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Diese
Anmeldung ist eine "Continuation-in-part" der anhängigen
U.S.-Patentanmeldung Nr. 09/735.402 ,
eingereicht am 12. Dezember 2000, und beansprucht die Priorität der PCT-Anmeldung mit
dem Titel "Improved
Biochip", eingereicht
am 11. Dezember 2001 (die Erfinder sind Vijay K. Mahant und Fareed
Kureshy), die hierin durch Bezugnahme umfasst ist.
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Gebiet der Erfindung
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Das
Gebiet der Erfindung sind analytische Vorrichtungen und Verfahren.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Genomik- und Proteomikforschung haben eine enorme Zahl an Nukleotid- und Peptidsequenzen
für die
Analyse verfügbar
gemacht. Infolgedessen hat das Proben-Screening mit hohem Durchsatz
nach dem Vorhandensein und/oder der Menge einer enormen Zahl an
bekannten Genen oder Polypeptiden in den letzten Jahren beachtliches
Interesse erlangt. Es gibt verschiedene nach dem Stand der Technik
bekannte Vorrichtungen und Verfahren und viele dieser Vorrichtungen
und Verfahren sind auf das Screening von Mehrfachnukleinsäuresequenzen ausgelegt.
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Zum
Beispiel beschreiben Johann und andere in dem
U.S.-Patent Nr. 6.277.628 in einem
relativ einfachen Ansatz ein Testsystem, in dem mehrere Trägerstrukturen
in einer Kapillare eingeschlossen sind und worin wenigstens einige
der Trägerstrukturen
(zum Beispiel Glasperlen) kovalent mit einer biomolekularen Sonde
beschichtet werden. Das System von Johann verkleinert das Verhältnis von
Probenvolumen zur Prüfoberfläche vorteilhaft,
wodurch mögliche
Verzögerungen
auf Grund von kinetischen Effekten verringert werden. Es treten
jedoch verschiedene Probleme bei der Verwendung solcher Systeme
auf. Unter anderen Nachteilen ist die optische Detektion (zum Beispiel
Fluoreszenz) eines Signals von einer hybridisierten Probe wenigstens
in gewissem Maße durch
unabsichtliche Lichtabsorption (zum Beispiel Erregung und Emission)
durch die Kapillare beeinträchtigt.
Ferner mindern intrinsische optische Effekte (zum Beispiel Autofluoreszenz)
der Kapillare die Empfindlichkeit der Analyse oder des Verfahrens wahrscheinlich
weiter. Weiterhin ist die unbeabsichtigte Fokussierung/Diffusion
von einfallendem und/oder emittiertem Licht auf Grund der starken Krümmung der
Kapillare unvermeidlich. Außerdem ist
der Aufbau von Johanns Testsystem relativ mühsam und zeitaufwändig.
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In
einem anderen Beispiel wird die Hybridisierung von Zielmolekülen von
einer Probe auf eine immobilisierte Fängersonde durch elektrophoretische
Unterstützung
unter Verwendung einer Mikrochipvorrichtung, wie in den
U.S.-Patenten Nr. 5.632.957 ,
5.605.662 und
5.849.486 beschrieben, beschleunigt.
Die Verwendung solcher Mikrochipvorrichtungen steigert nicht nur
die Geschwindigkeit der molekularen Assoziierung zwischen einem
Zielmolekül
und einer Fängersonde,
sondern ermöglicht ebenfalls
die Adressierbarkeit jedes „Pixels" des Testarrays.
Ferner kann die Stringenz elektronisch auf eine relativ einfache
Weise in einem zur elektrophoretisch unterstützten Hybridisierung umgekehrten Prozess
reguliert werden. Die Probendichte solcher Vorrichtungen ist jedoch
in vielen kommerziell verfügbaren
Systemen üblicherweise
auf ungefähr
100 Pixel pro Vorrichtung begrenzt. Außerdem erfordert die elektrophoretisch
unterstützte
Hybridisierung die Verwendung komplexer und relativ teurer Chips
und die Beladung/Hybridisierung und Detektion werden üblich unter
Verwendung separater Instrumente ausgeführt, wodurch die Anschaffungs-,
Betriebs- und Wartungskosten weiter steigen.
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In
einem weiteren Beispiel werden Testarrays unter Verwendung eines
photolithographischen Verfahrens hergestellt, was eine relativ hohe
Dichte der Fängerproben
ermöglicht
(zum Beispiel größer als
10000 Proben pro Array). Systeme für solche Arrays hoher Dichte
sind zum Beispiel in den
U.S.-Patenten Nr. 5.599.695 ,
5.843.655 und
5.631.734 beschrieben. Während Arrays
mit hoher Dichte besonders nützlich
für die
Sequenzierung oder die komplexe Genanalyse sind, gibt es zahlreiche
Nachteile. Zum Beispiel ist die kundenspezifische Synthese solcher
Arrays hoher Dichte voraussichtlich für jedermann bis auf wenige
Einzelpersonen und/oder Organisationen unfinanzierbar. Ferner weisen
Arrays hoher Dichte in der routinemäßigen klinischen Diagnostik
häufig
eingeschränkte
Anwendungen auf. Außerdem
sind auf Grund der bei der Erstellung solcher Arrays eingesetzten
besonderen Chemie Nichtnukleinsäuresonden
(zum Beispiel Rezeptoren, Antikörper und
andere Polypeptide) schwer, wenn überhaupt, zu realisieren.
