WO2006111325A1 - Mikrooptisches detektionssystem und verfahren zur bestimmung temperaturabhängiger parameter von analyten - Google Patents

Mikrooptisches detektionssystem und verfahren zur bestimmung temperaturabhängiger parameter von analyten Download PDF

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WO2006111325A1
WO2006111325A1 PCT/EP2006/003427 EP2006003427W WO2006111325A1 WO 2006111325 A1 WO2006111325 A1 WO 2006111325A1 EP 2006003427 W EP2006003427 W EP 2006003427W WO 2006111325 A1 WO2006111325 A1 WO 2006111325A1
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detection system
support structure
microoptical
micro
optical
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PCT/EP2006/003427
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Holger Klapproth
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Micronas Gmbh
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    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"

Definitions

  • the invention relates to a micro-optical detection system and to a method for detecting analytes by means of time-resolved luminescence. This serves to determine temperature-dependent parameters of analytes, in particular the determination of point mutations of nucleic acids (DNA), for which a time-resolved detection is required.
  • DNA nucleic acids
  • biosensors For qualitative and / or quantitative detection of certain substances, such as biomolecules in a sample to be analyzed, the use of essentially planar systems is known, which are referred to in the art as biosensors or biochips.
  • biochips form a support structure, on the surface of which, as a rule, a large number of detection areas arranged mostly in the form of a grid are formed, the individual areas being formed or range groups by their specificity to a particular analyte to be detected differ from each other.
  • nucleic acid probes such as oligonucleotides or cDNA in mostly single-stranded form, whose respective specificity towards the nucleic acid to be detected is essentially located by the sequence of sequences, are located within the individual regions of the carrier surface, directly or indirectly immobilized is predetermined.
  • the chip surface functionalized in this way is brought into contact with the sample possibly containing the DNA analytes which may be present under conditions which, in the case of the presence of the previously detectably labeled target nucleic acid (s), hybridize with the immobilized probe molecules guarantee.
  • the qualitative and optionally quantitative detection of one or more specifically formed hybridization complexes is then usually carried out by opto-physical luminescence measurement and assignment of the data obtained to the respective detection areas, whereby the determination of the presence of the DNA analyte (s) in the Sample and possibly its quantification is made possible.
  • EP 1 248 948 B1 discloses a method for the parallel determination of temperature-dependent parameters, such as, for example, the association / dissociation constants or equilibrium constants of complexes, which is based on total internal reflection fluorescence (TIRF).
  • TIRF total internal reflection fluorescence
  • this technology which makes use of the evanescent field, is very expensive in terms of apparatus, which leads to a cost factor which is not justifiable for routine analysis.
  • Another disadvantage which excludes such systems in the field of routine analysis is the high expenditure of time associated with these systems. Proceeding from this, it was an object of the present invention to provide a detection system for analytes, which on the one hand pursues the known for biochips miniaturization and at the same time allows a time-resolved measurement.
  • the associated apparatus and time complexity of such a system should be kept as low as possible.
  • micro-optical detection system having the features of claim 1
  • diagnostic device having the features of claim 30
  • method for determining temperature-dependent parameters having the features of claim 32.
  • inventive method uses of the inventive method may be mentioned.
  • the other dependent claims show advantageous developments.
  • a micro-optical detection system for determining temperature-dependent parameters of analytes. This is based on the following elements:
  • a support structure having at least one surface on which receptors for the analytes are immobilized, wherein the receptors form a plurality of measurement points,
  • the detection system according to the invention is based on the essential feature that at least the detector is monolithically integrated into the carrier structure. This makes it possible that the micro-optical detection system can be designed in the form of a biochip or DNA chip. To date, such miniaturized systems are not known from the state of the art, which make it possible to develop systems within the scope of chip technology which permit the determination of temperature-dependent parameters.
  • the detection system according to the invention can be used for the detection of nucleic acids as well as for detectably labeled analytes, in particular proteinose substances, for example peptides, proteins, antibodies and functional fragments thereof.
  • the present invention encompasses any detection of a complex formed from a detectably labeled analyte, ie a component from the sample to be analyzed, and a receptor, ie an immobilized carrier component, according to the invention also including those systems in which the analyte already characterized, for example, by a detectable autofluorescence and therefore requires no further markings.
  • amino acid thyroxine which is a Has intrinsic fluorescence, even without additional labeling of thyroxine residues containing proteinaceous substance.
  • proteinose substances for example antibodies or fragments thereof, can be detected as analytes, even without these having been previously labeled with a luminescent substance which is suitable according to the invention.
  • the detection system according to the invention has a device for continuous contacting, which may preferably be designed as a flow cell, as a cuvette or as a sample container.
  • the mentioned device for contacting is channel-shaped.
  • a plurality of channel-shaped devices are integrated parallel to each other in the array-like support structure.
  • the device for contacting is formed as a recess in the support structure, which is provided on the side facing away from the surface of the support structure with a cover layer.
  • a recess can be etched into the support structure, for example.
  • This cover layer preferably has at least two point-shaped recesses which allow the inflow and outflow of the fluid.
  • the at least one contacting device consists of a photocured polymer and is applied to the support structure by photopolymerization.
  • a further preferred variant provides that a device for contacting of any material is applied to the support structure, wherein this is effected by means of an adhesive, by means of bonding and / or a pressing operation.
  • the flow cell is coupled to at least one pump for transporting fluids.
  • the flow cell is coupled to at least one pump for transporting fluids.
  • tempering element Another essential point of the detection system according to the invention is the use of a tempering element.
  • the tempering allows this as desired, a temperature increase or a decrease in temperature of the fluid or the surface of the support structure.
  • the tempering element must be thermally connected to the fluid or at least to a surface in contact with the fluid.
  • this represents the only limitation with respect to the arrangement of the tempering element.
  • the tempering element is monolithically integrated into the support structure.
  • thermosensor or temperature sensor which may be e.g. forms a control loop in combination with a controller and the tempering element. In this way, a targeted control of the temperature of the fluid in the device for incontact is made possible.
  • the support structure of the biochip is preferably made of metal or semimetal oxides, e.g. Silicon wafer, alumina, quartz glass, glass or a polymer.
  • the support structure of the detection system according to the invention preferably consists of a semiconductor material with an integrated, preferably a plurality of detectors comprising optical detector layer, wherein preferably photodiodes are incorporated as detectors.
  • the signal processing takes place at least partially within the biosensor.
  • the receptor can now be attached to this support structure both directly and via a spacer.
  • a spacer ie a bifunctional molecule
  • compounds are preferably used which have a halosilane or alkoxysilane group for coupling to the surface of the support structure.
  • Particular preference ' is here under a chlorosilane.
  • the carrier structure can be coated with glycidyltriethoxysilane, which can be achieved, for example, by immersion in a solution of 1%.
  • Silane in toluene slow extraction and immobilization by drying at 120 0 C can be done.
  • a coating created in this way generally has a thickness of a few ⁇ .
  • spacer and receptor takes place via a suitable further functional group, for example an amino or an alkoxy group.
  • suitable bifunctional spacers for coupling a variety of different receptor molecules to a variety of support structure surfaces are well known to those skilled in the art (GT Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1996).
  • biomolecules to be detected are nucleic acids
  • suitable DNA probes can then be applied and immobilized by means of common pressure devices.
  • Biosensors made in this way can now be hybridized with, e.g. biotinylated DNA. This can e.g. be generated by PCR and the incorporation of biotin-dUTP. During hybridization, the biotinylated DNA now binds to the opposite strand on the sensor (if present). Positive hybridization events can now be achieved by the addition of dye conjugates, e.g. Streptavidin / avidin conjugates. Suitable dye conformers according to the invention are particularly suitable: europium, terbium and samarium chelates, Microspheres
  • Beads which are loaded, for example via avidin / streptavidin with Eu, Sm, Tb chelates, said chelates are characterized by their property, with appropriate excitation luminescent light with a half life of the excited state of about 5 ns
  • luminescent ornamental Microspheres such as FluoSpheres Europium (Molecular Probes F-20883), since they are able to immobilize a large number of fluorochromes with one binding event.
  • nanocrystals as described, for example, by Quantum Dot Corp. be offered under the name "Quantum Dots ® ".
  • the binding is measured by means of a suitable excitation and the measurement of the time-resolved fluorescence with the excitation light source switched off.
  • the term “luminescence” encompasses all light emissions (in a broader sense also the emission of ultraviolet and infrared radiation) caused by an excitation source of gaseous, liquid and solid substances which are not caused by high temperatures but by preceding ones
  • fluorescence and fluorophores
  • luminescence can be caused by irradiation from an excitation source with light, ie preferably shorter-wave light and X-rays, photoluminescence, with electrons, eg cathodoluminescence, ions, eg ionoluminescence, sound waves, eg sonoluminescence, with radioactive substances, eg radioluminescence, by electric fields, eg electroluminescence, by chemical reactions, eg chemoluminescence or mechanical processes, eg triboluminescence.
  • the thermoluminescence is luminescence initiated or enhanced by thermal influence.
  • the chemiluminescence is performed by coupling the analytes with an enzyme label capable of catalyzing the chemical reaction of a substrate to luminescent radiation.
  • an enzyme label capable of catalyzing the chemical reaction of a substrate to luminescent radiation.
  • all enzymes are suitable which can catalyze the corresponding excitation of the substrate, e.g. Alkaline phosphatase (AP), horseradish peroxidase and other peroxidases, in particular thermostable peroxidases, glucose-6-phosphatase dehydrogenase or xanthine oxidase.
  • Substrates are all chemiluminescent molecules in question, in particular luminol, isoluminol, lucigenin, Peroxioxalate, acridine esters, thioesters, sulfonamides and Phenantridiniumester.
  • a system consisting of Horseradish peroxidase as an enzyme label conjugated to a receptor for a hapten, and luminol together with hydrogen peroxide as a substrate.
  • Avidin or streptavidin for example, which can then be coupled with an analyte biotinylated with biotin or its derivatives, are suitable as the receptor.
  • Another particularly preferred variant provides a system of alkaline phosphatase with adamantyl - 1, 2 - dioxethanphenylphosphat as a substrate. Again, there is again a conjugation with, for example, avidin, streptavidin or anti-dioxygenin as a receptor. These can then be probed with analytes linked to the corresponding partners, e.g. Biotin or its derivatives and dioxygenin, modified, are coupled. It is preferred that the said enzymes are temperature-stable enzymes. The use of temperature-stable enzymes makes it possible to determine the temperature-dependent parameters of the analytes.
  • Another variant relates to the photoluminescence.
  • a time-resolved fluorescence can be evaluated directly on the chip with analog circuits by recording a value after the excitation source has been switched off, for example every nano-second, which then also has a reference value of a previously performed measurement. solution, which was also stored on the chip, is compared.
