DE19947616C2 - Verfahren zur Bestimmung von Substanzen, wie z.B. DNA-Sequenzen, in einer Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Substanzen in einer Probe gemäß Patentanspruch 1 und eine Vorrichtung zur Durchführung des Ver­ fahrens gemäß Patentanspruch 4.

Zur Bestimmung von Substanzen in Proben, insbesondere zur Feststellung be­ stimmter DNA-Sequenzen in einer Probe, ist die Verwendung von Biochips be­ kannt. Diese bilden planare Substanzträger, auf deren Oberfläche eine Vielzahl von Meßpunkten, z. B. gebildet durch Nukleinsäuren (komplementäre DNA- Einzelstränge) immobilisiert sind, wobei diese Chipoberfläche mit einer die DNA- Sequenzen als zu analysierende Substanzen enthaltenden Probe in Kontakt ge­ bracht werden und die Probe die zu analysierenden Nukleinsäuren enthält. Da jeder Einzelstrang eines Nukleinsäure-Moleküls mit seinem komplementären Strang eine Bindung eingeht, die als Hybridisierung bezeichnet wird, erhält man nach Prüfung der einzelnen Meßpunkte hinsichtlich der Anbindung von Proben­ molekülen eine Aussage über die in der Probe vorhandenen DNA-Sequenzen. Einer der Vorteile der Biochip-Analytik besteht darin, daß bis zu einigen tausend Hybridisierungsereignissen parallel auf einem Biochip durchgeführt und detektiert werden können.

Entsprechend der Parallelität der Hybridisierungsereignisse ist ein Analysator zur Auswertung des Biochips erforderlich, der bei hoher Ortsauflösung eine ebenfalls hohe Nachweisempfindlichkeit erreicht. Da ein möglichst geringer Aufwand bei der Probenvorbehandlung getrieben werden soll, muß außerdem auch eine ge­ ringe Zahl von hybridisierten Molekülen an den einzelnen Meßpunkten noch zu­ verlässig erkannt werden.

Die Auswertungsproblematik wird z. B. aus WO 96/35940 A1 deutlich, bei der auf einem gemeinsamen Substrat eine Mehrzahl von zonaren Wellenleitern verwen­ det wird und die Sensoren in bestimmten Verteilungsmustern angeordnet sind (s. die dortige Fig. 3, Fig. 5).

Die vorliegende Erfindung zielt demgegenüber auf eine beträchtliche Vereinfa­ chung im Aufbau des Reaktionsträgers, wie z. B. eines Biochips, sowie in der zu­ gehörigen Analysevorrichtung (optischer Detektor) ab.

Zur Erläuterung der Erfindung wird als Anschauungsbeispiel ein nicht erfindungsgemä­ ßes Vergleichsbeispiel verwendet (Fig. 3), bei dem die Anregung durch in einen Wellen­ leiter eingekoppeltes Anregungslicht erfolgt und das Fluoreszenzlicht seitlich detektiert wird ("waveguide excitation/side collection"). Ein ähnliches Verfahren wird beispielswei­ se in DE 196 15 380 A1 beschrieben.

Die Druckschrift "Fiber Optic Sensors in Medical Diagnostics", SPIE, Vol. 1886, S. 2-8 (1993) und EP 0671622 A1 betreffen Verfahren mit Anregung durch seitliche Einstrah­ lung des Anregungslichtes und Einkopplung des Fluoreszenzlichtes in einen Wellenleiter ("side excitation/waveguide collection"). Im Unterschied zur vorliegenden Erfindung sind in EP 0671622 A1 die fluoreszierenden Farbstoffe an weitere, nicht immobilisierte Komplementärsubstanzen gebunden. Dadurch erfordert das entsprechende Verfahren zwei getrennt voneinander und aufeinanderfolgend durchzuführende Schritte: In einem ersten Schritt werden die zu bestimmenden Substanzen eingebracht und reagieren mit den immobilisierten Komplementärsubstanzen. In einem zweiten Schritt werden die an freie Komplementärsubstanzen gebundenen fluoreszierenden Farbstoffe eingebracht, worauf derartig markierte freie Komplementärsubstanzen Verbindungen mit an immobilisierte Komplementärsubstanzen gebundenen Substanzen eingehen. Wegen der aufeinander­ folgend durchzuführenden Schritte kann das Verfahren nach EP 0671622 A1 nicht mit einer kontinuierlich betriebenen Flusszelle betrieben werden. Ein weiterer Nachteil des in EP 0671622 A1 beschriebenen Verfahrens ist, dass die Komplementär-Agenzien auf dem planaren Lichtwellenleiter eine Schicht bilden, während sie in der vorliegenden Er­ findung einzeln anregbare Messpunkte bilden.

