteinhaltigen Zellbestandteile werden hierbei spontan und vollständig denaturiert und solubilisiert.
Die Behandlung mit den genannten Antiköφern dient als Modellsystem für die co- stimulatorische Aktivierung von humanen T-Zellen (M. Diehn et al., „Genomic expression programs and the Integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation", Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (2002) 11796 - 11801). Die Bindung besagter Antiköφer an zellmembrangebundene Rezeptoren löst eine Phosphorylierangskaskade mit anschlossenen, unterschiedlichen Signalwegen innerhalb der betroffenen Zellen aus. Die Aktivität eines bestimmten Signal wegs lässt sich hierbei durch die Bestimmung des Phosphorylierungsgrades eines entsprechenden involvierten Schlüsselproteins (als einem sogenannten
„Markeφrotein") oder dessen Substrats nachweisen, was mithilfe einer erfindungsgemässen analytischen Plattform durchgeführt werden soll.
Als Referenzmethode zu dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine Westem-Blot Analyse durchgeführt.
Die mithilfe der vorangehend beschriebenen Vorbereitungsschritte gewonnenen Proben werden nochmals um einen Faktor 10 auf eine Totalproteinkonzentration von etwa 1 mg/ml verdünnt und dann als „natur-identische" Proben in diskreten Messbereichen zur Erzeugung eines Arrays von Messbereichen auf der mit der Haftvermittlungsschicht versehenen Evaneszentfeld-Sensoφlattform aufgetragen.
Zusätzlich zu den Messbereichen mit darin aufgebrachten „natur-identischen" Proben enthält jedes Mikroarray weitere Messbereiche mit darin immobilisiertem Cy5- fluoreszenzmarkiertem Rinderseramalbumin (Cy5-BSA), die zur Referenzierang von lokalen Unterschieden und / oder zeitlichen Variationen der Anregungslichtintensität bei der Messung verwendet werden („Referenz-Spots"). Cy5-BSA wird in einer Konzentration von 1.0 nM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4) aufgetragen (Markierungsrate: 3 Cy5-Moleküle pro BSA-Molekül).
Nach Aufbringen der „natur-identischen" Proben und Cy5-BSA wird die analytische Plattform zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und 100 % relativer Luftfeuchte gelagert und anschliessend bei Raumluft getrocknet. Dann werden die freien, nicht protein-bedeckten, hydrophoben Oberflächenbereiche der Evaneszentfeldsensor- Plattform mit Rinderseramalbumin (BS A) abgesättigt, indem die Oberfläche mit einer Lösung von BSA (30 mg/ml) in 50 mM Imidazol / 100 mM NaCl (pH 7.4) inkubiert wird. Danach wird die Evaneszentfeldsensor-Plattform mit den darauf erzeugten Messbereichen mit Wasser gewaschen und anschliessend in einem Stickstoffstrom getrocknet und bei 4°C bis zur Durchführung des erfindungsgemässen Nachweisverfahrens gelagert.
Die Geometrie einer typischen Anordnung der Messbereiche in einem zweidimensionalen Array und eine lineare Anordnung von sechs (identischen) Arrays auf einer Evaneszentfeldsensor-Plattform ist in Figur 1 dargestellt (für die Beispiele,
die anhand von Figur 3A/B bzw. Figur 4A B genauer besprochen werden) . Der Durchmesser der Spots, mit einem Abstand (Zentrum-zu-Zentram) von 600 μm, beträgt etwa 90 μm. Ein Array von Messbereichen umfasst für diese Beispiele jeweils eine Anordnung von Messbereichen mit 8 verschiedenen, in 5 Replikaten aufgetragenenen Proben, wobei die 5 gleichartigen Messbereiche jeweils in einer gemeinsamen Spalte senkrecht zur Aubreitungsrichtung des während des Detektionsschritts in der wellenleitenden Schicht der analytischen Plattform geführten Lichts angeordnet sind. Mithilfe der jeweils 5 gleichartigen Messbereiche soll die Reproduzierbarkeit der Mess-Signale innerhalb des Arrays von Messbereichen bestimmt werden. Zwischen und neben den Spalten von Messbereichen mit darin aufgebrachten zu anylsierenden Proben sind jeweils Spalten von Messbereichen mit darin aufgebrachtem Cy5-BSA (zu Referenzierungszwecken) angeordnet. Die erfindungsgemässe analytische Plattform umfasst in diesem Beispiel 6 gleichartige derartige Arrays von Messbereichen, wie in Figur 1 dargestellt.
