DE10142691B4

DE10142691B4 - Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen sowie eine Vorrichtung hierfür

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Publication number: DE10142691B4
Application number: DE10142691A
Authority: DE
Inventors: Thomas Haneder; Alfred Martin; Volker Dr. Lehmann; Thomas Ehben; Hans Christian Dr. Hanke; Karin Fuchs
Original assignee: Infineon Technologies AG
Current assignee: Infineon Technologies AG
Priority date: 2001-08-31
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2021-09-01
Also published as: US20030068639A1; DE10142691A1

Abstract

Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines makroporösen Substrats (10), das gegenüberliegend eine erste und zweite Oberfläche (10A, 10B) aufweist, wobei über mindestens einen Oberflächenbereich verteilt eine Vielzahl von diskreten Poren (11) mit einem Durchmesser im Bereich von 500 nm bis 100 μm angeordnet ist, welche sich durch das Substrat (10) von der ersten zur zweiten Oberfläche (10A, 10B) erstrecken,
(b) ortsspezifisches Immobilisieren pro Pore (11) von mindestens einem Fängermolekül (20) an den Innenwandoberflächen von mindestens einem Teil der Poren (11), wobei das Fängermolekül (20) befähigt ist, eine biochemische Reaktion einzugehen,
(c) Inkontaktbringen eines Analyten (21) mit dem mindestens einen Fängermolekül (20) in mindestens einer Pore (11),
(d) Beleuchten der ersten Oberfläche (10A) mit Licht, wobei das Licht durch mindestens einen Lichtwellenleiter (30, 32, 36) direkt in mindestens eine Pore eingekoppelt wird oder das Licht durch mindestens einen Lichtwellenleiter eingekoppelt wird, der...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen sowie eine Vorrichtung hierfür („BioChip" bzw. „Lab on chip"), insbesondere zur Untersuchung zur DNA-Hybridisierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen und anderer Bindungsreaktionen im Bereich der Genom-, Proteom- oder Wirkstoffforschung in Biologie und Medizin.
Für die Biowissenschaften und die medizinische Diagnostik ist die Detektion (bio)chemischer Reaktionen, d.h. die Detektion biologisch relevanter Moleküle in definiertem Untersuchungsmaterial von herausragender Bedeutung. In diesem Rahmen wird die Entwicklung von sogenannten BioChips stetig vorangetrieben. Bei derartigen BioChips handelt es sich üblicherweise um miniaturisierte hybride Funktionselemente mit biologischen und technischen Komponenten, insbesondere auf einer Oberfläche (Außenoberfläche und/oder Innenoberfläche) immobilisierte Biomoleküle, die als spezifische Interaktionspartner dienen. Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf. Man spricht dann von sogenannten „Chip-Arrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, werden diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt. Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z.B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z.B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren), Derivate der kombinatorischen Chemie (z.B. organische Moleküle), Zellbestandteile (z.B. Organellen), einzelne Zellen, mehrzellige Organismen sowie Zellverbände in Frage.
Im Bereich der BioChips werden heute meistens optische Verfahren verwendet. Dabei werden zum Nachweis entsprechender biologischer oder biochemischer Reaktionen beispielsweise kleine Mengen an unterschiedlichen Fängermolekülen punktförmig und matrizenartig, sogenannte Dots, auf einer Oberfläche aus beispielsweise Glas oder Gold fixiert. Anschließend wird ein zu untersuchender Analyt, der üblicherweise fluoreszierend markiert werden kann, über diese Oberfläche gepumpt. Wenn sich die entsprechenden Moleküle des fluoreszierend markierten Analyten mit den an der Oberfläche des Trägersubstrats immobilisierten Fängermolekülen umsetzen, kann durch optische Anregung mit einem Laser und Messung des entsprechenden Fluoreszenzsignals diese Reaktion nachgewiesen werden. Ein Nachteil eines solchen optischen Verfahrens besteht jedoch darin, daß der Analyt markiert bzw. gelabelt werden muss, also mit entsprechenden Fluoreszenzmolekülen, beispielsweise Cy3, Cy5, o.ä., versehen werden muß. Zum einen ist hierfür eine chemische Reaktion zwischen dem Analytmolekül und dem Fluoreszenzfarbstoffmolekül notwendig. Zum anderen läßt die Emissivität der Fluoreszenzmoleküle bei längeren bzw. wiederholten Messungen nach, wodurch die Intensität des Meßsignals abnimmt. Des weiteren kann die Bindung des zur Markierung, z.B. Fluoreszenzmarkierung, verwendeten Moleküls an den Analyten zu einer unerwünschten Änderung von dessen Bindungsverhalten gegenüber den Fängermolekülen führen.