Kommerziell erhältliche Biochip-Reader arbeiten nach dem Scanning-Prinzip. Das Anregungslicht zur Anregung der Fluoreszenz tastet hierbei die Oberfläche seriell ab. Entweder wird bei feststehendem Lichtstrahl der Biochip schnell be­ wegt oder es wird, zumindest für eine Bewegungsrichtung, ein Galvano-Scanner eingesetzt, mit dem der Lichtstrahl abgelenkt wird. Das von den Fluorochromen emittierte Licht wird dann mit einem empfindlichen Fotodetektor, z. B. einem Foto- Multiplier, nachgewiesen. Derartige Geräte sind als Labormeßsysteme für An­ wendungen in der molekularbiologischen Forschung ausgelegt. Das Detektions­ limit liegt im Bereich von wenigen Molekülen pro µm² bis zu ca. 100 pro µm². Die Scannzeiten liegen bei ca. 2 bis 4 Minuten.

Den bekannten Meßgeräten ist gemeinsam, daß sie den Biochip (allein) nach abgeschlossener Hybridisierung auswerten. Eine in-situ-Erfassung der Reaktion (Hybridisierung) zwischen den DNA-Sequenzen in der Probe und den komple­ mentären DNA-Einzelsträngen auf dem Biochip ist dabei nicht möglich.

Für eine Reihe von Anwendungen ist es aber auch interessant, den zeitlichen Verlauf der Hybridisierung direkt zu beobachten. Dies ist mit den vorerläuterten, im praktischen Einsatz befindlichen Geräten nicht möglich, da in allen Fällen die an der Oberfläche gebundenen Fluorochrome von der Chipoberseite beleuchtet werden. Die Echtzeit-Messung erfordert im Gegensatz dazu eine Detektion in Anwesenheit der Probe. Die Probe mit den Substanzen, insbesondere DNA- Sequenzen (es sind aber auch andere biologische oder chemische Substanzen in gleicher Weise durch Beobachtung der Reaktion mit Komplementär-Agenzien auf dem Reaktionsträger nachweisbar) kann sich z. B. in einer Flußzelle auf der Oberseite des Biochips befinden.

Eine Einstrahlung des Anregungslichtes durch die Flußzelle hindurch oder von der Unterseite des Biochips her würde wegen der Anregung von Fluorochromen in der Probe eine sehr hohe Untergrundintensität erzeugen und damit die Aus­ wertung der Reaktion auf der Oberseite des Biochips, die mit hoher Ortsauflö­ sung erfolgen muß, beträchtlich erschweren oder gar unmöglich machen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrich­ tung zur Bestimmung von Substanzen in einer Probe derart weiterzubilden, daß in einfacher Weise und ohne hohe Anforderungen an die Probenvorbehandlung eine präzise Detektion von Substanzen in der Probe mit Hilfe eines Reaktionsträ­ gers mit hoher Ortsauflösung erfolgen kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren mit den in Anspruch 1 angegebenen Schritten und die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 4 gelöst.

Ein solches Verfahren ermöglicht eine sehr einfache Auslegung des Reaktions­ trägers, insbesondere Biochips, durch Beschichten eines transparenten Körpers mit einer hochbrechenden planaren Wellenleiterschicht und gestattet eine einfa­ che Analysevorrichtung, bei der z. B. eine die Probe enthaltende Flußzelle (oder eine Küvette oder sonstiger stationärer Probenkörper) in abdichtenden Oberflä­ chenkontakt mit dem Reaktionsträger, insbesondere Biochip, gebracht wird, des­ sen Oberfläche zumindest im wesentlichen als planarer Wellenleiter ausgebildet ist.

