DE69637315T2

DE69637315T2 - Verfahren zur parallelen bestimmung mehrerer analyten mittels evaneszent angeregter lumineszenz

Info

Publication number: DE69637315T2
Application number: DE69637315T
Authority: DE
Inventors: Dieter NEUSCHÄFER; Gert Ludwig Duveneck; Michael Pawlak; Uwe Pieles; Wolfgang Budach
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1995-05-12
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2016-05-03
Also published as: JP2005338098A; WO1996035940A1; EP0824684B1; EP1890130A2; EP1890130A3; ATE377751T1; DE69637315D1; ZA963731B; TW302435B; PL323257A1; MX9708698A; EP0824684A1; US6289144B1; BR9608503A; AU5763296A; US6078705A; JPH11505610A; CA2219769A1; IL118217A0; KR19990014709A

Description

Die Erfindung betrifft eine Sensorplattform auf der Basis von mindestens zwei planaren, getrennten, anorganischen dielektrischen wellenleitenden Bereichen auf einem gemeinsamen Trägermaterial sowie ein Verfahren zur parallelen evaneszenten Anregung und Detektion der Lumineszenz gleicher oder unterschiedlicher Analyten. Die Erfindung betrifft auch eine modifizierte Sensorplattform, welche aus der Sensorplattform mit den planaren, getrennten, anorganischen dielektrischen wellenleitenden Bereichen und einer oder mehreren darauf immobilisierten organischen Phasen besteht. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Sensorplattform oder der modifizierten Sensorplattform in einem Lumineszenzdetektionsverfahren für die quantitative Affinitätssensorik sowie zur selektiven quantitativen Bestimmung lumineszierender Bestandteile in optisch trüben Lösungen.
Koppelt man eine Lichtwelle in einen planaren Wellenleiter, der von optisch dünneren Medien umgeben ist, so wird sie durch Totalreflektion an den Grenzflächen der wellenleitenden Schicht geführt. Ein planarer Wellenleiter besteht im einfachsten Fall aus einem Dreischichtsystem: Trägermaterial, wellenleitende Schicht, Superstrat ( bzw. zu untersuchende Probe), wobei die wellenleitende Schicht den höchsten Brechungsindex besitzt. Zusätzliche Zwischenschichten können die Wirkung des planaren Wellenleiters noch verbessern.
In die optisch dünneren Medien tritt dabei ein Bruchteil der elektromagnetischen Energie ein. Diesen Anteil bezeichnet man als evaneszentes (= abnehmendes) Feld. Die Stärke des evaneszenten Feldes ist sehr stark abhängig von der Dicke der wellenleitenden Schicht selbst sowie vom Verhältnis der Brechungsindices der wellenleitenden Schicht und der sie umgebenden Medien. Bei dünnen Wellenleitern, d. h. Schichtdicken von derselben oder niedrigerer Dicke als der zu führenden Wellenlänge, können diskrete Moden des geleiteten Lichts unterschieden werden.
Mit einem evaneszenten Feld ist es zum Beispiel möglich, Lumineszenz in optisch dünneren Medien anzuregen, und zwar nur in unmittelbarer Umgebung zum wellenleitenden Bereich. Dieses Prinzip wird evaneszente Lumineszenzanregung genannt.
Für die Analytik ist die evaneszente Lumineszenzanregung von grossem Interesse, da die Anregung auf die direkte Umgebung der wellenleitenden Schicht beschränkt ist. Verfahren und Apparate zur Bestimmung der evaneszent angeregten Lumineszenz von mit Lumineszenzfarbstoffen markierten Antikörpern oder Antigenen sind bekannt und zum Beispiel in der US-A-4 582 809 beschrieben. Die dort beanspruchte Anordnung verwendet eine Faseroptik zur evaneszenten Lumineszenzanregung. Solche Faseroptiken haben typischerweise einen Durchmesser von bis zu einem Millimeter und leiten eine Vielzahl von Moden, wenn Laser licht in sie eingekoppelt wird. Die evaneszent angeregte Lumineszenz kann in einfacher Weise nur durch den in die Faser rückgekoppelten Anteil gemessen werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass der apparative Aufbau relativ gross ist und vergleichsweise grosse Probenvolumina benötigt werden. Die Anordnung lässt sich kaum wesentlich weiter verkleinern oder gar zu integrierten optischen Sensoren miniaturisieren. Eine Erhöhung der Empfindlichkeit ist im allgemeinen mit einer Vergrösserung der Anordnung verbunden.
Photometrische Instrumente zur Bestimmung der Lumineszenz von Biosensoren unter evaneszenten Anregungsbedingungen mit planaren optischen Wellenleitern sind ebenfalls bekannt und zum Beispiel in der WO 90/06503 beschrieben. Die dort verwendeten wellenleitenden Schichten sind 160 nm bis 1000 nm dick; die Einkopplung der Anregungswelle erfolgt ohne Gitterkoppler.
Es sind verschiedene Versuche unternommen worden, die Empfindlichkeit evaneszent angeregter Lumineszenz zu steigern und integrierte optische Sensoren herzustellen. So wird zum Beispiel in Biosensors & Bioelectronics 6 (1991), 595–607 über planare mono- oder nieder-modale Wellenleiter berichtet, die in einem zweistufigen Ionenaustauschverfahren hergestellt werden, und bei denen die Einkopplung der Anregungswelle mit Prismen erfolgt. Als Affinitätssystem wird humanes Immunoglobulin G/fluoresceinmarkiertes Protein A verwendet, wobei der Antikörper auf dem Wellenleiter immobilisiert und das nachzuweisende fluoresceinmarkierte Protein A in Phosphatpuffer einem Film aus Polyvinylalkohol zugesetzt wird, mit dem die Messregion des Wellenleiters überzogen wird. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass nur geringe Brechungsindexunterschiede zwischen wellenleitender Schicht und Substratschicht erreichbar sind, was eine verhältnismässig geringe Empfindlichkeit zur Folge hat. Die Empfindlichkeit wird mit 20 nM fluoresceinmarkiertem Protein A angegeben. Um geringste Spuren bestimmen zu können, ist dies noch unbefriedigend und daher eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit notwendig. Darüberhinaus erscheint die Reproduzierbarkeit und praktische Durchführbarkeit der Lichteinkopplung durch Prismen aufgrund der grossen Abhängigkeit der Einkoppeleffizienz von Qualität und Grösse der Kontaktfläche zwischen Prisma und Wellenleiter schwierig.
In der US-A-5 081 012 wird ein anderes Prinzip vorgeschlagen. Die planare wellenleitende Schicht ist 200 nm bis 1000 nm dick und enthält zwei Gitter, von denen eines als Reflexionsgitter ausgebildet ist, so dass die eingekoppelte Lichtwelle den zwischen den Gittern liegenden Sensorbereich mindestens zweimal durchlaufen muss. Auf diese Weise soll eine erhöhte Empfindlichkeit erreicht werden. Ein Nachteil ist, dass die reflektierte Strahlung zu einer unerwünschten Erhöhung der Untergrund-Strahlungsintensität führen kann.
In der WO/9110122 wird ein dünnschichtiger spektroskopischer Sensor beschrieben, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein Einkoppelgitter und ein räumlich entferntes Auskoppelgitter aufweist. Er eignet sich insbesondere zur Absorptionsmessung, wenn als wellenleitende Schicht ein hochbrechendes anorganisches Metalloxid verwendet wird. Es werden verschiedene Ausführungsformen beschrieben, welche zum Ein- und Auskoppeln von multichromatischen Lichtquellen geeignet sind. Die bevorzugte Dicke der wellenleitenden Schicht ist grösser als 200 nm und die Gittertiefe soll ca. 100 nm betragen. Diese Bedingungen sind für Lumineszenzmessungen in der Affinitätssensorik nicht geeignet, da nur eine geringe Empfindlichkeit erhalten wird. Dies wird in Appl. Optics Vol. 29, No. 31, (1990), 4583–4589 durch die Angaben der Gesamteffizienz bei 633 nm von 0,3% und bei 514 nm von 0,01% für diese Systeme bestätigt.
In einer anderen Ausführungsform desselben Sensors werden mehrere polymere planare wellenleitende Schichten auf einem Substrat aufgebracht, die als Gasgemischanalysator verwendet werden können. Man macht sich dabei die Änderung des effektiven Brechungsindex oder die Schichtdickenänderung des polymeren Wellenleiters beim Kontakt mit z. B. Lösungsmitteldämpfen zunutze. Die wellenleitende Struktur wird dabei physikalisch verändert. Derartige Änderungen sind jedoch für Lumineszenzmessungen in der Affinitätssensorik vollständig ungeeignet, da sich dadurch die Einkopplung ändert, zunehmende Streuung auftritt und die Empfindlichkeit deutlich abnehmen kann.
Die Herstellung planarer Wellenleiter ist ein Vorgang, bei dem es sehr wesentlich auf die Planarität des Trägermaterials, die konstante Dicke und Homogenität der wellenleitenden Schicht und den Brechungsindex des dafür verwendeten Materials ankommt. Dies ist zum Beispiel in der EP-A-0 533 074 beschrieben, und es wird dort vorgeschlagen, anorganische Wellenleiter auf Kunststoffträgermaterialien aufzubringen. Dies bietet den Vorteil, dass zum Beispiel eine wirtschaftlich günstige Strukturierung des Gitterkopplers durch Einprägen der Struktur in den Kunststoff durchgeführt werden kann. Andererseits werden aber auch hohe Anforderungen an die optische Qualität der Kunststoffträgermaterialien gestellt.
Planare Wellenleiter bieten gegenüber Wellenleitern, die auf Faseroptiken basieren, wesentliche Vorteile in der grosstechnischen Herstellung. Insbesondere ist es in der Regel erforderlich, bei Fasern die geschnittenen Enden nachzupolieren, damit eine einwandfreie optische Qualität erzielt wird. Planare Wellenleiter hingegen können grossflächig hergestellt und danach in der gewünschten Grösse ausgestanzt, gebrochen oder geschnitten werden. Ein Nacharbeiten der Kanten erübrigt sich in den meisten Fällen, wodurch die Massenherstellung wirtschaftlicher wird.
Weitere Vorteile von planaren Wellenleitern mit Gitterkopplern sind die einfache Justierung im Messgerät oder in der Messanordnung sowie das einfache Aufbringen einer Beschichtung, beispielsweise zur Immobilisierung eines Analyten. Hierfür können Standardverfahren aus der Beschichtungstechnologie, mit denen sich reproduzierbare, konstante Schichtdicken herstellen lassen, verwendet werden. Beispiele sind Sprühen, Rakeln, Schleuderbeschichten oder Tauchen. Die Qualitätskontrolle lässt sich ebenfalls mit bekannten und sehr präzisen Methoden einfach durchführen. Geeignet sind beispielsweise mikroskopische oder interferometrische Methoden, Ellipsometrie oder Kontaktwinkelmessungen. Diese Verfahren sind für gekrümmte Oberflächen, wie sie bei Wellenleitern, die auf Faseroptiken basieren, nicht oder nur schwierig einsetzbar.
Neben der eigentlichen wellenleitenden Schicht stellt die Art der Einkopplung der Lichtwelle in die wellenleitende Schicht ein Hauptproblem dar. Die Anforderungen an Gitter zur Einkopplung von Licht in sich verjüngende Wellenleiter für integrierte optische Sensoren werden zum Beispiel in Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors V, Proc. SPIE, Vol. 2068, 313–325, 1994 dargestellt. Dabei werden die Modulationstiefe des Gitters und die Schichtdicke des Wellenleiters als kritische Merkmale beschrieben. Die dort vorgeschlagenen Systeme können zum Beispiel als integrierte optische Lichtzeiger Verwendung finden, wobei jedoch keine Hinweise auf eine zu detektierende Lumineszenz gegeben werden.
Sollen derartige planare Wellenleiter mit integrierten Gitterkopplern für Lumineszenzmessungen verwendet werden, so sind die wesentlichen Merkmale für ihre Brauchbarkeit und zur Erreichung einer hohen Empfindlichkeit eine ausreichend grosse Einkoppeleffizienz, ein möglichst starkes evaneszentes Feld und eine geringe Dämpfung der geführten Welle. Diese Merkmale werden kritisch bestimmt durch die Kombination von Brechungsindex der wellenleitenden Schicht und des Trägermaterials und eventuell vorhandener Zwischenschichten, Schichtdicke des Wellenleiters, Struktur, Modulationstiefe und Gitterperiode des Gitterkopplers. Hinzu kommt die erforderliche optische Qualität der Flächen, deren Planarität beziehungsweise Rauhigkeit.
Ein Nachteil aller im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Detektion evaneszent angeregter Lumineszenz liegt darin, dass auf der als homogener Film ausgebildeten Sensorplattform jeweils nur eine Probe analysiert werden kann. Um weitere Messungen auf derselben Sensorplattform durchführen zu können, sind aufwendige Wasch- bzw. Reinigungs schritte notwendig. Dies gilt insbesonders, wenn ein von der ersten Messung verschiedener Analyt detektiert werden soll. Im Falle eines Immunoassays bedeutet dies im allgemeinen, dass die gesamte immobilisierte Schicht auf der Sensorplattform ausgetauscht oder gleich eine neue Sensorplattform verwendet werden muss.
Es besteht daher das Bedürfnis ein Verfahren zu entwickeln, welches es erlaubt, parallel, das heisst gleichzeitig oder direkt hintereinander ohne zusätzliche Reinigungsschritte, mehrere Proben zu analysieren.
In der WO 95/03538 wird zum Beispiel vorgeschlagen, über einer durchgehenden wellenleitenden Schicht mehrere Probenzellen anzubringen, die in Form von Vertiefungen in einer Probenplatte über der wellenleitenden Schicht ausgebildet sind. Unter jeder Probenzelle befindet sich ein Gitter, welches einen Teil des in der wellenleitenden Schicht geführten Lichtes auskoppelt. Der Nachweis des Analyten beruht auf der Änderung des Auskoppelwinkels in Abhängigkeit von der Analytkonzentration. Diese auf der Änderung des Brechungsindex basierenden Verfahren sind in der Regel deutlich weniger empfindlich als Lumineszenzverfahren.
In der WO 94/27137 wird beispielsweise eine Vorrichtung und ein Verfahren für die Durchführung von Immunoassays mittels evaneszent angeregter Fluoreszenz vorgeschlagen. Die Vorrichtung besteht aus einem durchgehenden optischen Wellenleiter mit zwei planparallelen Oberflächen und einer Seitenkante, die in Verbindung mit einer Linse als Einkoppelelement wirkt. Auf mindestens einer Oberfläche sind eine Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern immobilisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese spezifischen Bindungspartner räumlich getrennt auf dem durchgehenden Wellenleiter angeordnet. Im Ausführungsbeispiel sind sie fleckenartig über die Wellenleiteroberfläche verteilt.
Anhand der offenbarten Ausführungsformen muss davon ausgegangen werden, dass die Einkoppeleffizienz über die Seitenkante niedriger ist als im Falle einer Gittereinkopplung, weiterhin ist wegen der grossen Schichtdicke (selbsttragender Wellenleiter) die evaneszente Feldstärke und damit auch die Anregungseffizienz wesentlich niedriger als bei monomodalen Wellenleitern niedrigerer Schichtdicke. Insgesamt wird die Empfindlichkeit der Anordnung dadurch limitiert.
Diese Anordnungen, bei denen verschiedene spezifische Bindungspartner auf einer durchgehenden wellenleitenden Schicht aufgebracht sind, weisen auch den Nachteil auf, dass das Anregungslicht die Gesamtheit der fluorophormarkierten Moleküle anregt. Eine räumlich Auswahl von Messstellen ist so nicht möglich. Darüberhinaus können evaneszent rückge koppelte Fluoreszenzphotonen zum Signal des Nachbarflecks beitragen und so zu Messfehlern führen.
In der integrierten Optik für Anwendungen in der Telekommunikation sind planare optische Bauelemente auf Glasbasis bekannt, die Wellenleiter in Kanalform enthalten, deren wellenleitende Kanäle durch Austausch einzelner Ionen an der Oberfläche unter Zuhilfenahme von Masken hergestellt werden (Glastechnische Berichte Vol. 62, Seite 285, 1989). Es resultiert eine physikalisch durchgängige Schicht, die in den mit Ionen dotierten Kanälen einen geringfügig erhöhten Brechungsindex aufweist. Die Erhöhung liegt in der Regel unter 5%. Die Herstellung derartiger Bauelemente ist aufwendig und teuer.
R. E. Kunz beschreibt in SPIE Vol 1587 Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors III (1991), Seiten 98–113 sich verzweigende und wieder zusammengeführte optische Wellenleiter, die vor allem für integrierte optische Geräte wie zum Beispiel Interferometer geeignet sind. Derartige Strukturen sind für die evaneszent angeregte Lumineszenzmessung ungeeignet, da man die Elemente nicht einzeln ansprechen kann, und durch die Anordnung mehrerer Verzweigungen hintereinander rasch hohe Intensitätsverluste der am ersten Zweig eingekoppelten Lichtwelle entstehen. Da der Öffnungswinkel solcher Verzweigungen klein ist, typisch sind 3°, sind die Abstände zwischen den zwei Ästen der Verzweigung bei kleinen Bauteilen gering oder die Bauteile müssen entsprechend grösser dimensioniert werden, was im allgemeinen unerwünscht ist. Darüberhinaus ist die feste Phasenbeziehung der verzweigten Wellen untereinander für Lumineszenzmessungen unnötig.
In WO 92/19976 wird ebenfalls von R. Kunz eine Anordnung mehrerer integrierter Messstreifen zur Erfassung eines komplexen Signals vorgeschlagen, insbesondere kann es sich dabei um die Erfassung eines Dufts mittels künstlicher Nase handeln.
Die Verwendung von im wesentlichen monomodalen, planaren anorganischen Wellenleitern für Lumineszenzdetektionsverfahren wird im Stand der Technik nur generisch erwähnt, ohne dass die spezifischen Erfordernisse, die mit der Lumineszenzanregung und Detektion verbunden sind, beschrieben werden. Insbesondere findet sich kein Hinweis, in welchen Bereichen von Schichtdicken und Modulationstiefen gute oder sehr gute Ergebnisse erhalten werden können.
Es wurde nun gefunden, dass sich auf einfache Art eine Sensorplattform auf der Basis von mindestens zwei planaren, getrennten, anorganischen, dielektrischen wellenleitenden Bereichen auf einem gemeinsamen Trägermaterial herstellen lässt, welche zur parallelen evanes zenten Anregung und Detektion der Lumineszenz gleicher oder unterschiedlicher Analyten geeignet ist. Diese getrennten wellenleitenden Bereiche können je ein oder mehrere Koppelgitter enthalten.
Ein wesentlicher Vorteil dieser Sensorplattform besteht darin, dass beispielsweise gleichzeitig mehrere Probenlösungen mit hoher Empfindlichkeit analysiert werden können. Wasch- oder Reinigungsschritte zwischen den einzelnen Messungen entfallen, so dass ein hoher Probendurchsatz pro Zeiteinheit erreicht wird. Dies ist insbesondere für Routineuntersuchungen oder im Bereich gentechnologischer Bestimmungen von grosser Bedeutung.
Neben der Untersuchung von mehreren Probenlösungen gleichzeitig kann auch eine Probenlösung auf mehrere in ihr enthaltenen Analyten gleichzeitig oder nacheinander auf einer Sensorplattform untersucht werden. Dies ist besonders vorteilhaft bei Blut- oder Serumuntersuchungen, die so besonders schnell und wirtschaftlich durchgeführt werden können.
Werden mehrere Probenlösungen gleichzeitig analysiert, verhindern die getrennten wellenleitenden Bereiche ein Übersprechen von Lumineszenzsignalen verschiedener Proben. Man erreicht mit diesem Verfahren eine hohe Selektivität und geringe Fehlerraten.
Durch die Trennung der wellenleitenden Bereiche ist es auch möglich, durch gezielten Einsatz von Lichtquellen verschiedener Wellenlänge die Selektivität und Sensitivität noch weiter zu erhöhen.
Ein weiterer Vorteil der Sensorplattform besteht darin, dass sich die einzelnen getrennten wellenleitenden Bereiche optisch, chemisch oder fluidisch selektiv adressieren lassen.
Besonders gut geeignet ist eine Sensorplattform mit planaren räumlich oder optisch getrennten wellenleitenden Bereichen, in denen nur ein oder wenige Moden geführt werden. Sie zeichnen sich durch eine besonders hohe Empfindlichkeit bei kleinstmöglicher Bauweise aus. In der Regel wird diese Empfindlichkeit von vielmodigen Wellenleitern planarer Bauart nicht erreicht.
Die Einkopplung des Anregungslichts erfolgt mit Gittern. Die Einkopplung und gegebenenfalls Auskopplung mit Gittern ist in der Regel einfacher und effizienter als bei Linsen oder Prismen, so dass die Intensität der eingekoppelten Lichtwelle ebenfalls grösser ist, was in Verbindung mit einer geringen Dämpfung der geführten Lichtwelle zu einer sehr hohen Empfindlichkeit dieser Anordnung beiträgt.
Die Empfindlichkeit kann durch ein möglichst starkes evaneszentes Feld noch weiter gesteigert werden. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, auch geringste Mengen lumineszierenden Materials an der Oberfläche der wellenleitenden Schicht zu bestimmen.
Gegenstand der Erfindung ist eine Methode gemäß Anspruch 1.
Nicht von der Erfindung umfasst sind Anordnungen von zwei wellenleitenden Bereichen, die sich zum Beispiel in Form eines Y zunächst verzweigen und danach an beiden Enden wieder miteinander verbunden werden, da sich in diesem Falle die Ausbreitungsrichtung des Wellenvektors nach der Einkopplung ändert. Solche Anordnungen sind bereits bekannt und werden zum Beispiel als Interferometer benutzt.
Bei der vorliegenden Erfindung liegt der Zweck der getrennten wellenleitenden Bereiche darin, eine Sensorplatform für die glechzeitige Detetektion evaneszent angeregter Lumineszenz von einem oder mehreren Analyten bereitzustellen.
Die Begriffe Messstrecke und Messbereich werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym benutzt.
Die geometrische Form der getrennten wellenleitenden Bereiche ist an für sich beliebig. Sie richtet sich zweckmässig nach dem Aufbau des gesamten Gerätes in dem die Sensorplattform eingebaut ist. Beispiele für geometrische Formen sind Striche, Streifen, Rechtecke, Kreise, Ellipsen, Schachbrettmuster, Rauten, Wabenmuster oder unregelmässige Mosaike. Die Trennungen zwischen den einzelnen wellenleitenden Bereichen verlaufen im wesentlichen geradlinig. An den Enden können sie beispielsweise spitz zulaufen, sie können insgesamt breiter oder schmaler als der Meßbereich sein.
Bevorzugt sind die wellenleitenden Bereiche in Form von getrennten Streifen, Rechtecken, Kreisen, Ellipsen, Schachbrettmustern angeordnet.
Besonders bevorzugt sind die wellenleitenden Bereiche in Form paralleler Streifen angeordnet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform entsteht, wenn die wellenleitenden Bereiche in Form paralleler Streifen angeordnet sind, die an einem oder an beiden Enden miteinander vebunden sind, wobei sich die Ausbreitungsrichtung des Wellenvektors nach der Einkopplung nicht ändert.
Eine andere vorteilhafte Ausführunsform ist, wenn die Streifen an einem Ende miteinander verbunden sind und das andere Ende jeweils offen ist, wobei sich die Ausbreitungsrichtung des Wellenvektors nach der Einkopplung nicht ändert.
Die 1a bis 1d und 2a bis 2d verdeutlichen einige weitere mögliche Anordnungen.
Die Bezugszeichen bedeuten:

1 die wellenleitende Schicht, die auf einem Trägermaterial aufgebracht ist;
2 die Trennstellen, die entweder durch ein absorbierendes Material auf der Oberfläche der wellenleitenden Schicht gebildet werden oder, die durch eine Erniedrigung des effektiven Brechungsindex in der Schichtebene gebildet werden, was im einfachsten Fall dadurch erreicht wird, dass keine wellenleitende Schicht sondern ein Luftspalt vorhanden ist;
3, 3' die Ein- bzw. Auskoppelgitter.

In 1a sind die wellenleitenden Bereiche (= Messbereiche) von Trennbereichen unterbrochen. Diese Trennbereiche berühren das Koppelelement nicht.
Im Falle von 1b sind Ein- und Auskoppelgitter gemeinsam für alle Messbereiche vorhanden. Es besteht kein Kontakt zu den Trennbereichen.
In 1c laufen die Trennbereiche über das Koppelelement hinaus. Die Einkopplung wird in den wellenleitenden Bereichen aber nicht davon beeinflußt.
1d enthält zwei Koppelelgitter und entspricht ansonsten 1c.
Die 2a bis 2d zeigen eine Anordnung, bei der die Koppelgitter nicht durchgängig sind, sondern jedem wellenleitenden Bereich ein individuelles Gitter zugeordnet ist.
Die räumlich oder optisch getrennten wellenleitenden Bereiche lassen sich mit bekannten Verfahren herstellen. Dabei bestehen zwei grundsätzliche Verfahrensmöglichkeiten. Beispielsweise lassen sich a) die Schichten in einem Aufdampfverfahren unter Verwendung von Masken von vornherein räumlich getrennt aufbauen oder b) man stellt eine durchgehende Schicht her und strukturiert diese anschliessend mit geeigneten Methoden.
Ein Beispiel für das Verfahren a) ist das Aufdampfen des anorganischen wellenleitenden Materials, wobei eine geeignet strukturierte Maske einen Teil der Sensorplattform abdeckt. Derartige Masken sind aus der Herstellung von integrierten Schaltkreisen bekannt. Die Masken sollen dabei in unmittelbarem Kontakt mit der Sensorplattform sein. Es können Positiv- und Negativmasken verwendet werden. Es ist auch möglich, eine Aufschlämmung des anorganischen wellenleitenden Materials über eine geeignet strukturierte Maske auf die Sensorplattform aufzubringen und die wellenleitende Schicht in der Sol-Gel Technik herzustellen.
Auf diese Weise entstehen getrennte wellenleitende Bereiche, wobei die Trennung im einfachsten Fall durch einen Luftspalt bewirkt wird. Dieser Spalt kann aber auch nachträglich mit einem anderen Material mit niedrigerem Brechungsindex als dem der wellenleitenden Schicht aufgefüllt werden. Wird die Trennung in mehrere wellenleitende Bereiche auf diese Weise durchgeführt, so beträgt die Differenz der effektiven Brechungsindices zwischen wellenleitendem Bereich und dem begrenzenden Material bevorzugt mehr als 0,2, besonders bevorzugt mehr als 0,6 Einheiten.
Ein Beispiel für das Verfahren b) ist das Aufdampfen eines anorganischen wellenleitenden Materials zu einer durchgehenden Schicht, die anschliessend durch mechanisches Kratzen, Lasermaterialbearbeitung, lithographische Verfahren oder Plasmaverfahren in einzelne wellenleitende Bereiche unterteilt wird.
Das Aufdampfen erfolgt in der Regel unter Vakuumbedingungen. Plasmaabscheidungen sind ebenfalls möglich.
Besonders zu nennen sind die Bearbeitung mittels gepulster Excimer- und Festkörperlaser oder kontinuierlicher Gaslaser. Bei gepulsten Hochenergielasern kann die Strukturierung grossflächig über eine Maske erfolgen. Bei kontinuierlich arbeitenden Lasern wird in der Regel der fokussierte Strahl über die zu strukturierende wellenleitende Schicht geführt, bzw. die wellenleitende Schicht relativ zum Strahl bewegt.
Als lithografische Verfahren kommen Ätztechniken in Frage, wie sie bei der Herstellung von Leiterplatten oder Mikroelektronikbauteilen Verwendung finden. Diese Verfahren erlauben eine ausserordentlich grosse Vielfalt geometrischer Muster und eine Feinheit der Strukturen, die im Mikrometer- oder Submikrometerbereich liegen.
Wichtig ist für alle ablativen Bearbeitungen, dass die wellenleitende Schicht ganz oder teilweise entfernt wird, die Sensorplattform jedoch nicht vollständig getrennt wird. Gegebenenfalls vorhandene Zwischenschichten können ebenfalls ganz oder teilweise entfernt werden.
In einer modifizierten Verfahrensausführung b) wird zunächst eine durchgehende Schicht eines anorganischen wellenleitenden Materials aufgebracht und auf diese Schicht wird in einem zweiten Schritt mit einem absorbierenden Material, welches die Wellenleitung unterbricht, eine Struktur so aufgebracht, dass wellenleitende Bereiche durch absorbierende und damit nicht wellenleitende Bereiche getrennt werden.
Bei den absorbierenden Materialien kann es sich um anorganische Materialien wie Metalle mit einem hohen optischen Absorptionskoeffizienten, z. B. Gold, Silber, Chrom, Nickel oder um organische Verbindungen, z. B. gefärbte und pigmentierte Polymere, handeln. Diese Materialien können als durchgehende Schichten, oder wie im Falle der Metalle, in Form von wässrigen Kolloidlösungen auf die wellenleitende Schicht aufgetragen werden. Dabei stehen verschiedene Methoden zur Auswahl.
Abscheidungsverfahren zur Strukturierung, die unter Vakuumbedingungen durchgeführt werden, sind bereits vorstehend erwähnt worden.
Kolloide Materialien in Wasser oder organischen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Gold in Wasser, können ebenfalls zur Strukturierung von wellenleitenden Bereichen verwendet werden. Das Abscheiden von kolloidalem Gold auf Oberflächen durch spontanes 'assembly' wurde zum Beispiel durch R. Griffith et al., Science 1995, 267, 1629–1632 beschrieben. So lässt sich zum Beispiel die wellenleitende Schicht mit räumlich oder fluidisch getrennten laminaren Teilstömen einer kolloidalen Goldlösung überströmen, wobei die Goldpartikel z. B. in Form von Streifen abgeschieden werden. Die Oberfläche wird getrocknet, und man erhält getrennte, wellenleitende Bereiche. Die abgeschiedenen Goldkolloide müsen eine Mindestgrösse von 10 bis 15 nm aufweisen, damit die gewünschte Absorption auftritt. Bevorzugt sind sie 15 bis 35 nm im Durchmesser.
Das Abscheiden von kolloidalem Gold kann auch durch Stempeln der Oberfläche erfolgen. Das Stempeln von gelösten organischen Materialien wird von Whitesides als sogenanntes 'Microcontact Printing' beschrieben und wurde zur Strukturierung von Goldoberflächen mit flüssigen Alkanthiolen verwendet (J. L. Wilbur et al., Adv. Mater. 1994, 6, 600–604; Y. Xia und G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3274–3275). So lässt sich zum Beispiel kolloidale Goldlösung in einem elastomeren Stempel mit gewünschtem Strukturierungsprofil aufsaugen und das Strukturierungsprofil durch Auflegen des Stempels auf die wellenleitende Oberfläche übertragen.
Verfahren, die mit organischen Lösungsmitteln oder Wasser arbeiten, sind sehr flexibel und schnell einsetzbar. Sie erlauben eine Wellenleiterstrukturierung unmittelbar vor der Durchführung eines Lumineszenzassays.
Gegebenenfalls muss die Oberfläche der wellenleitenden Schicht vor einer kolloidalen Abscheidung von zum Beispiel Gold so modifiziert werden, dass eine gute Haftung zwischen Kolloidteilchen und modifitzierter Oberfläche resultiert. Die Haftung kann durch hydrophobe Wechselwirkung, van der Waals Kräfte, Dipol-Dipol-Wechselwirkung, einfache elektrostatische Wechselwirkung oder kovalente Bindung erreicht werden. Die Wechselwirkung kann durch Funktionalisierung der Kolloide und/oder der Oberfläche der wellenleitenden Schicht hergestellt werden.
Eine geeignete Methode zur Modifizierung der Oberfläche und zur Erzielung der Haftung ist zum Beispiel die Silanisierung wie dies in Advances in Colloid and Interface Science 6, L. Boksányi, O. Liardon and E. Kováts, (1976) 95–137 beschrieben ist. Derartige Silanisierungen werden auch zur Verbesserung der Haftung der Erkennungselemente bei der Affinitätssensorik eingesetzt. Insbesondere ist mercaptoterminiertes Silan, wie zum Beispiel (Mercaptomethyl)dimethylethoxysilan, für die Haftung von Gold durch Ausbildung einer kovalenten Schwefel-Gold-Bindung geeignet.
Eine andere Modifikation des Verfahrens b) besteht darin, dass man auf die durchgehende Schicht eines anorganischen wellenleitenden Materials in einem zweiten Schritt dasselbe anorganische Material in Form einer Struktur aufbringt, so dass durch eine Erhöhung der Schichtdicke eine Erhöhung des effektiven Brechungsindexes erzielt wird und damit die Ausbreitung des Lichtwellenmodes auf diese dadurch entsandenen Messbereiche konzentriert wird. Derartige 'slab waveguides' und Verfahren zu ihrer Herstellung sind von H. P. Zappe in 'Introduction to Semiconductor Integrated Optics', Artech House Inc., 1995 beschrieben worden.
Die Streifenbreite der wellenleitenden Schichten beträgt bevorzugt 5 Mikrometer bis 5 Millimeter, besonders bevorzugt 50 Mikrometer bis 1 Millimeter.
Wird die Breite der wellenleitenden Bereiche zu sehr reduziert, wird auch die zur Verfügung stehende Sensorfläche reduziert. Zweckmässig werden Streifenbreite und notwendige Sensorfläche aufeinander angepasst.
Die Grösse und Breite der einzelnen wellenleitenden Bereiche kann in breitem Rahmen variiert werden und hängt im wesentlichen vom Verwendungszweck und dem Aufbau des Gesamtsystems ab.
Die einzelnen wellenleitenden Bereiche, wenn sie als Streifen ausgebildet sind, weisen bevorzugt eine Länge von 0,5 bis 50 mm auf, besonders bevorzugt von 1 bis 20 mm und ganz besonders bevorzugt von 2 bis 10 mm.
Bevorzugt beträgt die Streifenzahl auf der Sensorplattform 2 bis 1000, besonders bevorzugt 2 bis 100.
Die einzelnen wellenleitenden Bereiche können zum Beispiel als Streifen auf dem Trägermaterial zu zwei oder mehr Gruppen mit jeweils mindestens zwei Streifen angeordnet sein und so je einen Mehrfachnachweis-Bereich bilden.
Der grosse praktische Vorteil solcher zusammengesetzten Mehrfachnachweis-Bereiche besteht darin, dass zwischen aufeinanderfolgenden Multianalytmessungen die Sensorplattform nicht gereinigt oder ausgetauscht werden muss, sondern nur relativ zu Anregungs-, Fluidik- und Detektionseinheit verschoben werden muss.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass sich derartige Mehrfachnachweis-Bereiche ökonomisch günstiger herstellen lassen. Ein ganz wesentlicher Vorteil besteht darin, dass die sehr zeit- und kostenintensive Vereinzelung in getrennte Sensorplattformen entfällt.
Bevorzugt besteht jeder Mehrfachnachweis-Bereich aus 2 bis 50, besonders bevorzugt aus 2 bis 20 getrennten wellenleitenden Bereichen.
Bevorzugt befinden sich auf der Sensorplattform 2 bis 100, besonders bevorzugt 5 bis 50 Mehrfachnachweis-Bereiche.
Die 3a und 3b zeigen eine mögliche Anordnung einer Sensorplattform mit mehreren Mehrfachnachweis-Bereichen, bei der das Trägermaterial die Form einer Scheibe hat und deren Herstellung mittels Spritzguss (press molding) in ähnlicher Weise wie für gängige Compact Disks erfolgen kann. Die gesamte Anordnung kann aus einer scheibenförmigen Sensorplattform mit mehreren Mehrfachnachweis-Bereichen und einer Fluidikscheibe bestehen, welche die Fluidikzuführungen und die eigentlichen Zellvolumina enthält. Beide Teile werden zusammengefügt, z. B. verklebt, und bilden eine Einheit. Die Zellvolumina in Form von Vertiefungen können aber auch auf der scheibenförmigen Sensorplattform vorgebildet sein. Eine derartige Ausführungsform wird dann von einem planaren Deckel abgeschlossen.
Die Bezugszeichen 1 bis 3 haben die vorstehend angegebenen Bedeutungen, 4 bezeichnet einen gesamten Mehrfachnachweis-Bereich, 5 bedeutet das Trägermaterial und 6 stellt eine zentrische Aussparung dar, die eine Achse aufnehmen kann, so dass die einzelnen Mehrfachnachweis-Bereiche 4 unter einer Anregungs- und Nachweisoptik durchgedreht werden können. 7 und 7' bedeuten Ein- und Auslassöffnungen für die im Verlauf des Assays notwendigen Lösungen, die in der Regel über eine Durchflusszelle mit mindestens zwei Öffnungen mit den auf den wellenleitenden Bereichen immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.
Die Mehrfachnachweis-Bereiche können auch auf konzentrischen Kreisen angeordnet sein. Die Abstände zwischen den einzelnen Mehrfachnachweis-Bereichen können zum Beispiel so sein, dass eine Drehung um einen Winkel zwischen 5 bis 20 Grad einen neuen Mehrfachnachweis-Bereich unter die Anregungs- und Nachweisoptik führt.
4a und b zeigen einen analogen Aufbau der Sensorplattform auf einer Scheibe, mit dem Unterschied, dass die einzelnen Mehrfachnachweis-Bereiche 4 gegenüber 3 radial anstatt tangential angeordnet sind, was zu einer verbesserten Flächennutzung führt.
Eine weitere Anordnung ist in den 5a und 5b dargestellt. Die einzelnen Mehrfachnachweis-Bereiche 4 sind in Form eines rechteckförmigen Schachbrettmusters angeordnet. Die Mehrfachnachweis-Bereiche können aber auch wie einzelne Bilder auf einem Filmstreifen angeordnet sein. Dieser Filmstreifen kann als planares Element vorliegen oder aufgerollt sein.
Die einzelnen Mehrfachnachweis-Bereiche können unter einer Anregungs- und Nachweisoptik in analoger Weise zu einem Film transportiert werden.
Die für die getrennten wellenleitenden Bereiche angegebenen Bevorzugungen gelten auch für die Mehrfachnachweis-Bereiche.
Eine Sensorplattform bedeutet ein selbsttragendes Element, welches in Form eines Streifens, einer Platte, einer runden Scheibe oder einer beliebigen anderen geometrischen Form ausgebildet sein kann. Sie ist im wesentlichen planar. Die gewählte geometrische Form ist an und für sich unkritisch und kann sich nach dem Aufbau des gesamten Gerätes richten, in dem die Sensorplattform eingebaut ist. Sie kann auch als selbständiges Element, räumlich separiert von einer Anregungslichtquelle und vom optoelektronischen Nachweissystem, eingesetzt werden. Bevorzugt sind Anordnungen, die eine weitgehende Miniaturisierung zulassen.
Als Trägermaterial kommen zum Beispiel Gläser aller Art oder Quarz in Frage. Vorzugsweise werden Gläser verwendet, die einen möglichst niedrigen optischen Brechungsindex und möglichst geringe Eigenlumineszenz aufweisen, und die eine möglichst einfache optische Bearbeitung, wie Ätzen, Schleifen und Polieren zulassen. Bevorzugt ist das Trägermaterial mindestens bei der Anregungs- und Emissionswellenlänge transparent. Die mikroskopische Rauhigkeit des Trägermaterials soll möglichst niedrig sein. Als Trägermaterialien können auch transparente thermoplastische Kunststoffe verwendet werden, wie sie zum Beispiel in der EP-A-0 533 074 beschrieben sind. Die Trägermaterialien können noch mit einer dünnen Schicht überzogen sein, die einen Brechungsindex kleiner oder gleich dem Trägermaterial aufweist und die nicht dicker als 0,01 mm ist. Diese Schicht kann zur Verhinderung störender Fluoreszenzanregung im Trägermaterial und auch zur Verminderung der Oberflächenrauhigkeit des Trägermaterials dienen und kann aus einem thermoplastischen, einem thermisch vernetzbaren oder einem strukturvernetzten Kunststoff oder auch aus anorganischen Materialien wie SiO₂ bestehen Bei Vorhandensein einer Zwischenschicht, deren Brechungsindex niedriger als derjenige der wellenleitenden Schicht ist und deren Schichtdicke die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes deutlich übersteigt (d. h. i. a. >> 100 nm), reicht es aus, wenn nur diese Zwischenschicht bei Anregungs- und Emissionswellenlänge transparent ist, sofern das Anregungslicht von der Oberseite der Sensorplattform eingestrahlt wird. In diesem Fall kann das Trägermaterial auch absorptiv sein.
