DE10130568C2

DE10130568C2 - Optoelektrisches Analysesystem für die Biotechnologie

Info

Publication number: DE10130568C2
Application number: DE2001130568
Authority: DE
Inventors: Thoralf Gebel; Steffen Howitz
Original assignee: GESIM GmbH; NANOPARC GmbH
Current assignee: Gesim 01454 Grosserkmannsdorf De GmbH; Forschungszentrum Dresden Rossendorf eV
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2003-09-18
Anticipated expiration: 2021-06-28
Also published as: DE10130568A1

Description

Die Erfindung betrifft ein optoelektronisches Analysesystem für die Biotechnologie und das Verfahren zu dessen Her stellung. Das System soll insbesondere für die Fluores zenzanalytik in der Biotechnologie eingesetzt werden.

Bioanalytische Systeme gewinnen zunehmende Bedeutung in der Prozesskontrolle bei der Arzneimittelentwicklung und -her stellung, der in-situ Überwachung von Hormonkonzentrationen in Abwässern und in weiteren Anwendungen, die eine schnelle Datenerfassung und -auswertung vor Ort erfordern. Im medizi nisch-diagnostischen Bereich besteht ein großer Bedarf an sogenannten point-of-care-testing Verfahren, die eine schnellere und preiswertere Alternative zu konventionellen Laboranalysen darstellen. Gleichzeitig führt die zunehmende Miniaturisierung, insbesondere der Wunsch nach Reduzierung des erforderlichen Probenmaterials, nach Erhöhung der Funk tionsdichte auf kleinerem Raum und eines höheren Proben durchsatzes zu einer fortschreitenden Verkleinerung der Messpunkte für optische Analyseverfahren. Das hat aber in der optischen Biosensorik einen vergrößerten apparativen Aufwand in der Detektion zur Folge.

Im Bereich der optischen Bioanalytik ist die Lichtquelle im Hinblick auf die Parallelisierung eines Meßsystems eine be grenzende Größe. Sollen etwa über eine Fläche mehrere Mess punkte gleichmäßig ausgeleuchtet werden, so sind komplizier te Aufweitungs- und Einkoppeloptiken notwendig. Dies führt zu teureren, gegenüber äußeren Störeinflüssen erheblich emp findlicheren Apparaturen. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Abrasterung der einzelnen Messpunkte, was ebenfalls einen erhöhten technischen Aufwand sowie erheblich längere Messdauern nach sich zieht.

Bei der Anwendung von Fluoreszenzmethoden an Nanotiterplat ten (NTP)-Systemen kommen beispielsweise sogenannte "Fluo reszenz-Reader" zum Einsatz. Die NTP wird mit einem (auf geweiteten) Laserstrahl bei 639 nm Wellenlänge in einem 2D- Scanners zeilenweise abgerastert. Anregung und Detektion er folgen von derselben Seite ("Epi-mode"). Das Fluoreszenz licht wird (zusammen mit reflektiertem Anregungslicht) über der NTP von einer großen Linse eingesammelt und am dichroi tischen Strahlteiler aufgespalten. An dieser Stelle muss darauf hingewiesen werden, dass bei dem verwendeten Aufbau in jedem Bildpunkt jeweils die Gesamtfluoreszenz erfasst wird, die bei der Bestrahlung dieses Punktes entsteht.

Dadurch kann es z. B. zu Verzerrungen der tatsächlichen Flu oreszenzintensität aufgrund von Mehrfachreflexionen in der NTP kommen.

Die Modifikation zum sogenannten bikonfokalen Aufbau würde eine ortsaufgelöste Beobachtung erlauben. Hier wird das E missionslicht über die Spiegel des 2D-Scanners reflektiert. Eine abbildende Optik lässt das Licht auf eine ortsfeste Lochblende ("pinhole") vor dem Photomultiplier fallen, so dass nur Emissionslicht der beleuchteten Stelle registriert wird. Ein solches System ist aber durch einen sehr komplexen Aufbau gekennzeichnet. Dabei stellen die optischen Aufbauten hohe Anforderungen an die Justage, insbesondere beim Proben handling, und sind zudem in der Regel nur als stationäre Systeme einsetzbar.