Das Anregungslicht wird von der Umgebung, z. B. der Gegenseite des Reaktions­ trägers, wie z. B. Biochips, her durch einen transparenten Abschnitt desselben in den Wellenleiter im möglichen Reaktionsbereich zwischen den die Meßpunkte bildenden Agenzien auf der Oberfläche des planaren Wellenleiters und den Sub­ stanzen in der Probe eingestrahlt, wobei zwar alle, d. h. auch die gelösten und die gebundenen Fluorochrome durch das Anregungslicht zur Fluoreszenz angeregt werden, jedoch nur das von den nahe der Oberfläche des planaren Lichtwellen­ leiters gebundenen Fluorochromen emittierte Fluoreszenzlicht in den planaren Lichtwellenleiter eingekoppelt wird und das in dem planaren Wellenleiter geführte Fluoreszenzlicht an zumindest einer Seite des Lichtwellenleiters z. B. über eine einen Filter enthaltende Abbildungsoptik ausgelesen und z. B. einem Foto- Multiplier als Detektor zugeführt wird. Es könnte jedoch auch ein Detektor mit der Endfläche des Lichtwellenleiters (ohne Abbildungsoptik) gekoppelt werden. Es könnte jedoch auch ein Detektor direkt mit der Endfläche (Chipkante) gekoppelt werden, vorzugsweise unter Vermittlung eines Interferenzfilters.

In diesem Fall wird eine linienmäßige Erfassung der Meßpunkte (Scannen durch eine Scanneinrichtung) unter Bewegung des Reaktionsträgers bzw. Biochips bzw. des eingestrahlten Anregungslichtes relativ zueinander vorgenommen.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird der planare Lichtwellenleiter mit dem Anregungslicht bestrahlt und das im Bereich des Evaneszentfeldes emittier­ te Fluoreszenzlicht der nahe der Oberfläche des Wellenleiters befindlichen Fluo­ rochrome in den planaren Lichtwellenleiter eingekoppelt und in diesem geführt sowie einer an diesen angeschlossenen Erfassungseinrichtung, z. B. über eine Auswerteoptik und einen Detektor zugeführt wird.

Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß die Anregung der gebundenen, die Anwesenheit der zu detektierenden Substanz signalisierenden Fluorochrome zur Emission von Fluoreszenzlicht durch frei in Richtung auf das Meßfeld aus der Umgebung des Lichtwellenleiters auf diesen gestrahltes Anregungslicht erfolgt (wobei sämtliche Fluorochrome - auch die nicht gebundenen - angeregt werden), jedoch nur dann das Fluoreszenzlicht der gebundenen Fluorochrome, das im Be­ reich des Evaneszentfeldes des Anregungslichtes liegt, in den planaren Lichtwel­ lenleiter eingekoppelt und in diesem dann das Fluoreszenzlicht geführt und einer Detektion entweder über eine Auswerteoptik oder auch direkt am Ende des pla­ naren Lichtwellenleiters zugeführt wird, wobei eine Scanneinrichtung vorgesehen ist, um eine Relativbewegung zwischen dem Anregungslichtstrahl und den Meß­ punkten in zwei Achsen hervorzurufen.

Weitere, bevorzugte Ausgestaltungen des Erfindungsgegenstandes sind in den übrigen Unteransprüchen dargelegt.

Durch die Erfindung ist eine einfache "in-situ"-Auslesung von Reaktionsträgern, insbesondere von Biochips zur Erfassung von DNA-Sequenzen, die mit auf der Oberfläche des Biochips, d. h. des planare Wellenleiters immobilisierten komple­ menären DNA-Einzelsträngen kombinieren (hybridisieren) möglich, wobei die Anregung der gebundenen Fluorochome durch das evaneszente Feld des Anre­ gungslichtes zu einer erhöhten Auswertesicherheit und Zuverlässigkeit und Emp­ findlichkeit der Detektion führt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen der Erfin­ dung und nicht erfindungsgemäßen Vergleichsbeispielen und unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. In diesen zeigen:

Fig. 1a einen Biochip in schematischer perspektivischer Darstellung,

Fig. 1b einen Ausschnitt des Biochips nach Fig. 1a für einen Meßpunkt einer Oberfläche mit immobilisierten DNA-Einzelsträngen,

Fig. 1c eine schematische Darstellung der Zugabe der Probe mit den zu analysierenden DNA-Sequenzen zu dem Meßpunkt nach Fig. 1a und Darstellung der komplementären Interaktion zwischen den im­ mobilisierten DNA-Einzelsträngen nach Fig. 1b und den in der Pro­ be enthaltenen DNA-Sequenzen (Hybridisierung),

Fig. 2 eine schematische Darstellung eines planaren Wellenleiters mit Intensitätsverteilung des geführten Lichtes sowie auf dessen Ober­ fläche befindlichen immobilisierten DNA-Einzelsträngen, nach ei­ nem nicht erfindungsgemäßen Vergleichsbeispiel,

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer Meß- oder Analyseeinrichtung zum Auslesen eines Biochips nach einem nicht erfindungsgemä­ ßen Vergleichsbeispiel, und

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Einrichtung zum Auslesen eines Biochips nach einem erfindungsgemäßen Ausführungsbei­ spiel.

