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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung von Substrat-Materialien
mit Polyelektrolyt-Monoschichten, deren Derivatisierung mit bi-
oder multifunktionalen Reagenzien, sowie einen Signalwandler bzw.
Sensor mit derartigen funktionellen Oberflächen und dessen
Verwendung. Der Signalwandler kann insbesondere zum Nachweis von
Nukleinsäureanalyten genutzt werden.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur kovalenten Bindung
von Erkennungsmolekülen an die Oberfläche von
dielektrischen Materialien, wie optische Signalwandler vom Typ der
planaren Wellenleiter. Die dielektrischen Oberflächen werden
mit kationischen Polyelektrolyten modifiziert, die dann mit bi-
oder multifunktionellen Reagenzien umgesetzt werden. Auf den so
aktivierten Oberflächen können Erkennungselemente,
wie DNA bzw. RNA oder Proteine, kovalent immobilisiert werden. Stellen, die
keine Erkennungsmoleküle tragen, können schließlich
durch Reaktion mit hydrophilen Agentien im Hinblick auf eine nicht
spezifische Adsorption modifiziert werden.
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Solche
beschichtete dielektrische Materialien, z. B. beschichtete optische
Wellenleiter, finden Anwendung als Signalwandler (Transducer), wie
sie in der Sensorik bei Bio- oder Chemosensoren eingesetzt werden.
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Als
Bio- oder Chemosensoren bezeichnet man Geräte, die mit
Hilfe eines Signalwandlers und einer Erkennungsreaktion einen Analyten
qualitativ oder quantitativ nachweisen können. Als Erkennungsreaktion
wird ganz allgemein die spezifische Bindung oder Reaktion eines
so genannten Analyten mit einem so genannten Erkennungselement bezeichnet.
Beispiele für Erkennungsreaktionen sind die Bindung von
Liganden an Komplexe, die Komplexierung von Ionen, die Bindung von
Liganden an (biologische) Rezeptoren, Membranrezeptoren oder Ionenkanäle,
von Antigenen oder Haptenen an Antikörper, von Substraten
an Enzyme, von DNA oder RNA an bestimmte Proteine, die Hybridisierung
von DNA/RNA/PNA oder die Prozessierung von Substraten durch Enzyme.
Analyten können sein: Ionen, Proteine, natürliche
oder künstliche Antigene oder Haptene, Hormone, Cytokine,
Mono- und Oligosaccharide, Stoffwechselprodukte, oder andere biochemische
Marker, die in der Diagnostik verwendet werden, Enzymsubstrate,
DNA, RNA, PNA, potentielle Wirkstoffe, Medikamente, Zellen, Viren.
Beispiele für Erkennungselemente sind: Komplexbildner für
Metalle/Metallionen, Cyclodextrine, Kronenether, Antikörper,
Antikörperfragmente, Anticaline1,
Enzyme, DNA, RNA, PNA, DNA/RNA-bindende Proteine, Enzyme, Rezeptoren,
Membranrezeptoren, Ionenkanäle, Zelladhäsionsproteine,
Ganglioside, Mono- oder Oligosaccharide.
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Diese
Bio- oder Chemosensoren können in der Umweltanalytik, dem
Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik
und dem Pflanzenschutz eingesetzt werden, um Analyten qualitativ und/oder
quantitativ zu bestimmen. Die Spezifität der Erkennungsreaktion
ermöglicht es, auch Analyten in komplexen Proben wie z.
B. Umgebungsluft, verschmutztem Wasser oder Körperflüssigkeiten
ohne oder nur mit geringer vorheriger Aufreinigung qualitativ oder
quantitativ zu bestimmen. Zusätzlich können Bio-
oder Chemosensoren auch in der (bio-)chemischen Forschung und Wirkstoffsuche
eingesetzt werden, um die Interaktion zwischen zwei unterschiedlichen
Substanzen zu untersuchen (z. B. zwischen Proteinen, DNA, RNA, oder
biologisch aktiven Substanzen und Proteinen, DNA, RNA etc.).
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Die
Integration der Erkennungsreaktion mit dem Signalwandler zu einem
Bio- oder Chemosensor kann geschehen, indem man das Erkennungselement
oder den Analyten auf der Oberfläche des Signalwandlers
immobilisiert. Durch die Erkennungsreaktion, d. h. das Binden oder
die Reaktion des Analyten mit dem Er kennungselement, ändern
sich die optischen Eigenschaften des Mediums direkt an der Oberfläche
des Signalwandlers (z. B. Änderung des optischen Brechungsindexes,
der Absorption, der Fluoreszenz, der Phosphoreszenz, der Lumineszenz etc.),
was vom Signalwandler in ein Messsignal übersetzt wird.
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Optische
Wellenleiter sind eine Klasse von Signalwandlern, mit denen man
die Änderung der optischen Eigenschaften eines Mediums
detektieren kann, das an eine wellenleitende Schicht, typischer Weise
ein Dielektrikum, grenzt. Wird Licht als geführte Mode
in der wellenleitenden Schicht transportiert, fällt das
Lichtfeld an der Grenzfläche Medium/Wellenleiter nicht
abrupt ab, sondern klingt in dem an den Wellenleiter angrenzenden
sogenannten Detektionsmedium exponentiell ab. Dieses exponentiell
abfallende Lichtfeld wird als evaneszentes Feld bezeichnet. Werden
sehr dünne Wellenleiter verwendet, deren Brechungsindex
möglichst stark von dem des angrenzenden Mediums differiert,
werden Abfalllängen des evaneszenten Feldes (Intensität
fällt auf den Wert 1/e ab) von < 200 nm erreicht. Ändern sich
die optischen Eigenschaften des an den Wellenleiter grenzenden Mediums
(z. B. Änderung des optischen Brechungsindexes2,3,
der Lumineszenz4,5,6 etc.) innerhalb des
evaneszenten Feldes, kann dies über einen geeigneten Messaufbau
detektiert werden. Entscheidend für die Verwendung von
Wellenleitern als Signalwandler in Bio- oder Chemosensoren ist dabei, dass
die Änderung der optischen Eigenschaften des Mediums nur
sehr nahe an der Oberfläche des Wellenleiters detektiert
wird. Wird nämlich das Erkennungselement oder der Analyt
an der Grenzfläche des Wellenleiters immobilisiert, kann
das Binden an das Erkennungselement oder die Reaktion des Erkennungselementes
oberflächensensitiv detektiert werden, wenn sich dabei
die optischen Eigenschaften des Detektionsmediums (flüssig,
fest, gasförmig) an der Grenzfläche zum Wellenleiter ändern.