  • nonspecific interference signals such as, for example, intrinsic fluorescence from possibly existing system components. Assuming that it is now possible to dissolve in the GHZ range ( ⁇ 1 ns), the autofluorescence can be differentiated from the artificial fluorescence.
  • the detection of the field of view signal values is preferably carried out sequentially, e.g. entire rows or columns of the sensor surface or parts thereof are detected sequentially (multiplex application).
  • the electronic output signals of the detectors can be supplied to an external evaluation device by means of suitable switching devices after analog-to-digital conversion.
  • Suitable optical detectors or sensors according to the invention are, in addition to the photodiode (pn, p-i-n, avalanche) CCD sensors, photoconductors or a camera into consideration, which are preferably incorporated monolithically in the form of a row or array arrangement in the semiconductor substrate of the device.
  • Photodiodes can be advantageously used in the context of a time-resolved luminescence measurement, since they have a low detection surface compared to photomultipliers. Particularly preferred here is the use of CMOS photodiodes or CMOS cameras.
  • the choice of detection or the material depends on the emission wavelength of the dye to be detected.
  • the detector has different wavelength sensitivities due to the so-called “semiconductor bandgap", depending on the choice of material (eg silicon or germanium)
  • a sensitivity range is therefore created which ranges from infrared to into the ultraviolet wave spectrum, with the sensitivity being greatest between these regions (B. Streetman, Pricice-Hall, Inc., “Solid State Electronic Devices", 1995, ISBN 0-13-436379-5, p 201-227).
  • the optionally exposed surface of each photodiode consists of SiO 2 or Si 3 N 4 .
  • certain process parameters of the receptor / analyte binding and the detection can be positively influenced by the choice of the surface material for the sensor chip. For example, in some places Si 3 N 4 , on others SiO 2 or Al 2 O 3 or a noble metal may be applied, whereby on the sensor chip or even in the detection field for biomolecules or spacers preferred areas with eg more hydrophobic or rather hydrophilic properties can be provided in order to promote or prevent the application of, for example, DNA receptors in a location-directed manner.
  • controllable noble metal electrodes it is possible according to the invention to provide preferred devices in which, for example, hybridization events can be accelerated by applying, if necessary, detection points or fields of different voltages, or fluorescence can be triggered from electrically excitable dyes.
  • the detectors can additionally be arranged in groups, whereby individual detection fields are created whose input signals ensure a reliable result than would be the case for a single occupancy per detection range.
  • the individual photodiodes can advantageously be combined into defined detection groups or measurement fields, thereby significantly increasing the sensitivity of the subsequent luminescence measurement as well as the reproducibility and reliability of the measurement data obtained thereby ,
  • the excitation source is an integral part of the detection system and is characterized by the
  • a pn diode made of direct semiconductor material allows the following:
  • the activation means the application of a voltage, whereby a light signal (pn diode is used as an LED) is emitted, which depending on the nature and condition of the pn diode in a certain emission wavelength band and causes the excitation of a ligand bound in the region of this pn diode.
  • pn-diode is used as a photodiode
  • it is then activated again to perform the desired measurement (s).
  • the excitation radiation in the previously described embodiment is coupled in via the same component with which the luminescence radiation is also collected makes it possible to selectively irradiate a very small area of the sensor surface or of the detector field and luminescence radiation emanating from this area is evaluated. By doing so, the inspected detector array is to be imaged very accurately, and a disturbance of the measurement by the luminescence from outside the inspected area can be prevented.
  • CMOS complementary metal-oxide semiconductor
  • Manufacturing processes which are likewise suitable according to the invention are, for example, NMOS processes or bipolar processes (Wolf, Silicon Processing for the VLSI ERA, Vol. 1, Lattice Press, Sunset Beach (1986)).
  • NMOS processes or bipolar processes are, for example, NMOS processes or bipolar processes (Wolf, Silicon Processing for the VLSI ERA, Vol. 1, Lattice Press, Sunset Beach (1986)).
  • organic semiconductor conductors EP-A-085 319
  • the individual detection points or fields are separated from each other in such a way that substantially no light emission of one point or field can be received by the detector or detectors of another point or field.
  • the individual types of detection can be arranged in respective depressions, as known, for example, from conventional microtiter plates.
  • trough-like depressions and those whose lateral walls are arranged substantially perpendicular to the surface of the sensor chip are preferred.
  • the respective dimensions of such a depression can be freely selected by those skilled in the art, as long as the luminophore (s) of the expected ligand / receptor complex are within the depression and essentially no emission light can penetrate into adjacent depressions.
  • a particularly preferred depression is sunk into the surface of the device according to the invention by at least 100 nm.
  • the same effect can alternatively be achieved by arranging on the essentially planar detector surface vertically upwardly directed release agents, the dimensions of which can be easily selected by a person skilled in the art with regard to the desired field of application and the spatial dimension of an anticipated receptor / ligand complex.
  • the attachment according to suitable release agent can be done for example by anodic bonding or by so-called.
  • Flip-chip method Such a system according to the invention allows a sensor-based electro-optical image recording method.
  • channels are applied to the detector chip so that several different analytes are measured in parallel on a chip can.
  • the channels may provide rows of sensor elements to which the arrays of receptors are bound.
  • calibration measurements could be carried out.
  • a parallel measurement of n identical arrays is performed so as to drastically reduce the cost per analysis.
  • the chip is divided by microchannels into, for example, 8 identical compartments.
  • a monolithically integrated semiconductor material is used as a carrier device for the receptors and the formation of the sensors, a monolithically integrated circuit can also be produced on the same substrate, whereby a preprocessing of the electronic sensor output signals in the immediate vicinity of the examination subject (receptor / analyte complex) can be done.
  • this preferred embodiment of the present invention is an "intelligent" sensor device that performs significantly more than purely passive sensors, for example, the outputs of the electro-optical sensors can be conditioned by integrated circuits to provide output circuits and outputs Further, the preprocessing may consist of digitizing the analog sensor signals and converting them to a suitable data stream In accordance with the invention, further processing steps are possible with which, for example, the amount of data can be reduced or that of the external one Processing and presentation via a personal computer (PC) can be done. Furthermore, the device according to the invention can be designed so that the preferably compressed or processed data can be transmitted via infrared or radio link to appropriately equipped receiving stations.
  • PC personal computer
  • control of the associated devices on the substrate can be carried out via control signals from a control device, which may preferably also be wholly or partially formed on the substrate or is connected externally.
  • Data analysis by the use of the device according to the invention is subject to no restrictions compared to data generated using conventional external imaging optics.
  • the direct detection of the luminescences on the device according to the invention is realized in that the receptor molecules required for a specific detection - directly or e.g. over a conventional spacer, i. Spacer, or a coupling matrix - located on the surface of an optical detector, which is designed as an integral part of the device according to the invention.
  • the excitation source as in the form of a or several white light lamps LED's, (semiconductor) laser, UV tubes, and by piezoelectric elements (ultrasound) or by light energy emitting gases and / or liquids (chemical excitation) can be provided should be sufficiently powerful and preferably repetitive with high frequency. The latter property is given when the light source can both be activated and deleted for a short time. If an optical excitation source is used, it should be able to be switched off so that after switching off, essentially no further photons, such as afterglow, strike the detector. If necessary, this can be ensured, for example, by the use of mechanical shutters (“shutter”), as well as by selecting LEDs or lasers as an optical excitation source.
  • shutter mechanical shutters
  • the excitation source with the device is preferably optically and mechanically coupled to the optical detector units in such a way that a radiation field is generated in the direction of the optical sensors, the spatial distance of the excitation source to the detection plane being possibly small. However, the distance must be sufficient so that the reactions between ligand and receptor required for the intended use are not impaired.
  • wavelength-specific photoelements or conventional photodiodes are selected which are applied with applied, applied, upright photodiodes. steamed or integrated wavelength filters. It is known, for example, that silicon nitride, in contrast to silicon oxide, does not penetrate UV light, and that polysilicon absorbs UV radiation (VP Iordanov et al., Integrated high rejection filter for NADH fluorescence measurements, Sensors 2001 Proceedings, Vol. 1, 8-10 May, pp. 106-111, AMA-Service (2001)).
  • nitride or polysilicon can be deposited on the gate oxide layer in the context of the customary CMOS process, whereby corresponding filters are created on the photodiode.
  • NADH nicotinamide adenine dinucleotide
  • the sensitivity can be increased.
  • this effect can be used to enable differential detection in parallel use of, for example, two different luminophores, of which, for example, only one light emits in the UV range, since the detectors provided for this purpose are designed to be UV-sensitive or not.
  • this effect offers the possibility of removing possibly interfering autofluorescences of materials present at a known emission wavelength by providing appropriate filters from the measuring method.
  • An example of this is the parallel use of europium chelates (emission at ca. 620 nm) and copper-doped zinc sulfide (emission at ca. 525 nm), which allow two-color detection by sufficiently different emission wavelength ranges, eg within a range of Detector point or field, for example, by half the sensors of a detector point or field with a low-pass filter and the other half of the sensors of the same point or field with a high-pass filter Is provided.
  • different luminophores can be used in parallel, provided that their physical or optical properties differ sufficiently from one another.
  • the different excitation wavelengths of two luminophores A and B to be used and / or their different half-lives are used. This can e.g. by providing two differently doped nanocrystals.
  • the receptor / analyte-specific detection with this layer of optical sensors can be coated with a substance capable of coupling.
  • the sensor chip surfaces of metal or Halbmetalloxiden such as alumina, quartz glass, glass, in a solution of bifunctional molecules, so-called.
  • Linker for example, a halosilane, eg chlorosilane, or alkoxysilane for coupling to the carrier structure, so that a self-assembling monolayer (SAM) is formed, by which the covalent bond between sensor surface and receptor is produced
  • SAM self-assembling monolayer
  • a coating created in this way generally has a thickness of a few angstroms.
  • a diagnostic device which contains a microoptical detection system as described above.
  • diagnostic devices are meant here all measuring arrangements for which the use of micro-optical detection systems, e.g. in the form of biochips, technically useful and practicable.
  • handheld devices which are used in the field, i. e.g. in a hospital or in a medical practice, can be used in portable use.
  • the invention also provides a method for determining temperature-dependent parameters of analytes. This is based on the following process steps:
  • receptors for the analytes are bound to at least one surface of a support structure, wherein the receptors form a plurality of measurement points.
  • C) The receptor-analyte complexes are stimulated with at least one excitation source to cause a detectable optical change of the complex, the receptor or the analyte.
  • D) The optical change caused is then registered with at least one detector monolithically integrated in the carrier structure and directed onto the surface of the carrier structure and subsequently evaluated.