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Obwohl
somit zahlreiche Multisubstrat-Arrays nach dem Stand der Technik
bekannt sind, weisen alle oder beinahe alle einen oder mehrere Nachteile
auf (zum Beispiel hohe Kosten, schwierig anzupassen, spezialisierte
Chemie usw.). Folglich besteht noch ein Bedarf, verbesserte Multisubstrat-Array-Vorrichtungen und
-Verfahren bereitzustellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auf eine analytische Vorrichtung,
die ein Gehäuse
mit einem Hohlraum beinhaltet, worin ein Multisubstrat-Chip wenigstens
teilweise in dem Hohlraum angeordnet ist und worin der Multisubstrat-Chip
Referenzmarker und mehrere Substrate an vorgegebenen Positionen
aufweist, wobei wenigstens eines der mehreren Substrate mit einem
Träger über einen
in einer Matrix angeordneten Crosslinker verbunden ist. Besonders
bevorzugte Vorrichtungen beinhalten ein Gehäuse, das derart ausgelegt ist,
dass der Referenzmarker und die Substrate durch entsprechende Lichtquellen
unter verschiedenen Winkeln beleuchtet werden.
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In
einem Gesichtspunkt des erfinderischen Gegenstands beinhalten die
Hohlräume
ferner einen Anschluss zur Flüssigkeitshandhabung,
wobei der Hohlraum vorzugsweise ein Volumen zwischen 0,01 ml und
1 ml aufweist. Noch weiter bevorzugte Vorrichtungen beinhalten eine Überlaufkammer,
die ferner einen Überlaufanschluss
zur Flüssigkeitshandhabung
beinhalten kann, wobei sich der Hohlraum in Fluid leitender Verbindung
mit der Überlaufkammer befindet,
wenn der Hohlraum eine Flüssigkeit
mit einem Volumen enthält,
das größer als
ein vorgegebenes Volumen des Hohlraums ist.
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In
einem anderen Gesichtspunkt des erfinderischen Gegenstands können die
Vorrichtungen einen zweiten wenigstens teilweise in dem Hohlraum angeordneten
Multisubstrat-Chip oder einen zweiten Hohlraum und einen zweiten
Multisubstrat-Chip, der wenigstens teilweise in dem Hohlraum angeordnet ist,
umfassen.
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In
alternativen Gesichtspunkten des erfinderischen Gegenstands wird
der Hohlraum durch das Gehäuse
und ein Grundelement gebildet, worin der Multisubstrat-Chip mit
dem Grundelement (das vorzugsweise ausgelegt ist, thermische Energie und/oder
Ultraschallenergie auf den Multisubstrat-Chip und/oder ein Fluid
zu übertragen)
verbunden ist. In weiteren Gesichtspunkten haben ein oder mehrere
Substrate Kontakt mit einem Probenfluid, einem Reagensfluid, einem
Waschfluid und/oder einem Detektionsfluid, wenn sich der Multisubstrat-Chip
in einer im Wesentlichen horizontalen Position befindet, es ist
ferner bevorzugt, dass ebenfalls das Binden eines Analyts an ein
Substrat detektiert wird, während sich
der Multisubstrat-Chip in einer im Wesentlichen horizontalen Position
befindet.
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In
noch weiteren Gesichtspunkten beinhalten der Multisubstrat-Chip
und/oder das Gehäuse
einen Referenzmarker, der automatisch lesbar ist, und die Matrizen
beinhalten ferner wenigstens ein Zusatzmittel, das aus der Gruppe
bestehend aus einem Puffer, einem Befeuchtungsmittel, einem Licht
abweisenden Mittel und einem oberflächenaktiven Mittel ausgewählt wird.
Geeignete Matrizen können
eine einzelne Schicht beinhalten oder die Matrix kann aus wenigstens
zwei chemisch unterschiedlichen Schichten gebildet sein. Mehrere
der analytischen Vorrichtungen können
in einem Magazin untergebracht sein, vorzugsweise derart, dass sich
das Grundelement der ersten Vorrichtung über dem Gehäuse der zweiten Vorrichtung
befindet.
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Verschiedene
Ziele, Merkmale, Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung zusammen mit den angefügten Zeichnungen ersichtlicher
werden.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1A ist
eine Perspektivansicht einer beispielhaften Multisubstrat-Testvorrichtung.
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1B ist
eine schematische senkrechte Schnittansicht eines Teils der Multisubstrat-Testvorrichtung
aus 1A.
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2A ist
eine schematische Draufsicht einer alternativen Multisubstrat-Testvorrichtung.
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2B ist
eine schematische Draufsicht einer anderen alternativen Multisubstrat-Testvorrichtung.
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3 ist
eine schematische Seitenansicht eines Magazins, das mehrere Multisubstrat-Testvorrichtungen
beinhaltet.
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Ausführliche Beschreibung
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Die
Erfinder haben herausgefunden, dass eine Multisubstrat-Testvorrichtung
auf eine konzeptionell einfache und kostengünstige Weise hergestellt werden
kann. Außerdem
erlauben insbesondere die betrachteten Multisubstrat-Testvorrichtungen
eine einfache Anpassung des Arrays, schnelle Auslesezeiten, erheblich
verringerte Fotobleichung der Fluorophore und die Substrate sind
nicht auf eine bestimmte Gruppe oder Klasse von Biomolekülen beschränkt.
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Der
hierin verwendete Begriff „Multisubstrat" bezieht sich auf
mehrere chemisch und/oder physikalisch verschiedene Moleküle, wobei
die Zahl solcher Moleküle
allgemein zwischen zwei und mehreren zehntausend Molekülen beträgt, üblicher
zwischen hundert und mehreren tausend und am üblichsten zwischen einhundert
und eintausend. Die betrachteten Substrate beinhalten biologische
(d.h. natürlich
vorkommende) und nichtbiologische (d.h. synthetische) Moleküle, wobei
insbesondere die betrachteten biologischen Moleküle Nukleinsäuren (zum Beispiel DNA, mRNA,
hnRNA, snRNA usw.), Polypeptide (zum Beispiel Enzyme, Rezeptoren,
Antikörper,
Cytokine, Strukturproteine usw.), Lipide (Membranlipide, Botenlipide,
lipoproteingebundene Lipide usw.), Kohlenhydrate (zum Beispiel Glycocalyx- Kohlenhydrate, Glycogen
usw.) und alle Kombinationen und/oder Fragmente davon beinhalten.