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Bei
der Verwendung von optischen Wellenleitern als Bio- oder Chemosensoren
werden an die Grenzfläche Wellenleiter zu Detektionsmedium
hohe Anforderungen gestellt:
- • Unter
den Reaktionsbedingungen der Erkennungsreaktion muss die Grenzfläche
Wellenleiter/Detektionsmedium stabil sein.
- • Die Erkennungselemente müssen innerhalb
der Reichweite des evaneszenten Feldes des Wellenleiters immobilisiert
werden.
- • Unter den Reaktionsbedingungen der Erkennungsreaktion
muss die Immobilisierung der Erkennungselement stabil sein.
- • Die Funktionalität der Erkennungselemente muss
auch nach der Immobilisierung noch vorhanden sein.
- • Damit nur die spezifische Erkennungsreaktion durch
den Signalwandler detektiert wird, muss jede Art von unspezifischer
Bindung an die Grenzfläche Wellenleiter/Detektionsmedium
unterdrückt werden.
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An
die Oberfläche von Wellenleitern können auf verschiedenste
Weise Erkennungselemente immobilisiert werden. Dies kann z. B. durch
Physisorption der Erkennungselemente auf die Signalwandleroberfläche
geschehen. Clerc und Lukosz7 beschreiben
die Physisorption von Avidin auf SiO2-TiO2 Wellenleiteroberflächen. In einem
zweiten Schritt können unter Ausnutzung der hochaffinen
Avidin-Biotin Bindung biotinylierten Antikörpern an die
so aufgebrachten Avidin Schichten immobilisiert werden. Ein Nachteil
dieser Immobilisierungsmethode von Erkennungselementen auf Wellenleiteroberflächen
ist die Instabilität der physisorbierten Avidinschicht.
Eine Änderung der Reaktionsbedingungen, wie z. B. Temperaturänderungen,
pH-Änderungen, Zugabe von Detergenzien etc., kann zu einer
Desorption der Avidinschicht und damit auch des Antikörpers
führen.
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G.
Gao beschreibt in Surface & Coating Technology
(2005) 244–250 eine „oxygen plasma” Methode,
die eine adsorptive Bindung von DNA an Silika Wafer ermöglicht.
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Es
ist jedoch bekannt, dass durch Plasma Behandlung erzeugte aktivierte
Oberflächen keine gute Langzeitbeständigkeit be sitzen
und deshalb hinsichtlich Reproduzierbarkeit kritisch zu beurteilen sind.
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Eine
besonders elegante Form der physisorptiven Bindung von Erkennungselementen
ist in
WO 2007/079863 beschrieben.
Auf der Oberfläche von Wellenleitern werden hochmolekulare
Polyelektrolyte, bspw. Polyvinylaminhydrochloride mit Molgewichten
von über 300 000 g/mol, durch Tauchprozesse gebunden. Auf
der so kationisch modifizierten Oberfläche können
nun DNA oder RNA Erkennungselemente (capture DNA bzw. Fänger
DNA, capture DNA bzw. Fänger RNA) physisorptiv, über
Polyelektrolyt Wechselwirkungen gebunden werden. Die nicht mit Erkennungselementen
versehenen Oberflächen können anschließend
mit anionischen Polyelektrolyten, bspw. mit Dextransulfat durch
einfache Tauchprozesse gegen nicht spezifische Bindungen blockiert
werden. Limitierend bei dieser Methode ist, dass nur relativ hochmolekulare
DNA bzw. RNA Fänger-Moleküle in ausreichender
Stärke über Polyelektrolyt Wechselwirkungen gebunden
werden können. Dagegen können Protein Erkennungselemente,
wie Antikörper nicht mit ausreichender Stabilität über
Polyelektrolyt Wechselwirkungen gebunden werden.
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Die
Erkennungselemente, auch „capture” oder „Fänger”-Moleküle
genannt, können auch kovalent an die Oberfläche
eines Wellenleiters gebunden werden. Eine Möglichkeit dazu
stellen bifunktionelle Silane dar, die eine kovalente Bindung mit
der Wellenleiteroberfläche eingehen8. Über
eine zweite funktionelle Gruppe in diesem Silan können
nun die Erkennungselemente, wie z. B. Proteine oder DNA9,
kovalent gebunden werden. Diese bifunktionellen Silane sind sehr
reaktiv und bei der kovalenten Bindung an die Wellenleiteroberfläche
muss unter absolut trockenen Reaktionsbedingungen gearbeitet werden, um
eine Hydrolyse des reaktiven Silans zu vermeiden. Die Bindung der
Erkennungselemente über diese Silane an die Wellenleiteroberflächen
ist bei sauren, neutralen und leicht basischen Bedingungen stabil.
Bei pH-Werten über 9 kann aber eine Hydrolyse des Silans
eintreten, was zu einer Desorption der Erkennungselemente von der
Oberfläche führen kann. Ein weiterer Nachteil
dieser Immobilisierungsmethode liegt in der relativ hohen unspezifischen
Adsorption von Proteinen wie z. B. Albumin an die so funktionalisierten
Wellenleiteroberflächen10. Die
unspezifische Bindung an diese Wellenleiteroberflächen
kann reduziert werden, indem nach der Bindung der Erkennungselemente
in einem zweiten Schritt Blockierungsagenzien wie z. B. Polyethylenglykole11 an die Oberfläche gebunden werden.
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In
US 5 512 492 ist ein anderer
kovalenter Bindungsmechanismus beschrieben. Die Wellenleiteroberfläche
wird mit 3-Aminopropyltriethoxysilan umgesetzt. Die so Amin-funktionalisierte
Oberfläche wird Glutardialdehyd-derivatisiert. Anschließend
werden die noch frei verfügbaren Aldehydgruppen durch Umsetzen
mit Polymethacryloylhydrazid quervernetzt und die noch überschüssigen
Acryloylhydrazid Gruppen stehen schließlich zur kovalenten
Anknüpfung der biologischen Fänger-Moleküle
zur Verfügung. Es handelt sich hierbei um einen relativ
komplexen Prozess, der auch hinsichtlich Reproduzierbarkeit kritisch
zu beurteilen ist.