  • a particular feature of the method according to the invention is that the excitation and the detection takes place at at least two different temperatures in order to register and evaluate the temperature-dependent parameters at the at least two temperatures.
  • the method steps described above are carried out at different temperatures under otherwise identical conditions.
  • a temperature program so that, for example, in a temperature window of 20 to 80 0 C in 10 0 C steps, the temperature is increased and for these respective temperature levels, the detection method for the analyte is performed.
  • This then allows the determination of a melting curve of the analytes, which reflects the temperature dependence of the dissociation of the receptor-analyte complexes.
  • the detection takes place in the form of a
  • the association constant, the dissociation constant and / or the equilibrium constant can be determined as temperature-dependent parameters.
  • the method according to the invention is used in all areas in which the determination of temperature-dependent parameters of analytes is of importance. Concrete examples of such applications are pathogen detection in hospitals, proof of paternity, evidence of perpetrators or a P450 isoenzyme analysis. In this regard, especially the malignant hyperthermia, which is based on a mutation of the ryanodine receptor, to call.
  • the detection system according to the invention can enable early detection of hyperthermia here.
  • Another important field of application is the monitoring of the blood coagulation cascade in order to be able to recognize and treat the risk of thrombosis in patients with an increased tendency to coagulate in a timely manner.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the structure of a variant of the optical detection system according to the invention.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the detection of proteins using the microoptical detection system according to the invention.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the detection of nucleic acids with a microoptical detection system according to the invention.
  • Fig. 1 is a micro-optical according to the invention Detection system 1 shown.
  • a support structure 2 which consists of the known from the prior art materials for the production of chips. These include, in particular, a carrier structure made of polychlorinated biphenyl (PCB).
  • PCB polychlorinated biphenyl
  • a detector 3 is arranged, in the present case in the form of a single sensor chip.
  • This variant concerns a chemoluminscence measurement.
  • an excitation source can additionally be contained in the sensor chip 3.
  • the sensor chip 3 can also be integrated directly into the substrate.
  • the sensor chip is attached to the substrate via two adhesion sites 8 and 8 ', which can be made of an adhesive or a solder, for example.
  • a flow cell 4 is arranged, which serves for the continuous contacting of a fluid with the surface of the sensor chip.
  • the flow cell in this case has an inflow 6 and an outflow 7, via which the fluid can be transported into or out of the flow cell.
  • a temperature control element 5 is integrated in the flow cell 4, which allows a temperature increase or a decrease in the temperature of the fluid.
  • the tempering element 5 can also be used for tempering the surface of the support structure 2 or the sensor chip.
  • the arrangement of the tempering 5 is therefore arbitrary, as long as the arrangement allows a corresponding temperature.
  • FIG. 2 shows the measuring principle for the determination of proteins.
  • a detector 3 in the form of a photodiode is integrated here.
  • a primary antibody 9 is immobilized, which acts as a receptor. The receptor immobilized in this way is then brought into contact with the sample containing the analyte 10, whereby binding between receptor 9 and analyte 10 takes place.
  • the surface of the chip is then brought into contact with a detector molecule which can bind to the analyte 10.
  • This detector molecule consists of a receptor 11, in the present case a secondary antibody, and a thermally stable enzyme 12 coupled thereto, which can catalyze an optical detection reaction.
  • horseradish peroxidase is used as the thermally stable enzyme.
  • the substrate consisting of hydrogen peroxide and luminol is added. The associated luminous reaction can then be registered and evaluated by means of the photodiode 3.
  • a support structure 2 is shown, in which a photodiode is integrated as a detector 3. in the surface of the support structure, a DNA receptor 14 is immobilized here.
  • the sample is then brought into contact with the analyte 15 in the form of a DNA molecule with the biochip.
  • the DNA molecule can be labeled by biotin-dUTP.
  • the substrate consisting of luminol and hydrogen peroxide is then added.
  • the detection principle also corresponds here to that described under FIG. example 1
  • Microorganisms are processed in a suitable extraction system (Buchholz et al., 2002).
  • PCR all known and unknown bacteria can be detected by PCR using suitable primers (consensus primer) and their 16s rRNA amplified.
  • the PCR is preferably carried out asymmetrically, ie one of the two PCR primers is deficient in the reaction, so that single-stranded DNA is formed in addition to double-stranded DNA.
  • biotin-dUTP the DNA molecules are labeled. These labeled molecules are then hybridized on the chip. The temperature is below the expected melting point (eg 20 0 C lower than the melting point).
  • the flow cell of the chip is rinsed with wash buffer and streptavidin-HRP is added. After about 10 minutes, the unbound HPR is removed by washing with wash buffer and ECL substrate is added (luminol plus hydrogen peroxide). After the onset of the light reaction, the temperature is gradually increased from 20 0 C to 80 0 C and the signal is measured at each Tempe- ratur intimid. Thereby, a slow perfusion of the flow cell takes place so that separated analyte no longer disturbs the measurement.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrooptisches Detektionssystem sowie ein Verfahren zum Nachweis von Analyten mittels zeitaufgelöster Lumineszenz. Dieses dient der Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten, insbesondere der Bestimmung von Punktmutationen von Nukleinsäuren (DNA) , für die eine zeitaufgelöste Detektion erforderlich ist.

Description

Mikrooptisches DetektJonsSystem und Verfahren zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten
Die Erfindung betrifft ein mikrooptisches Detektions- System sowie ein Verfahren zum Nachweis von Analyten mittels zeitaufgelöster Lumineszenz. Dieses dient der Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten, insbesondere der Bestimmung von Punktmutationen von Nukleinsäuren (DNA) , für die eine zeitaufgelöste Detektion erforderlich ist.
Zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von bestimmten Substanzen, wie z.B. Biomolekülen in einer zu analysierenden Probe ist die Verwendung von im We- sentlichen planaren Systemen bekannt, welche in der Fachwelt als Biosensoren bzw. Biochips bezeichnet werden. Diese Biochips bilden eine Trägerstruktur, auf dessen Oberfläche i.d.R. eine Vielzahl von zumeist rasterartig angeordneten Detektionsbereichen ausgebildet ist, wobei sich die einzelnen Bereiche bzw. Bereichsgruppen jeweils durch ihre Spezifität gegenüber einem bestimmten nachzuweisenden Analyten voneinander unterscheiden. Im Falle von nachzuweisenden DNA-Analyten befinden sich innerhalb der einzel- nen Bereiche der Trägeroberfläche - direkt oder indirekt immobilisiert - spezifische Nukleinsäuresonden, wie z.B. Oligonukleotide oder cDNA in zumeist ein- zelsträngiger Form, deren jeweilige Spezifität gegenüber der nachzuweisenden Nukleinsäure im Wesentlichen durch die Sequenzabfolge vorgegeben ist. Die auf diese Weise funktionalisierte Chipoberfläche wird im Rahmen eines entsprechenden Nachweisverfahrens mit der die nachzuweisenden DNA-Analyten ggf. enthaltenden Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, wel- che im Falle des Vorhandenseins der zuvor nachweisbar markierten Zielnukleinsäure (n) deren Hybridisierung mit den immobilisierten Sondenmolekülen gewährleisten. Die qualitative und ggf. quantitative Detektion eines bzw. mehrer spezifisch gebildeter Hybridisie- rungskomplexe erfolgt anschließend zumeist durch op- tophysikalische Lumineszenzmessung und Zuordnung der erhaltenen Daten zu den jeweiligen Detektionsberei- chen, wodurch die Bestimmung der Anwesenheit des bzw. der DNA-Analyten in der Probe und ggf. deren Quanti- fizierung ermöglicht wird.
Ein Bereich der DNA-Forschung, der von den bislang aus dem Stand der Technik bekannten Biochips nur unzureichend abgedeckt werden kann, betrifft die Punkt- mutationen von Nukleinsäuren. Der Identifizierung von Punktmutationen im menschlichen Genom kommt dabei in der Wissenschaft eine große Bedeutung zu. Die Entdeckung einer Vielzahl von Punktmutationen, also Mutationen einzelner Basen, die bei mehr als 1 % der Be- völkerung auftreten, und die Erkenntnis, dass Punkt- mutationen die Nebenwirkung von Medikamenten determi- nieren können, führt zu der Vision einer personenbezogenen Therapie. Hiernach erhält der Patient nach einer Genotypisierung das für ihn verträglichste Medikament verschrieben. Notwendige Bedingung für eine solche Entwicklung ist eine schnelle und hoch durch- satzfähige DNA-Analytik. Dies führte jedoch bislang bei den aus dem Stand der Technik bekannten Systemen zu erheblichen Problemen, da der bei einer Punktmutation auftretende einzelne Basentausch nur eine gerin- ge Änderung in der Bindungsenergie zu dem komplementären Strang ausmacht . So beträgt die Änderung des Schmelzpunktes, also der Temperatur, bei der 50 % der DNA dissoziiert sind, in der Regel nur wenige Grad Celsius, teilweise auch weniger als 1 0C.
Aus der DE 101 33 844 Al ist eine Vorrichtung zur DNA-Analytik auf Basis eines Biochips bekannt, wobei auf dem Biochip Rezeptoren zur Ausbildung von Rezeptor/Liganden-Komplexen immobilisiert sind. Weiterhin sind in der Vorrichtung eine Anregungsquelle sowie ein optischer Detektor integriert. Eine zeitaufgelöste Analytik lässt sich mit dem hier beschriebenen System nicht realisieren.
Aus der EP 1 248 948 Bl ist ein Verfahren zur parallelen Bestimmung temperaturabhängiger Parameter, wie z.B. der Assoziations-/Dissoziationskonstanten oder Gleichgewichtskonstanten von Komplexen, bekannt, das auf der Totalen Internen Reflexions-Fluoreszenz (TIRF) basiert. Diese Technologie, die sich des Eva- nescentfeldes bedient, ist apparativ jedoch sehr aufwendig, was zu einem für die Routineanalytik nicht vertretbaren Kostenfaktor führt . Ein weiterer Nachteil, der derartige Systeme für den Bereich der Rou- tineanalytik ausschließt, ist der mit diesen Systemen verbundene hohe Zeitaufwand der Messung. Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Detektionssystem für Analyten bereitzustellen, das zum einen die für Biochips bekannte Mi- niaturisierung verfolgt und dabei gleichzeitig eine zeitaufgelöste Messung ermöglicht. Der hiermit verbundene apparative und zeitliche Aufwand eines derartigen Systems soll dabei möglichst gering gehalten werden.
Diese Aufgabe wird durch das mikrooptische Detektionssystem mit den Merkmalen des Anspruchs 1, die DiagnoseVorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 30 und das Verfahren zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter mit den Merkmalen des Anspruchs 32 gelöst. In Anspruch 49 werden Verwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens genannt. Die weiteren abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf .
Erfindungsgemäß wird ein mikrooptisches Detektionssystem zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten bereitgestellt. Dieses basiert auf den folgenden Elementen:
a) Eine Trägerstruktur mit mindestens einer Oberfläche, auf der Rezeptoren für die Analyten immobilisiert sind, wobei die Rezeptoren eine Vielzahl von Messpunkten bilden,
b) mindestens eine Anregungsquelle, die die Emission von Lumineszenzlicht induzieren kann,
c) mindestens einen monolithisch in die Trägerstruktur integrierten und auf die Oberfläche der Trägerstruktur gerichteten optischen Detektor,
d) mindestens eine Vorrichtung zum Inkontakt- bringen eines Fluids mit den Messpunkten an der Oberfläche der Trägerstruktur sowie
e) mindestens ein Temperierelement für das Fluid.
Das erfindungsgemäße Detektionssystem beruht auf dem wesentlichen Merkmal, dass zumindest der Detektor in die Trägerstruktur monolithisch integriert ist. Hierdurch wird ermöglicht, dass das mikrooptische Detek- tionssystem in Form eines Biochip bzw. DNA-Chip konzipiert werden kann. Bislang sind aus dem Stand der Technik derartig miniaturisierte Systeme nicht bekannt, die es ermöglichen, im Rahmen der Chip- Technologie Systeme zu entwickeln, die eine Bestim- mung temperaturabhängiger Parameter ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Detektionssystem kann zur Detek- tion von Nukleinsäuren ebenso wie für nachweisbar markierte Analyten, insbesondere Proteinose Substan- zen, z.B. Peptide, Proteine, Antikörper und funktionelle Fragmente derselben, eingesetzt werden kann. Somit umfasst die vorliegende Erfindung jeglichen Nachweis eines aus einem nachweisbar markierten Analyten, also einer Komponente aus der zu analysieren- den Probe, und einem Rezeptor, d.h. einer immobilisierten Trägerkomponente, gebildeten Komplexes, wobei erfindungsgemäß auch solche Systeme umfasst sind, bei denen sich der Analyt bereits z.B. durch eine nachweisbare Eigenfluoreszenz auszeichnet und daher kei- ner weiteren Markierungen bedarf. Als Beispiel hierfür ist die Aminosäure Thyroxin zu nennen, die eine Eigenfluoreszenz aufweist, und zwar auch ohne zusätzliche Markierung einer Thyroxin-Reste aufweisenden Proteinosen Substanz. So können erfindungsgemäß durch Verwendung von Peptiden als Rezeptoren Proteinose Substanzen, wie z.B. Antikörper oder Fragmente derselben, als Analyten nachgewiesen werden, auch ohne diese zuvor mit einem erfindungsgemäß geeigneten Lu- minophor markiert zu haben.
Das erfindungsgemäße Detektionssystem weist eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Inkontaktbringen auf, die vorzugsweise als Flusszelle, als Küvette oder als Probenbehälter ausgebildet sein kann.
Hinsichtlich der Anordnung der Vorrichtung zum Inkontaktbringen des Fluids mit den Messpunkten bestehen grundsätzlich keinerlei Beschränkungen.
So sieht eine bevorzugte Variante vor, dass die ge- nannte Vorrichtung zum Inkontaktbringen kanalförmig ausgebildet ist. Hierbei ist es dann auch möglich, dass z.B. mehrere kanalförmige Vorrichtungen parallel zueinander in der arrayartigen Trägerstruktur integriert sind.
Eine andere bevorzugte Variante sieht vor, dass die Vorrichtung zum Inkontaktbringen als Ausnehmung in der Trägerstruktur ausgebildet ist, die auf der der Oberfläche der Trägerstruktur abgewandten Seite mit einer Abdeckschicht versehen ist. Eine derartige Ausnehmung kann beispielsweise in die Trägerstruktur eingeätzt sein. Diese Abdeckschicht weist dabei vorzugsweise mindestens zwei punktförmige Ausnehmungen auf, die den Zufluss und den Abfluss des Fluids er- lauben. Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass die mindestens eine Vorrichtung zum Inkontaktbringen aus einem photogehärteten Polymer besteht, und durch Photopolymerisation auf der Trägerstruktur aufgebracht ist.
Eine weitere bevorzugte Variante sieht vor, dass eine Vorrichtung zum Inkontaktbringen aus einem beliebigen Material auf die Trägerstruktur aufgebracht ist, wobei diese mittels eines Klebers, mittels Bonding und/oder einen Pressvorgang erfolgt.
Vorzugsweise ist die Flusszelle mit mindestens einer Pumpe für den Transport von Fluiden gekoppelt. Es findet somit ein ständiger Transport des Analyten oder auch der Waschlösung an der Oberfläche des Chips entlang statt.
Ein weiterer wesentlicher Punkt des erfindungsgemäßen Detektionssystems ist die Verwendung eines Temperier- elementes. Das Temperierelement ermöglicht dabei je nach Wunsch eine Temperaturerhöhung bzw. eine Temperaturerniedrigung des Fluids bzw. der Oberfläche der Trägerstruktur. Um dies gewährleisten zu können, muss das Temperierelement mit dem Fluid oder zumindest mit einer mit dem Fluid in Kontakt stehenden Oberfläche thermisch verbunden sein. Dies stellt jedoch die einzige Beschränkung hinsichtlich der Anordnung des Temperierelements dar. Vorzugsweise ist das Temperierelement monolithisch in die Trägerstruktur integ- riert.
Für die Temperierung der Vorrichtung zum Inkontaktbringen stehen alle aus dem Stand der Technik bekannten Temperierungsmöglichkeiten zur Verfügung. Ei- ne bevorzugte Variante sieht vor, dass die Vorrichtung zum Inkontaktbringen mit einem Peltierelement verbunden ist, wodurch eine effiziente Aufheizung und Abkühlung der Vorrichtung ermöglicht wird.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Detekti- onssystems sieht vor, dass die Vorrichtung zum Inkon- taktbringen mit einem Thermosensor bzw. Temperaturfühler verbunden ist, der z.B. in Kombination mit einem Regler und dem Temperierelement einen Regelkreis bildet . Hierdurch wird eine gezielte Steuerung der Temperatur des Fluids in der Vorrichtung zum Inkon- taktbringen ermöglicht.
Die Trägerstruktur des Biochips besteht bevorzugt aus Metall- bzw. Halbmetalloxiden, wie z.B. Silicium- Wafer, Aluminiumoxid, Quarzglas, Glas oder einem Polymer.
Die Trägerstruktur des erfinduhgsgemäßen Detektions- systems besteht bevorzugt aus einem Halbleitermateri- al mit einer integrierten, vorzugsweise mehrere Detektoren umfassenden optischen Detektorschicht, wobei als Detektoren vorzugsweise Photodioden eingearbeitet sind. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die SignalVerarbeitung zumindest teilweise innerhalb des Biosensors.
Der Rezeptor kann nun an diese Trägerstruktur sowohl direkt als auch über einen Spacer angebunden werden. Für die Anbindung an einen Spacer, d.h. ein bifunkti- onelles Molekül, werden bevorzugt Verbindungen eingesetzt, die eine Halogensilan- oder Alkoxysilangruppe zur Kopplung mit der Oberfläche der Trägerstruktur aufweisen. Besonders bevorzugt ' ist hierunter eine Chlorsilangruppe. So kann beispielsweise die Träger- struktur mit Glycidyltriethoxysilan beschichtet werden, was z.B. durch Eintauchen in eine Lösung von 1 % Silan in Toluol , langsames Herausziehen und Immobilisieren durch Trocknen bei 120 0C erfolgen kann. Eine auf diese Weise geschaffene Beschichtung weist im Allgemeinen eine Dicke von wenigen Ä auf. Die Kopp- lung zwischen Spacer und Rezeptor erfolgt über eine geeignete weitere funktionelle Gruppe, beispielsweise eine Amino- oder eine Alkoxygruppe . Geeignete bifunktionelle Spacer für die Kopplung einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptormolekülen an eine Vielzahl von Trägerstrukturoberflächen ist dem Fachmann gut bekannt (G. T. Hermanson, „Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1996) .
Sofern es sich bei den zu detektierenden Biomolekülen um Nukleinsäuren handelt, können anschließend geeignete DNA-Sonden mittels gängiger Druckgeräte aufgebracht und immobilisiert werden.
Auf derart hergestellten Biosensoren können nun unter Anwendung etablierter Verfahren Hybridisierungen mit, z.B. biotinylierter DNA durchgeführt werden. Diese kann z.B. mittels PCR und dem Einbau von Biotin-dUTP erzeugt werden. Beim Hybridisieren bindet nun die bi- otinylierte DNA an den auf dem Sensor vorhandenen Ge- genstrang (sofern vorhanden) . Positive Hybridisie- rungsereignisse können nun durch Zugabe von Farbstoffkonjugaten, wie z.B. Streptavidin-/Avidin- Konjugaten, nachgewiesen werden. Als Farbstoffkonju- gate sind erfindungsgemäß besonders geeignet: Europi- um-, Terbium- und Samarium-Chelate, Microspheres
(„Beads") , die z.B. über Avidin-/Streptavidin mit Eu-, Sm-, Tb-Chelaten beladen sind, wobei sich die genannten Chelate durch ihre Eigenschaft auszeichnen, bei geeigneter Anregung Lumineszenzlicht mit einer Halbwertszeit des angeregten Zustandes von über 5 ns abzugeben. Besonders geeignet sind hierbei lumines- zierende Microspheres, wie z.B. FluoSpheres Europium (Molecular Probes F-20883) , da sie in der Lage sind, eine große Zahl von Fluorochromen mit einem Bindungs- ereignis zu immobilisieren. Erfindungsgemäß ferner geeignet sind Nanokristalle, wie sie z.B. von der Quantum Dot Corp. unter der Bezeichnung „Quantum- Dots®" angeboten werden.
Nach dem Waschen zum Entfernen nicht gebundener mar- kierter Liganden bzw. frei flottierender Lumineszenzfarbstoffe erfolgt die Messung der Bindung über eine geeignete Anregung und die Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenz bei ausgeschalteter Anregungslichtquelle.
Unter dem Begriff „Lumineszenz" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche, durch eine Anregungsquelle hervorgerufenen Lichtemissionen (im weiteren Sinne auch die Aussendung von ultravioletter und infraroter Strahlung) von gasförmigen, flüssigen und festen Stoffen zusammengefasst , die nicht durch hohe Temperaturen, sondern durch vorangegangene Energieabsorption und Anregung verursacht wird. Diese Stoffe werden Luminophore genannt. Auch wenn die vor- liegende Erfindung z.T. unter Verwendung der Begriffe „Fluoreszenz" und „Fluorophore" näher erläutert wird, kennzeichnen diese Begriffe lediglich bevorzugte Ausführungsformen des erfinderischen Grundgedankens und stellen somit keine Beschränkung der Erfindung dar.