DE 200 20 606 U1 beschreibt ein Fluidbauelement, das im wesentlichen auf einer strukturierten Halbleiterschicht beruht, wobei auf der Oberfläche dieser Fluidstruktur immobilisierte Biomaterialien angeordnet und wobei, wenn sich ein Probenfluid innerhalb der Fluidstruktur befindet, unter Verwendung einer Lichtquelle beispielsweise von der oberen Seite aus mittels eines Lichtempfängersdas Transmissionslicht durch das Probenfluid erfaßt werden kann, so daß ein Probenfluidanalysator dann die Eigenschaften des Probenfluids unter Verwendung des Spektrums des eingestrahlten Lichts und unter Verwendung des Spektrums des transmittierten Lichts bestimmen kann. DE 199 45 433 A1 und DE 199 40 750 A1 beschreiben jeweils einen Träger für Analytbestimmungsverfahren, wobei in den Kanälen eines Trägers eine Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptoren immobilisiert sind und wobei die Detektion der Nachweisreaktion bzw. des Bindungsereignisses beispielsweise durch Verwendung einer CCD-Kamera erfolgt. WO 01/50131 beschreibt einen Bioarray auf Basis eines porösen Substrats, das in den Poren Sondenmoleküle gebunden aufweist, wobei auf dem Substrat eine dünne elektrisch leitfähige Schicht angeordnet ist, so daß im Falle eines Bindungsereignisses mit entsprechenden Analytmolekülen eine elektrische Detektion des Bindungsereignisses über die dünne elektrische leitfähige Schicht erfolgt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, flexibles und kostengünstiges Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Nachweis biochemischer Reaktionen mittels sogenannter „Lab on chips" bzw. „BioChips" bereitzustellen, ohne daß der Analyt, d.h. die zu untersuchenden Zielmoleküle markiert werden müssen und somit in nativer Form eingesetzt werden können.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Insbesondere wird ein Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen bereitgestellt, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen eines makroporösen Substrats, das gegenüberliegend eine erste und zweite Oberfläche aufweist, wobei über mindestens einen Oberflächenbereich verteilt eine Vielzahl von diskreten Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 500 nm bis 100 μm, vorzugsweise 5 bis 10 μm, angeordnet ist, welche sich durch das Substrat von der ersten zur zweiten Oberfläche erstrecken,
(b) ortsspezifisches Immobilisieren bzw. Anbinden pro Pore von mindestens einem Fängermolekül an den Innenwandoberflächen von mindestens einem Teil der Poren, wobei das Fängermolekül befähigt ist, eine biochemische Reaktion einzugehen,
(c) Inkontaktbringen eines Analyten mit dem mindestens einen Fängermolekül in mindestens einer Pore,
(d) Beleuchten der ersten Oberfläche mit Licht, wobei das Licht durch mindestens einen Lichtwellenleiter direkt in mindestens eine Pore eingekoppelt wird oder das Licht durch mindestens einen Lichtwellenleiter eingekoppelt wird, der eine Vielzahl von Poren überdeckt, und
(e) Messen der sich in Abhängigkeit von dem Stattfinden einer Bindungsreaktion zwischen dem Analyten und dem an der Innenwandoberfläche der mindestens einen Pore immobilisierten Fängermoleküls ändernden Licht-Transmissionseigenschaft der mindestens einen Pore.

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Technologieplattform zum kostengünstigen, flexiblen und zuverlässigen Nachweis biochemischer Reaktionen auf Basis sogenannter „Lab on chips" bzw. „BioChips" bereit. Die vorliegende Erfindung ermöglicht erstmals eine optische Detektion biochemischer Reaktionen, ohne dass der zu untersuchende Analyt markiert werden muß, z.B. ohne die Verwendung von Fluoreszenzmolekülen oder anderen, beispielsweise radioaktiven, Markern. Weiterhin ist eine hohe Parallelisierung durch eine hohe Anzahl von entsprechenden Poren bevorzugt möglich.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Nachweis biochemischer Reaktionen, umfassend:

(a) mindestens ein makroporöses Substrat, vorzugsweise makroporöses Silizium, das gegenüberliegend eine erste und zweite Oberfläche aufweist, wobei über mindestens einen Oberflächenbereich verteilt eine Vielzahl von diskreten Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 500 nm bis 100 μm, vorzugsweise 5 bis 10 μm, angeordnet ist, welche sich durch das Substrat von der ersten zur zweiten Oberfläche erstrecken, wobei ortsspezifisch an den Innenwandoberflächen von mindestens einem Teil der Poren mindestens ein Fängermolekül pro Pore immobilisiert ist, das befähigt ist, eine biochemische Reaktion einzugehen,
(b) mindestens einen Lichtwellenleiter zum Zuführen von Licht zu den Poren, wobei der Lichtwellenleiter Licht direkt in mindestens eine Pore eingekoppelt oder eine Vielzahl von Poren überdeckt, und
(c) eine Meßeinrichtung zum Erfassen des durch die Poren transmittierten Lichts und zum Analysieren der sich in Abhängigkeit von dem Stattfinden einer Bindungsreaktion zwischen dem Analyten und dem an der Innenwandoberfläche der mindestens einen Pore immobilisierten Fängermoleküls ändernden Licht-Transmissionseigenschaft der mindestens einen Pore.

Das Anordnungsmuster der Poren ist zumindest bereichsweise nach einem Rastermaß aufgebaut. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist üblicherweise weiter in X-Y-Richtung abrastbare automatische Aufgabe- bzw. Entnahmevorrichtungen auf, welche vorzugsweise von außen ansteuerbare Mikroventile sind, die im selben Rastermaß wie das Anordnungsmuster der Poren angeordnet sind. Ferner kann unterhalb der zweiten Oberfläche eine Träger- bzw. Abschlußplatte angeordnet sein, die eine Erfassungseinrichtung in gleicher Anordnung zur Auswertung an einen Mikroprozessor aufweist. Eine derartige Erfassungseinrichtung kann ein CCD-Array oder eine andere entsprechende Detektionseinheit, wie es auf diesem Fachgebiet üblich ist, sein, welche auch unter einem Winkel α, verkippt gegen das makroporöse Substrat bzw. den Chip, angeordnet sein können. Vorzugsweise wird unterhalb der zweiten Oberfläche ein CCD-Array angeordnet.

