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Die Erfindung betrifft ein Analyseverfahren zur
Analyse von spezifischen Bindungsreaktionen zwischen Makromolekülen, bei
dem ein Array aus Spots mit Sondenmakromolekülen mit einer Flüssigkeit
mit Probenmakromolekülen
in Kontakt gebracht wird.
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Zur Untersuchung von spezifischen
Bindungsreaktionen werden heutzutage sogenannte Arrays eingesetzt,
die regelmäßig auf
Oberflächen
angeordnete Sondenmoleküle
zum Zwecke der Analyse aufweisen. Zum Beispiel kann ein solches
Array unterschiedliche Spots in regelmäßiger Anordnung aufweisen,
so daß sich
die einzelnen Spots durch ihre Art bzw. spezifischen Eigenschaften
unterscheiden. Die Sondenspots können
Proteine oder DNA umfassen, die mit in einer Lösung befindlichen Molekülen (Probenlösung) spezifische
Wechselwirkung eingehen. Die Probenlösung wird auf die Oberfläche aufgebracht
und kann dann mit den Sondenmolekülen reagieren. Anschließend wird
bei bekannten Verfahren die Probenlösung zumindest zum Teil wieder von
der Oberfläche
abgewaschen. An denjenigen Orten, an denen eine spezifische Bindung
zwischen Probenmolekülen
und Sondenmolekülen
stattfand, sind die Probenmoleküle
nach diesem Waschvor gang noch vorhanden. Durch Fluoreszenzmarkierung,
radioaktive Markierung oder auch Änderung der Masse oder der
elektrischen Eigenschaften kann die Position bestimmt werden, an
der Probenmoleküle
nach dem Waschvorgang noch vorhanden sind, so daß diese identifiziert werden
können.
Hieraus lassen sich entweder bei bekannten Probenmolekülen Informationen über die
Eigenschaften der einzelnen Sondenmoleküle, oder bei bekannter Anordnung
von Sondenmolekülen
Informationen über
das Vorhandensein oder die Eigenschaften von Probenmolekülen in der
Lösung
erhalten.
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In dem vorliegenden Text wird der
Begriff „Probenmolekül" für diejenigen
Moleküle
in der Probenlösung
verwendet, wohingegen der Begriff „Sondenmolekül" für an der
Oberfläche
gebundene Moleküle
verwendet wird. Ob das Vorhandensein bzw. das Reaktionsverhalten
bestimmter Probenmoleküle oder
das Vorhandensein oder das Reaktionsverhalten bestimmter Sondenmoleküle untersucht
wird, hängt
davon ab, ob bei dem Experiment die verwendeten Sondenmoleküle oder
die verwendeten Probenmoleküle
bekannt sind.
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Die beschriebene Technologie wird
unter anderem bei DNA-Arrays eingesetzt, wobei dies am Beispiel
von Microarrays beschrieben wird. Solche Microarrays sind miniaturisierte
Arrays, was im Falle von DNA-Microarrays Sondenspots mit einem Durchmesser
von etwa 100 μm
entspricht. Die DNA-Microarray-Technologie hat sich in den letzten
Jahren zur Analyse von DNA in biologischen Proben etabliert („DNA Microarrays", herausgegeben von
M. Schena, Oxford University Press, 1999). Mit dieser Technik ist die
simultane Analyse von bis zu mehreren Tausend genomischen DNA-Sequenzen
möglich.
Viele verschiedene DNA-Sonden können
z. B. in einem Schachbrettmuster auf die Oberfläche aufgebracht und gleichzeitig
zu Hybridisierungs- oder Enzymreaktionen benutzt werden. Sondenspots
können
entweder auf einen Chip direkt an den entsprechenden Positionen
synthetisiert werden oder durch Druckmethoden (Spotten) an den entsprechenden
Positionen aufgebracht werden. Darauf wird die Probenlösung mit
der zu untersuchenden Proben-DNA inkubiert, die meist mit einem
Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Gegebenenfalls kommt es zur spezifischen
Bindung bzw. Hybridisierung von Proben- und Sondenmolekülen. Aus den Signalintensitäten jeder
einzelnen aufgebrachten Sequenz kann man dann Rückschlüsse auf die Menge der in der
Lösung
enthaltenen Probe ziehen.