Als Ausführungsbeispiel des Verfahrens und der Vorrichtung wird die Gestaltung und das Auslesen eines Biochips gewählt, wie er für die Analyse von DNA- Sequenzen, die sich in einer Probe befinden und zur Analyse der Nukleinsäuren mit einer Oberfläche eines Biochips in Kontakt gebracht werden, verwendet wird.

Selbstverständlich ist dies nur ein Ausführungsbeispiel und können hier auch an­ dere molekularbiologische, biologische und/oder chemische Substanzen, wie z. B. Gene und Antikörper detektiert werden.

In Fig. 1a ist in schematischer Darstellung ein solcher Biochip 1 gezeigt, der ein kleines Plättchen bildet, auf dessen Oberfläche eine Vielzahl von Nukleinsäuren in einzelnen Meßpunkten 10 immobilisiert sind. An jedem einzelnen Meßpunkt 10 befindet sich ein Oligonukleotid mit einer definierten Basensequenz. Dies ist in Fig. 1b dargestellt. In Fig. 1c sind die zu analysierenden Substanzen (hier: Nuk­ leinsäuren) der zu untersuchenden Probe mit 12 bezeichnet und durch einen Pfeil ist angedeutet, daß diese in Kontakt gebracht werden, mit den Komplemen­ tär-Agenzien 11 (hier komplementären Nukleinsäuren), die sich im Meßpunkt 10 befinden. Da jeder Einzelstrang eines Nukleinsäuremoleküls mit seinem kom­ plementären Strang (s. Fig. 1b) eine Bindung eingeht (Hybridisierung), erhält man nach Prüfung der einzelnen Meßpunkte 10 hinsichtlich der Anbindung von Probenmolekülen eine Aussage über die in der Probe vorhandenen DNA- Sequenzen. Die hybridisierten DNA-Sequenzen sind in Fig. 1c mit 13 bezeichnet.

Fig. 2 verdeutlicht schematisch die Ausbildung des Biochips 1, bestehend aus einem transparenten Grundkörper (transparentes Substrat 1a) und einem plana­ ren Lichtleiter 1b, der die hochbrechende, lichtleitende Schicht auf dem transparenten Substrat 1a bildet.

In dieser Darstellung eines nicht erfindungsgemäßen Vergleichsbeispiels ist die Einkopplungsvorrichtung für das geführte Anregungslicht nicht gezeigt. Auf der Oberseite des Lichtwellenleiters 1b befinden sich die Meßpunkte 10, gebildet durch die komplementären DNA-Einzelstränge. Die zu detektierenden Substan­ zen 12 (hier: DNA-Sequenzen) der Probe sind mit Fluorochromen, d. h. fluores­ zierenden Farbstoffen, markiert, so daß immer dann, wenn diese mit dem auf dem planaren Lichtwellenleiter 1b immobilisierten, komplementären DNA-Strang hybridisieren, eine Markierung dieser Hybridisierung auf der Oberfläche des pla­ naren Lichtwellenleiters 1b erfolgt.

Es ist jedoch auch möglich, die immobilisierten komplementären Einzelstränge, die den Meßpunkt 10 bilden, fluoreszenzfarblich zu markieren. Im Unterschied zum erfindungsgemäßen Verfahren werden nach der Hybridisierung in diesem nicht erfindungsgemäßen Vergleichsbeispiel die so gebundenen Fluorochrome z. B. durch das evaneszente Feld von in dem planaren Lichtwellenleiter 1b ge­ führten Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Da die Inten­ sität des Evaneszenzfeldes in einem Abstand von ca. 50 nm auf die Hälfte des Wertes an der Wellenleiteroberfläche abgefallen ist, werden nahezu ausschließ­ lich die an der Oberfläche gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen. Die Intensitätsverteilung des geführten Lichtes ist in Fig. 2 mit 2 bezeichnet.