Die Lichtzuführeinrichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst mindestens einen Lichtwellenleiter, welcher derart angeordnet ist, daß Licht direkt in mindestens eine Pore eingekoppelt wird, oder daß er eine Vielzahl von Poren des makroporösen Substrats überdeckt. Es können dabei sowohl planare Lichtwellenleiter als auch vertikal emittierende Laserdioden vorgesehen sein. Zur Auskoppelung des Lichts kann die erfindungsgemäße Vorrichtung beispielsweise ein oder mehrere, um etwa 35° bis 55°, bevorzugt um etwa 45° abgeschrägte Glasfasern umfassen. In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung können die Lichtzuführeinrichtung und die Meßeinrichtung an der Seite der ersten Oberfläche und ein Reflexionsmittel an der Seite der zweiten Oberfläche angeordnet sein, welches durch die Poren transmittiertes Licht zumindest teilweise durch die Poren in die Meßeinrichtung reflektiert.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand begleitender Zeichnungen von bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Es zeigt:
1 ein beispielhaftes Schema einer Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, worin in definierten Abständen in jeweils eine Pore 11 eine Glasfaser 30 einmündet bzw. knapp über jeweils der Pore 11 positioniert ist;
2 eine Anordnung, bei der eine Glasfaser mehrere Poren des erfindungsgemäß eingesetzten makroporösen Substrats 10 überdeckt, wobei 2(A) eine Unteransicht auf das Substrat 10 ist und 2(B) eine Schnittansicht durch die Anordnung ist;
3(A) eine Anordnung, bei der eine Glasfaser mehrere Poren 11 des Substrats 10 überdeckt; und
3(B) eine Anordnung hinsichtlich eines planaren Lichtwellenleiters 32, der die transmittierten Signale zur Seite des Chips bzw. Substrats 10 leitet; und
4 eine weitere Anordnung, bei der das eingekoppelte Licht erst nach Reflexion an der Rückseite bzw. zweiten Oberfläche 10B des Substrats 10 detektiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Vorrichtung können zum Nachweis biochemischer Reaktionen verwendet werden, um molekulare Spezies zu charakterisieren oder in sonstiger Weise zu identifizieren, welche befähigt sind, kontrollierbar an Biomoleküle bzw. Fängermoleküle zu binden, die an einem makroporösen Substrat 10 immobilisiert sind. Dies schließt insbesondere das Binden von Antikörper-Antigen und Ligand-Rezeptor sowie die Analyse von Nukleinsäuresequenzen ein. Das makroporöse Substrat 10 weist hierfür eine Vielzahl von Poren bzw. Durchgangslöchern bzw. -kanälen bzw. Lochöffnungen 11 auf, an deren Innenwänden die Sonden bzw. Fängermoleküle 20 angeordnet bzw. immobiliert werden können. Die Poren 11 erstrecken sich von einer ersten Oberfläche bzw. Seite 10A zu einer zweiten Oberfläche bzw. Seite 10B des Substrats 10 und sind als Durchgangslöcher ausgestaltet. Wenn sich also beispielsweise eine DNA- oder RNA-Probe mit einer Nukleinsäuresonde, die eine spezifische Basensequenz enthält, „hybridisiert", bindet (siehe bei 22) die Sonde 20 an den Nukleinsäure-Zielstrang nur, wenn zwischen der Sonde (Fängermolekül 20) und dem Zielmolekül 21 eine vollständige bzw. nahezu vollständige Sequenzkomplementarität vorliegt.
Der Hybridisierungsvorgang kann dann gemäß der vorliegenden Erfindung durch Messen der Änderung der Licht-Transmissionseigenschaft(en) in der Pore 11, in welcher der Hybridisierungsvorgang erfolgte bzw. die hybridisierte Sonde 22 angeordnet ist, nachgewiesen werden. Hierfür wird Licht aus einer (weißen oder monochromatischen) Lichtquelle 40 über Wellenleiter 30 in die jeweiligen Poren 11 eingekoppelt. Um die Einkopplung einzelner Lichtleiter 30 in die jeweilige Pore 11 zu erleichtern, können die entsprechenden Enden 11A der Poren 11 kegelig bzw. sich verjüngend ausgestaltet sein. Das Licht aus der Lichtquelle 40 tritt durch die Stirnseite des Wellenleiters 30 in die jeweilige Pore 11 ein, und dessen Eigenschaften (wie Intensität, Beugungseigenschaften, Wellenlänge, Phase, usw.) bzw. die Transmissionseigenschaften der Pore 11 können sich in Abhängigkeit davon verändern, ob das/die darin angeordnete(n) bzw. immobilisierte(n) Fängermolekül e) bzw. Sonde(n) 20 mit einem entsprechenden Analyten bzw. Zielmolekül 21 reagiert hat/haben oder nicht. Das aus der Pore 11 auf der zweiten Oberfläche bzw. Seite 10B des Substrats 10 austretende Licht wird durch einen geeigneten Detektor 50, bevorzugt einem Charged Coupled Device (CCD) gemessen und entsprechend analysiert. In anderen Worten wird Licht aus Poren 11H, in denen beispielsweise eine Hybridisierung stattgefunden hat, dem entsprechenden Bereich 50H der CCD 50 Licht zuführen, das andere Eigenschaften hat als das Licht, das aus Poren 11NH austritt, in welchen dann keine Hybridisierung stattgefunden hat, und auf die entsprechenden Bereiche 50NH des CCDs 50 auftrifft. Wenn eine Phasenverschiebung des transmittierten Licht untersucht werden soll, ist es hingegen notwendig, das Licht mittels eines Interferometers zu untersuchen.