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In vielen Anwendungen wird die Menge
einer DNA-Probe einzelner Gene (Genexpression) in verschiedenen
biologischen Systemen untersucht. Vorzugsweise vergleicht man die
DNA zweier unterschiedlicher biologischer Systeme, die mit verschiedenen
Fluoreszenzfarben markiert sind, durch gleichzeitige Inkubation
auf einem Array. So erhält man
in einem Experiment alle Ergebnisse der auf dem Chip gebundenen
Gene für
beide Systeme und kann diese direkt miteinander vergleichen.
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Sowohl in der pharmazeutischen Forschung als
auch in der Diagnostik werden solche sogenannten Assays als Endpunktexperimente
durchgeführt. Dazu
wird das Array nach einer bestimmten Reaktionsszeit, die vor Beginn
des Experiments festgelegt werden muß, mit einem Scanner oder einem
Fluoreszenzmikroskop ausgelesen.
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Die Konzentration und/oder Reaktionsgeschwindigkeit
zwischen Probenmolekülen
und Sondenmolekülen
kann jedoch so gering sein, daß das Experiment
sehr lange andauern muß,
um ein ausreichend großes
Signal zu erzielen. Weiterhin erlauben die bekannten Experimentierverfahren
unter Einsatz von Endpunktexperimenten im allgemeinen keine Untersuchung
der Dynamik biologischer Prozesse und somit auch keiner lebenden
Zellen. Schließlich kann
die Reaktionskinetik nicht untersucht werden, da die Reaktion in
der Regel diffusionsbestimmt ist und die typischen Diffusionszeitkonstanten
oft länger sind
als die Zeitkonstanten der Bindungsereignisse selbst.
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Ein Verfahren zur Messung von Reaktionskinetiken
beruht auf der Oberflächenplasmonresonanz (SPR),
wie sie in
US 5,064,619 beschrieben
ist. Hier wird die Änderung
des Winkels der Totelreflexion gemessen, die durch die Bindung von
Probenmolekülen
an Sondenmolekülen
hervorgerufen wird, die an der Oberfläche gebunden sind. Dabei sind
die Sondenmoleküle
meist an einer Goldoberfläche
gebunden. In diesem Verfahren wird nicht direkt die Anzahl der Moleküle bestimmt,
da die Änderung
der SPR-Frequenz und damit die Änderung
des Winkels der Totalreflexion von der Änderung der dielektrischen
Umgebung der Goldoberfläche
abhängt.
Diese wird jedoch nicht nur durch die Zahl der gebundenen Moleküle, sondern
auch durch ihre elektronischen Eigenschaften bestimmt.
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In
DE-A-101
03 954 sind Verfahren zur Analyse von Makromolekülen mit
Hilfe von Microarrays beschrieben. Zur besseren Lokalisierung der
Probenflüssigkeit
an dem Microarray, das auf einer Festkörperoberfläche angeordnet ist, wird dort
die Verwendung eines bevorzugten Aufenthaltsbereiches im Bereich
des Microarrays auf der Festkörperoberfläche vorgeschlagen,
dessen Benetzungseigenschaften sich von der umgebenden Festkörperoberfläche derart
unterscheiden, daß sich
die Probenflüssigkeit bevorzugt
darauf aufhält.
Zur Durchmischung bzw. Homogenisierung und/oder Entfernung der Probenflüssigkeit
wird die Applikation von Oberflächenschallwellen
beschrieben. Auch die in
DE-A-101
03 954 beschriebenen Verfahren sind Endpunktmessungen.
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Andere Verfahren bedienen sich der
Tatsache, daß sich
durch eine Änderung
des Bedeckungsgrades der Oberfläche
mit Probenmolekülen
die mechanischen Eigenschaften des Substrates ändern. Hier können z.
B. Micro-Cantilever (
US 5,719,324 ) oder
dünn geschliffene
Schwingquarze (
US 5,552,274 )
als Detektoren eingesetzt werden. Dabei mißt man z. B. die Änderung
der Resonanzfrequenz des Micro-Cantilevers
oder des Schwingquarzes, die durch den zusätzlichen Massebelag der gebundenen Probenmoleküle hervorgerufen
wird. Ebenso kann die Änderung
der Resonanzfrequenz einer Oberflächenschallwelle durch den zusätzlichen
Massebelag ausgewertet werden (
US
5,130,257 ).