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Alternativ
wird die Bindung von hydrophilen Polymeren, wie z. B. Polyacrylamide,
Dextrane, Polyethylenglycole etc. an zuvor silanisierte Wellenleiteroberflächen
beschrieben12. Diese Polymere haben die
Aufgabe, die unspezifische Bindung von Proteinen etc. an die Oberfläche
zu minimieren. Die Erkennungselemente werden dann in einem weiteren Schritt
an diese Polymere kovalent gebunden. Problematisch bei dieser Oberflächenfunktionalisierung ist,
dass mehrere Schritte zur Immobilisierung der Erkennungselemente
an der Oberfläche durchgeführt werden müssen
und die Instabilität der Silanbindung an die Wellenleiteroberflächen
bei pH > 9.
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Die
Erkennungselemente können auch an Polymere gebunden werden,
die ohne vorangegangene Silanisierung direkt auf die Wellenleiterschichten
aufgebracht werden.
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Polymere
mit reaktiven Ankergruppen als Interface zwischen Wellenleiteroberfläche
und Erkennungselement ist Inhalt der vorliegenden Beschreibung.
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Unter
Berücksichtigung der o. g. Anforderungen an die Grenzfläche
Wellenleiter/Detektionsmedium muss das Polymer-Interface unter den
Reaktionsbedingungen sowohl zum Substrat als auch zum Erkennungselement
eine irreversible Bindung ermöglichen und es muss, wegen
der mit 1/e abfallenden Intensität möglichst dünn
sein.
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Von
Vorteil wären deshalb Polymer-Monoschichten, die darüber
hinaus, nach dem Ankoppeln der punktuell angeordneten Erkennungselemente, eine
Blockierung gegen nichtspezifische Adsorption von Störkomponenten
in einem möglichst einfachen Verfahrensschritt ermöglichen.
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Da
die Oberflächen von Wellenleiterschichten, bzgw. generell
von Substraten je nach Anwendungsgebiet verschieden und in der Regel
bzgl. Oberflächenchemie nicht exakt bekannt sind, ist die Bereitstellung
von geeigneten Polymeren eine große Herausforderung zur
Herstellung leistungsfähiger Bio- oder Chemosensoren.
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Es
hat deshalb nicht an Versuchen gefehlt, durch Synthese maßgeschneiderte
Polymere für bestimmte Substratoberflächen herzustellen.
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Hinsichtlich
Beschichtung von Substraten mit Metalloxid Oberflächen,
wie TiO2, Nb2O5 oder Ta2O5 sind bspw. auch ionische Polymere beschrieben.
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In
WO 03/020966 sind Poly(L-Lysin)-g-poly(ethylenglykol)
Pfropfcopolymere (PLL-g-PEG) beschrieben. Dabei bezeichnet „g” das
Pfropfverhältnis (grafting ratio), d. h. den Quotienten
aus der Anzahl der Lysineinheiten und der Anzahl Polyetylenglykol Setenketten.
Dabei hat sich gezeigt, dass mit diesen PLL-g-PEG Pfropf-Copolymeren
nur dann gute Ergebnisse erzielt werden können, wenn das
Pfropfverhältnis „g” innerhalb der Bandbreite
8 bis 12 liegt und die PEG Seitenketten im Molekulargewichtsbereich von
1500 bis 5000 g/mol liegen.
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Dieses
komplexe und eng definierte Spezialpolymer erfüllt die
gestellten Forderungen bzgl. guter Verfügbarkeit, gleich
bleibender Qualität und universelle Anwendbarkeit für
unterschiedliche Substratoberflächen nur unzureichend.
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Ein
weiterer Nachteil dieser Methode stellt die Instabilität
dieser Schichten gegenüber pH-Werten von kleiner 3 und
größer 9, sowie gegenüber hohen Salzkonzentrationen
dar, da unter diesen Bedingungen das elektrostatisch gebundene Polymer
von der Oberfläche desorbiert.
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In
WO 02/068481 sind phosphorhaltige
Polymere zur Beschichtung von dielektrischen Materialien und dessen
Verwendung bei optischen Signalwandlern beschrieben. Es handelt
sich hierbei um wasserlösliche Polymere, die bspw. durch
Umsetzen von Polyallylaminhydrochlorid mit Formaldehyd und phosphoriger
Säure, nach der sog. Mannich Mödritzer Reaktion,
hergestellt werden.
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Diese
Polyphosphonamide besitzen neben kationischen auch anionische Gruppen,
die einer Ankopplung von Erkennungsmolekülen, bspw. DNA
auf elektrostatischem Wege, eher kontraproduktiv sind. Darüber
hinaus handelt es sich erfahrungsgemäß bei der
o. g. Mannich Mödritzer Umsetzung um ein Verfahren, das
wegen Nebenreaktionen neben den gewünschten Polyphosphonamiden
auch andere Produkte bildet.
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Auf
Polyelektrolytbindung basierende Gen Chip Konzepte sind dagegen
wegen ihrer einfachen Herstellweise, besonders bevorzugte Ausführungsformen
bei der Beschichtung von Bio- und Chemorezeptoren.
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B.
Laguitton beschreibt in
US 6
689 478 die Ankopplung von DNA Erkennungsmolekülen
an Polyelektrolyt(PEL)- Multischichten, wobei die oberste Bindungsschicht
ein kationisches Polymer (kationischer PEL) ist. Polyelektrolyte
sind Polymere, die ionische oder ionisierbare Gruppen in ihrer wiederkehrenden
Einheit tragen. Beispiele für kationische Polyelektrolyte
sind Polyamine, wie Polyethylenimin (PEI) oder Polyammoniumverbindungen,
wie Polyallylaminhydrochlorid oder Polydiallyldimethylammoniumchlorid
(P DADMAC). Beispiele für anionische Polymere sind die
Salze von Polyacrylsäuren (PAS), Polystyrolsulfonsäuren
oder Dextransulfonsäure. Polyelektrolyt-Multischichten
bestehen aus einem abwechselnden Aufbau von entgegengesetzt geladenen
Polyelektrolyten, wie bspw. in
„Multilayer Thin
Films" G. Decher, Wiley-VCH, 2003 beschrieben.
Während die Bindung von Nukleinsäuren an PEL Multischichten ebenfalls
zum Stand der Technik gehört (
B. Sukhoukov, „Multilayer
Films Containing Immobilized Nucleic Acids" Biosensors & Bioelectronics,
vol 11, no 9, 913–922, 1966), besteht die Herausforderung,
wie in
US 6 689 478 beschrieben
darin, die erste Polymerschicht, ein kationisches Polymer an das
Substrat aus Glas zu binden. Diese Herausforderung wird dadurch
gelöst, dass die Glasträger zunächst
in einer komplexen Art mit Wasserstoffperoxid und anschließend
mit Schwefelsäure behandelt werden, wobei die Glasoberfläche
anionisch modifiziert wird. Dagegen argumentiert B. Languitton in
US 6 689 478 , dass mit Monolayer
Polymerschichten, die Anforderungen hinsichtlich zuverlässiger
Substratbeschichtung nicht erreicht werden können.
