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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Analysieren insbesondere biologischer Partikel. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Analysieren der insbesondere biologischen Partikel mittels der Vorrichtung.
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Stand der Technik
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Die Markierung einzelner biologischer Partikel mit fluoreszierenden Molekülen ermöglicht es biochemisch oder biophysikalisch selektive Eigenschaften bestimmter Farbstoffe zu nutzen, um Zellkerne oder bestimmte Organellen zu färben. Farbstoffe können aber auch an entsprechend selektive Moleküle wie beispielsweise Antigene gekoppelt werden, um diese beziehungsweise deren Bindungspartner im Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Mittels der sogenannten Liquid Biopsy kann eine große Anzahl durch Blutentnahme gewonnener Zellen mit verschiedenen Markern angefärbt werden, um beispielsweise Leukozyten und zirkulierende Tumorzellen vor einem großen Hintergrund von Erythrozyten identifizieren und voneinander unterscheiden zu können.
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Die Fluoreszenz ist allerdings sehr schwach, sodass ein Objektiv mit großer numerischer Apertur, kleinem Arbeitsabstand und entsprechend kleinem Sichtfeld erforderlich wäre, um genug Fluoreszenzlicht zu erfassen. Anderseits sind die jeweils gesuchten Zellen zahlenmäßig oft extrem selten, sodass ein großes Sichtfeld wünschenswert wäre. Dies steht allerdings im Konflikt mit der erstgenannten Anforderung. Außerdem würde ein entsprechendes Objektiv mit kleiner numerischer Apertur und entsprechend schwacher Vergrößerung sehr viel konkurrierende Hintergrundfluoreszenz aufsammeln.
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Offenbarung der Erfindung
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Vorteile der Erfindung
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Die Vorrichtung zum Analysieren insbesondere biologischer Partikel weist ein Substrat mit mindestens einer Kavität in einer Oberseite auf. Außerdem weist sie mindestens eine transparente Kugel auf. Jede Kavität ist so dimensioniert, dass die Kugel zumindest teilweise in einem Bereich der Kavität für eine optische Analyse mindestens eines in der Kavität befindlichen Partikels aufgenommen werden kann. Mit anderen Worten sind die Kavität und die transparente Kugel derart aufeinander abgestimmt ausgeformt, dass die Kugel zumindest teilweise in einem Bereich der Kavität für eine optische Analyse von in der Kavität befindlichen Partikeln aufgenommen werden kann Die transparente Kugel wirkt somit vorteilhafterweise als eine optische Linse zur optischen Auslese der Kavität.
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Das Substrat kann dabei insbesondere als ein mikrofluidisches Array ausgebildet sein. Unter einer Kavität kann eine Ausnehmung auf einer Seite des Substrats verstanden werden. Unter biologischen Partikeln werden dabei insbesondere Zellen, wie beispielsweise Leukozyten oder zirkulierende Tumorzellen, Zellcluster, Proteine oder Mikroorganismen verstanden. Es wird davon ausgegangen, dass biologische Partikel, die sich über dem Substrat in Suspension befinden, aufgrund ihrer Größe und Dichte mit der Zeit absinken. Der Durchmesser der Partikel beträgt insbesondere mehr als 1 um. Die Dichte des Suspensionsmediums liegt beispielsweise bei einer Temperatur von 20°C insbesondere im Bereich von 900 bis 1.100 kg/m3. Mehrere Kavitäten in der Oberseite des Substrats bilden insbesondere eine Matrix, die es ermöglicht, die biologischen Partikel zu vereinzeln und an besonderen Punkten im Raum zu lokalisieren. Das Substrat befindet sich insbesondere in einer mikrofluidischen Kammer, im Napf einer Mikrotiterplatte oder in einem sonstigen Behälter, der die Überdeckung mit einer Suspension der biologischen Partikel ermöglicht. Die Kugel kann nach der Sedimentation der Partikel in der Kavität angeordnet werden und fungiert dort als Linse, die das Fluoreszenzlicht der Partikel sammeln und in Richtung des Sensors lenken. Hierfür sollte sie vorzugsweise nicht so klein sein, dass sie bis auf den Boden der Kavität absinken kann. Geeignete Materialien für die Kugeln sind insbesondere Silikatglas, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC) oder Titandioxid.