Aus der DE 42 07 431 A1 ist eine Sensoranordnung, insbeson dere zur Untersuchung von biologischen und technischen Strukturen bekannt geworden, mit der sowohl kleinste Areale mit hohem Auflösungsvermögen als auch Makrostrukturen unter sucht werden können. Realisiert wird das mit einer monolit hischen optoelektronischen Sender- und Empfängerstruktur auf einem GaAs Substratmaterial, deren Einzelelemente galvanisch nicht entkoppelt sind. Bei dieser Sensoranordnung befindet sich die Senderoberfläche der einzelnen Senderelemente (Sen dediode) unterhalb derer des Empfängers. Mit dieser Sensor anordnung wird infolge der hohen Packungsdichte von Sendern und Empfängern erreicht, dass entweder mit geringerer Strah lungsleistung zu operieren oder ein tieferes Eindringen in das Volumen der zu untersuchenden Struktur zu ermöglichen, so dass eine nichtinvasive Optodiagnostik im medizinischen Bereich durchgeführt werden kann. Eine Fluoreszenzanalyse lässt sich mit einer derartigen Sensoranordnung jedoch nicht realisieren, da Sender und Empfänger sich auf derselben Sei te befinden.

Eine etwa vergleichbare monolithische Anordnung mit einem Array von Licht emittierenden Dioden und einem Detektor wird in der US 4 588 883 beschrieben. Auch hier sind eine Viel zahl von LED's in einer planaren Anordnung auf einem GaAs- Substrat nebeneinander angeordnet, wobei die LED durch einen Mikroprozessor angesteuert werden. Das von diesen LED emit tierte Licht wird durch einen gemeinsamen Detektor detek tiert. Das Ausgangssignal des Detektors wird hier zur dyna mischen Korrektur der Lichtintensität der LED verwendet.

Ein weiteres Problem der Bioanalytik ist die für Analysen erforderliche spezifische Anbindung von bioaktiven Substan zen an funktionalisierte Oberflächen. Zur Realisierung der Ortsauflösung verwendet man dort Methoden des Mikroarraying, in denen durch Plottersysteme Substanzen lokal aufgespottet oder aber aufwendige sequentielle photolithographische Pro zessierungen erforderlich werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein optisches Sys tem vorzuschlagen, mit dem die aufwendige externe Lichtein kopplung vermieden werden kann, die ortsaufgelöste Anregung von Fluoreszenzreaktionen verbessert wird und durch die E mission von energiereichem Licht Bindungsreaktionen lokal angeregt werden können.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit den in den Patentansprü chen dargelegten Merkmalen und Methoden der Mikrostruktur technik gelöst. Dabei ist wesentlich, dass eine Lichtquelle oder eine Arrayanordnung mehrerer Lichtquellen direkt in ei nem monolithischen Aufbau integriert sind und das Licht nicht mehr extern eingekoppelt werden muss. Die Verwendung von Lichtemittern auf der Basis von der Elektrolumineszenz aus nanoclusterhaltigen SiO₂ Schichten und die bei deren Her stellung verwendeten Standardverfahren der Silizium - Halb leitertechnologie ermöglichen dabei die Verwendung von hoch dichten Arrays bestehend aus einzelnen Elektrolumineszenz Elementen, die durch die einzelne oder gruppierte Ansteue rung eine ortsaufgelöste Anregung der Fluoreszenz ermögli chen.

Dieses System ist leicht parallelisierbar, in den geometri schen Dimensionen deutlich kleiner als bisher verwendete Systeme und zudem kostengünstig in Si-Technologie her stellbar. Der Aufbau in konventioneller Silizium-Technolo gie ermöglicht die Anwendung photolithographischer Struktu rierungsverfahren und damit eine hohe Ortsauflösung, da vie le Lichtemitter in der für den jeweiligen Zweck optimalen Größe und Form kostengünstig und mechanisch unempfindlich hergestellt werden können. Große Analyseapparate sind damit ersetzbar, da mit kleinen portablen Geräten Messungen schnell vor Ort ausgeführt werden könnten. Zusätzlich können die Herstellungskosten deutlich gesenkt werden. Durch diese Vorteile ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten in der point- of-care Diagnostik, insbesondere beim Einsatz als dispo sable.