2. Analytisches Nachweisverfahren 2.1. Assay- Architektur
Der Nachweis bestimmter Proteine allgemein (d. h. z. B. mit oder ohne Phosphorylierung) bzw. bestimmter Proteine speziell in aktivierter (z.B. phosphorylierter) Form in den immobilisierten Zell-Lysaten als in diskreten Messbereichen aufgetragenen „natur-identischen" Proben erfolgt mithilfe sequentieller Zugabe entsprechender Nachweisreagentien als Assay-Schritten vor der Vermessung der resultierenden Fluoreszenzsignale: Zur Vorbereitung für einen ersten Assay-Schritt werden polyklonale analytspezifische Kaninchen- Antiköφer (Antiköφer AI (#2261): Phospho-(Ser) PKC Substrat; Antiköφer A2 (#9611): Phosρho-(Ser/Thr) Akt Substrat; Antiköφer A3 (#9101): Phospho-p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204); Antiköφer A4 (#9102): p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204); alle Antiköφer bezogen von Cell Signaling Technology, INC., Beverly, MA, USA) typischerweise im Verhältnis 1:500 in Assay-Puffer (50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% Tween 20 pH 7.4) verdünnt. Von diesen vier verschiedenen Antiköφerlösungen werden jeweils 30 μ\ auf jeweils eines der 6 identischen Arrays von Messbereichen aufgebracht, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht (Erster Assay-Schritt). Überschüssige, nicht spezifisch
gebundene Antiköφer werden durch Waschen eines jeden Arrays mit Assaypuffer (5x100 ul) entfernt.
Die hier benutzten 4 verschiedenen Antiköφer sind grundsätzlich unterschiedlicher Natur: Antiköφer AI und A2 erkennen und binden eine Reihe unterschiedlicher, an Serin bzw. Serin/Threonin phosphorylierten Proteinen, welche Proteinkinasen als Substrate dienen. Dieses ist an der Vielzahl der Banden im Westem-Blot zu erkennen (Figur 2A und Abschnitt 2.4, "Ergebnisse"). Antiköφer A3 und A4 erkennen und binden die gleiche Art von Verbindung, nämlich die p44/42 MAP-Kinase (auch Erk2 genannt), wobei jedoch Antiköφer A3 nur dessen phosphorylierte „aktive" Form (pErk2) erkennt, während Antiköφer A4 beide Formen (die nicht phosphorylierte Form Erk2 und die phosphorylierte Form pErk2) erkennt und daran bindet.
Für den Nachweis von in disketen Messbereichen an dort in den immobilisierten „natur-identischen" Proben enthaltene gebundene analytspezifische Antiköφer erfolgt ein zweiter Assay-Schritt unter Benutzung eines Cy5-markierten anti-Kaninchen- Antiköφers (Amersham Biosciences, Dübendorf, CH), welches an alle vorangehend genannten Antiköφer AI - A4 bindet. Dieser Cy5-markierte Antiköφer wird in einer Konzentration von typischerweise 10 nM in Assay-Puffer auf die Arrays aufgebracht (je 30 μl) und damit anschliessend 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert wird. Anschliessend werden die Arrays mit Assaypuffer (jeweils fünfmal mit 100 μl) gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Cy5-anti-Kaninchen Antiköφer zu entfernen. Danach werden die so vorbereiteten analytischen Plattformen bis zum Detektionsschritt mittels Anregung und Detektion resultierender Fluoreszenzsignale im ZeptoREADER™ (siehe unten) gelagert.