Das Anbinden bzw. Koppeln von beispielsweise Oligonukleotiden bzw. DNA-Molekülen an die Innenwandoberflächen der Poren 11 des erfindungsgemäß verwendeten makroporösen Substrats 10 kann nach den im Stand der Technik üblichen Verfahren, beispielsweise mittels Behandeln des porösen Substrats 10 mit Epoxysilanen und anschließender Reaktion terminaler Epoxidgruppen mit terminalen primären Aminogruppen oder Thiolgruppen der als Fängermoleküle verwendeten Oligonukleotide bzw. DNA-Moleküle, erfolgen. Dabei können beispielsweise die in der vorliegenden Erfindung als Fängermoleküle 20 verwendbaren Oligonukleotide unter Verwendung der Synthesestrategie, wie in Tet. Let. 22, 1981, Seiten 1859 bis 1862, beschrieben, hergestellt werden. Die Oligonukleotide können dabei während des Herstellungsverfahrens entweder an der 5- oder der 3-Endstellung mit terminalen Aminogruppen derivatisiert werden. Eine weitere Möglichkeit der Anbindung der Fängermoleküle 20 an die Innenwandoberflächen der Poren 11 von insbesondere makroporösem Silizium 10 kann durchgeführt werden, indem das Siliziumsubstrat zunächst mit einer Chlorquelle, wie Cl₂, SOCl₂, COCl₂ oder (COCl)₂, gegebenfalls unter Verwendung eines Radikalinitiators wie Peroxide, Azoverbindungen oder Bu₃SnH, behandelt wird und anschließend mit einer entsprechenden nucleophilen Verbindung, wie insbesondere mit Oligonukleotiden bzw. DNA-Molekülen, die terminate primäre Aminogruppen oder Thiolgruppen aufweisen, umgesetzt werden (siehe WO 00/33976).
Das eingesetzte makroporöse Substrat 11 weist üblicherweise einen Porendurchmesser von 500 nm bis 100 μm, insbesondere 5 bis 10 μm auf. Die Dicke des makroporösen Substrats 10 beträgt üblicherweise 100 bis 5.000 μm, vorzugsweise 200 bis 500 μm. Die Wandstärke der Poren bzw. Durchgangslöcher 11, d.h. der Abstand zwischen zwei benachbarten Poren 11, beträgt üblicherweise 1 bis 2 μm. Die Porendichte liegt üblicherweise im Bereich von 10⁵ bis 10⁸/cm², wobei die Poren 11 eine innere Oberfläche von vorzugsweise 10 μm² bis 3 × 10⁴ μm² aufweisen.
Das makroporöse Substrat bzw. der Chip 11 ist dabei vorzugsweise aus makroporösem Silizium. Das Silizium kann dabei dotiert, vorzugsweise n-dotiert, oder undotiert sein. Ein solches makroporöses Silizium kann beispielsweise nach dem in EP-A1-0 296 348 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Silizium hat den Vorteil, für den üblicherweise verwendeten Spektralbereich lichtundurchlässig zu sein, so daß Licht, das auf die erste Oberfläche 10A des aus Silizium aufgebauten makroporösen Substrats 10 einfällt, lediglich durch die Poren 11 und nicht durch die dazwischen angeordneten Bereiche 12 (d.h. das „bulk"-Silizium) das Substrat 10 durchquert und aus den Öffnungen der Poren 11 auf der zweiten Oberfläche 10B des Substrats 10 austritt. In anderen Worten entsteht in der Nähe der jeweiligen Pore 11 ein Transmissionspeak und das entsprechend gemessene Signal wird im wesentlichen nicht durch Licht gestört, das durch das „bulk"-Silizium 12 hindurchtritt.
Die Herstellung der Lochöffnungen bzw. Poren 11 erfolgt bevorzugt auf elektrolytischem Wege, wobei eine elektrolytische Ätzung in einem flußsäurehaltigen Elektrolyten unter Anlegen eines konstanten oder sich zeitlich ändernden Potentials durchgeführt wird, wobei die aus Silizium bestehende Schicht oder das Substrat 10 als positiv gepolte Elektrode einer Elektrolysierzelle geschaltet wird. Die Herstellung derartiger Löcher 11 kann bespielsweise erreicht werden, wie in V. Lehmann, J. Electrochem. Soc. 140, 1993, Seiten 2836 ff., beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können als makroporöses Substrat 10 beispielsweise aber auch andere Halbleitersubstrate, wie z.B. GaAs-Substrate, oder mit Si₃N₄ beschichtete Glassubstrate vorgesehen werden.
Bevorzugt wird pro Pore 11 mindestens ein Fängermolekül 20 an den Innenwandoberflächen von mindestens einem Teil der Poren 11 ortsspezifisch immobilisiert bzw. gebunden (Schritt (b)). Dabei werden gleiche oder unterschiedliche Fängermoleküle 20 punktförmig und im wesentlichen matrizenartig, sogenannte Dots, mit einer entsprechenden Vorrichtung (nicht gezeigt), einem sogenannten Arrayer, auf das Substrat aufgebracht. Durch entsprechende Kapillarkräfte werden diese Flüssigkeitstropfen gleichmäßig in eine oder mehrere Poren 11 in dem makroporösen Substrat 10 verteilt. Diese kapillare Verteilung der Flüssigkeit hat den Vorteil, daß keine Luft in die Poren 11 eintreten kann, da der Durchsatz von sich aus aufhört, wenn keine entsprechende Flüssigkeit mehr vorhanden ist. Die Seitenwände bzw. Innenwandoberflächen der Poren 11 werden dabei im allgemeinen homogen mit den entsprechend eingesetzten Fängermolekülen bzw. Bindungsmolekülen 20 belegt. Die Fängermoleküle 20 sind befähigt, eine biochemische bzw. chemische Reaktion einzugehen, wie insbesondere eine Sequenzanalyse durch Hybridisierung, eine Analyse von Genexpressionsmustern durch Hybridisierung von mRNA oder cDNA mit genspezifischen Sonden, eine immunchemische Analyse von Proteingemischen, eine Epitopkartierung, einen Test bezüglich Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen sowie die Profilerstellung von Zellpopulationen, einschließlich das Binden von Zelloberflächenmolekülen an spezifische Liganden oder Rezeptoren. Vorzugsweise sind die Fängermoleküle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DNA und Proteinen. Besonders bevorzugt werden als Fängermoleküle Oligonukleotidsonden eingesetzt.