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Es ist in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugt, dass die Kavität sich zu ihrem Boden hin verjüngt. Dies ermöglicht es die biologischen Partikel gravitationsgetrieben auf die Mittelachsen der Kavität und auf ihren Boden, also auf einen definierten Punkt im Raum zu fixieren.
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In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, dass die Kavität eine Stufenform aufweist und die Kugel insbesondere eine Größe aufweist, aufgrund derer sie nur bis zu einer Stufe in die Kavität eindringen kann. Hierdurch wird die Kugel in einer vorgegebenen Tiefe der Kavität fixiert.
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Mit anderen Worten kann die Kavität eine bereichsweise Verengung aufweisen, wobei die Abmessungen der Kavität, die Abmessungen der Verengung und die Abmessungen der transparenten Kugel derart aufeinander abgestimmt sind, dass die Kugel durch die Verengung in Bezug auf die Kavität lokal stabil platziert werden kann. Die Verengung kann somit vorzugsweise die Form einer Verjüngung, einer Stufe oder eines oder mehrerer Vorsprünge aufweisen.
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Die Kavität weist vorzugsweise einen sechseckigen Querschnitt auf oder sind jeweils Teil eines sechseckigen Bereichs. Dies ermöglicht es, mehrere Kavitäten bienenwabenartig nebeneinander im Substrat anzuordnen, wobei sehr geringe Abstände zwischen den Mittelpunkten der Kavitäten realisiert werden können.
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Das Substrat kann vorteilhafterweise aus unterschiedlichen Materialien hergestellt werden. In einer Ausführungsform der Vorrichtung besteht es aus Silizium, das mittels lithografischer Prozesse, die aus der Mikrosystemtechnik bekannt sind, gut und präzise genug strukturiert werden kann. In einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung besteht das Substrat aus einem Kunststoff und wird insbesondere per Mikroablation oder mit einem Imprint-Verfahren hergestellt. In noch einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung besteht das Substrat aus zwei Teilsubstraten, wobei die Wände der Kavitäten aus einem Teilsubstrat herausgebildet werden und das andere Teilsubstrat den Boden des Substrats bildet. Geeignete Materialkombinationen sind hierfür insbesondere Fotolack auf Silizium oder Polymethylmethacrylat (PMMA) auf Glas. Alternativ kann in dieser Ausführungsform der Vorrichtung auch ein additives Verfahren vorgesehen sein, in dem die Wände der Kavitäten aus einem Material auf einem Teilsubstrat aus einem anderen Material aufgebracht werden. In noch einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung besteht das Substrat aus Glas, das mittels eines Ätzverfahrens strukturiert werden kann.
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Die biologischen Partikel, welche mittels der Vorrichtung analysiert werden sollen, können zur Fluoreszenz angeregt werden. Hierzu wurden sie entweder mit einem Fluoreszenzenzfarbstoff behandelt oder sie weisen von Natur aus Fluoreszenzeigenschaften auf. In einer Ausführungsform der Vorrichtung ist mindestens eine Lichtquelle oberhalb der Oberseite des Substrats angeordnet, um in die Kavitäten sedimentierte Partikel durch die Öffnungen der Kavitäten hindurch mit Licht zu bestrahlen und anschließend das Fluoreszenzlicht ebenfalls von der Oberseite erfassen zu können.