Besonders bevorzugte Trägermaterialien aus transparenten thermoplastischen Kunststoffen sind Polycarbonat, Polyimid oder Polymethylmethacrylat.
Bevorzugt ist der Brechungsindex für alle wellenleitenden Schichten gleich gross, d. h., bevorzugt bestehen alle wellenleitenden Schichten aus dem gleichen Material.
Der Brechungsindex der wellenleitenden Schichten muss grösser als der des Trägermaterials und gegebenenfalls verwendeter Zwischenschichten sein. Bevorzugt besteht die planare, transparente, wellenleitende Schicht aus einem Material mit einem Brechungsindex grösser als 2.
In Frage kommen zum Beispiel anorganische Materialien, insbesondere anorganische Metalloxide wie TiO₂, ZnO, Nb₂O₅, Ta₂O₅, HfO₂, oder ZrO₂.
Bevorzugt sind Ta₂O₅ und TiO₂.
Die Dicke der wellenleitenden Schichten ist 40 bis 160 nm.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Dicke der wellenleitenden Schichten gleich gross.
Die Modulationstiefe der Gitter beträgt 3 bis 60 nm, bevorzugt 3 bis 30 nm.
Das Verhältnis von Modulationstiefe zur Dicke der Schichten ist bevorzugt gleich oder kleiner als 0,5 und besonders bevorzugt gleich oder kleiner als 0,2.
Die Gitter zur Einkopplung des Anregungslichts oder zur Auskopplung des rückgekoppelten Lumineszenzlichtes sind als optische Beugungsgitter ausgebildet, bevorzugt als Reliefgitter. Die Rellefstruktur kann dabei verschiedene Formen aufweisen. Geeignet sind zum Beispiel Sinus-, Rechteck- oder Sägezahnstrukturen. Verfahren zur Erzeugung solcher Gitter sind bekannt. Vorwiegend werden photolithographische oder holographische Verfahren und Ätztechniken für ihre Herstellung eingesetzt, wie sie beispielsweise in Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors V. Proc. SPIE, Vol 2068, 313–325, 1994 beschrieben sind. Für organische Trägermaterialien können auch Press- oder Stempelverfahren eingesetzt werden.
Die Gitterstruktur kann auf dem Trägermaterial erzeugt und danach in die wellenleitende Schicht übertragen werden, in der sich dann die Gitterstruktur abbildet, oder das Gitter wird in der wellenleitenden Schicht selbst erzeugt.
Die Gitterperiode kann 200 bis 1000 nm betragen, wobei das Gitter vorteilhaft nur eine Periodizität aufweist, das heisst monodiffraktiv ist. Die Gitterperiode wird bevorzugt so gewählt, dass das Anregungslicht in der ersten Beugungsordnung eingekoppelt werden kann.
Die Modulationstiefen der Gitter sind bevorzugt gleich gross.
Bevorzugt weisen die Gitter ein Steg zu Nut-Verhältnis von 0,5 bis 2 auf. Unter Steg zu Nut-Verhältnis ist zum Beispiel bei einem Rechteckgitter das Verhältnis der Breite der Stege zu der Breite der Nuten zu verstehen.
Die Gitter können sowohl zum Einkoppeln von Anregungslicht in die einzelnen wellenleitenden Schichten als auch zur Auskopplung von in die wellenleitenden Schichten rückgekoppelten Lumineszenlichts dienen.
Für die Untersuchung verschieden lumineszierender Proben kann es zweckmässig sein, dass alle oder ein Teil der Ein- oder Auskoppelgitter verschiedene Gitterkonstanten aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Gitterkonstanten für alle Gitter gleich.
Wird ein Teil der Gitter zur Einkopplung und ein Teil zur Auskopplung des Lichts verwendet, so ist die Gitterkonstante des oder der Einkoppelgitter bevorzugt verschieden von der Gitterkonstante des oder der Auskoppelgitter.
Bevorzugt ist der Gitterabstand B ≤ 3·X_1/e ist, wobei X_1/e die Länge bezeichnet, bei der die Intensität I₀ der geführten Strahlung auf I₀/e abgefallen ist.
Eine bevorzugte Gruppe von Ausführungsformen einer Sensorplattform ist dadurch gekennzeichnet, dass
die transparenten, planaren, anorganischen dielektrischen wellenleitenden Bereiche auf der Sensorplattform mindestens entlang der Messstrecke durch einen Brechungsindexsprung von mindestens 0,6 voneinander getrennt sind und jeder Bereich einen oder zwei separate Gitterkoppler oder alle Bereiche zusammen einen oder zwei gemeinsame Gitterkoppler aufweisen, wobei die transparenten, planaren, anorganischen dielektrischen wellenleitenden Bereiche eine Dicke von 40 bis 160 nm aufweisen, die Modulationstiefe der Gitter 3 bis 60 nm und das Verhältnis Modulationstiefe zu Dicke gleich oder kleiner als 0,5 ist.
Am einfachsten wird der Brechungsindexsprung von 0,6 oder mehr dadurch bewirkt, dass die wellenleitende Schicht vollständig getrennt wird und einen Luftspalt oder bei der Messung gegebenenfalls Wasser enthält.
Bevorzugt leiten die wellenleitenden Bereiche nur 1 bis 3 Moden, besonders bevorzugt sind sie monomodale Wellenleiter.
Es können verschiedene spezifische Bindungspartner auf der Oberfläche eines wellenleitenden Bereichs aufgebracht sein, wobei ihre räumliche Trennung pro wellenleitendem Bereich unerheblich ist. Sie können zum Beispiel als statistisches Gemisch darauf vorliegen. Dies ist dann von Vorteil, wenn Analyten mit verschiedenen Emissionswellenlängen gleichzeitig über ein Auskoppelgitter bestimmt werden sollen.
Bevorzugt sind die spezifischen Bindungspartner auf der Oberfläche jedes wellenleitenden Bereichs räumlich voneinander getrennt.
Die spezifischen Bindungspartner können zum Beispiel durch photochemische Vernetzung an verschiedenen Stellen auf den wellenleitenden Bereichen immobilisiert werden, wie dies in der WO 94/27137 beschrieben ist. Eine andere Methode besteht darin, mittels eines Mehrfachpipettenkopfes die zu immobilisierenden spezifischen Bindungspartner aufzutropfen. Dies kann ebenfalls mit einem modifizierten Tintenstrahldruckkopf mit piezoelektrischen Aktoren geschehen. Dies hat zum Vorteil, dass das Verfahren rasch durchgeführt werden kann und sehr kleine Volumina eingesetzt werden können. Dies ist eine Voraussetzung, um dünne Streifen oder sonstige feinstrukturierte geometrische Muster herstellen zu können.
Eine weitere bevorzugte und sehr einfach durchzuführende Methode zur räumlich getrennten Immobilisierung der spezifischen Bindungspartner auf den wellenleitenden Bereichen basiert auf der Verwendung einer Flusszelle, wobei die Trennung in der Flusszelle entweder mechanisch, in Form von trennenden Stegen, oder fluidisch, bei laminarem Fluss, vorgenommen werden kann. Dabei entspricht die geometrische Anordnung der die Bindungspartner heranführenden Teilströme im wesentlichen der Anordnung der wellenleitenden Bereiche auf der Sensorplattform. Dieses Verfahren der Immobiliserung mittels einer Flusszelle ist besonders dann von Vorteil, wenn die spezifischen Bindungspartner in eine Umgebung eingebettet werden sollen, welche nur im flüssigen Medium stabil ist, wie dies beispielsweise bei lipidmembrangebundenen Rezeptoren der Fall ist.
Insbesondere können auf diese Weise kovalent an Goldkolloide gebundene spezifische Bindungspartner abgeschieden werden, und zwar in gleicher Weise, wie vorstehend zur Herstellung nicht wellenleitender Bereiche beschrieben. Um die Wellenleitung in den Immobilisierungsbereichen zu erhalten, ist es notwendig, Goldkolloide sehr kleinen Durchmessers von weniger als 10 nm und besonders bevorzugt von weniger als 5 nm zu verwenden.
Eine weitere und ebenfalls einfach durchzuführende Methode basiert auf Stempeln der Oberfläche mit den spezifischen Bindungspartnern, oder mit an Metalle gebundenen, spezifischen Bindungspartnern in analoger Weise, wie vorstehend zur Herstellung nicht wellenleitender Bereiche beschrieben.
Ein bevorzugtes Metall ist Gold.
Bevorzugte räumlich getrennte Muster sind Streifen, Rechtecke, Kreise, Ellipsen oder Schachbrettmuster.
Besonders bevorzugt ist eine Sensorplattform, die dadurch gekennzeichnet ist, dass auf der Oberfläche eines wellenleitenden Bereichs jeweils nur ein spezifischer Bindungspartner angeordnet ist.
Eine weitere Sensorplattform ergibt sich, wenn sich zwischen den wellenleitenden Bereichen und den immobilisierten spezifischen Bindungspartnern eine Haftvermittlungsschicht befindet.
Bevorzugt beträgt die Dicke der Haftvermittlungsschicht gleich oder weniger als 50 nm, besonders bevorzugt weniger als 20 nm.
Weiterhin ist es möglich, Haftvermittlungsschichten selektiv nur in den wellenleitenden Bereichen aufzutragen oder in den nicht wellenleitenden Bereichen zu passivieren, beispielsweise mittels photochemischer Aktivierung oder unter Verwendung nasschemischer Methoden wie zum Beispiel Mehrfachpipettenkopf, Tintenstrahldrucker, Flusszellen mit mechanischer oder fluidischer Trennung der Ströme, Abscheiden von Kolloiden oder Stempeln der Oberfläche. Die Methoden sind vorstehend zur direkten Immobilisierung der spezifischen Erkennungselemente, auf einer gegebenenfalls chemisch modifizierten oder funktionalisierten Oberfläche, bereits beschrieben worden.
Die direkte oder über Haftvermittlungsschichten vermittelte, selektive Immobiliserung der spezifischen Erkennungselemente ausschliesslich auf den wellenleitenden Bereichen kann, bei Verwendung einer sowohl die wellenleitenden wie nichtwellenleitenden Bereiche überdeckenden Probenzelle zu einer Verbesserung der Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens führen, da die unspezifische Bindung des Analyten in den nicht zur Signalerzeugung genutzten Bereichen herabgesetzt wird.
Die modifizierte Sensorplattform ist bevorzugt ganz oder teilweise regenerierbar und kann mehrmals verwendet werden. Unter geeigneten Bedingungen, beispielsweise tiefem pH, er höhter Temperatur, unter Anwendung organischer Lösungsmittel oder bei Einsatz sogenannter chaotroper Reagenzien (Salze), können die Affinitätskomplexe selektiv dissoziiert werden, ohne die Bindungsfähigkeit der immobilisierten Erkennungselemente wesentlich zu beeinträchtigen. Die genauen Bedingungen sind stark abhängig vom jeweiligen Affinitätssystem.
Eine spezifische Ausführungsform des Lumineszenznachweises im Assay besteht darin, dass man die zum Nachweis des Analyten benutzten lumineszenzfähigen Stoffe direkt an der Oberfläche der wellenleitenden Bereiche immobilisiert. Es kann sich dabei zum Beispiel um mehrere an ein Protein gebundenene Luminophore handeln, die auf diese Weise an der Oberfläche der wellenleitenden Bereiche zur Lumineszenz angeregt werden können. Werden für die Proteine affine Partner über diese immobilisierte Schicht geleitet, so kann dadurch die Lumineszenz verändert und auf diese Weise die Menge der affinen Partner bestimmt werden. Insbesondere können auch beide Partner eines Affinitätskomplexes mit Luminophoren markiert sein, um beispielsweise Konzentrationsbestimmungen anhand des Energietransfers zwischen den beiden, etwa in Form von Lumineszenzlöschung, vorzunehmen.
Eine andere, bevorzugte Ausführungsform der Immobilisierung für chemische oder biochemische Affinitätsassays besteht darin, daß man auf der Oberfläche der Sensorplattform einen oder mehrere spezifische Bindungspartner als chemische oder biochemische Erkennungselemente für die Analyten selbst oder für einen der Bindungspartner immobilisiert. Dabei kann es sich um ein- oder mehrstufige Assays handeln, in deren Verlauf in aufeinanderfolgenden Schritten eine oder mehrere Lösungen mit spezifischen Bindungspartnern für die auf der Oberfläche der Sensorplattform immobilisierten Erkennungselemente geführt werden, wobei die Analyten in einem der Teilschritte gebunden werden. Der Nachweis der Analyten erfolgt dabei durch Bindung von lumineszenzfähig markierten Teilnehmern der Affinitätsassays. Bei den dabei eingesetzten lumineszenzmarkierten Stoffen kann es sich um einen oder mehrere beliebige Bindungspartner der Affinitätsassays handeln, oder auch um einen mit einem Luminophoren versehenen Analogen der Analyten. Voraussetzung ist lediglich, dass die Anwesenheit der Analyten selektiv zu einem Lumineszenzsignal oder selektiv zu einer Änderung der Lumineszenzsignale führt.
Zur Vergrösserung der chemisch aktiven Sensoroberfläche ist es auch möglich, die chemischen oder biochemischen Erkennungselemente auf Mikropartikeln, sogenannten "Beads", zu immobilisieren, welche ihrerseits durch geeignete Methoden an der Oberfläche der Sensorplattform fixiert werden können. Voraussetzung für einen Einsatz dieser Beads, welche aus verschiedenen Materialien, wie beispielweise Kunststoff bestehen können, ist, dass erstens die Wechselwirkung mit dem Analyten zu einem erheblichen Teil im evaneszenten Feld des Wellenleiters stattfindet und zweitens die Wellenleitung nicht wesentlich beeinträchtigt wird.
Grundsätzlich kann die Immobilisierung der Erkennungselemente zum Beispiel durch hydrophobe Adsorption oder kovalente Bindung direkt auf dem wellenleitenden Bereich oder nach chemischer Modifikation der Oberfläche, z. B. durch Silanisierung oder Aufbringung einer Polymerenschicht, erfolgen. Zusätzlich kann zur Erleichterung der Immobilisierung der Erkennungselemente direkt auf dem Wellenleiter eine dünne Zwischenschicht als Haftvermittlungsschicht, z. B. bestehend aus SiO₂, aufgebracht werden. Die Silanisierung von Glas- und Metalloberflächen ist in der Literatur umfangreich beschrieben worden zum Beispiel in Advances in Colloid and Interface Science 6, L. Boksányi, O. Liardon and E. Kováts, (1976) 95–137. Spezifische Ausführungsmöglichkeiten der Immobilisierung sind vorstehend bereits beschrieben worden.
Als Erkennnungselemente kommen zum Beispiel Antikörper für Antigene, Bindungsproteine wie Protein A und G für Immunoglobuline, biologische und chemische Rezeptoren für Liganden, Chelatoren für "Histidin-tag-Komponenten", zum Beispiel Histidin markierte Proteine, Oligonukleotide und RNA- oder DNA-Einzelstränge für ihre Komplementärstränge, Avidin für Biotin, Enzyme für Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektine für Kohlehydrate in Frage. Welcher der jeweiligen Affinitätspartner auf der Oberfläche der Sensorplattform immobilisiert wird, ist abhängig von der Architektur des Assays. Die Erkennungselemente können natürlicher Art oder gentechnisch oder biotechnologisch hergestellt oder synthetisiert sein.
Die Begriffe Erkennungselement und spezifischer Bindungspartner werden synonym benutzt.
Die Assays selbst können sowohl einstufige Komplexierungsprozesse, beispielsweise kompetitive Assays, als auch mehrstufige Prozesse, beispielsweise Sandwich-Assays, sein.
Im einfachsten Fall des kompetitiven Assays wird die Probe, welche den Analyten in unbekannter Konzentration sowie eine bekannte Menge einer bis auf eine Lumineszenzmarkierung gleichartigen Verbindung enthält, mit der Oberfläche der Sensorplattform in Kontakt gebracht, wo die lumineszenzmarkierten und unmarkierten Moleküle um die Bindungsstellen an ihren immobilisierten Erkennungselementen konkurrieren. Bei dieser Assaykonfiguration erhält man ein maximales Lumineszenzsignal, wenn die Probe keinen Analyten enthält. Mit steigender Konzentration der nachzuweisenden Substanz werden die zu beobachtenden Lumineszenzsignale niedriger.