2.2. Bestimmung der Fluoreszenzsignale aus den Arrays von Messbereichen
Die Fluoreszenzsignale aus den verschiedenen Arrays von Messbereichen werden mit einem ZeptoREADER™ (Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil, Schweiz) sequentiell automatisch gemessen Für jedes Array von Messbereichen wird die erfindungsgemässe analytische Plattform justiert zur Erfüllung der Resonanzbedingung für die Lichteinkopplung in die wellenleitende Tantalpentoxid-
Schicht und zur Maximierung des in den Messbereichen verfügbaren Anregungslichts. Anschliessend wird von jedem Array eine vom Benutzer wählbare Anzahl von Bildern der Fluoreszenzsignale aus dem betreffenden Array erzeugt, wobei unterschiedliche Belichtungszeiten gewählt werden können. Die Anregungswellenlänge beträgt bei den Messungen für das vorliegende Beispiel 633 nm, die Detektion des Fluoreszenzlicht erfolgt mit einer gekühlten Kamera bei der Fluoreszenzwellenlänge von Cy5, unter Verwendung eines Interferenzfilters (Transmission 670±20 nm) zur Unterdrückung von Streulicht bei der Anregungswellenlänge, der vor dem Objektiv der Kamera positioniert ist. Die erzeugten Fluoreszenzbilder werden automatisch auf der Speicheφlatte des Steuer- Computers abgespeichert. Weitere Details des optischen Systems (ZeptoREADER™) sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP 01/10012 beschrieben, welche hiermit vollumfänglich als Bestandteil dieser Anmeldung eingeführt wird.
2.3. Auswertung und Referenzierung:
Die mittlere Signalintensität aus den Messbereichen (Spots) wird bestimmt mithilfe einer Bildanalyse-Software (ZeptoVIEW, Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil), welche es ermöglicht, die Fluoreszenzbilder einer Vielzahl von Arrays von Messbereichen halbautomatisch auzuwerten.
Die Rohdaten der einzelnen Pixel der Kamera stellen eine zweidimensionale Matrix digitalisierter Messwerte dar, mit der gemessenen Intensität als Messwert eines einzelnen Pixels entsprechend der auf ihn abgebildeten Fläche auf der Sensoφlattform. Für die Auswertung der Daten wird zunächst manuell ein zweidimensionales (Koordinaten-) Netz über die Bildpunkte (Pixelwerte) gelegt derart, dass das Teilbild jedes Spots in ein individuelles zweidimensionales Netzelement fällt. Innerhalb dieses Netzelements wird jedem Spot ein kreisförmiger möglichst gut anzupassender „Auswertebereich" (area of interest, AOI) mit einem vom Benutzer vorzugebenden Radius (typischerweise 90 μm) zugeordnet. Durch die Bildanalysesoftware wird der Ort der einzelnen AOIs individuell als Funktion der Signalintensität der einzelnen Pixel bestimmt. Dabei bleibt der zu Beginn vom Nutzer vorgegebene Radius der AOIs erhalten. Als mittlere Bruttosignalintensität eines jeden
Spots wird das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb eines gewählten Auswertebereichs bestimmt.
Die Hintergrundsignale werden bestimmt aus den gemessenen Signalintensitäten zwischen den Spots. Dazu werden pro Spot vier weitere kreisförmige Flächen (mit typischerweise gleichem Radius wie für die Auswertebereiche der Spots) als Auswertebereiche zur Hintergrundsignalbestimmung definiert, welche vorzugsweise in der Mitte zwischen zwischen benachbarten Spots angeordnet sind. Aus diesen vier Kreisflächen wird die mittlere Hintergrundsignalintensität beispielsweise als das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb eines hierfür gewählten AOIs bestimmt. Die mittlere Nettosignalintensität aus den Messbereichen (Spots) wird dann als Differenz zwischen der lokalen mittleren Brutto- und der lokalen mittleren Hintergrundsignalintensität des jeweiligen Spots berechnet.
Die Referenzierung der Netto-Signalintensität aller Spots erfolgt geweils mithilfe von Referenzspots (Cy5-BS A) eines jeden Arrays von Messbereichen. Dazu wird die Netto-Signalintensität eines jeden Spots durch den Mittelwert der Netto- Signalintensitäten der benachbarten Referenzspots derselben Reihe (angeordnet parallel zur Ausbreitungsrichtung des in der Evaneszentfeld-Sensoφlattform geführten Lichts) dividiert. Durch diese Referenzierang werden die lokalen Unterschiede der verfügbaren Anregungslichtintensität orthogonal zur Lichtausbreitungsrichtung sowohl innerhalb eines jeden Mikroarrays als auch zwischen verschiedenen Mikroarrays kompensiert.