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Ein
wichtiger Fortschritt hinsichtlich Anknüpfung von biologischen
Erkennungsmolekülen an planare Wellenleiter (PWG) wäre
dementsprechend ein Verfahren, das ähnlich einfach, wie
das in
WO 2007/079863 beschriebene
Polyelektrolyt Konzept ist, gleichzeitig jedoch einen kovalenten
Bindungsmechanismus erlaubt. Außerdem wäre es
von Vorteil, wenn bzgl. Auswahl an kationischen Polyelektrolyten
nicht die in
WO 2007/079863 erwähnten
sehr hohen Molekulargewichte (vzgw. höher 250 000 g/mol)
erforderlich wären, da hierdurch eine erhebliche Einschränkung
bzgl. Polymerauswahl vorgegeben ist. Außerdem enthalten
auch sehr hochmolekulare Verbindungen, wegen der Mole kulargewichtsverteilung,
niedermolekulare Komponenten, sodass hinsichtlich Reproduzierbarkeit
erschwerte Bedingungen auftreten können.
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Es
wurde nun überraschenderweise gefunden, dass das in
WO 2007/079863 beschriebene
Polyelektrolytkonzept durch einen zusätzlichen, Tauch-/Waschprozess
diese Anforderungen erfüllen kann. Der zusätzliche
Tauchschritt beinhaltet bi- oder multifunktionelle, niedermolekulare
oder hochmolekulare reaktive Verbindungen, im Folgenden auch als reaktive
Linker-Moleküle bezeichnet. Im einfachsten und bevorzugten
Fall kann bspw. Isophorondiisocyanat (IPDI) verwendet werden. Außerdem
können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
auch Polyelektrolyte und Polyamine in beliebigen Molekulargewichtsbereichen
eingesetzt werden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung umfasst insbesondere die in den nachfolgenden nummerierten
Absätzen bezeichneten Erfindungsgegenstände:
- 1. Verfahren zur Applikation von Messbereichen (Spots)
mit Fänger-Molekülen an einer Substratoberfläche
für einen Sensor (Chip), aufweisend folgende Schritte:
a)
Die Substratoberfläche des Sensors (Chip) wird in die verdünnte
Lösung eines kationischen Polyelektrolyts getaucht und
abgewaschen;
b) die Polyelektrolyt modifizierte Substratoberfläche
wird durch Tauchen in eine Reagenzlösung mit mindestens
einer bi- oder multifunktionellen Verbindung, welche mindstens zwei
funktionelle Gruppen aufweisen, die jeweils mit dem Polyelektrolyt
und/oder dem Fängermolekül reagieren können
quervernetzt und aktiviert;
c) auf die aktivierte Substratoberfläche
wird mindestens ein Fängermolekül aufgebracht;
und
d) der mit dem mindestens einen Fängermolekül bespottete
Sensor wird durch Tauchen in eine Reagenzlösung, die eben falls
mit der aktivierten Oberfläche reagieren kann, gegen nicht
spezifische Adsorption blockiert.
- 2. Verfahren nach Absatz 1, wobei die Substratoberfläche
ein Metalloxid oder Metallhydroxid aufweist.
- 3. Verfahren nach Absatz 2, wobei das Metalloxid Metalloxid
oder Metallhydroxid gewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Ta2O5, TiO2, Ta2O5,
ZrO2, HfO2, Al2O3, SiO2 (Si(Ti)O2), In2O3/SnO2 (ITO), Aluminumsilicate, Nb2O5, Vanadiumoxide, oder Mischungen dieser
Materialien, Oxide oder Hydroxide folgender Elemente Sc, Y, Ti,
Zr, Hf, V, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni,
PD, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Cd, Hg, B, Al, Ga, In, Tl, Ge, Sn, Pb, As,
Sb, Bi, Lanthanide, Actinide Be, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra Se, Te, Po und
Mischungen davon.
- 4. Verfahren nach einem der vorherigen Absätze, wobei
der kationische Polyelektrolyt ein Polyamin oder ein Polyimin aufweist.
- 5. Verfahren nach einem der vorherigen Absätze, wobei
die bi- oder multifunktionelle Reagenzlösung Dissuccinimidylsuberat
(DSS), wasserlösliche heterobifunktionelle Grosslinker,
Sulfosuccinimidy-4-(N-Maleimidoethyl)Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC)
Isocyanatverbindungen, Isophorondiisocyanat (IPDI), Polyisocyanate
auf Isocyanuratbasis, bi- oder multifunktionelle Säurechloride,
Polymethacryloylchlorid, Polycarbodiimide, oder Mischungen davon
aufweist.
- 6. Verfahren nach einem der vorherigen Absätze, wobei
die Blockierlösung Hydroxyl- oder Amin-haltige hydrophile
Verbindungen, insbesondere Dextransulfat, Diethanolamin, Polyethylenglykol
oder Mischungen davon aufweist.
- 7. Verfahren nach einem der vorherigen Absätze, wobei
der Sensor ein optischer Sensor ist.
- 8. Verfahren nach Absatz 7, wobei der Sensor einen optischen
Schichtwellenleiter aufweist.
- 9. Verfahren nach einem der vorherigen Absätze, wobei
eine Mehrzahl von unterschiedlichen Fängermolekülen
aufgebracht wird.
- 10. Substrat, aufweisend eine Oberfläche zur Immobilisierung
mindestens eines Fänger-Moleküls als Erkennungselement
zur Herstellung einer Erkennungsoberfläche zum Nachweis
mindestens eines Zielmoleküls in einer oder mehrerer mit
der Erkennungsoberfläche in Kontakt gebrachter Proben,
wobei das Fänger-Molekül auf einer kationischen
hochmolekularen Polyelektrolyte Schicht als Oberfläche
zur Immobilisierung aufgebracht ist.
- 11. Substrat nach Absatz 10, wobei auf der Substratoberfläche
bis zu 2 000 000 Messbereiche (Spots) vorgesehen sind, wobei in
jedem Messbereich ein Fängermolekül als Erkennungselement vorgesehen
ist.
- 12. Substrat nach Absatz 10 oder 11, wobei eine Mehrzahl von
unterschiedlichen Fängermolekülen vorgesehen ist,
wobei in jedem Messbereich jeweils nur eine Spezies eines Fänger-Moleküls vorgesehen
ist.