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Die
hierin verwendeten Begriffe „erster
Winkel" und „zweiter
Winkel" beziehen
sich auf einen Winkel, der zwischen der Oberfläche (der Matrix) des Multisubstrat-Chips
und dem einfallenden Licht gebildet wird, wobei der einfallende
Lichtstrahl entweder fokussiert oder ein Laserstrahl ist. Wo das
einfallende Licht diffus oder gebeugt ist, wird der Winkel zwischen
einer geraden Linie zwischen der Oberfläche (der Matrix) des Multisubstrat-Chips
und dem Teil der Licht emittierenden Vorrichtung, der der Oberfläche (der
Matrix) des Multisubstrat-Chips am nächsten ist, gebildet, worin
die Licht emittierende Vorrichtung eine Glühlampe, eine Licht emittierende
Diode, ein Lichtbogen oder eine elektrolumineszierende Quelle ist.
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Beispiele
für nichtbiologische
Moleküle
beinhalten synthetische Nukleinsäuren,
die ferner modifizierte Nukleoside oder Nukleotide beinhalten können (zum
Beispiel DNA, mRNA, hnRNA, snRNA usw.), natürliche und synthetische Polypeptide,
die ferner modifizierte Aminosäuren
beinhalten können
(zum Beispiel Enzyme, Rezeptoren, Antikörper, Cytokine, Strukturproteine
usw.), synthetische Lipide (Membranlipide, Botenlipide, lipoproteingebundene
Lipide usw.), synthetische Kohlenhydrate (zum Beispiel Glycocalyx-Kohlenhydrate,
Glycogen usw.) und alle Kombinationen und/oder Fragmente davon.
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Der
hierin verwendete Begriff „Chip" bezieht sich auf
einen Träger,
der mehrere Substrate in vorgegebenen Positionen aufweist, worin
wenigstens eines der Substrate mit dem Träger über einen Crosslinker verbunden
ist, der in einer Matrix angeordnet ist. Insbesondere sind die betrachteten
Multisubstrat-Chips in der allgemeineigenen und anhängigen
U.S.-Patentanmeldung Nr. 09/735.402 ,
eingereicht am 12. Dezember 2000, und der PCT-Prioritätsanmeldung
mit dem Titel „Verbesserter
Biochip", eingereicht
am 11. Dezember 2001 (die Erfinder sind Vijay K. Mahant und Fareed
Kureshy), beschrieben, die hierin durch Verweis aufgenommen sind.
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Der
ferner hierin verwendete Begriff „vorgegebene Position" eines Substrats
bezieht sich auf eine bestimmte Position des Substrats auf dem Chip, die
durch wenigstens zwei Koordinaten relativ zu einem Referenzpunkt
auf dem Chip adressierbar ist und schließt insbesondere eine im Wesentlichen
vollständige
Beschichtung des Chips mit dem Substrat aus. Daher beinhalten bevorzugte,
mehrere vorgegebene Positionen ein Array mit mehreren Substratzeilen,
die mehrere Spalten bilden (zum Beispiel weist jedes Substrat eine
x-Koordinate und eine y-Koordinate auf, wobei x und y größer als
1 sind).
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Eine
beispielhafte Multisubstrat-Testvorrichtung 100 ist in 1A veranschaulicht.
Die Testvorrichtung 100 weist ein Gehäuse 110 auf, in dem
ein Hohlraum 120 gebildet ist. Der Hohlraum 120 weist üblicherweise
ein Volumen zwischen ungefähr
0,01 ml und 10 ml auf. Ein Anschluss 122 zur Flüssigkeitshandhabung
steht in Fluid leitender Verbindung mit dem Hohlraum 120,
und der Hohlraum ist ferner teilweise mit einer Überlaufkammer 124 umgeben,
die Flüssigkeit
aus dem Hohlraum aufnimmt, wenn der Hohlraum Flüssigkeit mit einem Volumen
enthält,
das größer ist
als das Hohlraumvolumen. Der Überlaufanschluss 125 zur
Flüssigkeitshandhabung
ist an der gegenüberliegenden
Seite des Anschlusses 122 zur Flüssigkeitshandhabung angeordnet
und steht in Fluid leitender Verbindung mit der Überlaufkammer 124. Ein
Multisubstrat-Chip 130 ist mit dem Grundelement 140 verbunden,
das zusammen mit dem Gehäuse 110 den
Hohlraum 120 bildet. Das Grundelement 140 beinhaltet
ferner ein Führungselement 142 an
wenigstens zwei Seiten.
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1B veranschaulicht
eine schematische senkrechte Querschnittsansicht eines Teils des
Multisubstrat-Testchips, auf dem eine Matrix 138 (umfassend
eine erste Schicht 138A und eine zweite Schicht 138)
auf einem Träger 134 aufgetragen
ist.
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In
die erste Schicht 138A der Matrix 138 sind mehrere
Crosslinker 136 eingebettet, mit denen mehrere Substrate 132 verbunden
sind (hier: über molekulare
Anker (Linien zwischen Crosslinkern und Substraten)). Ebenfalls
ist an einer vorgegebenen Position auf der Matrix ein Referenzmarker 150 und 150' angeordnet,
die ebenso über
einen Crosslinker (und molekulare Anker) mit der ersten Schicht
der Matrix verbunden sind.