2.4. Ergebnisse
Die Ergebnisse der Westem-Blot Analyse als Vergleichsverfahren zu dem erfindungsgemässen Verfahren sind in Figur 2A dargestellt. Der untere Teil der Figur zeigt die Ergebnisse mit den Zellkulturen, die mit den Antiköφern gegen die Oberflächenrezeptoren CD23 („ CD3") und CD28 („ CD28") behandelt wurden, der
obere Teil die Ergebnisse mit den unbehandelten Kulturen als Vergleichsprobe, nach Inkubation mit den Lösungen der genannten Antiköφer AI - A4.
Die Westem-Blot Analyse bestätigt, dass die Antiköφer AI und A2 eine Reihe unterschiedlicher, an Serin bzw. Serin/Threonin phosphorylierten Proteinen, welche Proteinkinasen als Substrate dienen, erkennen und daran binden. Dieses ist an der Vielzahl der Banden im Westem-Blot zu erkennen. Die Antiköφer A3 und A4 erkennen und binden die gleiche Art von Verbinduung, nämlich die p44/42 MAP- Kinase (auch Erk2 genannt), wobei jedoch Antiköφer A3 nur dessen phosphorylierte „aktive" Form (pErk2) erkennt, während Antiköφer A4 beide Formen (die nicht phosphorylierte Form Erk2 und die phosphorylierte Form pErk2) erkennt und daran bindet. Daher wird erwartet, dass sich nach Zugabe von A3 zu der behandelten Probe eine stärker ausgeprägte Bande ergeben sollte als nach Zugabe von A3 zur unbehandelten Probe (sofern diese überhaupt in einer nachweisbaren Menge pErk2 enthält). Tatsächlich ist für die unbehandelte Probe keine solche Bande im Westem- Blot zu erkennen. Für die behandelte Probe sollte sich in beiden Fällen jeweils eine einzelne Bande ergeben. Diese Erwartungen finden sich in den in Figur 2A dargestellten Ergebnissen vollständig bestätigt.
Figur 2B zeigt die Ergebnisse, welche mit dem erfindungsgemässen Verfahren mit der erfindungsgemässen analytischen Plattform erzielt wurden. Das Balkendiagramm zeigt jeweils im Vergleich die Ergebnisse der mit den Antiköφern gegen die Oberflächenrezeptoren CD23 („αCD3") und CD28 („αCD28") behandelten Zellkultur (ausgefüllte Balken) und der unbehandelten Kultur („Negativ-Kontrolle", leere Balken), welche daraus gewonnenen „natur-identischen" Proben nach Aufbringung in jeweils 6 gleichartigen Arrays von Messbereichen auf einer oben beschriebenen Evaneszentfeld-Sensoφlattform mit den Lösungen der verschiedenen Antiköφer AI - A4 zusammengebracht worden sind. Dabei wurden auf jeweils 4 gleichartige Arrays, die in unterschiedlichen Probenbehältnissen auf einer gemeinsamen Evaneszentfeld-Sensoφlattform angeordnet waren, jeweils unterschiedliche, jeweils einen der 4 genannten Antiköφer AI - A4 enthaltene Lösungen aufgebracht und anschliessend, wie unter 2.1. beschrieben, Cy5-markierte anti-Kaninchen-Antiköφer zugeführt. In Figur 2B sind jeweils die Mittelwerte der
nach dem vorangehend beschriebenen Verfahren referenzierten Signalintensitäten von jeweils fünf gleichartigen Messbereichen innerhalb eines Arrays und deren Standardabweichungen dargestellt.