In einem kompetitiven Immunoassay braucht nicht unbedingt der Antikörper, sondern es kann auch das Antigen auf der Oberfläche der Sensorplattform als Erkennungselement immobilisiert werden. Generell ist es beliebig, welcher der Partner in chemischen oder biochemischen Affinitätsassays immobilisiert wird. Dieses ist ein prinzipieller Vorteil von auf Lumineszenz basierenden Assays gegenüber Verfahren wie beispielsweise Oberflächenplasmonenresonanz oder Interferometrie, welche auf der Änderung adsorbierter Masse im evaneszenten Feld des wellenleitenden Bereichs beruhen.
Weiterhin braucht im Falle kompetitiver Assays die Konkurrenz nicht beschränkt zu sein auf Bindungsstellen an der Oberfläche der Sensorplattform. Beispielsweise kann auch eine bekannte Menge eines Antigens an der Oberfläche der Sensorplattform immobilisiert werden, welches anchliessend mit der Probe in Kontakt gebracht wird, die eine unbekannte, nachzuweisende Menge des gleichen Antigens als Analyten sowie lumineszenzmarkierte Antikörper enthält. In diesem Fall findet die Konkurrenz zwischen an der Oberfläche immobilisierten und in Lösung befindlichen Antigenen um Bindung der Antikörper statt.
Der einfachste Fall eines mehrstufigen Assays ist ein Sandwich-Immunoassay, bei dem ein primärer Antikörper auf der Oberfläche der Sensorplattform immobilisiert wird. Die Bindung des nachzuweisenden Antigens und des zur Ausführung des Nachweises benutzten, lumineszenzmarkierten sekundären Antikörpers an ein zweites Epitop des Antigens kann sowohl durch aufeinanderfolgende Kontaktierung mit der das Antigen enthaltenden Lösung und einer zweiten, den Iumineszenzmarkierten Antikörper enthaltenden Lösung erfolgen, oder nach vorheriger Zusammenführung dieser beiden Lösungen, so dass abschliessend der Teilkomplex, bestehend aus Antigen und lumineszenzmarkiertem Antikörper, gebunden wird.
Affinitätsassays können auch weitere zusätzliche Bindungsschritte enthalten. Beispielsweise kann im Falle von Sandwich-Immunoassays in einem ersten Schritt Protein A auf der Oberfläche der Sensorplattform immobilisiert werden, welches spezifisch Immunoglobuline an ihrem sogenannten F_C-Teil bindet, welche dann als primäre Antikörper in einem nachfolgenden Sandwichassay dienen, der wie beschrieben ausgeführt werden kann.
Es gibt eine Vielzahl weiterer Ausführungsformen von Affinitätsassays, beispielsweise unter Verwendung des bekannten Avidin-Biotin-Affinitätssystems.
Beispiele von Ausführungsformen von Affinitäsassays finden sich bei J. H. Rittenburg, Fundamentals of Immunoassay; in Development and Application of Immunoassay for Food Analysis, J. H. Rittenburg (Ed.), Elsevier, Essex 1990, oder in P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, R. H. Burdon, P. H. van Knippenberg (Eds), Elsevier, Amsterdam 1985.
Zur Lumineszenzanregung kommt nur weitgehend paralleles Licht in Frage. Unter weitgehend parallel ist im Rahmen dieser Erfindung eine Divergenz von weniger als 5° zu verstehen. Das heisst, das Licht kann schwach divergent oder schwach konvergent sein. Bevorzugt verwendet man für die Lumineszenzanregung kohärentes Licht, besonders bevorzugt Laserlicht einer Wellenlänge von 300 bis 1100 nm, ganz besonders bevorzugt von 450 bis 850 nm und insbesondere von 480 bis 700 nm.
Als Laser können zum Beispiel Farbstofflaser, Gaslaser, Festkörperlaser und Halbleiterlaser eingesetzt werden. Bei Bedarf kann die Emissionswellenlänge durch nichtlineare Kristalloptiken auch verdoppelt werden. Der Strahl kann auch durch optische Elemente noch weiter fokussiert, polarisiert oder durch Graufilter abgeschwächt werden. Besonders geeignete Laser sind Argon-Ionen Laser und Helium-Neon Laser, die bei Wellenlängen zwischen 457 nm und 514 nm beziehungsweise zwischen 543 nm und 633 nm emittieren. Ganz besonders geeignet sind Diodenlaser oder frequenzverdoppelte Diodenlaser aus Halbleitermaterial, die bei einer Fundamentalwellenlänge zwischen 630 nm und 1100 nm emittieren, da sie wegen ihrer kleinen Abmessungen und geringen Leistungsaufnahme eine weitgehende Miniaturisierung des ganzen Sensorsystems erlauben.
Unter Probe wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die gesamte zu untersuchende Lösung verstanden, die eine nachzuweisende Substanz – den Analyt – enthalten kann. Der Nachweis kann in einem ein- oder mehrstufigen Assay erfolgen, in dessen Verlauf die Oberfläche der Sensorplattform mit einer oder mehreren Lösungen kontaktiert wird. Dabei enthält mindestens eine der verwendeten Lösungen einen lumineszenzfähigen Stoff, der erfindungsgemäss detektiert werden kann.
Wenn ein lumineszenzfähiger Stoff bereits an dem wellenleitenden Bereich adsorbiert ist, kann die Probe auch frei von lumineszierenden Bestandteilen sein. Die Probe kann weitere Bestandteile enthalten, wie zum Beispiel pH-Puffer, Salze, Säuren, Basen, oberflächenaktive Stoffe, viskositätsbeeinflussende Zusätze oder Farbstoffe. Insbesondere kann eine physiologische Kochsalzlösung als Lösungsmittel verwendet werden. Wenn der lumineszenzfähige Teil selbst flüssig ist, so kann auf die Zugabe eines Lösungsmittels verzichtet werden. In diesem Fall kann die Probe bis zu 100% lumineszenzfähigen Anteil enthalten.
Weiterhin kann die Probe ein biologisches Medium, wie zum Beispiel Eigelb, eine Körperflüssigkeit oder deren Bestandteile, insbesondere Blut, Serum, Plasma oder Urin sein. Darüberhinaus kann es sich um Oberflächenwasser, Lösungen von Extrakten aus natürlichen oder synthetischen Medien wie Böden oder Pflanzenteilen, Bioprozessbrühen oder Synthesebrühen handeln.
Die Probe kann entweder unverdünnt oder zusätzlich mit einem Lösungsmittel verwendet werden.
Als Lösungsmittel kommen Wasser, wässrige Puffer- und Proteinlösungen sowie organische Lösungsmittel in Frage. Als organische Lösungsmittel eignen sich Alkohole, Ketone, Ester, und aliphatische Kohlenwasserstoffe. Bevorzugt werden Wasser, wässrige Puffer oder ein Gemisch von Wasser mit einem mischbaren organischen Lösungsmittel verwendet.
Die Probe kann aber auch im Lösungsmittel nicht lösliche Bestandteile enthalten, wie Pigmentteilchen, Dispergatoren, natürliche und synthetische Oligomere oder Polymere. Sie liegt dann als optisch trübe Dispersion oder Emulsion vor.
Als lumineszierende Verbindungen können funktionalisierte Lumineszenzfarbstoffe mit einer Lumineszenz im Wellenlängenbereich von 330 nm bis 1000 nm, wie Rhodamine, Fluoresceinderivate, Cumarinderivate, Distyrylbiphenyle, Stilbenderivate, Phthalocyanine, Naphthalocyanine, Polypyridyl-Rutheniumkomplexe, wie z. B. Tris(2,2'-bipyridyl)rutheniumchlorid, Tris(1,10-phenanthrolin)rutheniumchlorid, Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin)rutheniumchlorid und Polypyridyl-Phenazin-Rutheniumkomplexe, Platin-Porphyrin-Komplexe, wie z. B. Octaethyl-Platin-Porphyrin, langlebige Europium- und Terbiumkomplexe oder Cyanin-Farbstoffe verwendet werden. Besonders geeignet für Analysen in Blut oder Serum sind Farbstoffe mit Absorptions- und Emissionswellenlängen im Bereich 600–900 nm.
Ganz besonders geeignet sind Farbstoffe wie beispielsweise Fluoresceinderivate, die funktionelle Gruppen enthalten, mit denen sie kovalent gebunden werden können wie zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat.
Ebenfalls gut geeignet sind die von der Fa. Biological Detection Systems Inc. im Handel befindlichen funktionellen Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise die mono- und bifunktionellen Cy 5.5^TM Farbstoffe, die zum Beispiel auch in Clinical Chemistry 40 (9): 1819–1822, 1994 beschrieben sind.
Bevorzugte Lumineszenz ist die Fluoreszenz.
Die Verwendung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, die gemeinsam von Licht einer Wellenlänge angeregt werden können, aber verschiedene Emissionswellenlängen aufweisen, kann vorteilhaft sein, insbesondere bei der Verwendung von Auskoppelgittern.
Die zur Anwendung kommenden Lumineszenzfarbstoffe können auch chemisch an Polymere oder an einen der Bindungspartner in biochemischen Affinitätssystemen, z. B. Antikörper oder Antikörperfragmente, Antigene, Proteine, Peptide, Rezeptoren oder ihre Liganden, Hormone oder Hormonrezeptoren, Oligonukleotide, DNA-Stränge und RNA-Stränge, DNA- oder RNA- Analoga, Bindungsproteine wie Protein A und G, Avidin oder Biotin, Enzyme, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektine oder Kohlenhydrate, gebunden sein. Die zuletzt genannte kovalente Lumineszenzmarkierung ist für reversible oder irreversible (bio)chemische Affinitätsassays die bevorzugte Verwendung. Weiterhin können auch lumineszenzmarkierte Steroide, Lipide und Chelatoren zum Einsatz kommen. Speziell für Hybridisierungsassays mit DNA-Strängen oder Oligonukleotiden sind auch interkalierende Lumineszenzfarbstoffe besonders geeignet, insbesondere wenn sie – wie verschiedene Rutheniumkomplexe – bei der Interkalation eine Lumineszenzverstärkung aufweisen. Werden diese lumineszenzmarkierten Verbindungen mit ihren auf der Oberfläche der Sensorplattform immobilisierten Affinitätspartnern in Kontakt gebracht, so lässt sich ihre Bindung leicht anhand der gemessenen Lumineszenzintensität quantitativ bestimmen. Ebenso ist eine quantitative Bestimmung der Analyten durch Messung der Lumineszenzänderung bei Wechselwirkung der Probe mit den Luminophoren möglich, z. B. in Form von Lumineszenzlöschung durch Sauerstoff oder von Lumineszenzverstärkung durch Konformationsänderungen von Proteinen.
Im erfindungsgemässen Verfahren können die Proben sowohl stationär mit den wellenleitenden Bereichen in Kontakt gebracht werden, als auch kontinuierlich über sie geleitet werden, wobei der Kreislauf offen oder geschlossen sein kann.
Eine weitere wesentliche Anwendungsform des Verfahrens beruht zum einen auf der Beschränkung der Signalerzeugung – im Fall der Rückkopplung gilt dies auch für die Signaldetektion – auf das evaneszente Feld des Wellenleiters, zum anderen auf der Reversibilität der Affinitätskomplexbildung als Gleichgewichtsprozess: Unter Anwendung geeigneter Flussraten in einem Durchflussystem kann die Bindung oder Desorption bzw. Dissoziation gebunde ner, lumineszenzmarkierter Affinitätspartner im evaneszenten Feld in Echtzeit verfolgt werden. Daher eignet sich das Verfahren für kinetische Studien zur Bestimmung unterschiedlicher Assoziations- oder Dissoziationskonstanten oder auch für Verdrängungsassays.
Die Detektion der evaneszent angeregten Lumineszenz kann mit bekannten Methoden erfolgen. Geeignet sind Photodioden, Photozellen, Photomultiplier, CCD-Kameras und Detektor-Arrays, wie z. B. CCD-Zeilen und CCD-Arrays. Die Lumineszenz kann mit optischen Elementen wie Spiegeln, Prismen, Linsen, Fresnellinsen und Gradientenindexlinsen auf diese abgebildet werden, wobei die Elemente entweder einzeln oder als arrays angeordnet sein können. Zur Selektion der Emissionswellenlänge können bekannte Elemente wie Filter, Prismen, Monochromatoren, dichroitische Spiegel und Beugungsgitter verwendet werden.
Insbesondere bei einer grösseren Zahl räumlich getrennter spezifischer Bindungspartner ist die Verwendung von Detektor-Arrays, welche in unmittelbarer Nähe der Sensorplattform angebracht sind, von Vorteil. Zweckmässig werden zwischen Sensorplattform und Detektor-Array optische Elemente zur Trennung von Anregungs- und Lumineszenzlicht wie holographische oder Interferenzfilter angeordnet.
Eine Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, dass man die isotrop abgestrahlte, evaneszent angeregte Lumineszenz detektiert.
In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens wird die in den wellenleitenden Bereich zurückgekoppelte, evaneszent angeregte Lumineszenz an einer Kante der Sensorplattform oder über ein Auskoppelgitter detektiert. Diese rückgekoppelte Lumineszenzenzintensität ist überraschend hoch, so dass sich mit dieser Verfahrensweise ebenfalls eine sehr gute Empfindlichkeit erreichen lässt.
In einer anderen Verfahrensform werden sowohl die evaneszent angeregte, isotrop abgestrahlte Lumineszenz als auch die in den Wellenleiter rückgekoppelte Lumineszenz unabhängig voneinander, aber simultan detektiert. Aufgrund der unterschiedlichen Selektivität der beiden Lumineszenzdetektionsmethoden, welche vom Abstand der Luminophoren von dem wellenleitenden Bereich abhängig ist, können mit dieser Ausführungsform zusätzliche Informationen über die räumliche Verteilung der Luminophoren gewonnen werden. Damit ergibt sich auch eine Unterscheidungsmöglichkeit von photochemischem Ausbleichen der Luminophoren und Dissoziation der die Luminophoren tragenden Affinitätskomplexe.
Ein Vorteil des Verfahrens besteht auch darin, dass neben der Lumineszenzdetektion gleichzeitig auch die Absorption des eingestrahlten Anregungslichtes bestimmt werden kann. Gegenüber multimodalen Wellenleitern faseroptischer oder planarer Bauart wird in diesem Fall ein wesentlich besseres Signal/Rausch Verhältnis erreicht. Durch das gleichzeitige Messen von Lumineszenz und Absorption lassen sich mit hoher Empfindlichkeit Lumineszenzlöscheffekte feststellen.
Das Verfahren kann so durchgeführt werden, dass man das Anregungslicht im "continuous wave" (cw) Betrieb einstrahlt, dies bedeutet, dass mit zeitlich konstanter Lichtintensität angeregt wird.
Das Verfahren kann aber auch so durchgeführt werden, dass man das Anregungslicht in Form eines zeitlichen Pulses mit einer Pulsdauer von zum Beispiel einer Pikosekunde bis zu 100 Sekunden einstrahlt und die Lumineszenz zeitlich aufgelöst – im Falle kurzer Pulsdauern – oder in Intervallen von Sekunden bis zu Minuten detektiert. Diese Methode ist besonders dann vorteilhaft, wenn man zum Beispiel die Geschwindigkeit einer Bindungsbildung analytisch verfolgen oder eine Lumineszenzsignalabnahme infolge photochemischen Ausbleichens verhindern will mittels kurzer Belichtungszeiten. Weiterhin ist bei Verwendung entsprechend kurzer Pulsdauer und geeigneter Zeitauflösung der Detektion die Diskriminierung von Streulicht, Ramanemission und kurzlebiger Lumineszenz möglicherweise vorhandener, unerwünschter lumineszierender Bestandteile der Probe und des Sensormaterials gegenüber einer in diesem Fall möglichst langlebigen Lumineszenz des Markierungsmoleküls möglich, indem die Emission des Analyten erst nach Abklingen dieser kurzlebigen Strahlung detektiert wird. Darüber hinaus erlaubt zeitaufgelöste Lumineszenzdetektion nach gepulster Anregung, ebenso wie modulierte Anregung und Detektion, die Untersuchung des Einflusses der Bindung des Analyten auf das molekulare Lumineszenzabklingverhalten. Die molekulare Lumineszenzabklingzeit kann, neben der spezifischen Analyterkennung durch die immobilisierten Erkennungselemente und der räumlichen Beschränkung der Signalerzeugung auf das evaneszente Feld des Wellenleiters, als ein weiteres Selektivitätskriterium benutzt werden.
Das Verfahren kann auch so durchgeführt werden, daß man, bei einer oder mehreren Frequenzen, das Anregungslicht intensitätsmoduliert einstrahlt und die resultierende Phasenverschiebung und Modulation der Probenlumineszenz detektiert.
Eine parallele Einkopplung von Anregungslicht in mehrere wellenleitende Bereiche ist auf mehrere Arten möglich:

a) man benutzt mehrere Laserlichtquellen;
b) man weitet den Strahl einer Laserlichtquelle mit bekannten, geeigneten optischen Bauteilen auf, so dass er mehrere wellenleitende Bereiche und Einkoppelgitter überdeckt;
c) man zerlegt den Strahl einer Laserlichtquelle mit diffraktiven oder holographisch optischen Elementen in eine Vielzahl von Einzelstrahlen, die dann in die wellenleitenden Bereiche über die Gitter eingekoppelt werden; oder
d) man verwendet einen Laser-Array aus Festkörperlasern.

Eine vorteilhafte Verfahrensführung ergibt sich auch dadurch, dass man einen steuerbaren Umlenkspiegel verwendet, mit dem zeitlich versetzt in die wellenleitenden Bereiche ein- oder ausgekoppelt werden kann. Alternativ kann auch die Sensorplattform geeignet verschoben werden.
Eine weitere bevorzugte Verfahrensvariante besteht darin, dass man die Lumineszenzen mit verschiedenen Laserlichtquellen gleicher oder verschiedener Wellenlänge anregt.
Besonders bevorzugt wird für die Anregung der Lumineszenzen mit einer einstückigen Zeile von Diodenlasern (Laser-Array) gearbeitet. Diese Bauteile haben den besonderen Vorteil, dass sie sehr kompakt und wirtschaftlich herstellbar sind, und die einzelnen Laserdioden können individuell gesteuert werden.
In 6 ist ein möglicher Gesamtaufbau schematisch dargestellt. Die Bezugszeichen 1 und 3 haben die vorstehend erwähnten Bedeutungen; des weiteren bedeuten:

8: Sensorplattform
9: Filter
10: Dichtung
11: Durchflusszelle
12: Probenvolumen
13: Anregungsoptik
14: Nachweisoptik/Elektronik.

Das Anregungslicht, zum Beispiel von einem Diodenlaser 13, wird über ein erstes Gitter 3 in einen wellenleitenden Bereich 1 der Sensorplattform 8 eingekoppelt. Auf der Unterseite der Sensorplattform 8 ist eine Durchflusszelle 11 dicht an die Sensorplattform angepresst. Durch das Volumen 12 der Durchflusszelle 11, die ein oder mehrere Einlassöffnungen und ein oder mehrere Auslassöffnungen aufweisen kann, werden die für den Assay notwendigen Lösungen gespült. Der Nachweis der Fluoreszenz eines Bindungspartners erfolgt am Detektor 14, auf den über ein zweites Gitter 3 das evaneszent in den wellenleitenden Bereich rückgekoppelte Fluoreszenzlicht ausgekoppelt wird. Die Filter 9 dienen zur Ausfilterung von Streulicht.
Das Verfahren wird bevorzugt zur Untersuchung an Proben wie Eigelb, Blut, Serum, Plasma oder Urin eingesetzt.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren ergibt sich bei der Untersuchung von Proben wie Oberflächenwasser, Boden- oder Pflanzenextrakten, Bio- oder Syntheseprozessbrühen.
Da Signalerzeugung und -detektion auf die chemische oder biochemische Erkennungsoberfläche auf dem Wellenleiter beschränkt sind und Störsignale aus dem Medium diskriminiert werden, kann die Bindung von Substanzen an die immobilisierten Erkennungselemente in Echtzeit verfolgt werden. Die Verwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zum Affinitätsscreening oder für Verdrängungsassays, insbesondere für die pharmazeutische Produktentwicklung, mittels direkter Bestimmung von Assoziations- und Dissoziationsraten in einem Durchflussystem mit geeigneten Flussraten, ist daher ebenfalls möglich.
Weiter sind von der vorliegenden Methode umfasst

a) die Verwendung der Sensorplattform zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen;
b) die Verwendung der Sensorplattform zur quantitativen Bestimmung von Rezeptoren oder Liganden, Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA-Analoga, Enzymen, Enzymsubstraten, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten und;
c) die Verwendung der Sensorplattform zur selektiven quantitativen Bestimmung lumineszierender Bestandteile in optisch trüben Flüssigkeiten.

Optisch trübe Flüssigkeiten können zum Beispiel biologische Flüssigkeiten wie Eigelb, Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Plasma sein, aber auch Proben aus der Umweltanalytik wie beispielsweise Oberflächenwasser, gelöste Erdextrakte oder gelöste Pflanzenextrakte. In Frage kommen auch Reaktionslösungen, wie sie beispielsweise bei der chemischen Produktion anfallen, insbesondere Farbstofflösungen oder Reaktionslösungen von optischen Aufhellern. In Frage kommen auch alle Arten von Dispersionen und Zubereitungen, wie sie zum Beispiel in der Textilindustrie eingesetzt werden, sofern diese eine oder mehrere lumineszierende Komponenten enthalten. Das Verfahren kann dadurch auch für die Qualitätssicherung eingesetzt werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Konzentrationsangabe M bedeutet in allen nachfolgenden Beispielen mol/l.
Beispiele A: Herstellung verschiedener Sensorplattformen
Beispiel A1: Herstellung mittels Masken beim Aufdampfen
Ein Substrat aus Polycarbonat (PC) wurde mit TiO₂ bedampft (Prozeß: Sputtern, Aufdampfrate: 0,5 Å/s, Dicke: 150 nm). Zwischen Target und Substrat wurde in unmitttelbarer Nähe des Substrates eine aus Aluminium gefertigte Maske gebracht, in welche sechs Streifen von 30 mm Länge und 0,6 mm Breite gefräst waren. Die dadurch entstandenen sechs wellenleitenden Bereiche (Meßbereiche) hatten ein trapezförmiges Profil mit einer gleichmäßigen Dicke von 150 nm in dem mittleren Bereich von 600 μm Breite und eine gradientenförmig abfallende Schichtdicke an den Seiten (Abschattung). Eingekoppeltes Laserlicht wird in dem wellenleitenden Bereich geführt ('confined'), da der effektive Brechungsindex im zentralen Bereich wegen der größten Schichtdicke am höchsten ist.
Beispiel A2: Herstellung durch nachträgliche Unterteilung
Es wird mit einem ArF-Excimer-Laser bei 193 nm gearbeitet. Der rechteckige Laserstrahl wird mittels einer Zylinderlinse zu einem 200 µm breiten und 20 mm langen Strahlprofil gebündelt mit der Sensorplattform im Fokus. Die Sensorplattform besitzt eine 100 nm dicke durchgehende Schicht aus Ta₂O₅. Bei einer Energiedichte oberhalb von 1 J/cm² wird die gesamte Schicht mit einem einzigen Laserpuls (10 ns) ablatiert.
Beispiel A3: Herstellung durch nachträgliche Unterteilung
Es wird mit einem Ar-Ionenlaser bei 488 nm gearbeitet. Der runde Laserstrahl wird mittels eines Mikroskopobjektives (40×) auf 4 μm Durchmesser gebündelt mit der wellenleitenden Schicht im Fokus. Die Sensorplattform besitzt eine 100 nm dicke durchgehende Schicht aus Ta₂O₅ und befindet sich auf einem motorgesteuertem Positionierelement (Newport PM500). Die Plattform wird bei kontinuierlicher Laserbestrahlung senkrecht zum Strahl mit 100 mm/s gefahren. Bei einer Leistung von 700 mW wird die gesamte wellenleitende Schicht im Fokus ablatiert, so daß zwei getrennte wellenleitende Bereiche entstehen.
Beispiel A4: Herstellung durch Aufbringen einer strukturierten absorbierenden Deckschicht im Vakuumverfahren.
Auf den Metalloxid-Wellenleiter aus Ta₂O₅ (durchgehend) wurden 5 parallele Streifen aus einem Schichtsystem aus Chrom/Gold aufgedampft (Bedampfungsanlage: Balzers BAK 400); zunächst 5 nm Cr mit 0,2 nm/s, anschließend 45 nm Au mit 0,5 nm/s. Die eingekoppelten Moden wurden an den absorbierenden Schichten unterbrochen.
Beispiel A5: Herstellung durch Aufbringen einer strukturierten absorbierenden Deckschicht im wässrigen Verfahren
Die Oberfläche eines Metalloxid-Wellenleiters aus Ta₂O₅ wird mit (Mercaptomethyl)dimethylethoxysilan in der Gasphase bei 180°C silanisiert. Auf die modifizierte Oberfläche wird mit Hilfe einer feinen Pipette Kolloidlösung A (GoldSol der Firma Aurion, mittlerer Kolloiddurchmesser = 28,9 nm, Konzentration: A₅₂₀ ≈ 1, wässrige Lösung) in Form von Tröpfchen oder Streifen aufgebracht und für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wird mit Wasser gewaschen. Geführtes Modenlicht wird an den inkubierten Orten absorbiert. Hinter den Inkubationsorten ist kein Modenlicht mehr vorhanden. Entsprechendes gilt für mit Protein A bedeckte Au-Kolloidlösung B (P-9785 der Firma Sigma, mittlerer Durchmesser = 18,4 nm, A₅₂₀ ≈ 5,5, in 50% Glycerol, 0,15 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 0.02% PEG 20, 0,02% Natriumazid). Die absorbierenden Muster auf der Wellenleiter Oberfläche bleiben auch nach mehrmaligem Spülen mit Wasser und mit Ethanol erhalten, was die Stabilität der erzeugten Strukturen demonstriert. Durch manuelles Aneinanderreihen von Mikrotröpfchen (1 μl) der Kolloidlösung A können durchgehend lichtabsorbierende Streifen erzeugt werden.
Beispiel A6: Herstellung durch Aufbringen einer strukturierten absorbierenden Deckschicht im wässrigen Verfahren
Die Oberfläche eines Metalloxid-Wellenleiters aus TiO₂ wird mit (Mercaptomethyl)dimethylethoxysilan in der Gasphase bei 50°C silanisiert Anschliessend wird ein Teil der Wellenleiteroberfläche vor und mit dem zweiten Auskoppelgitter für 3 h inkubiert mit Kolloidlösung B (P-9785 der Firma Sigma, mittlerer Durchmesser = 18,4 nm, A₅₂₀ ≈ 5,5, in 50% Glycerol, 0,15 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 0.02% PEG 20, 0,02% Natriumazid). Die Wellenausbreitung an den inkubierten Stellen ist vollständig unterbrochen. Die Oberfläche der inkubierten Stelle wird mit einem atomaren Kraftmikroskop untersucht und die Präsenz von Kolloiden und die für die beobachtete Lichtabsorption notwendige Dichte der auf der Oberfläche verankerten Goldpartikel bestimmt. Der mittlere Abstand der Partikel liegt im Bereich von etwa 100 nm.
Beispiel A7: Herstellung durch Aufbringen einer strukturierten absorbierenden Deckschicht im wässrigen Verfahren
Die Oberfläche eines Metalloxid-Wellenleiters aus Ta₂O₅ wird silanisiert mit (Mercaptomethyl)dimethylethoxysilan (in Gasphase bei 180°C). Der Wellenleiterchip wird mit einer Durchflusszelle mit parallelen, fluidisch getrennten laminaren Teilströmen verbunden, die es erlaubt, über separate und individuell ansprechbare Flussöffnungen (1–5) bis zu fünf verschiedene Flüssigkeitsströme parallel nebeneinander über die Länge der Wellenleiteroberfläche zu führen. Erzeugt werden sollen drei wellenleitende Streifen, die durch zwei dünnere Streifen von deponierten Au-Kolloiden getrennt werden. Die Durchflussflusszelle wird auf den Eingängen 1, 3, 5 mit Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,0) und auf den Eingängen 2, 4 mit Au-Kolloidlösung belegt. Es wird eine Kolloidlösung benutzt, deren Oberfläche mit Rinderserum Albumin belegt ist (BSA Gold Tracer der Firma Aurion, mittlerer Kolloiddurchmesser = 25 nm, OD₅₂₀ ≅ 2,0). Als Flussraten (pro Kanal) werden gewählt: 0,167 ml/min für die Pufferflüsse 1, 3, 5 und 0,05 ml/min für die beiden Kolloidflüsse 2, 4. Dabei ergibt sich eine Breite von etwa 1 mm für den Kolloidstrom und etwa 3 mm für den Pufferstrom. Das Verhältnis von Kolloid- zu Pufferstrombreite ist generell über das Verhältnis der Flüsse frei wählbar. Die müsse werden für 20 Minuten appliziert (entsprechend einer Kolloidmenge von 1 ml pro Kanal). Nach 20 minütiger Inkubation wird der Wellenleiterchip entnommen, mit Wasser gewaschen und mit einem Strom von Stickstoff getrocknet. Geführtes Modenlicht wird an den kolloidimmobilisierten Streifen völlig absorbiert und resultiert in drei voneinander getrennt lichtleitenden Moden von etwa 3 mm Breite.
Anwendungsbeispiele B
Beispiel B1: Parallele Detektion von zwei unterschiedlichen fluoresceinmarkierten Oligonukleotiden mit auf zwei räumlich getrennten wellenleitenden Bereichen immobilisierten Komplementärsträngen in einem Hybridisierungsassay
B1.1 Optische Sensorplattform mit zwei wellenleitenden Bereichen, erhalten nach Beispiel A3