Wie dem Fachmann bekannt ist, kann eine Lumineszenz hervorgerufen werden durch Bestrahlung aus einer Anregungsquelle mit Licht, d.h. vorzugsweise kürzerwelliges Licht sowie Röntgenstrahlen, Photolumineszenz, mit Elektronen, z.B. Kathodolumineszenz, Ionen, z.B. Ionolumineszenz, Schallwellen, z.B. Sonolumineszenz, mit radioaktiven Stoffen, z.B. Radiolumineszenz, durch elektrische Felder, z.B. Elektrolumineszenz, durch chemische Reaktionen, z.B. Chemolumineszenz oder mechanische Vorgänge, z.B. Tribolumineszenz . Demgegenüber handelt es sich bei der Thermolumines- zenz um durch thermischen Einfluss initiierte oder verstärkte Lumineszenz. Alle diese Prozesse unterliegen den allgemeinen Grundsätzen der Quantenmechanik und bewirken eine Anregung der Atome und Moleküle, die anschließend unter Emission von Licht, welches erfindungsgemäß detektiert wird, in den Grundzustand zurückkehren. Die Auswahl und ggf. unterschiedliche Ausführung geeigneter Anregungsquellen ist demnach davon abhängig, welcher Typ der Lumineszenzenerzeu- gung angewendet werden soll. Eine bevorzugte Variante der Lumineszenzerzeugung im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Chemolumineszenz. Hierbei erfolgt die elektronische Anregung durch eine chemische Reaktion mit anschließender Lichtemission.
Vorzugsweise wird die Chemolumineszenz in der Weise durchgeführt, dass die Analyten mit einem Enzym- Marker gekoppelt werden, der die chemische Reaktion eines Substrates unter Freisetzung lumineszenter Strahlung katalysieren kann. Hierfür sind alle Enzyme geeignet, die die entsprechende Anregung des Substrates katalysieren können, z.B. Alkalische Phosphatase (AP) , Meerrettichperoxidase und andere Peroxidasen, insbesondere thermostabile Peroxidasen, Glucose-6- Phosphatase-Dehydrogenase oder Xanthinoxidase . Als
Substrate kommen alle chemilumineszenten Moleküle in Frage, insbesondere Luminol , Isoluminol, Lucigenin, Peroxioxalate, Acridinester, Thioester, Sulfonamide und Phenantridiniumester .
Besonders bevorzugt ist ein System bestehend aus Meerrettichperoxidase als Enzymmarker, das mit einem Rezeptor für ein Hapten konjugiert ist, und Luminol zusammen mit Wasserstoffperoxid als Substrat. Als Rezeptor kommt hier beispielsweise Avidin oder Strepta- vidin in Frage, die dann mit einem mit Biotin oder dessen Derivaten biotinylierten Analyten gekoppelt werden können. .
Eine andere besonders bevorzugte Variante sieht ein System aus Alkalischer Phosphatase mit Adamantyl - 1 , 2 - dioxethanphenylphosphat als Substrat vor. Auch hier liegt wieder eine Konjugation mit beispielsweise Avidin, Streptavidin oder Anti-Dioxygenin als Rezeptor vor. Diese können dann mit Analyten, die mit den ent- sprechenden Partnern, wie z.B. Biotin oder dessen Derivate und Dioxygenin, modifiziert sind, gekoppelt werden. Es ist dabei bevorzugt, dass es sich bei den genannten Enzymen um temperaturstabile Enzyme handelt. Durch die Verwendung temperaturstabiler Enzyme wird es ermöglicht, die temperaturabhängigen Parameter der Analyten zu bestimmen.
Eine weitere Variante betrifft die Photolumineszenz.
Hinsichtlich der Photoluminophore wird auf die
DE 101 33 844 Al ausdrücklich Bezug genommen. Die hier genannten organischen wie anorganischen Lumi- nophore sind allesamt dann einsetzbar, wenn das De- tektionsprinzip auf der Photolumineszenz beruht.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine zeitaufgelöste Fluoreszenz direkt auf dem Chip mit analogen Schaltungen ausgewertet werden, indem man nach Abschalten der Anregungsquelle, z.B. jede Nano- Sekunde, einen Wert aufnimmt, der dann z.B. auch mit einem Referenzwert einer zuvor durchgeführten Mes- sung, welcher ebenfalls auf dem Chip gespeichert wurde, verglichen wird. Darüber hinaus wird auf diese Weise ermöglicht, dass man unspezifische Störsignale, wie z.B. Eigenfluoreszenz von gegebenenfalls anwesen- den Systemkomponenten, herausrechnen kann. Geht man davon aus, dass man mittlerweile auch bis in de GHZ- Bereich (< 1 ns) auflösen kann, so kann die Eigenfluoreszenz von der künstlichen Fluoreszenz unterschieden werden.
Sofern die Sensoroberfläche das Design einer Microar- ray-Anordnung aufweist, bei der eine Vielzahl von De- tektionsfeldern auszuwerten sind, erfolgt die Detek- tion der Messfeld- bzw. -punktsignalwerte vorzugswei- se sequentiell, indem z.B. ganze Zeilen oder Spalten der Sensoroberfläche bzw. Teile derselben nacheinander detektiert werden (Multiplexanwendung) .
Beispielsweise können die elektronischen Ausgangssig- nale der Detektoren mittels geeigneter Schaltungseinrichtungen nach einer Analog-Digitalumsetzung einer externen Auswerteeinrichtung zugeführt werden. Als erfindungsgemäß geeignete optische Detektoren bzw. Sensoren kommen neben der Photodiode (pn, p-i-n, ava- lanche) CCD-Sensoren, Photoleiter oder eine Kamera in Betracht, die vorzugsweise in Form einer Zeilen- oder Arrayanordnung in das Halbleitersubstrat der Vorrichtung monolithisch eingearbeitet sind. Photodioden können vorteilhaft im Rahmen einer zeitaufgelösten Lumineszenzmessung eingesetzt werden, da sie im Vergleich zu Photomultipliern eine geringe Detekti- onsflache aufweisen. Besonders bevorzugt ist hierbei die Verwendung von CMOS-Photodioden oder CMOS- Kameras .
Für den Fachmann ist klar, dass die Wahl des Detek- tors bzw. des Materials von der zu detektierenden Emissionswellenlänge des Farbstoffes abhängt. Grundsätzlich ist zu sagen, dass der Detektor aufgrund des sog. „Halbleiterbandgaps" je nach Materialwahl (z.B. Silizium oder Germanium) unterschiedliche Empfindlichkeiten bezüglich der Wellenlänge hat. Im bevorzugten Falle der Verwendung einer Silizium-Photodiode wird daher ein Empfindlichkeitsbereich geschaffen, der vom infraroten bis in das ultraviolette Wellen- Spektrum reicht, wobei die Empfindlichkeit zwischen diesen Bereichen am größten ist (B. Streetman, Pren- tice-Hall, Inc., „Solid State Electronic Devices", 1995, ISBN 0-13-436379-5, S. 201-227) .
Nach einer bevorzugten Ausführungsform besteht die ggf. freigelegte Oberfläche einer jeden Photodiode aus SiO2 oder Si3N4. Weiterhin können bestimmte Verfahrensparameter der Rezeptor/Analyt-Bindung und der Detektion durch Wahl des Oberflächenmaterials für den Sensorchip positiv beeinflusst werden. Beispielsweise kann an manchen Stellen Si3N4, an anderen dagegen SiO2 oder z.B. Al2O3 oder ein Edelmetall aufgebracht sein, wodurch auf dem Sensorchip oder sogar im Detektions- feld für die Biomoleküle oder Spacer bevorzugte Be- reiche mit z.B. eher hydrophoben bzw. eher hydrophilen Eigenschaften bereitgestellt werden können, um das Aufbringen von z.B. DNA-Rezeptoren ortsgerichtet zu fördern oder zu verhindern. Des weiteren können durch Aufbringen von ansteuerbaren Edelmetallelektro- den erfindungsgemäß bevorzugte Vorrichtungen geschaffen werden, bei denen z.B. durch Anlegen ggf. pro Detektionspunkt- bzw. -feld unterschiedlicher Spannungen Hybridisierungsereignisse beschleunigt oder eine Fluoreszenz ausgehend von elektrisch anreg- baren Farbstoffen ausgelöst werden kann. Selbstverständlich können die Detektoren zusätzlich in Gruppen angeordnet sein, wodurch einzelne Detekti- onsfelder geschaffen werden, deren Eingangssignale ein zuverlässiges Ergebnis gewährleisten als es bei einer Einzelbelegung pro Detektionsbereich der Fall wäre.
Weiterhin kann man durch mehrere Detektoren pro De- tektionsfeld Profile aufnehmen, mit deren Hilfe sich die ortsspezifische Zuordnung eines Bindungsereignisses von Rezeptor und Ligand im Wege der Zentrierung verbessern lässt . Im Rahmen dieser speziell auf die als solche bekannten Mikroarray-Anordnungen gerichteten Ausführungsformen können die einzelnen Photodio- den vorteilhafterweise zu definierten Detektionsgrup- pen bzw. Messfeldern zusammengefasst sein, wodurch die Sensitivität der nachfolgenden Lumineszenzmessung sowie die Reproduzierbarkeit und Verlässlichkeit der hierdurch erhaltenen Messdaten signifikant erhöht werden.
Durch eine Mehrfachbelegung pro Detektionsfeld kann auch eine messtechnische Zentrierung des Liganden- Bindungsereignisses gewährleistet werden, was im Wege der Signalaufbereitung zu einer deutlichen Sensitivitätssteigerung beitragen kann.
Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Anregungsquelle integraler Be- standteil des Detektionssystems und wird durch den
Detektor selbst bereitgestellt. Die Wahl einer pn- Diode aus direktem Halbleitermaterial ermöglicht folgendes: Im ersten Fall bedeutet die Aktivierung die Anlegung einer Spannung, wodurch ein Lichtsignal (pn- Diode wird als LED benutzt) ausgesendet wird, welches je nach Art und Beschaffenheit der pn-Diode in einem bestimmten Emissionswellenlängenband liegt und die Anregung eines im Bereich dieser pn-Diode gebundenen Liganden bewirkt. Nach Deaktivierung der pn-Diode (pn-Diode wird als Photodiode benutzt) und nach Ver- streichen einer gewissen Karenzzeit wird sie dann noch einmal aktiviert, um die gewünschte (n) Messung (en) durchzuführen.