Zum Immobilisieren kann das makroporöse Substrat 10 beispielsweise mit Epoxysilan derivatisiert werden, so daß anschließend die Fängermoleküle 20 wie z.B. Oligonukleotidsonden über endständige Aminogruppen an das Epoxysilan-derivatisierte Substratmaterial gebunden werden können.
Anschließend erfolgt ein Inkontaktbringen eines Analyten 21 mit dem mindestens einen Fängermolekül 20 in mindestens einer Pore 11 (Schritt (c)). Dabei wird üblicherweise der Analyt 21, d.h. die zu untersuchende Flüssigkeit, durch die Makroporen 11 gepumpt. Dies kann durch den Aufbau eines Druckgefälles entlang der Poren 11, üblicherweise im Bereich von 100 bis 300 mbar, erreicht werden, so daß zwischen der ersten Oberfläche 10A und der zweiten Oberfläche 10B des makroporösen Substrats 10 eine Druckdifferenz erzeugt wird. Zu diesem Zweck kann das Substrat 10 beispielsweise mit einer Vorrichtung verbunden werden (nicht gezeigt), die den Druck in einem über dem Substrat 10 befindlichen und mit diesem fest verbundenen abgeschlossenen Volumen dynamisch und periodisch verändert.
Das Anordnungsmuster der Poren 11 ist üblicherweise zumindest bereichsweise nach einem Rastermaß aufgebaut, so daß es in X-Y-Richtung von automatischen Aufgabe- bzw. Entnahmevorrichtungen, wie z.B. Probennehmern, Pumpen, Saughebern, o.ä. Mundstücken hiervon, abrastbar bzw. sequentiell anfahrbar ist, wobei insbesondere Mikroventile im selben Rastermaß angeordnet von außen ansteuerbar sind. Derartige Mikroventile selbst sind an sich bekannt (vgl. EP-A2-0 250 948). Sie werden bevorzugt in dem gleichen Array bzw. in der gleichen Matrix in X-Y-Richtung angeordnet wie die Poren 11 in dem makroporösen Substrat 10 und ergeben dadurch eine einfache Auswertemöglichkeit für jeweilige Untersuchungen. Die Mikroventile können in an sich bekannter Weise angesteuert und angetrieben werden.
Als Analyt 21 können beispielsweise DNA, RNA, PNA, Saccharide, Peptide, Proteine, Zellbestandteile, einzelne Zellen, mehrzellige Organismen sowie Zellverbände eingesetzt werden. Der zu untersuchende Analyt 21 kann dabei verdünnt, angereichert bzw. dosiert werden. Die Verweilzeit kann durch jeweiliges Schließen und Öffnen der Mikroventile gesteuert werden.
Wenn die zu untersuchenden Zielmoleküle des Analyten 21 mit den an der Innenwandoberfläche der Poren 11 des makroporösen Substrats 10 immobilisierten Fängermolekülen 20 reagieren und miteinander eine Bindung eingehen, ändern sich die optischen Parameter bzw. Eigenschaften der jeweiligen Pore 11, in der die Reaktion stattfindet. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die sich in Abhängigkeit von dem Stattfinden einer Bindungsreaktion zwischen dem Analyten 21 und dem an der Innenwandoberfläche der mindestens einen Pore 11 immobilisierten Fängermolekül 20 ändernde Licht-Transmissionseigenschaft der mindestens einen Pore 11 gemessen bzw. nachgewiesen. Aufgrund der einzigartigen optischen Eigenschaften von porösem Silizium, wie in Applied Physics Letters, Volume 78, Number. 5, 29. January 2001, beschrieben, ändern sich in Abhängigkeit von dem Stattfinden einer solchen biochemischen Reaktion die Licht-Transmissionseigenschaften der jeweiligen Pore 11. Je nachdem, ob in einer Pore 11 oder einem Poren-Array eine Reaktion zwischen den Fängermolekülen 20 an der Innenoberfläche der Pore 11 und den zu untersuchenden Zielmolekülen des Analyten 21 stattgefunden hat oder nicht, wird das Licht, das beispielsweise mittels eines oder mehrerer Lichtwellenleiter 30 in die Pore 11 oder die Vielzahl von Poren 11 eingekoppelt wird, in seiner Eigenschaft verändert. Auf Basis dessen können biochemische Reaktionen, wie z.B. die Bildung von DNA/DNA bzw. RNA/DNA-Hybriden, in dem „BioChip" erfindungsgemäß nachgewiesen werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise auch das unterschiedliche Absorptionsverhalten von einzelsträngiger und doppelsträngiger DNA gemessen werden.