Geometrie: 16 mm × 48 mm × 0,5 mm.
Wellenleitende Schicht: Ta₂O₅, n = 2,317 bei 488 nm, Dicke 150 ± 5 nm.
Trägermaterial: Corning Glas C7059, n = 1,538 bei 488 nm.
Gitter: Rechteckgitter mit einer Modulationstiefe von 6–7 nm, Gitterperiode 750 nm.

Einkoppelergebnis bei Anregung mit 633 nm
Koppelwinkel: 4°–5° (zweite Beugungsordnung)
Einkopplungseffizienz: 7% am Gitterort
Dämpfung: 2,5 dB/cm.

B1.2 Optischer Aufbau
Das Anregungslicht eines Argon-Ionen Lasers (Anregungswellenlänge 488 nm) wird mit einer Zylinderlinse auf 10 mm aufgeweitet und mit Hilfe eines drehbaren Spiegels von der Rückseite des Trägermaterials her auf die beiden Gitter der wellenleitenden Bereiche gerichtet. Auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht wird, gedichtet durch einen O-Ring, von oben eine thermostatisierbare Durchflusszelle angedrückt, deren Volumen ca. 0,07 ml beträgt und die sich über beide wellenleitende Bereiche erstreckt. Die im evaneszenten Feld angeregte Lumineszenzen der beiden Proben werden mittels zwei räumlich getrennt angeordneter Detektoren simultan aufgezeichnet. Beide Detektoren bestehen aus je einer Photodiode (SR 1133, Hamamatsu), auf die mittels einer identischen Glasfaseroptik unter Filterung mit einem Interferenzfilter die in das Volumen abgestrahlten Lumineszenzen geleitet werden. Die Signale werden mittels zweier Transimpedanzverstärker verstärkt. Die einzelnen für den Aufbau verwendeten Elemente sind bekannt und im Handel erhältlich.
B1.3 Verwendete Lösungen

1) Hybridisierungspuffer (pH 7,75), bestehend aus 0,069 M Phosphatpuffer (0,041 M Na₂HPO₄ + 0,028 M NaH₂PO₄), 0,176 M KCL, 1 ml POE-(20)-sorbitol monolaurat (Tween 20, ICI), 1 g Polyacrysäure PAA 5100, 500 mg/l Natriumazid, aufgefüllt auf 1 l mit destilliertem Wasser
2) Probenlösung 1 (16*kfl): fluoresceinmarkiertes, zu dem auf dem ersten wellenleitenden Bereich immobilisierten Oligomeren komplementäres, aus 16 Basenpaaren bestehendes Oligomer (Fluorescein-5'-GTTGTGTGGAATTGTG-3' (10^–8 M) in Hybridisierungspuffer 1).
3) Probenlösung 2 (15*kfl): fluoresceinmarkiertes, zu dem auf dem zweiten wellenleitenden Bereich immobilisierten Oligomereren komplementäres, aus 15 Basenpaaren bestehendes Oligomer (Fluorescein-5'-TTTTTCTCTCTCTGT-3' (10^–8 M) in Hybridisierungspuffer 1).
4) Regenerierungslösung: 50% Harnstoff (G/G) in wässriger Lösung.

Die Lösungen werden mit Cavropumpen (jeweils 10 ml Bürettenvolumen) zugeführt.
B1.4 Immobilisierungsverfahren
Mit einem Oligonukleotid-Synthesizer (Applied Biosystems 394B) wurden die spezifischen Bindungspartner (3'CAACACACCTTAACAC-5' auf dem ersten wellenleitenden Bereich, 3'AAAAAGAGAGAGAGA auf dem zweiten wellenleitenden Bereich) direkt auf der mit 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan silanisierten Sensorplattform synthetisiert nach einem Verfahren, wie es standardmäßig bei der Oligonukleotidsynthese auf Partikeln verwendet wird. Im Gegensatz zum Standardsynthese-Verfahren wurde für die Verankerung auf der Oberfläche, am 3'-Ende, jedoch ein stabiler Hexaethylenglykol-Linker verwendet. Nach Waschen mit Wasser wurden die Sensorplattformen mit den immobilisierten spezifischen Bindungspartnern im Assay verwendet.
B1.5 Messverfahren
Das Messverfahren Variante I (zeitlich aufeinanderfolgende Zufuhr von zwei verschiedenen Analyten über beide wellenleitende Bereiche gleichzeitig) besteht aus folgenden Einzelschritten:

– 2 Minuten Waschen mit Hybridisierungspuffer 1) (0,5 ml/min), Aufnahme des Untergrundsignals;
– 10 Minuten (nach einem 5 Sekunden Flush von 5 ml/min) Zuführung der Probenlösung 2) (0,5 ml/min);
– 2 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer 1)
– 3 Minuten Zufuhr der Regenerierungslösung 4) (0,5 ml/min)
– 4 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer 1)
– 10 Minuten (nach einem 5 Sekunden Flush von 5 ml/min) Zuführung der Probenlösung 3) (0,5 ml/min);
– 2 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer 1)
– 3 Minuten Zufuhr der Regenerierungslösung 4) (0,5 ml/min)
– 2 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer 1)

Die isotrop abgestrahlte Fluoreszenz der beiden wellenleitenden Bereiche wird während des Verfahrens mittels direkt unterhalb der Sensorplattform plazierter Lichtleiterbündel rechteckigen Eintrittsquerschnitts (10 mm·1 mm) gesammelt. Der rechteckige Querschnitt der Lichtleiterbündel wird gewandelt in kreisförmige Ausgänge (Durchmesser 6 mm). Direkt hinter den Ausgängen der Lichtleiterbüdel befinden sich gleichartige Interferenzfilter (maximale Transmission bei 530 nm, Bandbreite 30 nm): Das spektral gefilterte Fluoreszenzlicht wird mittels zweier Photodioden gemessen. Nach 10 minütiger Probenzufuhr von fluoresceinmarkierter 16-mer Komplementärprobe wird von dem ersten wellenleitenden Bereich ein Fluoreszenzsignal von 42 mV und von dem zweiten wellenleitenden Bereich kein Signal (1 mV) beobachtet. Nach 10 minütiger Probenzufuhr von fluoresceinmarkierter 15-mer Komplementärprobe wird dagegen ein Fluoreszenzsignal von 43 mV auf dem zweiten wellenleitenden Bereich und kein Signal (0 mV) auf dem ersten wellenleitenden Bereich gemessen. Das Signalrauschen beträgt etwa 2 mV.
Messverfahren Varante II (gleichzeitige Zufuhr von zwei verschiedenen Analyten auf die beiden räumlich getrennten wellenleitenden Bereiche mittels getrennter Zellen) besteht aus folgenden Einzelschritten:

– 2 Minuten Waschen mit Hybridisierungspuffer 1) (0.5 ml/min) auf beiden wellenleitenden Bereichen, Aufnahme der Untergrundsignale beider Kanäle;
– 10 Minuten (nach einem 5 Sekunden Flush von 5 ml/min) Zuführung der Probenlösung 2) (0,5 ml/min) auf den ersten wellenleitenden Bereich und der Probenlösung 3) (0,5 ml/min) auf den zweiten wellenleitenden Bereich;
– 2 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer 1) beider wellenleitender Bereiche;
– 3 Minuten Zufuhr der Regenerierungslösung 4) (0,5 ml/min) beider wellenleitender Bereiche;
– 4 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer 1) beider wellenleitender Bereiche;

Die isotrop abgestrahlte Fluoreszenz der beiden wellenleitenden Bereiche wird während des Verfahrens mittels direkt unterhalb der Sensorplattform plazierter Lichtleiterbündel rechteckigen Eintrittsquerschnitts (10 mm × 1 mm) gesammelt. Der rechteckige Querschnitt der Lichtleiterbündel wird gewandelt in kreisförmige Ausgänge (Durchmesser 6 mm). Direkt hinter den Ausgängen der Lichtleiterbüdel befinden sich gleichartige Interferenzfilter (maximale Transmission bei 530 nm, Bandbreite 30 nm): Das spektral gefilterte Fluoreszenzlicht wird mittels zweier Photodioden gemessen. Man erhält deutliche Signale von beiden wellenleitenden Bereichen.
Beispiel B2: Nachweis von Erkennungselementen auf 5 parallelen Streifen
B2.1 Immobilisierung der Erkennungselemente
Auf der in Beispiel A4 beschriebenen Sensorplattform werden Cy 5.5-markierter human-Antikörper, Protein A und BSA als Erkennungselemente bzw. Kontrollmoleküle in fünf Bereichen streifenförmig immobilisiert.
Als Analyt für alle Erkennungselemente diente ein Cy 5.5-markierter human-Antikörper, der nur mit den Protein A-Streifen eine Affintätsreaktion zeigt.
Alle Streifen messen 0,6 mm × 15 mm. Der Abstand zwischen den Streifen beträgt 0,6 mm
Die Streifen beginnen 1 mm rechts vom durchgehenden Einkoppelgitter.
Zur strukturierten Immobilisierung von Erkennungselementen und Kontrollmolekülen auf der Oberfläche der Sensorplattform wird eine Mehrkanalzelle mit folgender Geometrie verwendet. In einen Teflonquader (Masse 100 mm·60 mm·18 mm) werden sechs Kanäle mit den Massen 0,6 mm Breite × 15 mm Länge und eine Vertiefung in der Grösse der verwendeten Sensorplattform eingefräst. An den beiden Enden der Kanäle wird das Teflon mit einem 0,6 mm Bohrer durchbohrt, um von der Unterseite des Teflonblocks Zugänge zu den jeweiligen Kanälen zu haben. Durch die spezielle Formgebung der in das Teflon eingearbeiteten Kanäle, bzw. durch die gewählte Geometrie der Umgebung der Kanäle ergeben sich die Kanäle als "Lippen", die aus der für den Wellenleiter ausgefrästen Vertiefung um ca. 0,2 mm hervorstehen.
Die wellenleitenden Schichten, deren Oberfläche zuvor mittels Gasphasensilanisierung mit 3-Mercaptopropyl-dimethylmethoxysilan chemisch modifiziert werden, werden so in die Vertiefung der Mehrkanalzelle gelegt, dass die wellenleitende Schicht den Kanälen zugewandt ist. Durch Anpressen der Sensorplattform an die Teflonlippen der Mehrkanalzelle gibt es eine dichte Verbindung zwischen der Oberfläche der wellenleitenden Bereiche und dem Teflonblock. In die einzelnen Kanäle werden folgende Lösungen über die Bohrungen in die Kanäle injeziert.

Kanal 1: 1 nM Lösung eines mit Cy 5.5 markierten human-Antikörpers
Kanal 2: 1 mg/ml Protein A in Wasser
Kanal 3: 10 mg/ml BSA in Wasser
Kanal 4: 1 mg/ml Protein A in Wasser
Kanal 5: 1 mg/ml Protein A in Wasser
Kanal 6: nicht verwendet

Nach 2 Stunden Inkubationszeit werden die Känale durch Injizieren von demineralisiertem Wasser gewaschen und durch Ausblasen mit Stickstoff getrocknet. Die Sensorplattform wird anschliessend aus der Mehrkanalzelle ausgebaut und die wellenleitende Oberfläche mit ca. 400 μl einer BSA-Lösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml benetzt, um noch aktive Bindungsstellen der silanisierten Oberfläche mit einem Protein (BSA) abzusättigen. BSA zeigt keine Affinität zu dem in diesem Experiment als Analyt benutzten Cy 5.5 markierten human-Antikörper. Nach einer Inkubatationszeit von zwei Stunden wurde die Sensorplattform mit demineralisiertem Wasser gewaschen.
B2.2 Experimenteller Aufbau zur automatischen Fluoreszenzmessung von streifenförmig immobilisierten Erkennungselementen bzw. deren Bindungspartnern
Die Messanordnung besteht aus drei Hauptbestandteilen.