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Nachteil der letztgenannten Verfahren
ist es, daß nur
die Kinetik eines oder einiger weniger Spots gemessen werden kann.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, mit der die
Hybridisierung sich auch in-situ auf einfache und zuverlässige Weise
bestimmen läßt, wobei
auch die Vermessung von Microarrays mit sehr vielen Spots möglich sein
soll.
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Diese Aufgabe wird mit einem Analyseverfahren
mit den Merkmalen des Anspruches 1 bzw. einer Analysevorrichtung
mit den Merkmalen des Anspruches 9 gelöst. Unteransprüche sind
auf bevorzugte Ausführungsformen
gerichtet.
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Bei dem erfindungsgemäßen Analyseverfahren
wird ein transparenter, nicht lumineszierender Träger bereitgestellt,
auf dem sich ein Array aus Spots mit dort gebundenen Sondenmakromolekülen befindet.
Diese Spots können
z. B. durch direkte Synthetisierung der Makromoleküle an den
gewünschten Stellen
entstanden sein oder mit Hilfe einer Drucktechnik aufgespottet worden
sein. Zumindest einer der Spots wird mit einer Flüssigkeit
in Kontakt gebracht, die Probenmakromoleküle enthält. Je nach Verfahrensführung sind
entweder die Sondenmoleküle
oder die Probenmoleküle
lumineszenzmarkiert. Die Lumineszenz wird durch den transparenten nicht-lumineszierenden
Träger
hindurch ausgelesen, während
die Probenflüssigkeit
mit dem Array in Verbindung ist.
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Das Auslesen der Lumineszenz durch
den transparenten Träger
hindurch beinhaltet dabei Verfahrensführungen, bei denen das lumineszenzanregende
Licht durch den Träger
eingestrahlt wird, oder das Lumineszenzlicht, das durch den Träger austritt, nachgewiesen
wird. Bevorzugt ist jedoch, wenn der transparente Träger als
optisches Fenster eingesetzt wird, durch das sowohl lumineszenzanregendes Licht
eintritt als auch das Lumineszenzlicht ausgelesen wird.
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Durch die Verwendung einer durch
den Träger
abgeschlossenen Probenflüssigkeitsaufnahmekammer
ist die Verdampfung, die gerade bei kleinen Mengen ein Problem darstellen
kann, signifikant verringert.
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Die Beobachtung der Lumineszenz durch den
Träger
hindurch ermöglicht
eine signifikante Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses.
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So wird durch die Spots der Sondenmoleküle bei der
Beobachtung der Lumineszenz eine Hintergrundlumineszenz, die bei
Verwendung von lumineszierenden Probenmolekülen auftritt, abgeschattet. Das
Signal, das von an den Spots gebundenen lumineszierenden Probenmolekülen erzeugt
wird, wird also weniger durch den Hintergrund der noch in der Probenlösung befindlichen
lumineszierenden Probenmoleküle
gestört.
Dies ermöglicht
eine in-situ-Messung und Feststellung der Erhöhung der Lumineszenz an den
Sondenspots.
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Ebenso kann durch das Trägermaterial
hindurch mit Hilfe einer konfokalen Optik durch Einstellung der
entsprechenden Brennweite auf die Oberfläche des Trägermateriales mit den Spots
nur der unmittelbar der Oberfläche
mit den Spots benachbarte Bereich untersucht werden, so daß auch in
diesem Fall der Hintergrund durch noch in der Probenlösung befindliche
Probenmoleküle
weniger ins Gewicht fällt.
Bei einer anderen Ausführungsform
werden zur Anregung der Lumineszenz evaneszente Felder eingesetzt,
die nach Durchlaufen des transparenten Trägermaterials in der Probenflüssigkeit
stark gedämpft werden,
so daß auch
hier nur die unmittelbare Nachbarschaft der Grenzfläche der
Oberfläche
des Trägers
mit den Sondenspots und der Probenflüssigkeit untersucht wird.