- 13. Substrat nach Absatz 10, 11 oder 12, wobei mindestens 100
Messbereiche pro Quadratzentimeter angeordnet sind.
- 14. Substrat nach Absatz 10, 11, 12, oder 13, wobei das Fänger-Molekül
eine Nukleinsäure ist.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung wird im Folgenden beschrieben anhand von Beispielen und
anhand der Figur, welche die Signalintentstät von Messbereichen
gegenüber dem Hintergrundsignal eines erfindungsgemäß hergestellten
Sensors zeigt.
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Die
Erfindung wird ferner beispielhaft beschrieben anhand von Wellenleitern
welche als Sensoren genutzt werden. Die Erfindung ist grundsätzlich
auch für andere Sensoren anwendbar, z. B. andere optische
Sensoren, magnetische Sensoren, elektrische Sensoren, elektrochemische
Sensoren und andere.
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Erfindungsgemäß enthält
der Gesamtprozess zur Applikation von Messbereichen an adressierbaren
Positionen (sogenannte „Spots”) mit Fänger-Molekülen
an der Oberfläche eines planaren Wellenleiters (planar
waveguide, PWG) in der bevorzugten Version folgende vier Teilschritte:
- 1. Der planare Wellenleiter (Chip) wird in
die verdünnte Lösung eines kationischen Polyelektrolyts,
bspw. wässrige Polyvinylamin oder alkoholische lineare
Polyethylenimin Lösung, getaucht und abgewaschen (Polyelektrolyt
Beschichtung).
- 2. Der Polyelektrolyt modifizierte Chip wird durch Tauchen in
eine bi- oder multifunktionelle Reagenzlösung, bspw. IPDI
Lösung in Toluol, quervernetzt und aktiviert. (Aktivierung)
- 3. Die aktivierte Chipoberfläche wird mit den Fänger-Molekülen,
deren funktionelle Gruppen mit der Aktivierung kovalent reagieren
können, bespottet. (Spot Schritt)
- 4. Der bespottete Chip wird durch Tauchen in eine Reagenzlösung,
die ebenfalls mit der aktivierten Oberfläche reagieren
kann, bspw. wässrige Dextransulfat Lösung, gegen
nicht spezifische Adsorption blockiert. (Blockschritt).
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Der
so mit Fänger-spots versehene planare Wellenleiter kann
direkt durch Probenaufgabe für die Erkennungsreaktion,
bspw. nach dem Prinzip der Hybridisierung, eingesetzt werden.
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In
einer weiteren Version kann der eben beschriebene Gesamtprozess
durch einen weiteren Schritt, der dem ersten Schritt der Polyelektrolyt
Beschichtung vorgeschaltet wird, modifi ziert werden. Hierbei kann
die Chip Oberfläche mit den im Schritt zwei erwähnten
bi- oder multifunktionellen Reagenzien voraktiviert werden (Voraktivierungsschritt).
Im einfachsten und bevorzugten Fall besteht die Voraktivierung in
einem Tauchschritt mit einem Diisocyanat, wie IPDI.
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Im
Folgenden sollen die Einzelkomponenten, die zur Modifizierung der
Substratoberflächen eingesetzt werden können,
näher beschrieben werden.
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Hinsichtlich
kationischer Polyelektrolyte kommen die an sich bekannten Polyamine
in den für sie typischen Molekulargewichtsverteilungen
in Frage. Polyamine liegen in wässriger Umgebung teilprotoniert
vor und besitzen daher die Eigenschaften kationischer Polyelektrolyte.
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Bspw.
können die von der Fa. BASF hergestellten Polyvinylamine,
die unter dem Handelsnamen Lupamin® in
verschiedenen Molekulargewichtsbereichen (von 10 000 bis 340 000
g/mol) erhältlich sind, eingesetzt werden. Neben der reinen
Amin Form werden diese Produkte durch Umsetzen mit HCl auch in Form
ihrer Hydrochloride, mit einem Hydrochlorierungsgrad von ca. 50%,
angeboten. Somit liegen bei diesen Polvinylaminen ca. 50% der Aminogruppen
frei vor, während die restlichen 50% der Aminogruppen als
Ammoniumhydrochlorid derivatisiert sind. Diese teilprotonierte Form
ist, sowohl im Falle von Polyvinylamin, als auch bei den anderen Polyaminen,
die bevorzugte Verwendungsform.
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Andere
gut verfügbare Polyamine sind Polyallylamin, das in Molekulargewichtsbereichen
von 17 000 sowie 65 000 g/mol von Aldrich erhältlich ist,
sowie verzweigtes Polyethylenimin, das von BASF in verschiedenen
Molekulargewichtsbereichen bezogen werden kann. Von Polyscience
sind auch lineare Polyethylenimine, die Alkohol löslich
sind, erhältlich.
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Hinsichtlich
der multi- wenigstens bifunktionellen reaktiven Verbindungen, die
einerseits mit der Polyamin modifizierten Oberfläche reagieren
und andererseits noch über kovalente Ankergruppen zur Immobilisierung
der biologischen Fänger-Moleküle verfügen,
gibt es eine breite Auswahl. Bspw. können Wasser lösliche
homobifunktionale Cross-linker, wie Dissuccinimidylsuberat (DSS)
oder wasserlösliche heterobifunktionelle Cross-linker,
wie Sulfosuccinimidy-4-(N-Maleimidoethyl)Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC)
eingesetzt werden. Es können aber auch organisch lösliche
bi- oder multifunktionelle Verbindungen, bspw. auf Isocyanatbasis,
erhältlich unter dem Produktnamen Desmodur®,
eingesetzt werden. Bevorzugt eingesetzt wurde bspw. Isophorondiisocyanat
(IPDI), gelöst in Toluol oder Aceton, das von Bayer Material
Science unter dem Produktnamen Desmodur I erhältlich ist.
Gute Ergebnisse wurden auch mit Desmodur Z 4470, das sind Polyisocyanate auf
Isocyanuratbasis, erzielt. Weitere mögliche Produktklassen
sind bspw. bi- oder multifunktionelle Säurechloride, wie
Polymethacryloylchlorid oder Polycarbodiimide, die bspw. unter dem
Produktnamen Stabaxol® von der
Fa. Rheinchemie erhältlich sind.
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Auch
bzgl. der im dritten Verfahrensschritt (Blockierung) eingesetzten
Verbindungen, die die PWG Oberfläche gegen nicht spezifische
Bindungen schützen sollen, gibt es eine breite Auswahl.