Es sind jedoch auch stationäre Substanzbereitstellungen in Küvetten oder Pro­ benbehältern möglich.

Mit der als Vergleichsbeispiel zur Erfindung dienenden nicht erfindungsgemäßen Anregung der Meßpunkte 10 durch Einkopplung von Anregungslicht in den pla­ naren Lichtwellenleiter 1b gemäß Fig. 2 wird eine gleichzeitige Anregung sämtli­ cher Meßpunkte 10 erreicht.

Die Fig. 3, die als nicht erfindungsgemäßes Vergleichsbeispiel zu der erfin­ dungsgemäßen Anordnung von Fig. 4 dient, zeigt in schematischer Darstellung eine Einrichtung zum Auslesen eines Biochips 1, der eine Konfiguration aufweist, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist. Der Biochip 1 besteht wiederum aus dem transpa­ renten Substrat 1a und der auf das Substrat aufgebrachten hochbrechenden Be­ schichtung als planarer Lichtwellenleiter 1b. Die Ränder 1c des Biochips 1 blei­ ben außerhalb der Wellenleiterstruktur. Der Lichtwellenleiter trägt ein Feld von Meßpunkten 10 und das Anregungslicht 4 wird über ein Koppelgitter 5 in den Lichtwellenleiter 1b eingekoppelt und in diesem geführt. Die Meßpunkte 10 sind so ausgebildet, wie dies anhand der Fig. 1b und Fig. 2 erläutert wurde. Zur Ana­ lyse von DNA-Nukleinsäuren in einer Probe wird diese Probe hier beispielsweise in einer Flußzelle 6 und durch diese hindurchgeführt, wie dies durch die Strö­ mungspfeile 6a, 6b angedeutet ist. Die Flußzelle 6 wird abgedichtet auf den Lichtwellenleiter 1b aufgesetzt und umgibt das Meßfeld mit den Meßpunkten 10 rahmenartig und fluiddicht, so daß die Probe mit allen Meßpunkten 10 zur mögli­ chen Hybridisierung in Wechselwirkung treten kann. Die Detektion des durch das Evaneszenzfeld des Anregungslichtes angeregten Fluoreszenzlichts 7 erfolgt z. B. mittels einer Abbildungsoptik 8 in Verbindung mit einem (hier nicht gezeig­ ten) Filter und einem ortsauflösenden Detektor 9, wie z. B. einer CCD-Kamera oder einem Foto-Multiplier. Die Detektion kann aber auch durch Abstrahlung des Fluoreszenzlichtes nach oben oberhalb des Lichtwellenleiters 1b erfolgen.

Auf diese Weise erfolgt mit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung des nicht erfindungsgemäßen Vergleichsbeispiels eine "in-situ-Erfassung" der Hybridisie­ rung und eine parallele Auslesung des Biochips 1 mit allen Meßpunkten 10 gleichzeitig. Zugleich erfolgt eine selektive Anregung der gebundenen Fluoro­ chrome in den Meßpunkten. Durch dieses Meßprinzip ist daher ohne besondere Probenvorbereitung eine mit großer Genauigkeit hinsichtlich der Ortsauflösung und auch hinsichtlich der Präsenz von hybridisierten Nukleinsäuren eine sehr schnelle Auswertung und Detektion des Biochips 1 möglich.

Bekanntermaßen muß bei der Vorrichtung nach Fig. 3 zusätzlicher Aufwand für die Einkopplung des Anregungslichtes 4 in den Lichtwellenleiter 1b (hier über ein Gitter 5) getrieben werden. Einerseits werden somit zusätzliche Präparations­ schritte bei der Herstellung des Biochips 1 nötig, andererseits sind Justiervorrich­ tungen in der optischen Anordnung zwischen Anregungslichtquelle (Laserquelle) und Biochip erforderlich. Die damit einhergehende Erhöhung der Biochipkosten, die als Verbrauchsmaterial problematisch ist, wird dadurch vermieden, daß die Meß- und Analysenanordnung nach der schematischen Darstellung gemäß Fig. 4, die ein Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt, verwendet wird. Eine Anre­ gung der Fluoreszenz erfolgt auf der Oberseite des Lichtwellenleiters 1b von der Rückseite des Biochips 1 und damit von der gegenüberliegenden Seite in Bezug auf die Flußzelle 6. Eine Detektion des von den gebundenen Fluorochromen e­ mittierten Fluoreszenzlichtes erfolgt durch Einkopplung desselben in den plana­ ren Lichtwellenleiter 1b.