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In einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung ist mindestens eine Lichtquelle unterhalb der Unterseite des Substrats angeordnet. Um die Partikel mittels des Lichts dieser Lichtquelle zum Fluoreszieren anzuregen zu können, ist es vorgesehen, dass das Substrat zumindest teiltransparent ist. Unter teiltransparent wird dabei verstanden, dass seine Transmission in zumindest einem Wellenlängenbereich des von der Lichtquelle ausgesandten Lichtes mindestens 80 % beträgt. Die Erfassung des Fluoreszenzlichtes der Partikel kann in dieser Ausführungsform der Vorrichtung ebenfalls von der Oberseite des Substrats her erfolgen. Diese Anordnung der Lichtquelle hat den Vorteil, dass die Erfassung des Fluoreszenzlichtes nicht durch am Boden der Kavitäten reflektiertes Licht der Lichtquelle beeinträchtigt wird. Besonders bevorzugt strahlt die Lichtquelle hierzu ihr Licht nicht entlang der Mittelachse der Kavitäten ab, sondern gegenüber diesen Mittelachsen gewinkelt, sodass von der Lichtquelle ausgesandtes Licht, welches das Substrat passiert nicht auf den zum Erfassen des Fluoreszenzlichtes vorgesehenen Sensor gelenkt wird. Ganz besonders bevorzugt weist das Substrat an seiner Unterseite, jeweils unter jeder Kavität, eine einstückig mit dem Substrat ausgebildete Linse aus, die es ermöglicht, das eingestrahlte Licht auf die Partikel in den Kavitäten zu fokussieren. In dieser Ausführungsform der Vorrichtung besteht das Substrat vorzugsweise aus einem Glas.
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Um zu verhindern, dass Partikel, die in der Kavität sedimentiert sind, von dort aufgrund mikrofluidischer Bewegungen wieder abdriften, ist es weiterhin bevorzugt, dass am Boden der Kavität eine Beschichtung angeordnet ist, welche eingerichtet ist, um die biologischen Partikel zu binden. Eine unspezifische Bindung kann insbesondere durch eine Beschichtung aus Poly-L-Lysin realisiert werden, das beispielsweise auch zum Beschichten von Objektträgern für Blutabstriche verwendet wird.
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Eine andere bevorzugte Möglichkeit, die Partikel in der Kavität zu modulieren, besteht darin, dass unterhalb der Unterseite des Substrats mindestens ein Magnet angeordnet ist. Werden die Partikel mit ferromagnetischen Nanopartikeln konjugiert, so können diese mittels des vom Magneten erzeugten Magnetfelds am Boden der Kavität festgehalten werden. Der Magnet kann dabei als Elektromagnet oder als Permanentmagnet ausgeführt sein. Besonders bevorzugt ist am Boden der Kavität ein ferromagnetisches Material angeordnet. Dies ermöglicht es, das äußerlich homogene Magnetfeld des Magneten lokal zu modellieren, um Feldgradienten zu den Böden der Kavitäten hin zu erzeugen.
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Für eine optimale Wirkung der Kugel als Sammellinsen liegt eine Brennweite der Kugel bevorzugt im Bereich von 80 % bis 120 % einer Tiefe der Kavität. Besonders bevorzugt entspricht die Tiefe der Kavität der Brennweite der Kugel.
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Ein Abstand benachbarter Kavitäten liegt vorzugsweise im Bereich von 101 % bis 115 % des Durchmessers der Kugeln. Unter dem Abstand wird dabei der Abstand von der Mitte einer Kavität zur Mitte der benachbarten Kavität verstanden. Durch diesen Abstand wird zum einen eine sterische Behinderung der Kugeln untereinander verhindert. Andererseits wird sichergestellt, dass die Fläche des Substrats optimal ausgenutzt wird und es zu keiner Begünstigung von Kugelstapeln kommt.
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Die Anzahl der Kugeln entspricht vorzugsweise der Anzahl der Kavitäten. Auf diese Weise wird beim Absinken der Kugeln idealerweise jede Kavität mit jeweils einer Kugel bedeckt. Die Anzahl von Fehlstellen und Überstapelungen wird auf diese Weise minimiert.