Es kommen sowohl organisch als auch Wasser lösliche nieder
und hochmolekulare Verbindungen in Frage, wobei zwei Auswahlkriterien
essentiell sind. Zum einen müssen diese Verbindungen mit
den bi- bzw. multifunktionellen Linkermolekülen aus Verfahrenschritt zwei
reagieren können und zum anderen muss der nicht reagierte
Molekülteil nicht spezifische Bindungen verhindern. Werden
bspw. Isocyanat haltige Linkermolekül eingesetzt, so können
Hydroxyl- oder Aminhaltige hydrophile Verbindungen verwendet werden.
In Kombination mit IPDI wurde bevorzugt das in
WO 2007/079863 beschriebene Dextransulfat, ein
anionischer Polyelektrolyt, eingesetzt. Alternativ könnten
auch niedermolekulare Verbindungen, wie Diethanolamin, oder Polyethylenglykole
verwendet werden.
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Das
beschriebene Verfahren, basierend auf Polyaminen als Interface zwischen
planarem Wellenleiter und Erkennungselemente bezieht sich auf Substrate
mit Metalloxid-, vzgw. Ta2O5 Oberflächen.
Als weitere Metalloxide kommen Materialien, wie TiO2, Ta2O5, ZrO2,
HfO2, Al2O3, SiO2 (Si(Ti)O2), In2O3/SnO2 (ITO), Aluminumsilicate, Nb2O5, Vanadiumoxide, oder Mischungen dieser
Materialien in Frage. Die Wellenleitermaterialien können
aber auch Oxide oder Hydroxide folgender Elemente sein, die Oxide
oder Hydroxide bilden können: Sc, Y, Ti, Zr, Hf, V, Nb,
Ta, Cr, Mo, W, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, PD, Pt, Cu,
Ag, Au, Zn, Cd, Hg, B, Al, Ga, In, Tl, Ge, Sn, Pb, As, Sb, Bi, Lanthanide,
Actinide und Mixturen davon ebenso wie Mixturen von Gruppe IIa (Be,
Mg, Ca, Sr, Ba, Ra) und VIb (Se, Te, Po)).
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Das
Polymer (Polyelektrolyt Beschichtung) wird aus organischer oder
bevorzugt wässriger Lösung auf die Wellenleiteroberflächen
aufgebracht. Dies kann durch Inkubation in der Lösung,
wie Tauchen, Sprühen, Spotten, Spincoating oder ähnliche übliche
Verfahren geschehen. Typischerweise werden Lösungen zwischen
0,5 bis 0.001 Gew.-%, insbesondere zwischen 0,1 und 0.01 Gew.-%,
verwendet und die Substratoberflächen bei Temperaturen zwischen
0 und 200°C, insbesondere zwischen 20 und 30°C,
beschichtet. Die Inkubationszeit der Wellenleitermaterialien mit
den Polymer-Lösungen kann zwischen 10 s und 48 h liegen,
typischerweise zwischen 10 min und 24 h. Nach der Inkubation werden die
Substrate, z. B. Wellenleiter in Chip-Form), mit organischen Lösungsmitteln
oder wässrigen Lösungen gespült und mit
bi- oder multifunktionellen derivatisiert, bzw. aktiviert.
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Die
auf die beschriebene Weise beschichteten Wellenleiterchips können
für jede Art von qualitativer, semiquantitativer oder quantitative
analytische Assays verwendet werden.
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Eine
Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Immobilisierungsoberflächen ist die Verwendung auf optisch
transparenten Trä gern, die dadurch gekennzeichnet sind,
dass sie durchgehende oder einzelne wellenleitende Bereiche umfassen
(optische Wellenleiter). Besonders bevorzugt handelt es sich bei
dem optischen Wellenleiter um einen optischen Schichtwellenleiter
mit einer, der Immobilisierungsoberfläche zugewandten,
ersten im wesentlichen optisch transparenten Schicht (a) auf einer
zweiten im wesentlichen transparenten Schicht (b) mit niedrigeren
Brechungsindex als Schicht (a). Außerdem wird bevorzugt,
dass besagter optischer Wellenleiter im Wesentlichen planar ist.
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Kennzeichen
einer derartigen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen
Immobilisierungsoberfläche auf einem optischen Schichtwellenleiter
als Träger ist, dass zur Einkopplung von Anregungswellenlicht
in die optisch transparenten Schicht (a), diese Schicht in optischen
Kontakt zu einem oder mehrerer optischen Einkoppelelementen aus
der Gruppe steht, die von Prismenkopplern, evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern
mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten
fokussierten Linsen und Gitterkopplern gebildet wird.
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Dabei
wird bevorzugt, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die optisch
transparente Schicht (a) mithilfe einer oder mehrerer Gittestrukturen
(c) erfolgt, die in der optisch transparenten Schicht (a) ausgebildet
sind.
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Ein
Gegenstand der Erfindung ist eine Oberfläche zur Immobilisierung
einer oder mehrerer erster Nukleinsäuren als Erkennungselemente
zur Herstellung einer Erkennungsoberfläche zum Nachweis
einer oder mehrere zweiter Nukleinsäuren in einer oder mehrerer
mit der Erkennungsoberfläche in Kontakt gebrachter Proben,
wobei die ersten Nukleinsäuren auf einer kationischen hochmolekularen
Polyelektrolyte Schicht als Oberfläche zur Immobilisierung
aufgebracht sind.
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Besonders
bevorzugt werden solche Ausführungsformen einer erfindungsgemäßen
Immobilisierungsoberfläche, bei denen die darauf immobilisierten
Nukleinsäuren als Erkennungselemente in diskreten (räumlich
getrennten) Messbereichen angeordnet sind. In einer zweidimensionalen
Anordnung können bis zu 2 000 000 Messbereiche angeordnet sein,
und ein einzelner Messbereich kann eine Fläche von 10–5 mm2 bis
10 mm2 einnehmen. Es wird bevorzugt, dass
die Messbereiche in einer Dichte von mehr als 100, bevorzugt mehr
als 1000 Messbereiche pro Quadratzentimeter angeordnet sind.
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Die
diskreten (räumlich getrennten) Messbereiche auf besagter
Immobilisierungsoberfläche können durch räumlich
selektive Aufbringung von Nukleinsäuren als Erkennungselemente
erzeugt werden, vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer
Verfahren aus der Gruppe von Verfahren, die von „ink jet
Spotting”, mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder
Kapillare, „Micro contact spotting”, fluidischer
Kontaktierung des Messbereichs mit den biologischen oder biochemischen
oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen
oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden
oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen sowie photochemischen
oder photolitographischen Immobilisierungsverfahren gebildet wird.