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Bezüglich des
Gehäuses 110 ist
es allgemein bevorzugt, dass das Gehäuse aus einem transparenten
Polyethylen hoher Dichte hergestellt ist. Es ist jedoch zu verstehen,
dass sich das Material für das
Gehäuse
erheblich ändern
kann und alternative Materialien natürliche und synthetische Polymere, Metalle,
Keramiken, Glas, Presspapier und jede sinnvolle Kombination davon
umfassen. Zum Beispiel sind, wo ein Einweggehäuse bevorzugt ist, verschiedene
synthetische Polymere und/oder Presspapier als besonders geeignet
erachtet. Auf der anderen Seite und insbesondere dort, wo das Gehäuse mehrmals
wieder verwendet wird, werden haltbarere Materialien (zum Beispiel
Keramik oder Metall) vorteilhaft eingesetzt. Ferner können ebenfalls
Materialien beinhaltet sein, um bestimmte Verfahrensschritte zu ermöglichen,
die andernfalls das Gehäuse
beschädigen
würden.
Wo zum Beispiel das Gehäuse
sterilisiert werden muss (zum Beispiel durch Bestrahlung oder Autoklavierung),
kann Glas vorteilhaft als Gehäusematerial
eingesetzt werden.
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Auf ähnliche
Weise müssen
optische Eigenschaften nicht notwendigerweise auf ein transparentes
Material beschränkt
sein. Wo es zum Beispiel erwünscht
ist, kann ein reflektierendes oder Licht absorbierendes Material
eingesetzt werden, um die Analyseempfindlichkeit zu verbessern.
Ferner kann das Gehäuse
(an sich oder in Verbindung mit dem Grundelement) eingesetzt werden,
Energie zu und von der Probe zu übertragen.
Zum Beispiel kann das Unterteil des Gehäuses als ein Wandler für Ultraschallenergie
eingesetzt werden, während
der Rest des Gehäuses
ausgelegt sein kann, die in dem Gehäuse angeordnete Probe zu erwärmen und/oder
zu kühlen.
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Es
ist jedoch besonders bevorzugt, dass wenigstens ein Teil des Gehäuses einen
klaren, halbtransparenten oder lichtdurchlässigen (d.h. lichtpermeablen)
Teil umfasst, der es erlaubt, dass einfallendes Licht durch das
Gehäuse
fällt.
Solche Gehäuse sind
besonders dort wünschenswert,
wo der Multisubstrat-Chip
einen Referenzmarker und wenigstens ein Lichtsubstrat beinhaltet.
Folglich umfassen besonders bevorzugte Vorrichtungen ein Gehäuse, das wenigstens
teilweise einen Multisubstrat-Chip umhüllt, der einen Referenzmarker
und mehrere Substrate an vorgegebenen Positionen beinhaltet, worin der
Referenzmarker durch eine erste Lichtquelle in einem ersten Winkel
beleuchtet wird und worin wenigstens eines der mehreren Substrate
durch eine zweite Lichtquelle in einem zweiten Winkel beleuchtetet wird
und worin das Gehäuse
derart ausgelegt ist, dass der erste Winkel und der zweite Winkel
nicht identisch sind.
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Es
ist insbesondere zu verstehen, dass die getrennte Beleuchtung eines
Referenzmarkers und eines Substrats zahlreiche Vorteile aufweist.
Zum Beispiel erfordern bekannte optisch analysierte Mikroarrays üblicherweise,
dass die Fokusebene oder der Brennpunkt zur Detektion eines gekennzeichneten
Analyts unabhängig
für jedes
gekennzeichnete, an das Mikroarray gebundene Analyt bestimmt werden
müssen,
was nahezu immer die Beleuchtung des fluoreszierenden Analytmarkers
erfordert. Folglich und insbesondere dort, wo die Einstellung auf
die optimale Fokusebene oder den Brennpunkt relativ langsam ist
(üblicherweise
bis zu ungefähr
einer Minute pro Stelle), ist die Fotobleichung (und gleichzeitig
der Verlust des eigentlichen Signals) der Fluorophore praktisch
unvermeidbar. Außerdem
neigen die individuellen Fokuseinstellungen dazu, die Analysezeit drastisch
zu erhöhen,
insbesondere dort, wo die Dichte der gekennzeichneten Analyte relativ
hoch ist.
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Demgegenüber setzen
die betrachten Vorrichtungen eine Lichtquelle ein, die eine oder
mehrere Referenzstellen durch das Gehäuse beleuchtet, worin sich
das Beleuchtungslicht vorzugsweise wenigstens 20 nm von dem Beleuchtungslicht
der Substrate unterscheidet. Insbesondere stellen die betrachteten
Anordnungen eine Dunkelfeldbeleuchtung der Referenzstellen bereit.
Somit kann die Intensität des
Beleuchtungslichts der Referenzstellen erheblich verringert werden,
wodurch die Wahrscheinlichkeit der Fotobleichung der gekennzeichneten,
an die Substrate gebundenen Analyte verringert wird.
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Außerdem kann,
wo sich der (die) Referenzmarker an vorgegebener Position relativ
zu den Substraten befinden, die Beleuchtung der Referenzmarker eingesetzt
werden, den Multisubstrat-Chip in die Fokusebene eines optischen
Instruments zu leiten, das die optischen Signale der gekennzeichneten,
mit den Substraten auf dem Multisubstrat-Chip verbundenen Analyte
erfasst. Folglich wird erwartet, dass das Neufokussieren für jedes
der folgenden Pixel in dem Multisubstrat-Chip teilweise, wenn nicht
völlig, vermieden
werden kann, was die Messzeit für
den gesamten Multisubstrat-Chip erheblich verringert. Die Bestimmung
der richtigen Fokusebene kann durch Erfassen mehr als eines Referenzmarkers
bereitgestellt werden, und es wird insbesondere erwartet, dass jeder
Multisubstrat-Chip wenigstens vier Referenzmarker beinhaltet.