Das beschriebene System eignet sich zur direkten Messung im Durchfluss und kann daher in Mikrosystemen zur Analytik von Flüssigkeiten eingesetzt werden. Weiterhin kann die Anbin dung entsprechender bioaktiver Substanzen auf einem derart aufgebauten Emitterarray durch Direktpipettierung mit einem Pipettierroboter oder durch ein konventionelles Verfahren mit lokaler Belegung, Inkubation und anschießenden Reini gungsschritten ausgeführt werden.

Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Als Lichtquelle werden modifizierte Metall-Oxid-Halbleiter (MOS)-Strukturen verwendet (siehe Abb. 1). In einer Oxid schicht werden dazu gezielt durch Ionenstrahlsynthese Germa nium-Nanostrukturen erzeugt, die aufgrund ihrer Eigenschaf ten elektrisch zur Lichtemission angeregt werden können. Das Spektrum des emittierten Lichtes liegt im violett/blauen Be reich und weist einen Peak bei 390 nm auf.

Die Herstellung der Strukturen erfolgt, indem auf einem Si- Wafer 1 in einer Feldoxidumgebung 2 dünne SiO₂-Schichten 3 (50 . . . 200 nm) durch thermische Trockenoxidation erzeugt werden. Zur Herstellung kann dabei beispielsweise eine LOCOS -Technologie eingesetzt werden. Diese dünnen SiO₂-Schich ten 3 werden mit Ge⁺-Ionen mit Peakkonzentrationen von 1 . . . 6 at% implantiert und mit einer anschließenden Kurzzeit temperung (1 . . . 100 s) bei 800 . . . 1000°C behandelt. Infolge dieser Behandlung bilden sich Nanostrukturen 7 in der im plantierten dünnen Oxidschicht 3 aus. Anstelle von Germanium können auch andere Elemente der Gruppe 4 des Periodensystems der Elemente implantiert werden.

Als transparenter Kontakt 4 für die Lichtquelle wird Indium -Zinnoxid (ITO) eingesetzt, wobei die Schichtdicke des Kon takts 50 . . . 150 nm beträgt. Aufgrund der begrenzten Tempera turstabilität von etwa bis 200°C können anstelle des ITO auch alternative Kontaktmaterialien in Betracht gezogen wer den, wie z. B. ultradünne Metallschichten aus Al, oder Au, mit Dicken im Bereich 10-15 nm. Beim Aufbringen von Gold schichten ist ein entsprechender Haftvermittler einzusetzen, z. B. Cr. Die elektrische Kontaktierung der Emitterstruktu ren erfolgt an der Oberseite über eine an den transparenten Kontakt 4 angeschlossene Leitbahn 5 und auf der Waferrück seite über die Aluminiumbeschichtung 6. Die Lichtquellen werden durch Anlegen einer Spannung zur Lichtemission ange regt. Die anzulegende Spannung ist dabei abhängig von der Dicke der dünnen Oxidschicht 3 und ist so zu wählen, dass Fowler-Nordheim Tunneln von Elektronen einsetzt, also Feld stärken < 6 MVcm^-1 auftreten. Die Anregung kann dabei auch im Pulsbetrieb erfolgen.

Zum Schutz vor äußeren Einflüssen wird das System durch eine < 1 µm dicke SiO₂-Schicht 8 abgedeckt. Auf die Kontakt schicht 4 des Emitters können entsprechende biosensitive Schichten 9 aufgebracht werden, die für je Spot individuelle Bindungschemie stehen können und so das parallele Suchen nach unterschiedlichen Zielmolekülen im Durchflussmode ermöglichen. Der Kontakt 4 des Lichtemitters im Bereich der Emitterregion kann dabei auch vor dem Aufbringen bioaktiver Schichten 9 durch zusätzliche Beschichtungen oder durch eine Abfolge von lithographischen Prozessschritten in der Ober flächenstruktur so verändert werden, dass spezifische Biomo leküle an der Emitteroberfläche angekoppelt werden können.