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Weiterer
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum gleichzeitigen oder
sequentiellen, qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer oder
mehrerer zweiter Nukleinsäuren in einer oder mehrerer Proben,
dadurch gekennzeichnet, dass besagte Proben und gegebenenfalls weitere
Reagenzien mit einer der erfindungsgemäßen Immobilisierungsoberflächen
nach einer der genannten Ausführungsformen in Kontakt gebracht
werden, auf welcher eine oder mehrere Nukleinsäuren als
Erkennungselemente zur spezifischen Bindung/Hybridisierung mit zweiten
Nukleinsäuren gebunden sind und aus der Bindung/Hybridisierung
dieser zweiten Nukleinsäure oder weiter zum Analytnachweis
eingesetzter Nachweissubstanzen resultierende Änderung
von optischen oder elektrischen Signalen gemessen werden.
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Dabei
wird bevorzugt, dass der Nachweis einer oder mehrerer zweiter Nukleinsäuren
auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen
beruht. Zur Luminszenzerzeugung sind verschiedene optische Anregungskonfigurationen möglich.
Eine Möglichkeit besteht darin, dass Anregungslicht zur
Anregung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einer oder mehrerer
Lichtquellen in einer Auflichtanregungsanordnung eingestrahlt wird.
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Eine
andere mögliche Konfiguration ist dadurch gekennzeichnet,
dass Anregungslicht zur Anregung einer oder mehrerer Luminszenzen
von einer oder mehrerer Lichtquellen in einer Transmissionslichtanregungsanordung
eingestrahlt wird.
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Bevorzugt
wird eine solche Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Immobilisierungsoberflächen und/oder Verfahren welche dadurch
gekennzeichnet sind, dass die Oberfläche auf einem optischen
Wellenleiter angeordnet ist, dass die eine oder mehrere Proben mit
darin nachzuweisenden zweiten Nukleinsäuren und gegebenenfalls
weiterer Nachweisreagenzien sequenziell oder nach Mischung mit besagten
Nachweisreagenzien mit den gebundenen ersten Nukleinsäuren
als Erkennungselemente in Kontakt gebracht werden und dass das Anregungswellenlicht
von einer oder mehrerer Lichtquellen in den optischen Wellenleiter
eingekoppelt wird mit Hilfe eines oder mehrerer optischer Kopplungselemente aus
der Gruppe, die von Prismenkopplern, evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern
mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierten
Linsen und Gitterkopplern gebildet wird.
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Bevorzugt
wird, dass die im Wellenleiter laufende Lichtwelle Lumineszenz von
lumineszenzfähigen Molekülen erzeugt und dass
diese Lumineszenz von einem oder mehrerer Detektoren erfasst wird. Aus
der Intensität des Lumineszenzsignals kann die Konzentration
einer oder mehrerer nachzuweisenden Nukleinsäuren ermittelt
werden.
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Das
Lumineszenzlabel kann an die nachzuweisende zweite Nukleinsäure
selbst gekoppelt sein, oder in einem kompetetiven Ansatz an Molekülen
mit bekannter Konzentration und Sequenz, als Kompetitor, gebunden
ist und so der Probe beigefügt werden. Das Luminszenzlabel
kann aber auch durch einen dritten Bindungspartner in das Analysengemisch
eingebracht werden.
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Es
wird bevorzugt, dass zur Erzeugung der Lumineszenz Lumineszenz-Farbstoffe
oder lumineszente Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet werden,
die bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt
werden und emittieren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
dass die zu untersuchenden Proben wässrige Lösungen,
insbesondere Pufferlösungen oder natürlich vorkommende
Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin
oder Gewebeflüssigkeiten sind. Die zu untersuchenden Proben können
auch aus biologischen Gewebeteilen oder Zellen präpariert
werden.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen
Immobilisierungsoberflächen und/oder Verfahren in der qualitativen
und quantitativen DNA- und RNA Analytik, beispielsweise die Bestimmung
von genomischen Unterschieden wie den Einzelnukleotid-Polymorphismen
(SNPs) oder DNA Amplifikationen oder DNA Deletionen oder DNA-Methylierung
oder für die Detektion und Quantifizierung von mRNA (Expression
Profiling).
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Beispiele
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Beispiel 1: Modifizieren eines planaren
Wellenleiters mit einer Monoschicht aus linearem Polyethylenimin und
anschließende Aktivierung mit Isophorondiisocyanat
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Ein
planarer Wellenleiter (Unaxis Balzers, Liechtenstein) in den Dimensionen
2 × 1 cm, bestehend aus AF 45 Glas mit einer wellenleitenden,
optisch transparenten, hochbrechenden Ta2O5 Schicht (Brechungsindex von 2.10 bei 633
nm, Schichtdicke 185 nm) und parallel zur Breite verlaufenden Gitterlinien
(318 nm Periode mit 32 +/– 3 nm Gittertiefe) wurde
- – 30 Min. in eine 0.1%ige Lösung
von linearem Polyethylenimin (lPEI, Mw: 25 000, Polyscience, Inc.)
in Ethanol getaucht, anschließend wurde kurz in reinem
Ethanol gewaschen, mit Luft abgeblasen und 10 Minuten bei 50°C
im Umlufttrockenschrank getrocknet.
- – Der mit lPEI modifizierte Wellenleiter wurde 10 Minuten
in einer 0.1%igen Lösung von Isophorondiisocyanat (IPDI,
Aldrich) in Toluol inkubiert, anschließend kurz in reinem
Toluol gewaschen, mit Luft abgeblasen und 10 Minuten bei 50°C
getrocknet.
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Beispiel 2: Immobilisieren eines Fluoreszenz
markierten DNA Oligomeren an der IPDI aktivierten Oberfläche.
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- – Mit Hilfe einer Mikropipette wurden
5 μl einer Fluoreszenz markierten DNA Sequenz (Cy5 – 50 mer:
5'-Cy5-CAA CAG TGC AAC CTT GGA AGC AGA TGT AGA TGT TGT TGT GTC ACC
TCC AT 3', Fa. BioTeZ Berlin) auf die IPDI aktivierte Oberfläche
(Bsp. 1) pipettiert. Auf dieselbe Weise wurden an zwei anderen Stellen
analoge Fänger-Oligonukleotid-Spots aufgetragen.
- – Nach einer Inkubationszeit von 30 Min. bei RT wurde
der bespottete Wellenleiter 30 Min. in eine wässerige Dextransulfat
Lösung (MW: 500 000 g/mol, Fa. Fluka) eingetaucht und kurz
mit Wasser abgewaschen.