Dadurch, dass die Anregungsstrahlung in der zuvor be- schriebenen Ausführungsform über dieselbe Komponente eingekoppelt wird, mit der auch die Lumineszenzstrahlung aufgefangen wird, kann erreicht werden, dass selektiv ein sehr kleiner Bereich der Sensoroberfläche bzw. des Detektorfeldes bestrahlt wird und von diesem Bereich ausgehende Lumineszenzstrahlung ausgewertet wird. Durch diese Vorgehensweise ist das untersuchte Detektorfeld sehr genau abzubilden und eine Störung der Messung durch die Lumineszenz von außerhalb des untersuchten Bereichs kann verhindert werden.
Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Sensors kann unter Anwendung des an sich bekannten CMOS (comple- mentary metal-oxide semiconductor) -Verfahrens erfolgen, weshalb alle Schaltungsbibliotheken für die In- tegration von Signalkonditionierung und Auswertung ohne Modifikationen verfügbar sind und im Rahmen der vorliegenden Erfindung implementiert werden können. Erfindungsgemäß ebenfalls geeignete Herstellungsverfahren sind z.B. NMOS-Prozesse oder Bipolar-Prozesse (Wolf, Silicon Processing for the VLSI ERA, Vol. 1, Lattice Press, Sunset Beach (1986)). Ferner besteht die insbesondere nach Kostengesichtspunkten interessante Möglichkeit der Herstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors auf der Basis von organischen HaIb- leitern (EP-A-I 085 319) . Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die einzelnen Detektionspunkte oder -felder voneinander in der Weise getrennt, dass im Wesentlichen keine Lichtemission eines Punktes oder Feldes von dem oder den Detektoren eines anderen Punktes oder Feldes empfangen werden kann. So können die einzelnen Detekti- onsorte in jeweiligen Vertiefungen angeordnet sein, wie sie z.B. von üblichen Mikrotiterplatten bekannt sind. Bevorzugt sind erfindungsgemäß muldenartige Vertiefungen und solche, deren seitliche Wandungen im Wesentlichen senkrecht zur Oberfläche des Sensorchips angeordnet sind. Die jeweiligen Abmessungen einer solchen Vertiefung kann der Fachmann in Kenntnis des Anwendungsbereichs frei wählen, solange sich der bzw. die Luminophoren des zu erwartenden Liganden/Rezeptor-Komplexes innerhalb der Vertiefung befinden und im Wesentlichen kein Emissionslicht in benachbarte Vertiefungen eindringen kann. Eine besonders bevorzugte Vertiefung ist um mindestens 100 nm in die Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesenkt. Der gleiche Effekt kann alternativ erzielt werden, indem auf der im Wesentlichen planaren Detektoroberfläche senkrecht nach oben gerichtete Trennmittel angeordnet sind, deren Abmessungen vom Fach- mann in Kenntnis des gewünschten Anwendungsbereiches und der räumlichen Abmessung eines antizipierten Rezeptor/Liganden-Komplexes leicht ausgewählt werden kann. Die Anbringung entsprechend geeigneter Trennmittel kann beispielsweise durch anodische Bonden oder durch sog. Flip-Chip-Verfahren erfolgen. Ein derartiges System ermöglicht erfindungsgemäß ein sensorgestütztes elektrooptisches Bildaufnahmeverfahren.
In einer bevorzugten Ausführung sind auf dem Detek- torchip Kanäle aufgebracht, sodass auf einem Chip parallel mehrere verschiedene Analyte gemessen werden können. Die Kanäle können z.B. Reihen von Sensorelementen versorgen, auf denen die Arrays der Rezeptoren gebunden sind. So ließen sich z.B. Kalibrationsmes- sungen durchführen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Parallelemessung von n identischen Arrays durchgeführt, um so die Kosten pro Analyse drastisch zu senken. Dazu wird der Chip durch Mikrokanäle in beispielsweise 8 identische Komparti- mente unterteilt.
Wenn man als Trägereinrichtung für die Rezeptoren und die Ausbildung der Sensoren ein monolithisch integriertes Halbleitermaterial verwendet, lässt sich auch eine monolithisch integrierte Schaltung auf demselben Substrat herstellen, wodurch in unmittelbarer Nähe zum Untersuchungsobjekt (Rezeptor/Analyt-Komplex) eine Vorverarbeitung der elektronischen Sensor-Ausgangssignale erfolgen kann. Somit handelt es sich bei dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um eine „intelligente" Sensoreinrichtung, die wesentlich mehr leistet, als rein passive Sensoren. Beispielsweise können die Ausgangssignale der elektrooptischen Sensoren durch eine mitintegrierte Schaltung so aufbereitet werden, dass sie über Aus- gangsschaltungen und Anschlusskontakte relativ problemlos nach außen geführt werden können. Ferner kann die Vorverarbeitung aus der Digitalisierung der analogen Sensorsignale und ihre Umwandlung in einen geeigneten Datenstrom bestehen. Des weiteren kann das signal-to-noise ratio, d.h. Signal -Rausch-Verhältnis, durch die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwirklichten Nähe des Detektors zum Ort der Signalverarbeitung aufgrund kurzer Signalwege sehr stark verbessert werden. Darüber hinaus sind auch weitere Ver- arbeitungsschritte möglich, mit denen z.B. die Datenmenge reduziert werden kann oder die der externen Verarbeitung und Darstellung über einen Personal Computer (PC) erfolgen kann. Ferner kann die erfindungsgemäße Vorrichtung so ausgestaltet sein, dass die vorzugsweise verdichteten bzw. aufbereiteten Daten über Infrarot- oder Funkverbindung an entsprechend ausgestattete Empfangsstationen übermittelt werden können .
Die Steuerung der zugehörigen Einrichtungen auf dem Substrat kann über Steuersignale aus einer Steuereinrichtung erfolgen, die vorzugsweise ebenfalls ganz oder teilweise auf dem Substrat ausgebildet sein kann oder extern angeschlossen wird.
Die mögliche Auswertung der optischen/elektrischen Signale im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens über einen handelsüblichen Computer hat den weiteren Vorteil, dass über geeignete Programme eine weitgehende Automatisierung der Datenauswertung sowie -speicherung möglich ist, sodass man im Rahmen der
Datenanalyse durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung keinerlei Einschränkungen gegenüber mit Hilfe herkömmlicher externer Abbildungsoptiken generierter Daten unterliegt.
Das direkte Erfassen der Lumineszenzen auf der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird dadurch realisiert, dass sich die für einen spezifischen Nachweis erforderlichen Rezeptormoleküle - direkt oder z.B. über einen üblichen Abstandshalter, d.h. Spacer, bzw. eine Kopplungsmatrix - auf der Oberfläche eines optischen Detektors befinden, welcher als integraler Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausgestaltet ist.
Die Anregungsquelle, wie sie z.B. in Form einer oder mehrerer Weißlichtlampen LED's, (Halbleiter-) Laser, UV-Röhren, sowie durch Piezoelemente (Ultraschall) bzw. durch Lichtenergie abgebende Gase und/oder Flüssigkeiten (chemische Anregung) bereitgestellt werden kann, sollte ausreichend leistungsstark und vorzugsweise mit hoher Frequenz repetierbar sei. Letztere Eigenschaft ist dann gegeben, wenn die Lichtquelle sowohl kurzzeitig aktiviert als auch gelöscht werden kann. Im Falle der Verwendung einer optischen Anre- gungsquelle sollte diese so abschaltbar sein, dass nach dem Abschalten im Wesentlichen keine weiteren Photonen, wie z.B. durch Nachglühen, auf den Detektor treffen. Dies kann erforderlichenfalls beispielsweise durch die Verwendung von mechanischen Verschlussblen- den (engl, „shutter") , sowie durch Auswahl von LED's oder Lasern als optische Anregungsquelle gewährleistet werden.
Vorzugsweise ist die Anregungsquelle mit der Vorrich- tung optisch und mechanisch derartig mit den optischen Detektoreinheiten gekoppelt, dass ein Strahlungsfeld in Richtung der Optosensoren erzeugt wird, wobei der räumliche Abstand der Anregungsquelle zur Detektionsebene möglich klein ist. Der Abstand muss jedoch ausreichend sein, damit die für den bestimmungsgemäßen Einsatz erforderlichen Reaktionen zwischen Ligand und Rezeptor nicht beeinträchtigt werden.
Auf der Sensorseite können unterschiedliche oder durchstimmbare Sensoren für die Erfassung der aus einem Rezeptor/Liganden-Komplex emittierten Lichtenergie vorhanden sein. Sofern es sich hierbei um Photodioden handelt, werden entweder wellenlängenspezifi- sehe Photoelemente oder aber herkömmliche Photodioden ausgewählt, die mit aufgelegten, aufgebrachten, auf- gedampften oder integrierten Wellenlängenfiltern ausgestattet sind. So ist z.B. bekannt, dass Siliziumnitrid im Gegensatz zu Siliziumoxid UV-Licht nicht durchläset, und dass Polysilizium UV-Strahlung absor- biert (V. P. Iordanov et al . , Integrated high rejecti- on filter for NADH fluorescence measurements, Sensors 2001 Proceedings, Vol. 1, 8- 10 Mai, S. 106-111, AMA- Service (2001) ) . Daher kann auf die Gateoxidschicht im Rahmen des üblichen CMOS-Prozesses Nitrid oder Po- lysilizium deponiert werden, wodurch auf der Photodiode entsprechende Filter geschaffen werden. So hat z.B. NADH (Nicotinamid Adenine Dinucleotid) eine Anregungswellenlänge von 350 nm und eine Emissionswellenlänge von 450 nm. Durch Aufbringung eines Filters, der 350 nm ausfiltert, kann daher die Sensitivität erhöht werden. Erfindungsgemäß kann dieser Effekt genutzt werden, um bei paralleler Verwendung von z.B. zwei unterschiedlichen Luminophoren, von denen beispielsweise nur einer Licht im UV-Bereich emittiert, eine differentielle Detektion zu ermöglichen, da die hierfür vorgesehenen Detektoren UV-sensitiv ausgestaltet sind oder nicht. Ferner bietet dieser Effekt die Möglichkeit, gegebenenfalls störende Eigenfluoreszenzen anwesender Materialien mit bekannter Emis- sionswellenlänge durch Bereitstellung entsprechender Filter aus dem Messverfahren herauszunehmen. Ein Beispiel hierfür ist die parallele Verwendung von Euro- pium-Chelaten (Emission bei ca. 620 nm) und mit Kupfer dotiertem Zinksulfid (Emission bei ca. 525 nm) , die durch hinreichend voneinander verschiedenen Emissionswellenlängenbereichen eine Zweifarbdetektion ermöglichen, z.B. innerhalb eines Bereiches eines Detektorpunktes bzw. -feldes, indem z.B. die Hälfte der Sensoren eines Detektorpunktes bzw. -feldes mit einem Tiefpassfilter und die andere Hälfte der Sensoren des gleichen Punktes oder Feldes mit einem Hochpassfilter ausgestattet ist.