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Wenn unterhalb der Unterseite des Substrats eine Lichtquelle angeordnet ist, so ist es bevorzugt, dass die Kugeln eine Beschichtung aufweisen, welche Licht in einem Wellenlängenbereich absorbiert, in welchem die Lichtquelle Licht emittiert. Diese Beschichtung, bei der es sich insbesondere um einen Farbstoff handeln kann, blockiert das zur Anregung der Fluoreszenz der Partikel verwendete Licht auf dem Weg zum Beobachter oberhalb des Substrats.
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Wenn das Substrat am Boden einer mikrofluidischen Kammer angeordnet ist, dann ist es bevorzugt, dass die Kugel lösbar an der Decke der Kammer adhäsiert ist. Nach der Sedimentation der Partikel kann die Kugel so zu einem festgelegten Zeitpunkt abgelöst werden, um auf das Substrat herabzusinken. Eine Möglichkeit, um dies zu realisieren, besteht beispielsweise darin, dass die Kugel mittels eines Haftvermittlers an der Decke adhäsiert ist, welcher sich nach einiger Zeit in Kontakt mit der Flüssigkeit löst, in welcher die Partikel suspendiert sind. Es kann auch vorgesehen sein, dass ein chemischer Wirkstoff in der Flüssigkeit freigesetzt wird, der den Haftvermittler auflöst. Weiterhin kann ein temperaturempfindlicher Haftvermittler vorgesehen sein, der sich löst, wenn die Temperatur in der mikrofluidischen Kammer mittels eines externen Heizers erhöht wird. Außerdem ist eine elektrostatische Adhäsion der Kugel möglich, die gelöst wird, wenn eine elektrische Spannung, welche die elektrostatische Adhäsion auslöst, unterbrochen wird. Ferner ist eine Lösung der Haftung durch einen Ultraschallpuls möglich. Wenn der Haftvermittler ein Protein ist, kann vorgesehen sein, dass der Flüssigkeit ein Enzym zugesetzt wird, das den Haftvermittler biochemisch abbaut. Schließlich kann ein fotoaktiver Haftvermittler verwendet werden, der durch Bestrahlung mit Licht deaktiviert wird. Wenn die Lichtquelle oberhalb des Substrats angeordnet ist, so kann für die Deaktivierung des Haftvermittlers vorzugsweise dieselbe Lichtquelle verwendet werden, die auch zur Anregung der Fluoreszenz der Partikel vorgesehen ist.
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In dem Verfahren zum Analysieren insbesondere biologischer Partikel mittels der Vorrichtung ist vorgesehen, dass zunächst eine Suspension der Partikel in einer Flüssigkeit auf das Substrat aufgebracht wird. Hierdurch werden die Kavitäten vollständig, d.h. luftfrei mit der Suspension gefüllt. Das Aufbringen kann beispielsweise manuell mittels Pipettierens erfolgen oder, wenn die Vorrichtung Teil einer mikrofluidischen Vorrichtung ist, auch durch einen automatisierten Pumpvorgang geschehen. Anschließend erfolgt ein Sedimentieren der Partikel in die Kavitäten. Nachdem das Sedimentieren abgeschlossen ist, wobei auch einige Partikel außerhalb der Kavitäten sedimentieren können, werden transparente Kugeln auf das Substrat aufgebracht, deren Abmessungen, insbesondere deren Durchmesser, so gewählt sind, dass sie zumindest teilweise in den Kavitäten aufgenommen werden können. Weiterhin weisen sie eine größere Dichte als die Flüssigkeit auf, damit sie gravitationsgetrieben absinken können. Ihr Brechungsindex ist größer als der Brechungsindex der Flüssigkeit damit sie als Sammellinsen wirken können. Nach dem Aufbringen der Kugeln werden die Partikel durch Bestrahlung mit Licht angeregt und schließlich wird Fluoreszenzlicht der Partikel durch die Kugeln hindurch, also aus Richtung der Oberseite des Substrats, erfasst.