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Der
Funktionstest erfolgte durch Einkoppeln eines Laserlichtstrahls
der Wellenlänge 635 nm. Dabei konnten an den Stellen, an
denen die Fänger-DNA Messbereiche aufpipettiert wurden,
hervorgerufen durch die Emission des Cy5 Fluoreszenzfarbstoffes
(Fa. Amersham), hell leuchtende Punkte beobachtet werden. Zum Vergleich
wurde die oben erwähnte Cy5 50 mer Fänger-Lösung
auf eine Stelle, die mit Dextransulfat gegen DNA Adsorption geblockt war,
aufpipettiert und mit Wasser gewaschen. Beim anschließenden
optischen Funktionstest wurde an den entsprechenden Stellen kein
Farbsignal gefunden.
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Beispiel 3
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Hybridisierung bakterieller cDNA auf IPDI
aktivierten planaren Wellenleiter-Chips aus Bsp. 1
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- – Die Chips wurden in einen Kontakt-Spotter
positioniert und mit einer Oligonucleotid-Lösung in einer
Konzentration von 5 × 10–5 M
in Spotting-Puffer (3 × SSC/1.5M Betain) bespottet. Die
Oligonucleotide wurde von der Firma Operon (Köln, Deutschland)
synthetisiert und hatten eine Länge von 70 Basen. Die Oligonucleotide
hatten eine Sequenz die komplementär zu der bei der späteren
Hybidisierung verwendeten bakteriellen Kontroll-Nukleinsäure
war (B. subtilis Sequenz, ATCC 87482; Referenz Sequenz X17013, The
American Type Culture Collection, www.atcc.org)
- – Nach einer über Nacht Inkubation bei RT
wurde der bespottete Wellenleiter 5 Min. in eine wässerige
Blockingslösung (5% Dextransulfat (MW: 500 000 g/mol, 1%
Tween, 10 mM Tris, 30% Formamid, ph 8,5) eingetaucht und anschließend
1 min mit Wasser abgewaschen.
- – Überschüssige Wasserreste wurden
mit einem trockenen N2 Strom entfernt.
- – Die bespotteten und blockierten Chips wurden in die
Hybridisierungkammern des SensiChip Systems der Firma Zeptosens
(Bayer Schweiz AG, Witterswil, Schweiz) nach Angaben des Systemherstellers
eingelegt. Die Chips wurden nach Anweisung des Systemherstellers
zunächst in SB Puffer und dann in PHB Puffer inkubiert.
Das die bakterielle Nukleinsäure beinhaltende Hybridisierungsgemisch
wurde ebenfalls nach Vorgaben des SensiChip Systems angesetzt. Die
bakterielle Nukleinsäure war zuvor aus einem geeigneten Plasmid
gewonnen worden. Das Hybridisierungsgemisch wurde unmittelbar vor
Einfüllen in die Hybridisierungskammern für 5
min bei 95° erhitzt. Die bakterielle Nukleinsäure
wurde in einer Konzentration von 1 × 10–12 M
eingesetzt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei
42°C in 40 μl Hybridisierungsvolumen.
- – Die Auslesung der Chips erfolgte im Zepto-Reader
(PWG-System, CCD Kamera basiert) mit unterschiedlichen Belichtungszeiten.
Hierbei wurden die Fluoreszenzsignale (Alexa 647) gemessen, welche
auf der Chipoberfläche durch Bindung der bakteriellen Nukleinsäure
an die gespotteten 70-mer Fängeroligonukleotide entstehen. Die
ermittelten Signalintensitäten der spezifisch an die Messbereiche
mit Fänger-Oligonukleotiden („Spots”)
gebundenen Fluoreszenzmoleküle im Vergleich zu der unspezifischen
Bindung an benachbarte Chipregionen („Hintergrundsignal”) sind
in 1 dargestellt. Auf der y-Achse ist die Signalinensität
dargestellt, die Signalintensität einzelner Spots ist für
das spezifische Signal (weisse Säulen) und das Hintergrundssignal (schraffierte
Säulen dargestellt.
-
Literatur
-
- 1 Beste, G.; Schmidt, F.
S.; Stibora, T.; Skerra A.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96,
1898–1903.
- 2 Tiefenthaler et al.; US 4 815 843 (1989).
- 3 Kunz, R.; US 5 442 169 (1995).
- 4 Duveneck, G. L.; Neuschäfer,
D.; Ehrat, M.; US 5 959 292 (1999).
- 5 Duveneck, D. L.; Heming, M.; Neuschäfer,
D.; Segner, J.; EP 0 759 159 (1995).
- 6 Neuschäfer, D.; Duveneck,
G. L.; Pawlak, M.; Pieles, U.; Budach, W.; WO 96/35940 (1996).
- 7 Clerc, D. and Lukosz, W.;
Sensors and Actuators B (1997) 40, 53–58.
- 8 Barner, R.; Fattinger, C.; Huber,
W., Hübscher, J.; Schlatter, D.; Europäische Patentanmeldung EP 0 596 421 .
- 9 Budach, W.; Abel, A: P.; Bruno,
A. E.; Neuschäfer, D.; Anal. Chem. (1999) 71, 3347–3355.
- 10 Piehler, J.; Brecht, A.;
Geckeler, K. E.; Gauglitz, G.; Biosensors & Biolelectronics (1996) 11, 579–590.
- 11 Schneider, B. H.; Dickinson,
E. L.; Vach, M. D.; Hoijer, J. V.; Howard, L. V.; Biosensors & Bioelectronics (2000)
15, 13–22.
- 12 Piehler, J.; Brecht, A.;
Geckeler, K. E.; Gauglitz, G.; Biosensors & Biolelectronics (1996) 11, 579–590.
- 13 Porath, J. Protein Expr.
Purif. (1992) 3, 263–281.
- 14 Buckland, R. M.; Nature (1986)
320, 557.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 2007/079863 [0012, 0030, 0030, 0031, 0043]
- - US 5512492 [0014]
- - WO 03/020966 [0023]
- - WO 02/068481 [0026]
- - US 6689478 [0029, 0029, 0029]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - G. Gao beschreibt
in Surface & Coating
Technology (2005) 244–250 [0010]
- - „Multilayer Thin Films” G. Decher, Wiley-VCH, 2003 [0029]
- - B. Sukhoukov, „Multilayer Films Containing Immobilized
Nucleic Acids” Biosensors & Bioelectronics, vol 11, no 9, 913–922,
1966 [0029]
- - www.atcc.org [0063]