Zusätzlich oder alternativ können unterschiedliche Luminophore parallel eingesetzt werden, sofern ihre physikalischen bzw. optischen Eigenschaften hinreichend voneinander abweichen. Beispielsweise werden erfindungsgemäß die unterschiedlichen Anregungswellenlängen zweier zu verwendender Luminophore A und B und/oder deren unterschiedlichen Halbwertzeiten ge- nutzt. Dies kann z.B. durch Bereitstellung von zwei unterschiedlich dotierten Nanokristallen erfolgen.
Um mit dieser Schicht aus Optosensoren eine Rezep- tor/Analyt-spezifische Detektion durchführen zu kön- nen, kann sie nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform mit einer kopplungsfähigen Substanz beschichtet werden. Typischerweise werden hierzu die Sensor-Chip-Oberflächen aus Metall- bzw. Halbmetalloxiden, wie z.B. Aluminiumoxid, Quarzglas, Glas, in eine Lösung von bifunktionellen Molekülen, sog. „Linker", die beispielsweise eine Halogensilan- , z.B. Chlorsilan, oder Alkoxysilangruppe zur Kopplung an die Trägerstruktur aufweisen, getaucht, so dass sich eine sich selbst organisierende Monoschicht (SAM) bildet, durch welche die kovalente Bindung zwischen Sensoroberfläche und Rezeptor erzeugt wird. Beispielsweise kann mit Glycidyltriethoxysilan beschichtet werden, was z.B. durch Eintauchen in eine Lösung von 1 % Silan in Toluol , langsames Herausziehen und Immobilisieren durch „Backen" bei 120 0C erfolgen kann. Eine auf diese Weise geschaffene Beschichtung weist im Allgemeinen eine Dicke von wenigen Ängström auf. Die Kopplung zwischen Linker und Rezeptormole-' kül (n) erfolgt über eine geeignete weitere funktio- nelle Gruppe, beispielsweise eine Amino- oder Epo- xygruppe . Geeignete bifunktionelle Linker für die Kopplung einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptor-Molekülen, insbesondere auch biologischen Ursprungs, an eine Vielzahl von Trägeroberflächen sind dem Fachmann gut bekannt, vgl. beispielsweise „Bio- conjugate Techniques" von G. T. Hermanson, Academic Press 1996.
Erfindungsgemäß wird ebenso eine Diagnosevorrichtung bereitgestellt, die ein mikrooptisches Detektions- System, wie es zuvor beschrieben wurde, enthält. Unter Diagnosevorrichtungen sind hierbei sämtliche Messanordnungen zu verstehen, für die der Einsatz von mikrooptischen Detektionssystemen, z.B. in Form von Biochips, technisch sinnvoll und praktizierbar ist. Hier sind insbesondere Handheld-Geräte bevorzugt, die vor Ort, d.h. z.B. im Krankenhaus oder in einer Arzt- praxis, im portablen Einsatz verwendet werden können.
Erfindungsgemäß wird ebenso ein Verfahren zur Bestim- mung temperaturabhängiger Parameter von Analyten bereitgestellt. Dieses basiert auf den folgenden Verfahrensschritten :
A) Zunächst werden Rezeptoren für die Analyten an mindestens eine Oberfläche einer Trägerstruktur gebunden, wobei die Rezeptoren eine Vielzahl von Messpunkten bilden.
B) Die Rezeptoren werden mit den Analyten in Kon- takt gebracht, wobei es zur Ausbildung von Re- zeptor-Analyt-Komplexen kommt.
C) Die Rezeptor-Analyt-Komplexe werden mit mindestens einer Anregungsquelle angeregt, um eine detektierbare optische Änderung des Komplexes, des Rezeptors oder des Analyten zu bewirken. D) Die hervorgerufene optische Änderung wird dann mit mindestens einem in der Trägerstruktur monolithisch integrierten und auf die Oberfläche der Trägerstruktur gerichteten Detektor regist- riert und anschließend ausgewertet.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird dabei die zuvor beschriebene Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 29 eingesetzt.
Besonderes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die Anregung und die Detektion bei mindestens zwei unterschiedlichen Temperaturen erfolgt, um die temperaturabhängigen Parameter bei den mindes- tens zwei Temperaturen zu registrieren und auszuwerten.
Die zuvor beschriebenen Verfahrensschritte werden bei unterschiedlichen Temperaturen unter ansonsten glei- che Bedingungen durchgeführt. Hier ist es also möglich, ein Temperaturprogramm zu fahren, sodass z.B. in einem Temperaturfenster von 20 bis 80 0C in 10 0C- Schritten die Temperatur erhöht wird und für diese jeweiligen Temperaturstufen das Nachweisverfahren für den Analyten durchgeführt wird. Dies ermöglicht dann, die Bestimmung einer Schmelzkurve der Analyten, die die Temperaturabhängigkeit der Dissoziation der Rezeptor-Analyt-Komplexe wiedergibt .
Vorzugsweise erfolgt die Detektion in Form eines
ELISA, wie er aus dem Stand der Technik bekannt ist.
So lassen sich erfindungsgemäß als temperaturabhängige Parameter die Assoziationskonstante, die Dissozia- tionskonstante und/oder die Gleichgewichtskonstante bestimmen. Verwendung findet das erfindungsgemäße Verfahren in allen Bereichen, in denen die Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten von Bedeutung ist . Konkrete Beispiele für derartige Anwendungsfeider sind der Erregernachweis im Krankenhaus, der Vaterschaftsnachweis, der Täternachweis oder auch eine P450- Isoenzymanalyse . Diesbezüglich ist insbesondere die maligne Hyperthermie, die auf einer Mutation des Ryanodin-Rezeptors beruht, zu nennen. Das erfindungsgemäße Detektionssystem kann hier eine frühzeitige Erkennung der Hyperthermie ermöglichen. Ein anderes wichtiges Anwendungsfeld ist die Überwachung der Blutgerinnungskaskade, um bei Patienten mit erhöhter Blutgerinnungsneigung die Thrombosegefahr rechtzeitig erkennen und behandeln zu können.
Anhand der nachfolgenden Figuren und des nachfolgenden Beispiels soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten erfindungsgemäßen Varianten zu beschränken.
Fig. 1 zeigt anhand einer schematischen Darstellung den Aufbau einer Variante des erfindungsgemäßen optischen Detektionssystems .
Fig. 2 zeigt in einer schematischen Darstellung die Detektion von Proteinen unter Verwendung des erfin- dungsgemäßen mikrooptischen Detektionssystems.
Fig. 3 zeigt anhand einer schematischen Darstellung die Detektion von Nukleinsäuren mit einem erfindungsgemäßen mikrooptischen Detektionssystem.
In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßes mikrooptisches Detektionssystem 1 dargestellt. Dies beruht auf einer Trägerstruktur 2 , die aus den aus dem Stand der Technik bekannten Materialien für die Herstellung von Chips besteht. Hierzu zählt insbesondere eine Träger- struktur aus polychloriertem Biphenylen (PCB) . Auf der Trägerstruktur 2 ist ein Detektor 3 angeordnet, im vorliegenden Fall in Form eines einzigen Sensorchips. Diese Variante betrifft eine Chemoluminszenz- Messung. Beispielsweise kann im Falle einer Photolu- minszenz-Messung in dem Sensorchip 3 zusätzlich eine Anregungsquelle enthalten sein. Der Sensorchip 3 kann auch direkt in das Substrat integriert sein. Der Sensorchip wird über zwei Haftungsstellen 8 und 8', die z.B. aus einem Klebstoff oder einem Lot bestehen kön- nen, am Substrat befestigt. Auf dem Sensorchip ist eine Flusszelle 4 angeordnet, die der kontinuierlichen Inkontaktbringung eines Fluids mit der Oberfläche des Sensorchips dient. Die Flusszelle weist dabei einen Zufluss 6 und einen Abfluss 7 auf, über die das Fluid in bzw. aus der Flusszelle transportiert werden kann. Weiterhin ist in der Flusszelle 4 ein Temperierelement 5 integriert, das eine Temperaturerhöhung bzw. auch eine Temperaturerniedrigung des Fluids ermöglicht. Alternativ kann das Temperierelement 5 auch zur Temperierung der Oberfläche der Trägerstruktur 2 bzw. des Sensorchips eingesetzt werden. Die Anordnung des Temperierelementes 5 ist daher beliebig wählbar, solange die Anordnung eine entsprechende Temperierung erlaubt. Als Temperierelement 5 wird im vorliegenden Fall ein Peltierelement verwendet. Weiterhin kann die Flusszelle mit weiteren Komponenten gekoppelt sein, die in der vorliegenden Fig. 1 jedoch nicht dargestellt sind. Eine Möglichkeit ist die Kopplung der Flusszelle mit einer Pumpe für den Transport von FIu- iden, die direkt an den Zufluss 6 bzw. Abfluss 7 gekoppelt werden kann. In Fig. 2 ist das Messprinzip für die Bestimmung von Proteinen dargestellt. In die Trägerstruktur 2 ist hier ein Detektor 3 in Form einer Photodiode integ- riert . Auf der Oberfläche der Trägerstruktur 2 im Bereich der Photodiode 3 ist ein Primärantikörper 9 immobilisiert, der als Rezeptor fungiert. Der derart immobilisierte Rezeptor wird dann mit der den Analy- ten 10 enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, wobei es zu einer Bindung zwischen Rezeptor 9 und Analyt 10 kommt. In einem nachfolgenden Verfahrensschritt wird dann die Oberfläche des Chips mit einem Detektormolekül in Kontakt gebracht, das an den Analyten 10 binden kann. Dieses Detektormolekül besteht aus einem Rezeptor 11, im vorliegenden Fall einem Sekundäranti- kόrper, und einem hiermit gekoppelten thermisch stabilen Enzym 12, das eine optische Nachweisreaktion katalysieren kann. Im vorliegenden Fall wird als thermisch stabiles Enzym Meerrettich-Peroxidase ein- gesetzt. Im Anschluss wird dann das Substrat, bestehend aus Wasserstoff-Peroxid und Luminol , zugesetzt. Die damit verbundene Leuchtreaktion kann dann mittels der Photodiode 3 registriert und ausgewertet werden.