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Während es
allgemein bevorzugt ist, dass das gesamte Gehäuse vollständig lichtpermeabel ist, ist
ebenfalls zu verstehen, dass nur Teile (zum Beispiel Kanäle durch
das Gehäuse
mit oder ohne Linsen) für
die Beleuchtung der Referenzmarker lichtpermeabel sein können. Alternativ
und insbesondere dort, wo das Gehäuse lichtpermeabel ist, wird
erwartet, dass die Referenzmarker mit herkömmlicher Dunkelfeldbeleuchtung
beleuchtet werden oder bei einer Beleuchtung, bei der der Referenzmarker
durch eine erste Lichtquelle in einem ersten Winkel beleuchtet wird
und worin wenigstens eines der mehreren Substrate durch eine zweite
Lichtquelle in einem zweiten Winkel (vorzugsweise mit einer Winkeldifferenz
größer als
45 Grad) beleuchtet wird.
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Geeignete
Referenzmarker beinhalten alle bekannten Moleküle oder Zusammensetzungen,
die bei der Beleuchtung ein optisch detektierbares Signal erzeugen
(d.h. Lichtemission oder Lichtabsorption). Deshalb werden insbesondere
alle bekannten Chromophoren und Fluorophoren betrachtet. Ferner
ist zu verstehen, dass der Referenzmarker ebenfalls einen chemilumineszierenden
Teil beinhalten kann, der ein optisch detektierbares Signal unter
vorgegebenen Reaktionsbedingungen emittiert. Solche Reaktionsbedingungen
können
zum Beispiel durch Zugabe geeigneter Reagenzien in den Hohlraum
der Vorrichtung erzeugt werden und sind einem Fachmann wohl bekannt.
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Besonders
bevorzugte Lichtquellen beinhalten verschiedene Laser, es wird jedoch
allgemein erwartet, dass alle für
die Photonenanregung bekannten Lichtquellen (zum Beispiel Fluoreszenz,
Phosphoreszenz) für
die Verwendung hierin geeignet sind. Es gibt zahlreiche geeignete,
nach dem Stand der Technik bekannte Lichtquellen und eine beispielhafte Sammlung
solcher Quellen kann in „Fluorescence Methods
and Protocols (Methods in Molecular Biology)" von Dan Sackett (Humana Press; ISBN: 0896035441)
oder „Fluorescence
Microscopy and Fluorescent Probes" von Jan Slavik (Plenum Pub Corp; ISBN
0306460211) gefunden werden. Es ist jedoch insbesondere bevorzugt,
dass, wo Laser eingesetzt werden, der Unterschied in der Wellenlänge zwischen
dem ersten und dem zweiten Laser (zur Beleuchtung des Referenzmarkers
und des Substrats) wenigstens 20 nm beträgt.
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Weiterhin
können
geeignete Gehäuse und/oder
Multisubstrat-Chips einen oder mehrere Registrierungsmarker, Strichcodes
und/oder Normierungen beinhalten, die manuell oder automatisch gelesen
werden können.
Zum Beispiel wird erwartet, dass manuell lesbare Marker aufgedruckte
oder ansonsten befestigte Seriennummern, Art der Substrate auf dem
Chip, Telefonnummer des Lieferanten usw. beinhalten. Automatisch
lesbare Referenzmarker können
Strichcodes oder ein oder mehrere farbige oder fluoreszierende Etiketten
beinhalten, die einen bestimmten Informationsteil kodieren.
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Bezüglich der
Gehäusegröße wird
erwartet, dass eine bestimmte Größe nicht
einschränkend
auf den erfinderischen Gegenstand wirkt. Bevorzugte Größen sind
jedoch üblicherweise
Größen, bei
denen das längste
Maß des
Gehäuses
weniger als 10 Zoll beträgt,
bevorzugter weniger als 5 Zoll, noch bevorzugter weniger als 2 Zoll
und am meisten bevorzugt 1 Zoll und noch weniger.
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Folglich
wird erwartet, dass das Volumen geeigneter Hohlräume erheblich variieren kann.
Bevorzugte Hohlräume
weisen jedoch ein Volumen von weniger als 20 ml auf, bevorzugter
zwischen 0,01 ml und 1 ml und am meisten bevorzugt zwischen 0,01
ml und 1 ml. Bezüglich
der Form geeigneter Hohlräume wird
erwartet, dass jede sinnvolle Form geeignet ist, solange solch eine
Form den Multisubstrat-Chip wenigstens zum Teil aufnimmt. Zum Beispiel
können
geeignete Hohlräume
eine runde, elliptische oder quadratische Form aufweisen. Ähnlich können die
Wände des
Hohlraums senkrecht oder in einem Winkel (vorzugsweise zwischen
45 Grad und 89 Grad) zur Oberfläche
des Multisubstrat-Chips stehen. Daher wird abhängig von der Größe und der
Gestaltung des Hohlraums, der Wand/Wände und des Multisubstrat-Chips
erwartet, dass der Multisubstrat-Chip an verschiedenen Positionen
des Hohlraums angeordnet sein kann. Es ist jedoch allgemein bevorzugt, dass
der Multisubstrat-Chip auf dem Boden des Gehäuses angeordnet ist (der ein
Grundelement sein kann oder nicht). Alternativ kann der Multisubstrat-Chip jedoch
auch an dem Gehäuse
derart befestigt sein, dass sich der Multisubstrat-Chip an einer Position
außer
dem Boden des Hohlraums befindet (zum Beispiel an den Wänden des
Hohlraums aufgehängt).
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Es
wird weiterhin erwartet, dass sich der Hohlraum in Fluid leitender
Verbindung mit einem oder mehreren Anschlüssen zur Flüssigkeitshandhabung befindet,
wobei solche Anschlüsse
ausgelegt sein können,
eine Pipettenspitze zum Hinzufügen und/oder
zur Entnahme von Fluids aufzunehmen. Alternativ können die
betrachteten Anschlüsse
zur Flüssigkeitshandhabung
ebenfalls Kanäle
oder Durchgangslöcher
in dem Gehäuse
sein, um ein Fluid hinzuzufügen
und/oder abzulassen. Obwohl nicht besonders bevorzugt, können die
betrachteten Anschlüsse
zur Flüssigkeitshandhabung
ferner Reservoirs beinhalten, die Reagenzien oder andere testbezogene
Fluids aufbewahren, oder Strukturen bereitstellen, um den nichtlinearen
Fluss einer Flüssigkeit zu
erhöhen/senken
oder Strukturen, um den Fluss einer Flüssigkeit zu beschleunigen/verlangsamen
oder Strukturen, um ein Fluid mit einem anderen Fluid zu mischen.