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Das Sedimentieren kann grundsätzlich gravitationsbetrieben erfolgen. Es ist jedoch bevorzugt, dass es unterstützt wird, indem die Partikel vor dem Aufbringen auf das Substrat mit ferromagnetischen Nanopartikeln konjugiert werden und das Sedimentieren dann durch Anlegen eines Magnetfelds an das Substrat ausgelöst wird.
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Figurenliste
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Ausführungsbeispiele der Beschreibung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
- 1 zeigt eine Aufsicht auf ein Substrat einer Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
- 2a bis 2e zeigen schematisch Schritte eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
- 3 zeigt eine schematische Schnittdarstellung einer Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
- 4 zeigt eine schematische Aufsicht auf eine Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
- 5 zeigt in einer schematischen Schnittdarstellung ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Teil einer mikrofluidischen Vorrichtung.
- 6 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, in dem eine Lichtquelle unterhalb einer Unterseite des Substrats der Vorrichtung angeordnet ist.
- 7 zeigt eine schematische Schnittdarstellung einer Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, welche einen Magneten aufweist.
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Ausführungsbeispiele der Erfindung
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Eine Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, die in 1 dargestellt ist, weist ein Substrat 10 auf, in dem hexagonale Kavitäten 20 bienenwabenartig nebeneinander angeordnet sind. In den 2a bis 2e ist dargestellt, wie mittels eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens biologische Partikel mittels dieser Vorrichtung analysiert werden können. In einem ersten Verfahrensschritt, der in 2a dargestellt ist, wird eine Suspension biologischer Partikel 30, bei welchen es sich im vorliegenden Ausführungsbeispiel um Leukozyten handelt, auf das Substrat 10 aufgebracht. 2b zeigt, dass die Partikel 30 im nächsten Verfahrensschritt auf den Boden der Kavitäten 20 absinken. Die Kavitäten 20 verjüngen sich zum Boden hin, sodass die Partikel 30 dabei in der Mitte der Kavität 20 zentriert werden. Überwiegend wird in jeder Kavität 20 genau ein Partikel 30 fixiert. Einzelne Kavitäten 20 bleiben frei und für eine der Kavitäten 20 ist gezeigt, dass eine Doppelbelegung durch zwei der Partikel 30 stattgefunden hat. Im nächsten Verfahrensschritt, der in 2c dargestellt ist, werden transparente Kugeln 40, die im vorliegenden Ausführungsbeispiel aus Silikatglas bestehen, in die Lösung gegeben. Sie sinken gravitationsgetrieben ab und verschließen, wie in 2d gezeigt ist, die Öffnungen der meisten Kavitäten 20. Lediglich einige der Kavitäten 20 werden nicht mit einer der Kugeln 40 bedeckt. Nach einer nicht dargestellten Anregung eines Fluoreszenzfarbstoffs, der an die Partikel 30 gekoppelt ist, senden diese, wie in 2e dargestellt ist, Fluoreszenzlicht 50 aus. Die Kugeln 40 fungieren dabei als Sammellinsen, welche die Lichtstrahlen des Fluoreszenzlichts 50 parallelisieren und parallel zu den Mittelachsen der Kavitäten 20 nach oben aus diesen heraus leiten. Auf diese Weise kann das Fluoreszenzlicht 50 von einem Beobachter oberhalb des Substrats 10 leicht erfasst werden.
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3 zeigt eine Detailansicht von zwei Kavitäten 20, in deren Öffnungen 21 jeweils eine Kugel 40 angeordnet ist. Die Kavitäten 20 haben im vorliegenden Ausführungsbeispiel eine Tiefe t von 22 µm und die Kugeln haben einen Durchmesser d von 10 µm. Ihr Brechungsindex n von 1,5 ist größer als der Brechungsindex n
0 von 1,33 des Wassers, in dem die Partikel 30 suspendiert sind. Gemäß Formel 1 ergibt sich damit eine Brennweite f der Kugeln 40 von 22 µm:
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Indem die Tiefe der Kavitäten 20 der Brennweite der Kugeln entspricht, können die Kugeln 40 optimal als Sammellinsen fungieren.