Zur Messung der Änderung der Licht-Transmissionseigenschaften (Schritt (e)) wird üblicherweise unterhalb der zweiten Oberfläche 10B eine Träger- bzw. Abschlußplatte vorgesehen, die eine Erfassungseinrichtung 50 in gleicher Anordnung zur Auswertung an einen Mikroprozessor aufweist. Dabei kann ein CCD-Array 50 oder eine andere entsprechende Detektionseinheit, wie es auf diesem Fachgebiet üblich ist, auch unter einem Winkel α, verkippt gegen das makroporöse Substrat bzw. den Chip 10, angeordnet werden. Vorzugsweise wird unterhalb der zweiten Oberfläche 10B ein CCD-Array angeordnet. Mit derartigen Elementen ist eine (bevorzugt direkte) Speicherung eines Test- bzw. Analyseergebnisses möglich und jederzeit gezielt abfragbar, auch nach einzelnen Poren 11 im erfindungsgemäß eingesetzten makroporösen Substrat 10.
Bevorzugt können zum Beleuchten der ersten Oberfläche 10A mit Licht (Schritt (d)), vorzugsweise monochromatisches Licht, planare Lichtwellenleiter 32 (3(B)) eingesetzt werden, welche z.B. durch Wellenleiter ausgebildet sind, deren lichtaustrittsseitige Stirnfläche in einem Bereich von etwa 35° bis etwa 55°, bevorzugt um etwa 45° abgeschrägt ist, so daß Licht in dem Wellenleiter 32 im wesentlichen parallel zu der ersten Oberfläche 10A des Substrats 10 geleitet wird, und durch die entsprechenden lichtaustrittsseitigen Stirnflächen des Wellenleiters 32 in die jeweilige Pore 11 bevorzugt im wesentlichen senkrecht zu der ersten Oberfläche 10A des Substrats 10 eingekoppelt wird. Weiterhin können alternativ oder zusätzlich Laserdioden verwendet werden, welche jeweils entweder eindeutig einer einzelnen Pore 11 oder einer Gruppe von benachbarten Poren 11 (3(A)) zugeordnet sind.
Wie in 3(B) gezeigt, kann das durch ein oder mehrere Poren 11 transmittierte Licht ebenfalls durch einen oder mehrere Ausgangswellenleitern 34 (z.B. Glasfasern) nach außen geleitet werden. Der Durchmesser der dabei verwendeten Glasfaser 34 kann gleich oder entsprechend der Dot-Größe, d.h. einige bis einige hundert Poren 11, oder dem Durchmesser einer Pore 11 entsprechen. Um eine einfachere Verbindung und/oder Positionierung des Ausgangswellenleiters 34 zu erzielen, kann die entsprechende Oberfläche 10B des Substrats 10 vertieft, z.B. lithographisch strukturiert und durch KOH geätzt worden sein, so daß ein dem Ausgangswellenleiter 34 entsprechender, rückspringender Bereich 13 an der entsprechenden Oberfläche 10B ausgebildet ist. Ein solcher rückspringender Bereich kann ebenfalls zur Einkopplung von Licht, d.h. an der ersten Oberfläche 10A des Substrats 10 vorgesehen sein, um einen Wellenleiter, z.B. eine Glasfaser zu positionieren (siehe z.B. 4).
Vorzugsweise können zur Auskoppelung des Lichts beispielsweise ein oder mehrere, um etwa 35° bis 55°, bevorzugt um etwa 45° abgeschrägte Glasfasern (ähnlich dem planaren Wellenleiter 32) verwendet werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Licht durch einen Lichtwellenleiter 30 direkt in mindestens eine Pore 11 eingekoppelt und dann am Porenende an der zweiten Oberfläche 10B des makroporösen Substrats 10 beispielsweise auf ein CCD-Array 50 geleitet (1). In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Licht durch einen Lichtwellenleiter ein- bzw. ausgekoppelt, der eine Vielzahl von Poren 11 des makroporösen Substrats 10 überdeckt (2). Eine im wesentlichen homogene Beleuchtung der Poren 11 mit Licht 42 auf der ersten Oberfläche 10A kann durch eine entsprechende optische Anordnung 44 aus einer Lichtquelle 40 erzeugt werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (4) kann in den Schritten (d) und (e) das in die mindestens eine Pore 11 eingekoppelte Licht nach Reflexion an der Rückseite bzw. der zweiten Oberfläche 10B des makroporösen Substrats 10 detektiert bzw. gemessen werden. Dieses Verfahren ist insbesondere für eine Auswertung der Phaseninformation des transmittierten und reflektierten Lichts (konstruktive bzw. destruktive Interferenz) geeignet. Dabei werden die Lichtzuführeinrichtung und die Meßeinrichtung an der Seite der ersten Oberfläche 10A und ein Reflexionsmittel 60 an der Seite der zweiten Oberfläche 10B angeordnet, welches durch die Poren 11 transmittiertes Licht zumindest teilweise durch die Poren 11 in die Meßeinrichtung reflektiert. Das transmittierte Licht wird dabei am Porenende bzw. auf der Seite der zweiten Oberfläche 10B des Substrats 10 reflektiert, erneut durch die entsprechende Pore(n) 11 geleitet und dann beispielsweise in einen Wellenleiter 36 (z.B. eine Glasfaser) eingekoppelt. Der Durchmesser der Glasfaser 36 kann dabei nahezu der Dot-Größe entsprechen, und die Glasfaser 36 kann in einen entsprechenden rückspringenden Bereich 13 der ersten Oberfläche 10A eingepaßt sein. Somit kann der Wellenleiter 36 als Lichteinkopplungseinrichtung dienen, um Licht in die Poren 11 des Substrats einzukoppeln. Das eingekoppelte Licht durchläuft die Poren 11, d.h. wird durch diese transmittiert, verändert ggf. seine Eigenschaften und wird an oder in Nähe von der zweiten Oberfläche 10B des Substrats 10 durch eine Reflektionseinrichtung 60 (z.B. einen Spiegel) reflektiert. Das reflektierte Licht durchläuft erneut die entsprechende(n) Pore(n) 11 und wird in den Wellenleiter 34 an der ersten Oberfläche 10A eingekoppelt und zu einer (nicht gezeigten) Meß- bzw. Detektionseinrichtung geführt. Somit ist eine Messung des transmittierten Lichts auch an der Seite der ersten Oberfläche 10A des Substrats 10 möglich.