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In
einem weiter bevorzugten Gesichtspunkt der betrachteten Vorrichtungen
steht der Hohlraum in Fluid leitender Verbindung mit einer Überlaufkammer und
es ist insbesondere bevorzugt, dass der Hohlraum lediglich in Fluid
leitender Verbindung mit einer Überlaufkammer
steht, wenn der Hohlraum Flüssigkeit
mit einem Volumen enthält,
das größer ist
als das vorgegebene Volumen des Hohlraums. Somit können die
betrachteten Überlaufkammern
einen Kanal oder ein Durchgangsloch umfassen, das derart angeordnet
ist, dass das Fluid nur von dem Hohlraum aufgenommen wird, wenn
der Fluidpegel eine vorgegebene Höhe erreicht. Zusätzlich können geeignete Überlaufkammern
einen oder weitere Anschlüsse
zur Flüssigkeitshandhabung
beinhalten und dieselben Erwägungen
gelten für
den Anschluss/die Anschlüsse
zur Flüssigkeitshandhabung
wie oben beschrieben für
die betrachteten Überlaufanschlüsse zur Flüssigkeitshandhabung.
In einem besonders bevorzugten Gesichtspunkt ist die Überlaufkammer
ein Kanal, der wenigstens teilweise den Hohlraum umgibt und wenigstens
einen Überlaufanschluss
zur Flüssigkeitshandhabung
beinhaltet.
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In
einem weiteren besonders bevorzugten Gesichtspunkt des erfinderischen
Gegenstands ist der Multisubstrat-Chip an oder nahe dem Boden des Hohlraums
angeordnet und der Hohlraum steht lediglich in Fluid leitender Verbindung
mit einer Überlaufkammer,
wenn der Hohlraum Flüssigkeit
mit einem Volumen enthält,
das größer ist
als das vorgegebene Volumen des Hohlraums. Aus einem anderen Blickwinkel
betrachtet, ist besonders zu erkennen, dass in solchen Vorrichtungen
das Volumen eines Fluids in dem Hohlraum auf einem konstanten Wert
ohne vorherige Bestimmung der Fluidmenge, die sich bereits in dem
Hohlraum befindet, gehalten werden kann. Ein konstantes Fluidvolumen
ist besonders wünschenswert,
wo die Beleuchtung einer Probe oder die Detektion eines optischen
Signals von dem Multisubstrat-Chip durch eine Fluidschicht ausgeführt wird,
da die Höhe
der Fluidschicht vorbestimmt und im Wesentlichen in solchen Hohlräumen konstant
ist (d.h. sie ändert
sich üblicherweise
weniger als +/–5%, üblicher
weniger als +/–2%).
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4 veranschaulicht
einige Vorteile der betrachteten Hohlräume, die in Fluid leitender
Verbindung mit einer Überlaufkammer
stehen. Hier weist eine Multisubstrat-Testvorrichtung 400 einen
Hohlraum 410 auf, der in Fluid leitender Verbindung mit der Überlaufkammer 420 steht
(wenn das Fluidvolumen in dem Hohlraum das Volumen des Hohlraums übersteigt).
Der Laserstrahl 432 aus dem Laser 430 (üblich aus
einem konfokalen Mikroskop; nicht dargestellt) wird an der Fluidoberfläche 412 abgelenkt.
Der Ablenkwinkel wird vorwiegend durch den Brechungsindex des Fluids
und den Winkel des Laserstrahls 342 relativ zur Oberfläche 432 bestimmt.
Ungeachtet des Winkels ist jedoch zu verstehen, dass die horizontale
Abweichung D1 und D2 unter anderem durch die Länge des Wegs, den das Licht
durch das Fluid zurücklegt,
bestimmt ist. Folglich verringert, wenn es sie nicht vollständig beseitigt,
ein vorgegebenes Volumen des Hohlraums (und damit eine vorgegebene Höhe des Fluids)
die Fehlbeleuchtung von Positionen auf dem Multisubstrat-Chip erheblich.
Außerdem verhindert
das Bereitstellen eines konstanten Fluidvolumens über dem
Multisubstrat-Chip die meisten Probleme bei den Versuchen, das Fluid
vor der Detektion eines optischen Signals zu entfernen (zum Beispiel
unvollständiges
Ablassen, eingeschlossene Luftblasen usw.).
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In
einem weiteren bevorzugten Gesichtspunkt der betrachteten Vorrichtungen
ist der Hohlraum wenigstens zum Teil durch das Gehäuse und ein
Grundelement gebildet und es wird insbesondere erwartet, dass das
Gehäuse
und das Grundelement entfernbar miteinander verbunden sind (zum
Beispiel über
Stifte, Schrauben usw.). In alternativen Gesichtspunkten kann das
Gehäuse
jedoch dauerhaft mit dem Grundelement verbunden sein. Folglich kann
der Multisubstrat-Chip wenigstens in einigen der bevorzugten Vorrichtungen
(direkt oder indirekt) mit dem Grundelement verbunden sein. Direkte
Verbindung bedeutet, dass der Träger
des Multisubstrat-Chips an dem Grundelement befestigt ist, wohingegen
indirekte Verbindung bedeutet, dass sich wenigstens eine zusätzliche
Schicht zwischen dem Multisubstrat-Chip und dem Grundelement befindet.