A) Höhenverstellbare Halterung der Sensorplattform mit integrierter Durchflusszelle zur Flüssigkontaktierung der wellenleitenden Bereiche mit verschiedenen Lösungen.
B) Optischer Aufbau mit einer Halterung für eine Laserquelle und optischen Elementen zur Definition des Anregungslichtstrahles.
C) Optischer Aufbau, der mittels eine Linsenkombination und einer mechanischen Blende einen streifenförmigen Bereich der Wellenleiteroberfläche auf einem Detektor abbildet.

Die Flusszelle wird so auf eine computerkontrollierte Translations- und Rotationseinheit montiert, dass sich das Einkoppelgitter genau in der Rotationsachse der Rotationeinheit befindet. Mit der Translationseinheit kann die Flusszelle samt Wellenleiter längs dieser Rotationsachse positioniert werden und so der Mode im Bereich der fünf auf dem Wellenleiter immobilisierten Molekülestreifen eingekoppelt werden.
Die Flusszelle besteht prinzipiell aus einer Aluminiumplatte mit den Massen 75 mm × 40 mm × 5 mm in die zentral ein O-Ring so eingearbeitet wird, dass sich durch das Anpressen einer Sensorplattform eine flache Kammer mit dem Massen 28 mm × 6 mm × 0,2 mm ergibt. Zur Flüssigkontaktierung ist diese Kammer über 3 in das Aluminium gebohrte Löcher mit 1 mm Durchmesser zugänglich. Zwei dieser Bohrungen, die als Eingänge zu der Flusszelle dienen, sind jeweils mittig an den Stirnseiten im Innenraum der Kammer angebracht. Bei angepresster Sensorplattform befinden sich die beiden Gitter der Sensorplattform zwischen diesen Eingängen zur Flusszelle. Die dritte Bohrung dient als Ausgang der Flusszelle und ist so angeordenet, dass sich das Eingangkoppelgitter symmetrisch zwischen einem der Eingänge und dem Ausgang der Flusszelle befindet. Über den Eingang am Einkoppelgitter wird ein Puffer in die Zelle gepumpt, über den Eingang am Auskoppelgitter wird der Analyt in die Flusszelle gepumpt. Diese Konstruktion verhindert, dass das Einkoppelgitter mit Bestandteilen der Analytlösung kontaminiert wird (Gegenflussprinzip).
Eine dichtende Verbindung zwischen Wellenleiter und Flusszelle wird mittels eines in die Flusszelle eingearbeiteten O-Ringes erzielt. Durch Schlauchanschlüsse kann das Medium in der Flusszelle unter Verwendung des Gegenflussprinzipes ausgetauscht werden. Zur Erzeugung eines konvergenten Lichtstrahles wird ein Diodenlaser benutzt. Der aus der Laseroptik kommende Laserstrahl mit einem Durchmesser von 0,4 mm bildet mit der Stirnseite der Sensorplattform konstant einen rechten Winkel. Durch einen Polarisator und eine λ/2 Platte können Intensität und Polarisation des Laserstrahles eingestellt werden. Ein Bandpassfilter mit einer Wellenlänge von 670 nm eliminiert vom Diodenlaser emittierte, die Fluoreszenzdetektion störende, Photonen im Wellenlängenbereich der zu detektierenden Fluorophore (690–740 nm). Der Winkel zwischen dem Laserstahl und der Längsachse des Wellenleiters ist durch das Rotationselement frei einstellbar und wird benutzt, um den Einkoppelwinkel für den TE₀ Mode zu justieren. Die Detektionsoptik (C) ist auf die Mitte der Längsseite des Wellenleiters und auf Höhe des TE₀ Modes fokussiert und erzeugt auf dem Detektor eine Abbildung des Modes auf der Wellenleiteroberfläche. Durch eine Streifenblende unmittelbar vor dem Detektor wird nur der Bereich abgebildet, der der Geometrie der streifenförmig immobilisierten Moleküle entspricht, also ein Bereich von 0,6 mm × 15 mm. Die Detektoroptik wird so gewählt, dass sie eine 1:1 Abbildung von der Wellenleiteroberfläche in der Detektorebene erzeugt. Eine Filterkombination eliminiert das Anregungslicht weitgehend und lässt nahezu nur Fluoreszenzphotonen an den Detektor (2* Bandpass 725 nm).
62.3 Durchführung eines Multi-Assays
Zunächst wird die Flusszelle mit PBS 7.0 gefüllt und mittels der Rotationseinheit der Einkoppelwinkel eingestellt.
Durch die Flusszelle werden pro Messzyklus nacheinander folgende Lösungen gepumpt:

1) 1 ml Waschpuffer PBS 7.0, Flussgeschwindigkeit 500 μl/min.
2) 1 ml Analyt 10 pM Cy 5.5 markierter human-Anitikörper, Flussgeschwindigkeit 250 μl/min.
3) 1 ml Waschpuffer PBS 7.0, Flussgeschwindigkeit 250 μl/min.
4) 1 ml chaotroper Puffer (Glycin, pH 2.6), Flussgeschwindigkeit 250 μl/min.
5) 1 ml Waschpuffer PBS 7.0, Flussgeschwindigkeit 500 μl/min.
Gegenfluss: 5 ml PBS 7.0, Flussgeschwindigkeit 300 μl/min.

Mit Hilfe von computergesteuerten Mehrfachventilen und Kolbenpumpen werden die verschiedenen Lösungen mit oben angebenener Reihenfolge und Flussgeschwindigkeit während des 15 minütigen Messzyklus durch die Flusszelle gepumpt. Die vertikale Position der Flusszelle wird mittels der Translationseinheit eingangs so eingestellt, dass der Mode genau in dem oberen Bereich der Wellenleiteroberfläche läuft, auf dem zuvor der Cy 5.5 markierte human-Antikörper immobilisiert wurde. Da dieser Streifen durch die Anregung mit dem Laserstrahl permant fluoresziert, wird die vertikale Position so justiert, dass der Photonenzähler einen maximalen Wert ergibt. Damit ist die Position des immobilisierten Cy 5.5 markierten human-Antikörpers identifiziert.
Es wird nun eine automatische Messung gestartet, bei der durch schrittweise Änderung der vertikalen Position der Flusszelle mit Hilfe der Translationseinheit entsprechend dem Abstand der immobilisierten Streifen von unten nach oben die fünf Streifen in der Reihenfolge 1–5 im 8 Sekunden Rythmus nacheinander in den Fokus des Detektors gefahren werden. Durch die beschriebene Geometrie wird der TE₀ Mode ebenfalls nur in den angewählten Bereichen erzeugt.
Während die Flusszelle mit dem Wellenleiter an einer Position verweilt, wird der in dem angewählten Bereich während einer Sekunde gemessene Zählerwert des Photonenzählers als Funktion der Zeit registriert.
Das automatische Pendeln zwischen den fünf unterschiedlichen Bereichen des Wellenleiters wird während der gesamten Messdauer von 15 min permant fortgesetzt. Währenddessen werden die oben angegebenen Lösungen mit den entsprechenden Flussraten durch die Messzelle gepumpt. Die erhaltenen Daten können als Funktion der Zeit dargestellt werden. Der Bereich, in dem der Cy 5.5 markierte human-Antikörper immobilisiert ist (Streifen/Kanal 1), fluoresziert während des gesamten Messzyklus und zeigt keine Wechselwirkung mit der als Analyt in die Messzelle gepumpten 10 pM Lösung eines Cy 5.5 markierten human-Anitikörpers. Für die Bereiche 2, 4 und 5 der Sensorplattform, an denen zuvor das Protein A immobilisiert wurde, beginnt nach 150 Sekunden ein Anstieg des Fluoreszenzsignals auf das 4–5 fache des Anfangswertes. Der Beginn des Anstiegs korreliert mit dem Zeitpunkt, zu dem der Analyt in die Flusszelle gepumpt wird. Das Signal bleibt bei diesen Kanälen fast unverändert auf einem hohen Wert, auch als nach 400 Sekunden 1 ml des Waschpuffers mit einer Flussgeschwindigkeit von 250 μl/min durch die Flusszelle gepumpt wird. Dieses Verhalten entspricht einer spezifischen Bindung des markierten Antikörpers an das Protein A. Im Bereich 3 der Sensorplattform ist zuvor als Kontrolle BSA immobilisiert worden. Dieser Streifen/Kanal zeigte erwartungsgemäss während der gesamten Messung einen sehr niedrigen Wert, da die als Analyt benutzten mit Cy 5.5 markierten human-Anitikörper nur unspezifisch mit BSA reagieren.

Claims

Verfahren zur parallelen Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen unter Verwendung einer Sensorplattform aus einem durchgehenden Trägermaterial und einer transparenten, planaren, anorganischen, dielektrischen wellenleitenden Schicht, wobei a) die transparente, anorganische, dielektrische wellenleitende Schicht mindestens im Messbereich in wenigstens zwei wellenleitende Bereiche dadurch unterteilt ist, dass der effektive Brechungsindex in den Bereichen, in denen die Welle geführt wird, grösser ist als in den umgebenden Bereichen oder dadurch, dass die Unterteilung der wellenleitenden Schicht durch ein Material auf der Oberfläche gebildet wird, welches das eingekoppelte Licht absorbiert; b) die wellenleitenden Bereiche mit je einem oder einem gemeinsamen Einkoppelgitter so versehen sind, dass die Ausbreitungsrichtung des Wellenvektors nach der Einkopplung beibehalten wird, und die wellenleitenden Bereiche gegebenenfalls mit je einem Auskoppelgitter odereinemgemeinsamen Auskoppelgitter versehen sind, c) die Dicke der wellenleitenden Schicht 40 bis 160 nm und die Modulationstiefe der Gitter 3 bis 60 nm beträgt, dadurch gekennzeichnet, dass man eine oder mehrere flüssige Proben mit einer oder mehreren wellenleitenden Bereichen auf der Sensorplattform in Kontakt bringt, Anregungslicht in die wellenleitenden Bereiche einkoppelt, es diese durchlaufen lässt, hierbei die lumineszenzfähigen Stoffe in den Proben oder die auf den wellenleitenden Bereichen immobilisierten lumineszenzfähigen Stoffe parallel im evaneszenten Feld anregt, und die dadurch erzeugten Lumineszenzen mit optoelektronischen Bauelementen misst.
Verfahren zur parallelen Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Lumineszenzanregung Laserlicht einer Wellenlänge von 300 bis 1100 nm verwendet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die isotrop abgestrahlten, evaneszent angeregten Lumineszenzen detektiert, oder die in die wellenleitende Schicht zurückgekoppelten, evaneszent angeregten Lumineszenzen über ein Auskoppelgitter oder an einer Kante der Sensorplattform detektiert, oder sowohl die isotrop abgestrahlte Lumineszenz als auch die rückgekoppelte Lumineszenz unabhängig voneinander aber simultan detektiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die parallele Einkopplung von Anregungslicht in mehrere wellenleitende Bereiche vorgenommen wird durch: a) Benutzung mehrerer Laserlichtquellen; b) Aufweitung des Strahls einer Laserlichtquelle mit bekannten, geeigneten optischen Bauteilen, so dass er mehrere wellenleitende Bereiche und Einkoppelgitter überdeckt; c) Zerlegung des Strahls einer Laserlichtquelle mit diffraktiven oder holographisch optischen Elementen in eine Vielzahl von Einzelstrahlen, die dann in die wellenleitenden Bereiche über die Gitter eingekoppelt werden; oder d) Verwendung eines Laser-Array aus Festkörperlasern.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen wellenleitenden Bereiche auf dem Trägermaterial zu Mehrfachnachweis-Bereichen angeordnet sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die wellenleitenden Bereiche in Form von getrennten Streifen, Rechtecken, Kreisen, Ellipsen oder Schachbrettmustern angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die wellenleitenden Bereiche in Form paralleler Streifen angeordnet sind, die an einem oder an beiden Enden miteinander verbunden sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Streifenzahl auf der Sensorplattform 2 bis 1000 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Mehrfachnachweis-Bereich aus 2 bis 50 getrennten wellenleitenden Bereichen besteht.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich auf der Sensorplattform 2 bis 100 Mehrfachnachweis-Bereiche befinden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorplattform die Form einer Scheibe hat, die um eine zentrische Aussparung (6) frei drehbar ist und auf der mehrere Mehrfachnachweis-Bereiche (4) tangential oder radial so angeordnet sind, dass bei einer Drehung um die Aussparung (6) unter einer Anregungs- und Nachweisoptik mehrere Mehrfachnachweise nacheinander durchgeführt werden können.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorplattform die Form eines Rechtecks oder Streifens aufweist, auf der Mehrfachnachweis-Bereiche (4) so ange ordnet sind, dass bei lateraler Bewegung der Sensorplattform unter einer Anregungs- und Nachweisoptik mehrere Mehrfachnachweise nacheinander durchgeführt werden können.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial der Sensorplattform Glas, Quarz oder ein transparenter thermoplastischer Kunststoff ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Brechungsindex der wellenleitenden Bereiche grösser als 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die wellenleitenden Bereiche aus TiO₂, ZnO, Nb₂O₅, Ta₂O₅, HfO₂, oder ZrO₂ bestehen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Modulationstiefe zur Dicke der wellenleitenden Schichten gleich oder kleiner als 0,5 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterperiode 200 bis 1000 nm beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche der wellenleitenden Bereiche ein oder mehrere spezifische Bindungspartner als chemische oder biochemische Erkennungselemente für einen oder mehrere, gleiche oder verschiedene Analyten immobilisiert sind.
Modifizierte Sensorplattform nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen den wellenleitenden Bereichen und den immobilisierten spezifischen Bindungspartnern eine Haftvermittlungsschicht befindet, deren Dicke bevorzugt gleich oder weniger als 50 nm ist.