Auch hier ist wieder eine Trägerstruktur 2 dargestellt, in die eine Photodiode als Detektor 3 integriert ist. in der Oberfläche der Trägerstruktur ist hier ein DNA-Rezeptor 14 immobilisiert. In einem folgenden Verfahrensschritt wird nun die Probe mit den Analyten 15 in Form eines DNA-Moleküls mit dem Biochip in Kontakt gebracht. Das DNA-Molekül kann z.B. durch Biotin-dUTP markiert werden. In einem folgenden Verfahrensschritt wird dann das Substrat, bestehend aus Luminol und Wasserstoff-Peroxid, zugesetzt. Das Detektionsprinzip entspricht auch hier dem unter Fig. 2 beschriebenen. Beispiel 1
Mikroorganismen werden in einem geeigneten Extrakti- onssystem aufbereitet (Buchholz et al . , 2002). Bei der PCR können über geeignete Primer (Consensus Primer) alle bekannten und auch unbekannten Bakterien mit der PCR erfasst und deren 16s rRNA amplifiziert werden. Die PCR wird bevorzugt asymmetrisch durchge- führt, d.h. von einem der beiden PCR-Primer liegt in der Reaktion ein Mangel vor, sodass neben Doppel - sträng DNA auch Einzelstrang DNA gebildet wird. Durch den Einbau von Biotin-dUTP in der PCR werden die DNA Moleküle markiert . Diese markierten Moleküle werden dann auf dem Chip hybridisiert. Die Temperatur liegt dabei unter dem zu erwartenden Schmelzpunkt (z.B. 20 0C tiefer als der Schmelzpunkt) . Nach ca. Ih wird die Flusszelle des Chips mit Waschpuffer gespült und Streptavidin-HRP wird zugegeben. Nach ca. 10 Minuten wird die ungebundene HPR durch Waschen mit Waschpuffer entfernt und ECL-Substrat wird zugegeben (Luminol plus Wasserstoffperoxid) . Nach Einsetzen der Leuchtreaktion wird die Temperatur schrittweise von 20 0C auf 80 0C erhöht und das Signal wird bei jedem Tempe- raturschritt gemessen. Dabei findet eine langsame Perfusion der Flusszelle statt, sodass abgelöstes Analyt die Messung nicht mehr stört .
Anschließend wird eine Temperaturkorrektur der Enzym- aktivität (der Umsatz des Enzyms ist temperaturabhängig) durchgeführt, um vergleichbare Messwerte zu erhalten. Nun können auch problematische Punktmutationen sicher erkannt werden. Da die Bakterien sich in den Sequenzen zwischen dem Primer stark unterschei- den, kann durch die Wahl der Sonden eine genaue Identifizierung bekannter Mikroorganismen stattfinden.

Claims

Patentansprüche
1. Mikrooptisches Detektionssystem (1) zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten enthaltend
a) eine Trägerstruktur (2) mit mindestens einer Oberfläche, auf der Rezeptoren (9, 14) für die Analyten zur Ausbildung von Rezeptor-Analyt- Komplexen immobilisiert sind, wobei die Rezeptoren eine Vielzahl von Messpunkten bilden,
b) mindestens eine Anregungsquelle, die eine de- tektierbare optische Änderung des Rezeptor-Ana- lyt-Komplexes induzieren kann,
c) mindestens einen monolithisch in die Trägerstruktur integrierten und auf die Oberfläche der Trägerstruktur gerichteten optischen Detektor (3)
d) mindestens eine Vorrichtung (4) zum kontinuierlichen Inkontaktbringen eines Fluids mit den Messpunkten an der Oberfläche der Trägerstruktur sowie
e) mindestens ein Temperierelement (5) für das Fluid.
2. Mikrooptisches Detektionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) eine Flusszelle, eine Küvette oder ein Probenbehälter ist.
3. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) in die Trägerstruktur (2) eingeätzt ist.
4. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) aus einem photogehärteten Polymer besteht und durch Photopolymerisation auf der Trägerstruktur (2) aufgebracht ist.
5. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) auf der Trägerstruktur (2) durch Kleber, Bonding und/oder Pressen aufgebracht ist .
6. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) kanalförmig ausgebildet ist.
7. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) als Ausnehmung in der Träger- Struktur (2) ausgebildet ist, die auf der der
Oberfläche der Trägerstruktur (2) abgewandten Seite mit einer mindestens zwei punktförmigen Ausnehmungen für den Zu- und Abfluss des Fluids aufweisenden Abdeckschicht versehen ist.
8. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) mit mindestens einer Pumpe für den Transport von Fluiden gekoppelt ist .
9. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Temperierelement (5) ein Peltierelement ist.
10. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Temperierelement (5) mit der Vorrichtung (4) thermisch gekoppelt ist.
11. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Temperierelement (5) monolithisch in die Trägerstruktur (2) integriert ist .
12. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionssystem (1) zusätzlich einen Thermosensor zur Be- Stimmung der Temperatur des Fluids und/oder der
Oberfläche der Trägerstruktur (2) aufweist.
13. Mikrooptisches Detektionssystem nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Thermosensor mit der Oberfläche der Trägerstruktur (2) in thermischem Kontakt steht.
14. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsquelle eine zur Anregung von Chemolumineszenz geeignete
Verbindung ist.
15. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsquelle eine Strahlungsquelle für Strahlen insbesondere Licht, Elektronen, Ionen und Schallwellen ist.
16. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsquelle aus einem elektrischen Feld besteht .
17. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Detektor (3) eine Photodiode, ein Photomul- tiplier, ein Photoleiter oder eine Kamera ist.
18. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Detektor (3) eine CMOS-Photodiode und/oder eine CMOS-Kamera ist.
19. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren (9, 14) direkt oder über einen Linker an die Oberfläche der Trägerstruktur (2) kovalent gebunden sind.
20. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker aus mindestens einer Schicht eines bifunktionellen Si- lans besteht .
21. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren (9, 14) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzel- und doppelsträngigen Nukleinsäuren, Nuk- leinsäureanaloga, Haptenen, Proteinen, Peptiden, Antikörpern oder deren Fragmenten, Zuckerstrukturen, Rezeptoren oder Liganden.
22. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren (9, 14) in voneinander getrennten Nachweisfeldern, die die Messpunkte darstellen, immobili- siert sind.
23. Mikrooptisches Detektionssystem nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisfelder arrayartig angeordnet sind.
24. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisfelder als muldenartige Vertiefung in der Oberfläche der Trägerstruktur (2) ausgebildet sind.
25. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisfelder durch im Wesentlichen senkrecht zur Oberfläche ausgerichtete Trennmittel voneinander getrennt sind.
26. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Detektions- System (1) mindestens eine weitere Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Steuereinheit, einem Verstärker, einem Signal- wandler, einer Speichereinheit, einem Filter, einer Optik, Lichtleitern und Schutzschichten integriert ist.
27. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt (10, 15) mit einem Detektormolekül gekoppelt wird, das ein thermostabiles Enzym (12) enthält.
28. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym (12) Pe- roxidase oder alkalische Phosphatase ist.
29. Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten (10, 15) Biomoleküle ausgewählt aus der Gruppe beste- hend aus Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Antikörper und deren funktionellen Fragmenten sind.
30. Diagnosevorrichtung enthaltend ein mikrooptisches Detektionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 27.
31. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 30 in Form einer Handheld-Vorrichtung.
32. Verfahren zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten, bei dem
A) Rezeptoren (9, 14) für die Analyten (10, 15) an mindestens eine Oberfläche einer Trägerstruktur (2) gebunden werden, wobei die Rezeptoren (9, 14) eine Vielzahl von Messpunkten bilden,
B) die Rezeptoren (9, 14) mit den Analyten (10, 15) in Kontakt unter Ausbildung von Rezeptor- Analyt-Komplexen gebracht werden,
C) die Rezeptor-Analyt-Komplexe mit mindestens einer Anregungsquelle zu einer detektierbaren optischen Änderung angeregt werden, D) die optische Änderung mit mindestens einem monolithisch in die Trägerstruktur integrierten und auf die Oberfläche der Trägerstruktur (2) gerichteten Detektor (3) registriert und ausgewertet wird,
wobei die Schritte C) und D) bei mindestens zwei unterschiedlichen Temperaturen erfolgen, um die temperaturabhängigen Parameter bei den mindestens zwei Temperaturen zu registrieren und auszuwerten, und das Verfahren unter Verwendung des mikrooptischen Detektionssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 29 durchgeführt wird.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet dass die Anregung mittels Licht, insbesondere kurzwelliges Licht oder Röntgenstrahlung erfolgt.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet dass die Anregung mittels Elektronen, Ionen, Schallwellen, radioaktiven Stoffen, elektrischen Feldern, Induktion oder mechanisch erfolgt.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung mittels Chemolumineszenz erfolgt.
36. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt (10, 15) mit einem Detektormolekül gekoppelt wird, das aus einem eine optische Nachweisreaktion katalysierenden, thermisch stabilen Enzym (12) und einem mit dem Enzym konjugierten Rezeptor (11) für den Analyten besteht .
37. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das thermisch stabile Enzym (12) eine Peroxidase und/oder eine alkalische Phosphatase ist.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass mittels eines Korrekturfaktors die Temperaturabhängigkeit arithmetisch korrigiert wird.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor (11) Avidin und/oder Streptavidin ist und der Analyt
(10, 15) biotinyliert ist.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels Photodioden, Photomultiplier, Photoleiter oder Kamera erfolgt .
41. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mit CMOS-Photodiode und/oder CMOS-Kamera erfolgt.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektoren (3) seriell ausgelesen werden.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Temperatur des Fluids und/oder der Oberfläche der Trägerstruktur ein Thermosensor verwendet wird.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 43,
dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Verfahrensschritte bei unterschiedlichen Temperaturen unter ansonsten gleichen Bedingungen durchgeführt werden.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 44,
dadurch gekennzeichnet, dass bei verschiedenen Temperaturen vor der Detektion die Oberfläche der Trägerstruktur mit einer Waschlösung zur
Entfernung von dissoziierten Analyten gespült wird.
46. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 45,
dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten (10, 15) Biomoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Antikörper und deren funktionellen Fragmenten sind.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 46,
dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion als ELISA durchgeführt wird.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 47,
dadurch gekennzeichnet, dass als temperaturabhängige Parameter die Assoziationskonstante, die Dissoziationskonstante und/oder die Gleichgewichtskonstante bestimmt wird.
49. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 32 bis 48 zur Bestimmung der Bindungsstärke von Analyten.
50. Verwendung nach Anspruch 49 zur Bestimmung der Assoziationskonstanten, der Dissoziationskonstanten und/oder der Gleichgewichtskonstanten von Analyten.
51. Verwendung nach einem der Ansprüche 49 oder 50 für Erregernachweise im Krankenhaus, insbesondere zur Erkennung von Hyperthermie oder der Überwachung der Blutgerinnungskaskade, Vaterschaftstests, Täternachweise und/oder P450- Isoenzymanalyse .
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