Als sensitive Schicht wird z. B. Biotin an die Glasoberflä che der Lichtquelle kovalent immobilisiert. Der Nachweis der Affinitätsbindung erfolgt über fluoreszenzmarkierte Avidin moleküle. Um eine optimale Fluoreszenzausbeute zu erreichen, ist der Farbstoff auf das Intensitätsprofil der Lichtquelle abzustimmen. Bei der verwendenden Lichtquelle liegt die ma ximale Intensität bei einer Wellenlänge von ca. 390 nm. Ein möglicher Farbstoff sind die vom Hersteller Molecular Probes vertriebenen Platin Luminescent Microspheres, die bei einer Wellenlänge von 390 nm angeregt werden und bei 650 nm fluo reszieren.

Durch die einfache Anwendung eines Kantenfilters ist die Trennung zwischen Anregungs- und Fluoreszenzwellenlänge mög lich. Im Zuge einer integrierten optischen Lösung wird in einem Multischichtaufbau eine entsprechende modifizierte Schicht eingebracht, die die Wellenlängentrennung zwischen einem integrierten Lichtemitter und einem Lichtdetektor be wirkt.

Bezugszeichenliste

1

Substrat

2

Feldoxidumgebung

3

dielektrische Schicht (Oxydschicht)

4

transparenter Kontakt

5

Leitbahn

6

Aluminiumbeschichtung

7

Nanocluster

Claims

1. Optoelektronisches Analysesystem für die Biotechnolo gie, bestehend aus einer Lichtquelle, einem Lichtdetek tor und einer Schicht mit einer funktionalisierten O berfläche, dadurch gekennzeichnet, dass die mittels mikrotechnischen Verfahren in einer frei wählbaren Form und Größe auf einem Silizium-Substrat (1) hergestell te Lichtquelle und eine Schicht mit einer funktionali sierten Oberfläche in einem monolithischen Block verei nigt sind.

2. Optoelektronisches Analysesystem für die Biotechnologie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle eine durch Ionenstrahlsynthese bei Implan tation von Elementen der Gruppe 4 des Periodensystems modifizierte SiO2 Schicht oder durch ein plasmagestütz tes Verfahren unter Variation der Stöchiometrie erzeug te SiOx Schicht enthält, wobei sich nach anschließender thermischer Ausheilung Nanocluster (7) in dieser die lektrischen Schicht (3) bilden, und die derart modifi zierte dielektrische Schicht (3) bei elektrischer Anregung über eine Kontraktelektrode (4) und einen Rückkon takt (6) zur Elektrolumineszenz angeregt wird.

3. Optoelektronisches Analysesystem für die Biotechnologie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Emissionsrichtung liegende Kontaktelektrode (4) der Lichtquelle für das von der Lichtquelle emittierte Licht transparent ist und aus den Materialien Indium- Zinnoxid (ITO) mit der Dicke von 20-150 nm oder Alumi nium mit einer Dicke von 10-30 nm oder einem Schicht system Chrom/Gold (3-5 nm Cr, 10-20 nm Au) besteht.

4. Optoelektronisches Analysesystem für die Biotechnologie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass intrans parente Materialien für die Kontaktelektrode (4) verwendet werden, indem die Kontaktelektrode (4) dann zusätzlich, mittels lithographischer Strukturie rung erzeugte transparente Bereiche (Fenster) innerhalb der Kontraktfläche aufweist.

5. Optoelektronisches Analysesystem für die Biotechnologie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ober fläche des Kontakts (4) des Lichtemitters ohne Störung von deren Lichtdurchlässigkeit und geometrisch auf den Bereich der Emitterregion beschränkt, durch zusätzliche Beschichtungen in der Oberflächenstruktur so verändert wird, dass spezifische Biomoleküle an der Emitterober fläche angekoppelt werden können.

6. Optoelektronisches Analysesystem für die Biotechnologie nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere strukturierte Lichtquellen mit Abmessungen von 1 bis 500 µm als Array angeordnet sind, über je weils getrennt ansteuerbare Kontaktelektroden (5) ver fügen und durch eine elektronische Ansteuerung einzeln oder in Gruppen zur Lichtaussendung aktiviert werden können.

7. Optoelektronisches Analysesystem für die Biotechnologie nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass durch Implantation unterschiedlicher Ionensorten von Elementen der Gruppe 4 des Periodensystems oder die kombinierte Implantation verschiedener Ionensorten der Gruppe 4 des Periodensystems, auf einem Chip unter schiedliche Lichtwellenlängen zur Anregung erzeugt wer den können.