Das von einer Laserstrahlquelle als Lichtquelle 3 emittierte Anregungslicht wird über eine Ablenkeinheit 14 auf einen Umlenkspiegel 15 und von dort in den Lichtwellenleiter 1b im Bereich des Meßfeldes der Meßpunkte 10 geführt, an dem sich z. B. die Flußzelle 6 befindet. Hierbei findet mit einer Scanneinrichtung eine zweiachsige Relativbewegung zwischen Anregungslichtstrahl und Biochip statt. Auch in diesem Fall wird durch den planaren Lichtwellenleiter 1b eine Trennung von angebundenen und gelösten Fluorochromen erreicht, da nur das im Bereich des Evaneszentfeldes des Anregungslichtes 4 emittierte Fluoreszenzlicht 7 auch in den planaren Lichtwellenleiter 1b eingekoppelt und anschließend detektiert wird. Die gelösten Fluorochrome erzeugen keine Untergrundintensität, da dieses Licht nicht an die Erfassungseinrichtung herangeführt wird, sondern nur das in dem planaren Lichtwellenleiter 1b geführte Fluoreszenzlicht der gebundenen Fluorochrome. Die Strömungspfeile 6a, 6b geben wiederum den Probenfluß durch die Flußzelle 6 an, während die Abbildungsoptik 8 mit Filter 8a im Anschluß an den planaren Lichtwellenleiter 1b dargestellt ist, wobei als ortsauflö­ sender Detektor hier ein Foto-Multiplier verwendet wird.

Da bei diesem Ausführungsbeispiel eine zeilenweise Auslesung erfolgen muß, wird der Biochip 1 in Pfeilrichtung A, wie angegeben, entsprechend bewegt.

Gegebenenfalls kann auch auf der anderen Seite des Wellenleiters eine Erfas­ sungseinrichtung mit Auswerteoptik, Filter und Foto-Multiplier zur Erfassung des auf der anderen Seite aus dem Lichtwellenleiter 1b austretenden Fluoreszenz­ lichtes vorgesehen sein oder der Detektor kann direkt an die Kante des Lichtwel­ lenleiters 1b angekoppelt sein.

Als Lichtwellenleiter kann auch unmittelbar eine Glasplatte verwendet werden, die selbst den Reaktionsträger und zugleich planaren Lichtwellenleiter bildet. In diesem Fall kann eine separate, den Lichtwellenleiter bildende Beschichtung ei­ nes Substrats entfallen.

Die beschriebene Lösung gestattet die Real-Time-Messung und Auswertung von Biochips oder auch von anderen Reaktionsträgern, auf deren mit einem planaren Wellenleiter beschichteten Oberseite durch Reaktion Analysen von Substanzen in Proben bewirkt werden.

Es wurden ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Substanzen, wie z. B. DNA-Sequenzen, in einer Probe beschrieben, wobei gleichzeitig zu einer Reaktion der in der Probe enthaltenen, zu analysierenden Substanzen mit Kom­ plementär-Agenzien auf einem Reaktionsträger eine Anregung derselben zur Fluoreszenz mittels eines Anregungslichtes erfolgt und der Reaktionsträger auf seiner Oberseite einen planaren Lichtwellenleiter aufweist, auf dem sich die im­ mobilisierten Komplementär-Agenzien befinden und das evaneszente Feld des Fluoreszenzlichtes in dem planaren Lichtwellenleiter auf der Oberseite des Reak­ tionsträgers geführt werden, wobei das Fluoreszenzlicht vorzugsweise über eine Abbildungsoptik einem Detektor zugeführt wird.