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In
noch weiteren bevorzugten Gesichtspunkten ist der Hohlraum ein offener
Hohlraum, wobei der hierin verwendete Begriff „offener Hohlraum" sich auf einen Hohlraum
in dem Gehäuse
bezieht, der von einem Punkt außerhalb
des Gehäuses
zugänglich
ist, ohne durch eine Wand des Gehäuses oder einen Kanal, der
den Hohlraum mit der Außenseite
des Gehäuses
verbindet, zu gehen.
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Bezüglich des
Materials für
das Grundelement wird erwartet, dass jedes Material, das (a) zum Tragen
des Multisubstrat-Chips geeignet ist und (b) das Grundelement an
dem Gehäuse
befestigt, für
die Verwendung hierin als geeignet betrachtet ist. Es ist jedoch
allgemein bevorzugt, dass das Grundelement ein Material umfasst
(und ausgelegt ist), thermische und/oder Ultraschallenergie auf
den Multisubstrat-Chip und/oder ein Fluid in dem Hohlraum zu übertragen.
Folglich beinhalten besonders bevorzugte Materialien Metalle (zum
Beispiel Aluminium), Keramiken und synthetische Polymere.
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Obwohl
nicht einschränkend
auf den erfinderischen Gegenstand, ist es allgemein bevorzugt, dass
das Grundelement wenigstens ein, bevorzugter zwei, Führungselemente
aufweist, die bei der automatischen Handhabung der analytischen
Verrichtungen behilflich sind. Zum Beispiel beinhalten die betrachteten
Führungselemente
Vertiefungen oder Vorsprünge
aus dem Grundelement, können
jedoch auch Magnetflecken oder Elemente beinhalten, die mit einem
Aktor in Eingriff stehen (zum Beispiel Haken, Ösen usw.). Somit können die
betrachteten Vorrichtungen ein Gehäuse mit einer ersten Breite
und ein Grundelement mit einer zweiten Breite umfassen, wobei die
erste Breite kleiner ist als die zweite Breite.
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In
noch einem weiteren alternativen Aufbau können geeignete analytische
Vorrichtung mehr als einen Multisubstrat-Chip beinhalten (wobei
wenigstens ein Chip wenigstens teilweise in dem Hohlraum angeordnet
ist). Wo zum Beispiel Zellextrakte in solchen Vorrichtungen analysiert
werden, kann ein erster Multisubstrat-Chip eingesetzt werden, eine
Nukleinsäurepopulation
zu analysieren, während
ein zweiter Multisubstrat-Chip eingesetzt werden kann, eine Polypeptidpopulation
zu analysieren (siehe 2B). Alternativ und insbesondere
wo sich Hybridisierungsbedingungen zwischen mehrfachen Multisubstrat-Chips
und mehrfachen Hohlräumen ändern, können mehrfache
Multisubstrat-Chips eingesetzt werden (zum Beispiel mit einem Chip
pro Hohlraum), wobei wenigstens einer der Chips wenigstens teilweise in
dem entsprechenden Hohlraum angeordnet ist (siehe 2A).
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Bevorzugte
Matrizen sind Multifunktionsmatrizen, die zusätzlich zu dem Crosslinker wenigstens ein
weiteres Zusatzmittel beinhalten, das spezifisch für einen
besonderen Aufbau oder eine Testbedingung ist. Geeignete Zusatzmittel
können
ausgewählte
Eigenschaften verleihen und insbesondere die betrachteten Zusatzmittel
beinhalten einen Puffer (zum Beispiel um die Stringenz auf ein bestimmtes
Niveau einzustellen, den pH auf einen bestimmten Wert zu ändern usw.),
ein Befeuchtungsmittel (zum Beispiel um die Matrixhydratation zu
erhalten oder anzupassen), ein Licht abweisendes Mittel (zum Beispiel
um die Trägerautofluoreszenz
zu unterdrücken)
oder ein oberflächenaktives
Mittel (zum Beispiel um die Matrixhaftung an dem Träger zu verbessern).
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Ferner
können
geeignete Matrizen mehrere Schichten beinhalten, die vorzugsweise
chemisch unterschiedliche Schichten sind. Zum Beispiel kann eine
erste Schicht ein Reinigungsmittel beinhalten, um die Haftung an
dem Träger
zu verbessern, während
eine zweite Schicht ein Licht abweisendes Mittel beinhalten kann,
um die Trägerautofluoreszenz
zu verringern und eine dritte Schicht beinhaltet den Crosslinker,
der eingesetzt wird, um das Substrat mit dem Träger zu verbinden. Es wird allgemein
erwartet, dass jeder Crosslinker geeignet ist, der ein modifiziertes
oder nicht modifiziertes Substrat (kovalent oder nichtkovalent)
halten kann, es ist besonders bevorzugt, dass der Crosslinker ein
Molekül
umfasst, dass Biotin mit KD von nicht mehr
als 10–5M.
Somit umfassen geeignete Crosslinker Avidin, Streptavidin und Antikörper gegen
Biotin. Ferner wird erwartet, dass geeignete Crosslinker in der
Matrix eingesetzt werden können,
um einen Referenzmarker oder eine Referenzsubstanz zu binden, gegen
deren Position oder deren optisch detektierter Signalmenge gerechnet
werden kann.
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Außerdem ist
insbesondere zu verstehen, dass in den bevorzugten Gesichtspunkten
die Matrix (zum Beispiel Agarose, Gelatin oder Polyacrylamid) auf
den Träger
durch nach dem Stand der Technik wohl bekannte Verfahren aufgetragen
wird. Daher werden in Verbindung mit unebenen Trägeroberflächen stehende Probleme allgemein
vermieden. Ferner kann durch Zugabe von Zusatzmitteln unerwünschte Signalinterferenz
von dem Träger
im Wesentlichen verringert, wenn nicht eliminiert werden.