Um zwischen den Poren 11H, in denen eine Reaktion zwischen den Fängermolekülen 20 und den zu untersuchenden Zielmolekülen des Analyten 21 an der Innenwandoberfläche der Pore 11 stattgefunden hat und solchen 11NH, in denen keine Reaktion bzw. Bindung erfolgte, einen möglichst großen Unterschied im Rahmen der Messung des transmittierten Signals zu erhalten, können beispielsweise die Porendurchmesser, die Porenlänge, die Wellenlänge bzw. der Wellenlängenbereich des eingekoppelten Lichts, die Oberfläche der Poren 11 bzw. die Besetzungsdichte mit Fängermolekülen 20 sowie der Winkel und/oder der Abstand, unter dem das transmittierte Signal gemessen wird, optimiert werden.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können jegliche Änderungen der Transmissionseigenschaften (insbesondere der Beugungseigenschaften) der Poren 11, insbesondere die Änderung in der Intensität des transmittierten Signals, Änderungen der Beugungseigenschaften, Wellenlängenänderungen oder Phasenverschiebungen, gemessen werden. Vorzugsweise wird in Schritt (e) des Verfahrens die Intensitätsänderung des transmittierten Signals gemessen.
Durch das Einkoppeln von Licht in die Poren 11 des makroporösen Substrats 10, unter Messung der Änderung der Transmissionseigenschaften in Abhängigkeit von dem Stattfinden einer biochemischen Reaktion, ergeben sich prinzipielle Vorteile:

– ein „optisches" Übersprechen aus anderen Dots im Rahmen der Auswertung ist in der Regel nicht möglich, infolgedessen wird automatisch die Ortsauflösung und damit die Zuordnung zwischen dem jeweiligen Dot und dem detektierten Signal erhältlich;
– alle Poren eines Dots tragen zum Meßsignal bei, wodurch ein besseres Signal/Rausch-Verhältnis erreicht wird;
– das verwendete makroporöse Substrat bzw. der verwendete Chip 10, insbesondere makroporöses Silizium, kann zum Auslesen auf einen strukturierten planaren Lichtwellenleiter 32 gelegt werden, so daß der Chip 10 von oben homogen beleuchtet und das transmittierte Signal über den Lichtwellenleiter 32 zu den Seitenflächen des Chips 10 geleitet werden kann, damit ist ein Auslesen direkt im „Variable Inset Plate" (VIP) möglich. Eine derartige „Variable Inset Plate" (VIP) ist in der deutschen Patentanmeldung DE 100 27 104.9 sowie der europäischen Patentanmeldung 01 113 300.6 explizit beschrieben. Es wird in vollem Umfang auf die genannten Patentanmeldungen Bezug genommen, deren Offenbarungsgehalt insoweit Teil der vorliegenden Anmeldung sein soll.

10: Substrat
10A: erste Oberfläche
10B: zweite Oberfläche
11: Pore
12: Bereiche zwischen Poren und „bulk"-Silicium
13: rückspringender Bereich
20: Sonde/Fängermolekül
21: Zielmolekül/Analyt
22: hybridisierte Sonde
30: Wellenleiter
32: Planarer Wellenleiter
34: Ausgangswellenleiter
40: Lichtquelle
50: Detektor/CCD-Array
60: Spiegel

Claims

Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines makroporösen Substrats (10), das gegenüberliegend eine erste und zweite Oberfläche (10A, 10B) aufweist, wobei über mindestens einen Oberflächenbereich verteilt eine Vielzahl von diskreten Poren (11) mit einem Durchmesser im Bereich von 500 nm bis 100 μm angeordnet ist, welche sich durch das Substrat (10) von der ersten zur zweiten Oberfläche (10A, 10B) erstrecken, (b) ortsspezifisches Immobilisieren pro Pore (11) von mindestens einem Fängermolekül (20) an den Innenwandoberflächen von mindestens einem Teil der Poren (11), wobei das Fängermolekül (20) befähigt ist, eine biochemische Reaktion einzugehen, (c) Inkontaktbringen eines Analyten (21) mit dem mindestens einen Fängermolekül (20) in mindestens einer Pore (11), (d) Beleuchten der ersten Oberfläche (10A) mit Licht, wobei das Licht durch mindestens einen Lichtwellenleiter (30, 32, 36) direkt in mindestens eine Pore eingekoppelt wird oder das Licht durch mindestens einen Lichtwellenleiter eingekoppelt wird, der eine Vielzahl von Poren (11) überdeckt, und (e) Messen der sich in Abhängigkeit von dem Stattfinden einer Bindungsreaktion zwischen dem Analyten (21) und dem an der Innenwandoberfläche der mindestens einen Pore (11) immobilisierten Fängermoleküls (20) ändernden Licht-Transmissionseigenschaft der mindestens einen Pore (11).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das makroporöse Substrat (10) ein Substrat auf Basis von makroporösem Silizium ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das makroporöse Substrat (10) eine Dicke zwischen 100 bis 5.000 μm aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Porendichte im Bereich von 10⁵ bis 10⁸/cm² liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Poren (11) eine innere Oberfläche von 10 μm² bis 3 × 10⁴ μm² aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Anordnungsmuster der Poren (11) zumindest bereichsweise nach einem Rastermaß aufgebaut ist, so daß es in X-Y-Richtung von automatischen Aufgabe- bzw. Entnahmevorrichtungen abrastbar ist, wobei insbesondere Mikroventile im selben Rastermaß angeordnet von außen ansteuerbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei unterhalb der zweiten Oberfläche (10B) eine Träger- bzw. Abschlußplatte angeordnet ist, die eine Erfassungseinrichtung (50) in gleicher Anordnung zur Auswertung an einen Mikroprozessor aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei unterhalb der zweiten Oberfläche ein CCD-Array (50) angeordnet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das CCD-Array (50) unter einem Winkel verkippt gegen das makroporöse Substrat angebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Licht durch einen Lichtwellenleiter (30; 32; 36) direkt in mindestens eine Pore (11) eingekoppelt wird und am Porenende der zweiten Oberfläche (10B) des makroporösen Substrats (10) auf eine Detektoreinrichtung (50), bevorzugt ein CCD-Array (50), geleitet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das in die mindestens eine Pore (11) eingekoppelte Licht nach Reflexion an der Rückseite der zweiten Oberfläche (10B) des makroporösen Substrats (10) detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei in Schritt (d) ein oder mehrere planare Lichtwellenleiter (32) eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei in Schritt (d) als Lichtwellenleiter ein oder mehrere vertikal emittierende Laserdioden verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei zur Auskoppelung des Lichts ein oder mehrere, um etwa 35° bis 55°, bevorzugt um etwa 45° abgeschrägte Glasfasern (32) verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Fängermoleküle (20) ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus DNA und Proteinen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Fängermoleküle (20) Oligonukleotidsonden sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei vor dem Immobilisieren das makroporöse Substrat (10) mit Epoxysilan derivatisiert wird und die Oligonukleotidsonden über endständige Amino- oder Thiolgruppen gebunden werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin als Analyt DNA, RNA, PNA, Saccharide, Peptide, Proteine, Zellbestandteile, einzelne Zellen, mehrzellige Organismen oder Zellverbände eingesetzt werden.
Vorrichtung zum Nachweis biochemischer Reaktionen, umfassend: (a) mindestens ein makroporöses Substrat (10), das gegenüberliegend eine erste und zweite Oberfläche (10A, 10B) aufweist, wobei über mindestens einen Oberflächenbereich verteilt eine Vielzahl von diskreten Poren (11) mit einem Durchmesser im Bereich von 500 nm bis 100 μm angeordnet ist, welche sich durch das Substrat (10) von der ersten zur zweiten Oberfläche (10A, 10B) erstrecken, wobei ortsspezifisch an den Innenwandoberflächen von mindestens einem Teil der Poren (11) mindestens ein Fängermolekül (20) pro Pore (11) immobilisiert ist, das befähigt ist, eine biochemische Reaktion einzugehen, und (b) mindestens einen Lichtwellenleiter (30; 32; 36) zum Zuführen von Licht zu den Poren (11), wobei der Lichtwellenleiter (30, 32, 36) Licht direkt in mindestens eine Pore eingekoppelt oder eine Vielzahl von Poren (11) überdeckt, und (c) eine Meßeinrichtung (50) zum Erfassen des durch die Poren (11) transmittierten Lichts und zum Analysieren der in Abhängigkeit von dem Stattfinden einer Bindungsreaktion zwischen dem Analyten (21) und dem an der Innenwandoberfläche der mindestens einen Pore (11) immobilisierten Fängermoleküls (20) sich ändernden Licht-Transmissionseigenschaft der mindestens einen Pore (11).
Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei das makroporöse Substrat (11) ein Substrat auf Basis von makroporösem Silizium ist.
Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Anordnungsmuster der Poren (11) zumindest bereichsweise nach einem Rastermaß aufgebaut ist und die Vorrichtung weiter in X-Y-Richtung abrastbare automatischen Aufgabe- bzw. Entnahmevorrichtungen aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei die automatischen Aufgabe- bzw. Entnahmevorrichtungen von außen ansteuerbare Mikroventile sind, die im selben Rastermaß wie das Anordnungsmuster der Poren (11) angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei unterhalb der zweiten Oberfläche (10B) ein CCD-Array (50) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei das CCD-Array (50) unter einem Winkel verkippt gegen das makroporöse Substrat (10) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei als Lichtwellenleiter (32) ein oder mehrere planare Lichtwellenleiter auf der ersten Oberfläche (10A) des makroporösen Substrats (10) angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei als Lichtwellenleiter ein oder mehrere vertikal emittierende Laserdioden über der ersten Oberfläche (10A) des makroporösen Substrats (10) angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 26, ferner umfassend ein oder mehrere, um etwa 35° bis 55°, bevorzugt um etwa 45° abgeschrägte Glasfasern (32) zur Auskoppelung des Lichts.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 27, wobei die Fängermoleküle (20) ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus DNA und Proteinen.
Vorrichtung nach Anspruch 28, wobei die Fängermoleküle (20) Oligonukleotidsonden sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 29, wobei der Lichtwellenleiter (36) und die Meßeinrichtung an der Seite der ersten Oberfläche (10A) angeordnet sind und ein Reflexionsmittel (60) an der Seite der zweiten Oberfläche (10B) angeordnet ist, welches durch die Poren (11) transmittiertes Licht zumindest teilweise durch die Poren (11) in die Meßeinrichtung reflektiert.