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung von Substanzen in einer Probe, bei welchem:
die Substanzen (12) mit Komplementär-Agenzien (11) in Kontakt gebracht werden, die auf der Oberfläche eines planaren Lichtwellenleiters (1b) eines Reaktionsträgers (Biochip 1) immobilisiert sind, wobei die Komplementär- Agenzien (11) eine Anordnung von Messpunkten (10) auf dem planaren Licht­ wellenleiter (1b) bilden,
fluoreszierende Farbstoffe, die an die Substanzen (12) und/oder die Komple­ mentär-Agenzien (11) gebunden sind, im Bereich der Oberfläche des planaren Lichtwellenleiters (1b) durch Anregungslicht (4) zur Emission von Fluoreszenz­ licht (7) angeregt werden, wobei das Anregungslicht von außen auf einen je­ weiligen Messpunkt der Anordnung der Messpunkte mit Hilfe einer Scanein­ richtung, durch die der Reaktionsträger (Biochip 1) und das Anregungslicht re­ lativ zueinander in zumindest einer Ebene bewegbar sind, gerichtet wird,
emittiertes Fluoreszenzlicht (7) im Bereich seines Evaneszenzfeldes in den planaren Lichtwellenleiter (1b) eingekoppelt und durch den planaren Lichtwel­ lenleiter (1b) einer Erfassungseinrichtung zugeführt und durch die Erfassungs­ einrichtung ausgelesen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen (12) DNA-Sequenzen und die Komplementär-Agenzien (11) komplementäre DNA-Einzelstränge umfassen, wobei die DNA-Sequenzen fluoreszenzfarb­ stoffmarkiert sind und mit den komplementären DNA-Einzelsträngen auf der Oberfläche des planaren Lichtwellenleiters (1b) hybridisieren.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Anre­ gungslicht (4) von der Rückseite des Reaktionsträgers (Biochip 1) eingestrahlt und das Fluoreszenzlicht (7) nach Durchgang durch eine einen Filter (8a) ent­ haltende Abbildungsoptik (8) zumindest einem Detektor (9) der Erfassungsein­ richtung zugeführt wird.

4. Vorrichtung zur Bestimmung von Substanzen in einer Probe, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, mit:
einem Reaktionsträger (Biochip 1), der einen planaren Lichtwellenleiter (1b) zur Aufnahme einer Anordnung von Messpunkten (10) auf dessen Oberfläche um­ fasst, wobei die Messpunkte (10) durch mit den Substanzen (12) reagierenden Komplementär-Agenzien (11) gebildet werden, die auf der Oberfläche des pla­ naren Lichtwellenleiters (1b) des Reaktionsträgers (Biochip 1) immobilisiert sind,
einer Lichtquelle (3) zur Beleuchtung des Lichtwellenleiters (1b) von außen auf einen jeweiligen Messpunkt der Anordnung von Messpunkten, zur Anregung von fluoreszierenden Farbstoffen zur Emission von Fluoreszenzlicht (7) in Ab­ hängigkeit von der Reaktion der Substanzen (12) mit den immobilisierten Kom­ plementär-Agenzien (11), wobei die fluoreszierenden Farbstoffe an die Sub­ stanzen (12) und/oder Komplementär-Agenzien (11) gebunden sind,
einer Scaneinrichtung, durch die der Reaktionsträger (Biochip 1) und das An­ regungslicht relativ zueinander in zumindest einer Ebene bewegbar sind, und
einer Erfassungseinrichtung zum Erfassen des von den an der Oberfläche des Lichtwellenleiters (1b) gebundenen fluoreszierenden Farbstoffen emittierten und in den planaren Lichtwellenleiter (1b) im Bereich seines Evaneszenzfeldes eingekoppelten Fluoreszenzlichtes.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassungs­ einrichtung einen Detektor (9) aufweist, der an einer Endfläche des planaren Lichtwellenleiters (1b) oder direkt an einer Kante des Reaktionsträgers (Biochip 1) angeordnet ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe durch eine Flusszelle (6) führbar oder stationär in einer Küvette oder einem Probenbehälter in abdichtender Verbindung im Bereich der Messpunkte (10) auf der Oberfläche des planaren Lichtwellenleiters (1b) des Reaktionsträgers (Biochip 1) anordenbar ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsträger ein Biochip (1) mit dem planaren Lichtwellenleiter (1b) auf seiner Oberseite ist, der die Messpunkte (10) trägt.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsträger eine Glasplatte ist, die selbst den planaren Lichtwellenleiter (1b) bildet.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (4) von einer Ober- oder Unterseite des Reaktionsträgers, vorzugsweise eines Biochips (1), her auf diesen einstrahlbar ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassungseinrichtung eine Abbildungsoptik (8) mit einem Filter (8a) auf­ weist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassungseinrichtung einen Foto-Multiplier oder eine CCD-Kamera als Detektor (9) umfasst.