Dabei korrelieren die ermittelten Signalintensitäten mit der Konzentration eines jeweilig auftretenden bestimmten Änalyten (hohe Signalintensität entsprechend hoher Konzentration). Es ist deutlich zu erkennen, dass durch Behandlung der Jurkat- Zellkulturen mit den Antiköφern gegen die Oberflächenrezeptoren CD23 („αCD3") und CD28 („αCD28") („Stimulation") die relative intrazelluläre Konzentration an Phospho-(Ser) PKC- und Phospho-(Ser/Thr) Akt Substraten um den Faktor 2.5 bzw. 1.8 im Vergleich zur Negativ-Kontrolle erhöht wurde. Noch stärker, nämlich um den Faktor 10, stieg die Konzentration an pErk2, wobei die Summe des Gehaltes an Erk2 und pErk2 /detektiert mithilfe von Antiköφer A4) innerhalb der Messgenauigkeit konstant blieb. Dieses bedeutet, dass innerhalb der Stimulationsdauer von 10 Minuten der Gesamtgehalt an Erk2 nicht durch Anstieg der Expression erhöht wurde, sondern nur der Gehalt an pErk2 durch Phosphorylierung gesteigert wurde. Die Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit der als Vergleichsmethode durchgeführten Westem-Blot Analyse (Fig. 2A), wobei hier allerdings der Anstieg des Anteils von Phospho-(Ser/Thr) Akt Substraten nur schwach oder gar nicht zu erkennen ist und eine quantitative Aussage über relative Konzentrationen oder über deren Änderungen, im Gegensatz zu den Ergebnissen des erfindungsgemässen Verfahrens, generell nicht gemacht werden kann.
Um die Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens für den Nachweis eines einzelnen interessierenden „Markeφroteins" in einer in einem Messbereich aufgebrachten „natur-identischen" Probe, d.h. in dem in einem einzelnen Messbereich immobilisierten Proteom, zu prüfen, wird ein unbehandeltes Zell-Lysat (Negativ- Kontrolle), welches gemäss dem zuvor durchgeführtem Versuch (dessen Ergebnisse in Figur 2B dargestellt sind) nachweislich nur einen sehr geringen Gehalt an pErk2 (drittes Balkenpaar in Figur 2B) enthielt, für einen zweiten Versuch in einzelne Teillösungen aufgeteilt, welche mit diesem „Markeφrotein" in unterschiedlichen Konzentrationen von (0-3645 ng/ml) versetzt werden. Anschliessend werden diese
Lösungen, wie zuvor beschrieben, auf dem planaren Wellenleiterchip immobilisiert und ein Assay gemäss 2.1 (unter Verwendung von Antiköφer A3) durchgeführt. Figur 3A zeigt eine typische Signalverteilung aus einem Array von Messbereichen, wobei die markierten Rechtecke jeweils 5 Replikatspots einer zu dem unbehandelten Zell-Lysat hinzugegebenen pErk2-Konzentration darstellen (1-8: aufsteigende Konzentration, gemäss der in Figur 1 dargestellten geometrischen Anordnung).
Das Ergebnis dieser Messung für die Detektion von pErk2, in Abhängigkeit von dessen hinzugegebener Konzentration, kann durch eine typische Bindungskurve beschrieben werden, indem an den Konzentrationsverlauf der Signale eine Hill- Funktion angepasst („gefittet") wird (Fig. 3B). Jeder Datenpunkt in Figur 3B stellt den Mittelwert der referenzierten Nettosignalintensitäten von 5 Replikat-Analytspots, jeweils mit der durch Fehlerbalken markierten zugehörigen Standardabweichung, dar. Der vergrösserte Bildausschnitt in Figur 3B zeigt den Konzentrationsverlauf der Signale für die niedrigeren Konzentrationen, dessen Anstieg in der Darstellung für den gesamten Konzentrationsverlauf nicht mehr aufgelöst werden kann. Als Empfindlichkeit des Assays (Limit of Detection) wird, basierend auf der Summe des Signals des O-Wertes („Blank", ohne hinzugefügtes p-Erk2) und dessen zweifacher Standardabweichung, ein Wert von 2.0 ng/ml bestimmt, was einer Gewichtsfraktion von 2x10" g pro g Totalprotein entspricht.