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Schließlich kann bei Verwendung von
Sondenmolekülen,
die nur dann eine Lumineszenz aufweisen, wenn sie eine spezifische
Bindung eingegangen sind, durch das Trägermaterial hindurch die Lumineszenz
untersucht werden, die erst bei Bindung von Probenmolekülen an den
Sondenmolekülen
auftritt.
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Es sind verschiedene Arten der Lumineszenz
auswertbar, z. B. Phosporeszenz oder Elektrolumineszenz. Besonders
einfach und gut auswertbar ist der Prozeß jedoch bei Einsatz von fluoreszierenden
Proben- bzw. Sondenmolekülen.
In diesem Fall wird ein Träger
aus nicht-fluoreszierendem Material eingesetzt.
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Bei einer vorteilhaften Weiterbildung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Probenflüssigkeit
mit Hilfe von Oberflächenschallwellen
durchmischt bzw. homogenisiert. Auf diese Weise ist sichergestellt,
daß alle
Spots gleichermaßen
mit Probenlösung
bzw. den darin befindlichen Probenmolekülen in Berührung kommen.
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Mit einem solchen Mischprozeß kann zusätzlich sichergestellt
werden, daß der
Prozeß nicht diffusionsbegrenzt
ist.
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Bei bekannten Verfahrensführungen
ist die Zeitkonstante für
Bindungs- und Trennungsereignisse in der Regel wesentlich kürzer als
eine typische Zeitkonstante der Diffusion. Das System steht daher sozusagen
still, während
die Bindungsereignisse stattfinden. Dadurch kommt es zu Verarmungseffekten
in den Bereichen der Spots, insbesondere wenn die Konzentration
der Sondenmoleküle
auf den Spots deutlich höher
ist als die der Probenmoleküle in
Lösung.
Die Bindungen finden mit kurzer Zeitkonstante statt, ohne daß ausreichend
Probenmoleküle in
den Bereich des Spots „nachgeliefert" werden, da dieser
Prozeß diffusionsbestimmt
ist. Gerade bei kleinen Probenvolumina, wie sie hier betrachtet
werden, ist die Zeitkonstante der Diffusion signifikant höher als
die Zeitkonstante der Bindungs- und Trennungsereignisse. Die Kinetik
der Bindungsereignisse ist in der Regel kompliziert. Die langsame
Diffusion stellt ein Nadelöhr
dar, so daß man
im allgemeinen bei Endpunktexperimenten nicht weiß, wann
das Experiment eigentlich vollständig
abgeschlossen ist bzw. man kann nach Beendigung des Experimentes
nicht genau aussagen, wie weit das Experiment überhaupt fortgeschritten ist.
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Durch den hier beschriebenen Mischprozeß ist eine
deutliche Verkürzung
der Zeitkonstante für die
Homogenisierung bzw. den „Nachschub" gewährleistet.
Es werden nicht nur homogenere Ergebnisse erhalten, sondern auch
die Kinetik der Bindungsexperimente kann in situ verfolgt werden.
Ein Experimentator ist daher in der Lage, sich ein Bild über den Stand
des Experiments zu machen.
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Oberflächenschallwellen lassen sich
z. B. mit einem sogenannten Interdigitaltransducer erzeugen, wie
er in
DE 101 03 954 beschrieben
ist. Dieser Interdigitaltrans ducer kann z. B. in der Haltevorrichtung für den Träger integriert
sein oder auf dem Träger
selber definiert sein. Durch elektrische Anregung des Interdigitaltransducers
mit einem Hochfrequenzfeld werden Oberflächenschallwellen erzeugt, die
Impuls auf die Flüssigkeit übertragen.
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Um die Temperaturabhängigkeit
der Hybridisierung untersuchen zu können, wird während des Reaktionsprozesses
die Probenflüssigkeit
geheizt oder gekühlt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere
zur Untersuchung von Nukleinsäuren,
z. B. DNA oder RNA.