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4 zeigt, wie die Kugeln 40 auf den hexagonalen Kavitäten 20 angeordnet sind. Der Abstand a von der Mitte einer Kugel zur Mitte der benachbarten Kugel entspricht dabei dem Abstand a der Mittelachsen zweier benachbarter Kavitäten 20. Der Abstand a hat im vorliegenden Ausführungsbeispiel einen Wert von 10,5 µm, um sterische Behinderungen auszuschließen.
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In einem anderen Ausführungsbeispiel der Vorrichtung, in dem Kugeln mit einem Durchmesser d von 35 µm verwendet werden, die aus PMMA mit einem Brechungsindex n von 1,49 bestehen, ergibt sich in Wasser gemäß Formel 1 eine Brennweite von 81,5 µm. In diesem Ausführungsbeispiel beträgt auch die Tiefe t der Kavitäten 20 jeweils 81,5 µm. Der Abstand a liegt dabei zur Verhinderung sterischer Behinderungen im Bereich von 38 bis 40 µm.
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5 zeigt ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung, in welchem das Substrat 10 am Boden einer mikrofluidischen Kammer 70 angeordnet ist. Eine Suspension der Partikel 30 wird durch einen Einlass 71 in die Kammer 70 geleitet. An der Decke der Kammer 70 sind ein Sensor 51 zum Empfangen des Fluoreszenzlichts und eine Lichtquelle 61 zur Fluoreszenzanregung angeordnet. Die Kugeln 40 sind an der Decke adhäsiert und können von dieser abgelöst werden, sodass sie nach der Sedimentierung der Partikel 30 auf das Substrat 10 herabsinken.
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6 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung, in dem das Substrat 10 aus transparentem Glas besteht. Die Lichtquelle 61 ist hierbei nicht wie im vorangehend beschriebenen Ausführungsbeispiel oberhalb des Substrats 10, sondern unter diesem angeordnet. Sie strahlt Licht 60 gegenüber den Mittelachsen der Kavitäten 20 gewinkelt auf die Unterseite des Substrats 10. Unterhalb jeder der Kavitäten 20 ist das Glas des Substrats 10 zu einer Sammellinse 11 geformt, die das Licht 60 am Boden der jeweiligen Kavität 20 und somit auf dem dort sedimentierten Partikel 30 bündelt. Die Kugeln 40 weisen in diesem Ausführungsbeispiel eine Beschichtung 41 aus einem Farbstoff auf, der Licht im Wellenlängenbereich des für die Anregung vorgesehenen Lichtes 60 absorbiert. Damit wird weitgehend verhindert, dass das zur Anregung verwendete Licht 60 zu einem Beobachter oberhalb des Substrats 10 gelangt. Das Fluoreszenzlicht weist hingegen ein anderes Frequenzspektrum als das des anregenden Lichts 60 auf und kann die Beschichtung 41 daher ungehindert passieren.
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In noch einem anderen Ausführungsbeispiel, das mit allen vorhergehenden Ausführungsbeispielen kombiniert werden kann, ist ein Magnet 81 unterhalb des Substrats 10 angeordnet. Am Boden jeder der Kavitäten 20 ist ein ferromagnetisches Material 22 angeordnet, welches die Feldlinien des vom Magneten 81 ausgehenden Magnetfeldes 80 lokal einschnürt. In diesem Ausführungsbeispiel ist vorgesehen, dass die Partikel 30 nicht nur mit einem Fluoreszenzfarbstoff, sondern auch mit ferromagnetischen Nanopartikeln konjugiert werden, bevor sie auf das Substrat 10 aufgebracht werden. Anschließend werden sie durch das Magnetfeld 80 an den Boden der Kavitäten gelenkt und dort festgehalten.
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Zum Festhalten der Partikel 30 kann außerdem in jedem der vorhergehend beschriebenen Ausführungsbeispiele vorgesehen sein, dass am Boden der Kavitäten 20 jeweils eine Beschichtung aus Poly-L-Lysin angeordnet ist, um die Partikel 30 festzuhalten.