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In
noch einem weiteren Gesichtspunkt des erfinderischen Gegenstands,
ist zu verstehen, dass mehrere der betrachteten Vorrichtung in einem
Magazin beinhaltet sein können,
um das Beladen eines Analysators mit einer Anzahl an Multisubstrat-Chips zu
ermöglichen.
Während
sich die Anordnung der analytischen Vorrichtungen in dem Magazin
erheblich ändern
kann (zum Beispiel linear als ein Vorrichtungsband oder eine Vorrichtungskette,
zweidimensional als Vorrichtungs-Array oder dreidimensional als eine
Vorrichtungsrolle), ist es allgemein bevorzugt, dass die betrachteten
Vorrichtungen derart gestapelt sind, dass ein Grundelement einer
ersten Vorrichtung über
einem Gehäuse
einer zweiten Vorrichtung angeordnet ist. Eine Führung in einem Magazin kann mit
einem Führungselement
der betrachteten Vorrichtungen in Eingriff stehen und ein Gewicht
oder eine Feder oberhalb der Vorrichtungen kann die mechanische
Kraft bereitstellen, um die Vorrichtungen der Reihe nach zum Boden
des Magazins zu befördern.
Ein beispielhaftes Magazin ist in 3 veranschaulicht,
in der das Magazin 300 mehrere analytische Vorrichtungen 300A beinhaltet.
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In
Betrieb wird eine analytische Vorrichtung gemäß dem erfinderischen Gegenstand
bereitgestellt (zum Beispiel in einem Magazin oder manuell in einen
Analysator eingeführt)
und in einem Schritt werden die mehreren Substrate in Kontakt mit
wenigstens einem aus der Gruppe bestehend aus einem Probenfluid
(zum Beispiel Vollblut, Zellextrakt usw.), einem Reagensfluid (zum
Beispiel Fluid mit hohem Salzgehalt zur Anpassung der Stringenz),
einem Waschfluid (zum Beispiel Wasser), einer gekennzeichneten Probe
(zum Beispiel Nukleinsäure oder
Antikörper)
und/oder einem Detektionsfluid (zum Beispiel kolorimetrische oder
luminogene Substrate) ausgewählten
Fluid gebracht, vorzugsweise wenn sich der Multisubstrat-Chip in
einer im Wesentlichen horizontalen Position befindet (d.h. nicht
mehr als ± 15
Grad von der Horizontalen, üblicher
nicht mehr als ± 8
Grad von der Horizontalen und am üblichsten nicht mehr als ± 3 Grad
von der Horizontalen). In einem weiteren Schritt wird erwartet,
dass wenigstens eines der mehreren Substrate ein Analyt aus dem
Fluid (zum Beispiel Probenfluid) bindet, worin das Binden des Analyts
in einer im Wesentlichen horizontalen Position detektiert wird.
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Daher
beinhalten in besonders betrachteten Gesichtspunkten des erfinderischen
Gegenstands die bevorzugten Vorrichtung eine erste Lichtquelle, die
einen oder mehrere Referenzmarker beleuchtet, wobei die Beleuchtung
der Referenzmarker eingesetzt wird, um die Fokusebene der optischen
Vorrichtung zu bestimmen (üblicherweise
ein konfokales Mikroskop), das den Multisubstrat-Chip analysiert. Nachdem
die richtige Fokusebene bestimmt wurde, kann die Analyse der Sonden,
Proben oder anderer Moleküle
auf dem Multisubstrat-Chip ohne weiteres Fokussieren durch Verwenden
einer zweiten Lichtquelle (üblicherweise
aus dem konfokalen Mikroskop) fortgesetzt werden. Solch eine Vorausbestimmung
der Fokusebene ist besonders dort vorteilhaft, wo eine relativ große Anzahl
an individuellen Messungen eingesetzt wird. Somit ist zu erkennen,
dass die Analyse mehrerer Substrate auf einem Multisubstrat-Chip
erheblich schneller ausgeführt
werden kann als mit bekannten Vorrichtungen, da das Neufokussieren
von einem Substrat zu dem nächsten
zur Optimierung der Signalstärke
ausgelassen werden kann. Außerdem
ist zu erkennen, dass die Bestimmung der Fokusebene unter Verwendung
von Referenzmarkern auf dem Multisubstrat-Chip (unter bevorzugter
Verwendung einer anderen Beleuchtungswellenlänge als die Wellenlänge zur
Beleuchtung des Substrats) die Fotobleichung der Fluorophore vorteilhaft
verringert, wenn nicht beseitigt. Während es allgemein bevorzugt
ist, dass die Beleuchtung des (der) Referenzmarker(s) mit einer
Licht emittierenden Diode durchgeführt wird, werden andere Lichtquellen (weißglühend oder
fluoreszierend) ebenso als geeignet betrachtet. Ferner können, wo
angebracht, die erste und zweite Lichtquelle identisch sein.
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Somit
wurden spezifische Ausführungsformen
und Anwendungen verbesserter Substrat-Chipvorrichtungen offenbart.
Es ist jedoch jenen Fachleuten offensichtlich, dass viele weitere
Modifikationen neben den bereits beschriebenen möglich sind, ohne von dem erfinderischen
Gedanken hierin abzurücken.
Der erfinderische Gegenstand wird deshalb nicht eingeschränkt, außer in dem
Sinn der angefügten
Ansprüche.
Außerdem
sind bei der Interpretation sowohl der Patentschrift als auch der
Ansprüche
alle Begriffe in der am weitesten möglichen Weise in Übereinstimmung
mit dem Kontext zu interpretieren. Insbesondere sind die Begriffe „umfasst" und „umfassend" als Bezug nehmend
auf Elemente, Komponenten oder Schritte in einer nicht ausschließenden Weise
zu interpretieren, die besagt, dass die verwiesenen Elemente, Komponenten
oder Schritte vorhanden sein, angewendet oder mit anderen Elementen, Komponenten
oder Schritten, auf die nicht ausdrücklich verwiesen wird, kombiniert
werden können.