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Eine erfindungsgemäße Analysevorrichtung, mit
der das erfindungsgemäße Verfahren
durchgeführt
werden kann, weist einen Aufnahmeraum für die Probenflüssigkeit
auf. Weiterhin ist eine Haltevorrichtung vorgesehen, die zum Halten
eines Trägers
aus nicht lumineszierendem, transparentem Material dient. Zur Untersuchung
der Fluoreszenz von Molekülen
wird ein nicht-fluoreszierender Träger eingesetzt. Die Haltevorrichtung
ist so ausgestaltet, daß ein
in ihr gehaltener Träger
mit dem Flüssigkeitsraum in
Verbindung steht und diesen abschließt. Zur Untersuchung der Lumineszenz
durch das transparente Trägermatieral
hindurch weist die erfindungsgemäße Analysevorrichtung
eine Lumineszenzmeßeinrichtung
auf, die derart ausgestaltet ist, daß sie die Lumineszenz durch
einen von der Haltevorrichtung gehaltenen transparenten Träger hindurch
beobachten kann. Eine solche Lumineszenzmeßeinrichtung kann z. B. eine
Scanneinrichtung, eine CCD-Kamera oder ein Lumineszenzmikroskop
umfassen. Schließlich weist
die erfindungsgemäße Analysevorrichtung
eine erste Befüllöffnung auf,
durch die der Flüssigkeitsaufenthaltsraum
befüllt
werden kann. Eine zweite Öffnung
ist vorgesehen, um während
des Befüllvorganges
den Flüssigkeitsaufenthaltsraum
zu entlüften.
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Bei einer vorteilhaften Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist der Flüssigkeitsaufnahmeraum
zumindest teilweise von Metall umgeben. Eine solche Ausgestaltung
gewährleistet
eine gleichmäßige Temperaturverteilung.
Bevorzugt wird das Metall dort wo es an den Flüssigkeitsaufnahmeraum grenzt
mit einer Beschichtung passiviert. Zur Einstellung einer gewünschten
Temperatur oder zur Messung der Temperaturabhängigkeit von spezifischem Bindungsverhalten
kann innerhalb des Metalls eine Temperiervorrichtung vorgesehen
sein, z. B. ein Peltierelement oder eine Widerstandsheizung.
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Als Isolation und zum Schutz gegen äußere Umwelteinflüsse oder
mechanische Stöße ist vorteilhafterweise
um das Metall auf der dem Flüssigkeitsaufenthaltsraum
abgewandten Seite eine Kunststoffisolationsschicht vorgesehen.
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Zur Erzeugung von quasistatischen
Strömungsmustern
und damit Durchmischung bzw. Homogenisierung der Probenflüssigkeit
wird bei einer vorteilhaften Ausführungsform zumindest eine Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung
vorgesehen. Bei einer einfachen Ausgestaltung handelt es sich dabei
um einen sogenannten Interdigitaltransducer, wie er in
DE 101 03 954 beschrieben ist. Gerade beim
Einsatz in einer erfindungsgemäßen Analysevorrichtung
mit einem durch den Träger
für das
Microarray abgeschlossenen Flüssigkeitsaufenthaltsraum
ist die Verwendung eines Interdigitaltransducers zur effektiven
Applikation von Oberflächenschallwellen
besonders vorteilhaft.
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Alternativ kann eine von außen ansteuerbare Einrichtung,
z. B. eine Spule, vorgesehen sein, mit der ein ggf. auf dem Träger selbst
aufgebrachter Interdigitaltransducer drahtlos angeregt werden kann, so
daß er
Oberfächenschallwellen
abstrahlt.
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Der mit der beschriebenen Mischvorrichtung erreichbare
vorteilhafte Effekt, daß der
Prozeß nicht durch
die große
Zeitkonstante der Diffusion begrenzt ist, läßt sich auch in Verfahrensführungen
vorteilhaft ausnutzen, in denen nicht optische Ausleseverfahren eingesetzt
werden, z. B. Auswertung der Oberflächenplasmonresonanzen, Verwendung
radioaktiv markierter Moleküle
etc.
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Der vorteilhafte Effekt, daß der Prozeß nicht durch
hohe Diffusionskonstante limitiert ist, ist unter Einsatz der vorteilhaften
Mischvorrichtung auch bei Verfahrensführungen erreichbar, bei denen
beide Reaktionsmolekülpartner
in Lösung
sind.