Die Figuren 4A und 4B zeigen die Ergebnisse eines zu dem zweiten im wesentlichen analogen dritten Versuchs. Als Unterschied zum vorangehend beschriebenen zweiten Versuch mit den in Figur 3 A und 3 B dargestellten Ergebnissen wird in diesem dritten Versuch das Assay gemäss 2.1 unter Verwendung des Antiköφers A4 (d.h. unter Zugabe zu gleichartigen Arrays wie im zweiten Versuch) durchgeführt. In diesem Versuch wird also die Gesamtheit von phosphorylierter und nicht phosphorylierter Verbindung (pErk2 und Erk2), entsprechend der unterschiedlichen Zugabe von pErk2, bestimmt. Figur 4A zeigt eine typische Signalverteilung aus einem Array von Messbereichen, wobei die markierten Rechtecke wiederum jeweils 5 Replikatspots einer zu dem unbehandelten Zell-Lysat hinzugegebenen pErk2-Konzentration darstellen (1-8: aufsteigende Konzentration, gemäss der in Figur 1 dargestellten geometrischen Anordnung). In diesem Fall wird für die Emfindlichkeit des Assays
(Limit of Detection) ein Wert von 120 ng/ml bestimmt, was einer Gewichtsfraktion von 1.2xl0"4 g pro g Totalprotein entspricht.
In einem weiteren, vierten Experiment wird untersucht, ob sich auch unterschiedliche Änderungen der Konzentration an pErk2 infolge Co-Stimulation von Jurkat-Zellen mit CD3/ CD28, mit unterschiedlicher Stimulationsdauer nachweisen lassen und ob die Unterschiede dieser Änderungen mit dem erfindungsgemässen Verfahren aufgelöst werden können.. Dazu werden Jurkat-Zellkulturen vor ihrer Lyse jeweils unterschiedlich lange (im Minutenbereich) mit je 1 μg/ml αCD3/ccCD28 inkubiert. Weiterhin wird eine Jurkat Zeil-Kultur mit Staurosporin (Proteinkinase-Inhibitor) behandelt. Letzere Zellkultur dient als eine Negativkontrolle, da hier aufgrund der Inhibition aller Proteinkinasen kein pErk2 vorhanden sein sollte (siehe auch Abschnitt 1.2), ein hierfür gemessenes Signal also dem Signal einer von pErk2 freien Probe entsprechen sollte. Anschliessend werden die so behandelten Zell-Lysate auf die Evaneszentfeld-Sensor-Plattform gespottet und ein Assay gemäss 2.1, unter Benutzung des Antiköφers A3 zum Nachweis der Änderungen der Konzentrationen von pErk2, durchgeführt.
Das Ergebnis dieser Messung ist in Fig. 5 A dargestellt. Jeder der im Graph gezeigten Balken stellt den referenzierten Mittelwert der Nettosignalintenstät von 5 Replikat- Analytspots mit der dazugehörigen Standardabweichung dar. Es ist gut zu erkennen, dass sich die Änderung der pErk2-Konzentration, detektiert mit dem Antiköφer 3, sehr gut auflösen lässt, wobei die Zeitabhängigkeit, d.h. die Abhängigkeit von der Stimulationsdauer, durch einen schnellen Anstieg der pErk2-Konzentration gekennzeichnet ist, gefolgt von einem Abfall auf das Niveau der Anfangskonzentration nach einer Stimulationsdauer von 60 Minuten, wobei das Konzentrationsmaximum nach etwa 10 Minuten erreicht wird. Das Signal der nicht stimulierten Kontrollprobe liegt geringfügig höher als als dasjenige der mit Staurosporin behandelten Probe, was den natürlichen Anteil von pErk2 ohne Stimulation repräsentiert.
Als Kontrollmessung werden ein ansonsten gleichartiges Assay und Nachweisverfahren durchgeführt, wobei anstelle des Antiköφers 3 der Antiköφer 4
zum Nachweis der Gesamtheit der entsprechenden phosphorylierten und nicht phosphorylierten Proteinform, also des relativen Gesamtgehalts an Erk2/pErk2 eingesetzt wird. Hierbei wird innerhalb der experimentellen Genauigkeit kein signifikanter Unterschied der Signale, d.h. keine Konzentrationsänderung für die unterschiedlichen Stimulationsdauern, von bis zu 60 Minuten, und auch kein Unterschied zur unbehandelten Kontrollprobe und zur mit Staurosporin behandelten Probe festgestellt (Fig. 5B).