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Zur Befestigung des Trägers mit
dem Array aus Sondenspots zum Abschluß des Flüssigkeitsaufenthaltsraumes
sind vorteilhafterweise entsprechende Befestigungsvorrichtungen,
z. B. Federklemmen, vorgesehen, die einen schnellen Austausch des
Trägers
erlauben.
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Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
werden im folgenden unter Bezugnahme auf die anliegenden Figuren
im Detail erläutert.
Die Figuren sind schematischer Natur und nicht maßstabsgetreu.
Dabei zeigt:
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1:
den seitlichen Schnitt durch eine erfindungsgemäße Analysevorrichtung,
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2:
den seitlichen Schnitt durch eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform,
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3:
den seitlichen Schnitt durch eine dritte erfindungsgemäße Ausführungsform,
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4:
eine Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Ausführungsform, und
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5:
den Schnitt durch einen Teil einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform.
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In 1 ist
in nicht maßstabsgetreuer
schematischer Darstellung eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Analysevorrichtung
gezeigt. 1 ist ein Träger
aus transparentem und nicht fluoeszierendem Material. Die Fläche dieses
Trägers
beträgt z.
B. 20 mm × 20
mm oder mehr. Besonders geeignet sind z. B. die Maße eines
konventionellen Objektträgers
(75 mm × 25
mm). Das Material kann Glas sein oder z. B. ein transparentes, nicht
fluoeszierendes piezoelektrisches Material, wie z. B. Lithiumniobat.
Die Dicke des Trägers 1 beträgt bei Verwendung
eines Objektträgers
etwa 1 mm und bei Verwendung z. B. eines Lithiumniobatplättchens
etwa 500 μm.
Eine geringe Dicke ist vorteilhaft, da so der Arbeitsabstand von
der noch zu beschreibenden Optik 15 zu den Spots 3 gering
gehalten werden kann. Grundsätzlich sind
aber auch größere Abstände bzw.
Dicken einsetzbar. Der Träger 1 trägt ein Array
aus Spots, von denen zwei beispielhaft mit 3 bezeichnet
sind.
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Obwohl die Figur nur einige Spots
zeigt, befinden sich auf dem Träger
je nach Experiment bis zu mehreren Tausend solcher Spots eines Durchmessers
von z. B. 100 μm.
Die Spots werden aus Sondenmakromolekülen gebildet, die z. B. mit
Hilfe einer Drucktechnik auf den Träger aufgespottet worden sind. 5 bezeichnet
eine Probenflüssigkeitsaufnahmekammer,
die durch in 1 nicht
sichtbare Befüllkanäle befüllt werden
kann und eine typische Höhe
von 50 μm
bis 250 μm
hat. Die Probenflüssigkeitsaufnahmekammer
wird von einem Metallkörper 7 abgeschlossen,
in dem Kanäle 11 für ein Temperierelement,
z. B. ein Peltierelement oder ein Widerstandsheizelement, eingelassen
sind. Der Träger 1 stützt sich
gegen in 1 nicht gesondert
gezeigte Ansätze
in dem Probenflüssigkeitsaufnahmeraum 5 ab
und ist ggf. mit einer Dichtung abgedichtet.
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Der Metallkörper 7 ist von einem
Kunststoffkörper 9 umgeben.
Bei der gezeigten Ausführungsform
ist im Boden der Probenflüssigkeitskammer 5 ein
piezoelektrischer Chip 13 eingelassen, der einen Interdigitaltransducer 14 trägt. Entweder
mit Hilfe von nicht gezeigten Zuführungsleitungen oder drahtlos lassen
sich mit diesem Interdigitaltransducer in bekannter Weise Oberflächenschallwellen
erzeugen. Diese können
einen Impuls auf eine in der Probenflüssigkeitskammer 5 vorhandene
Flüssigkeit übertragen.
Die Oberfläche
des Metalls 7 in Berührung mit
dem Flüssigkeitsaufenthaltsraum 5 und/oder
die Oberfläche
des Chips 13 sind mit einer Beschichtung 17 passiviert,
um eine in dem Flüssigkeitsaufenthaltsraum 5 befindliche
Flüssigkeit
zu schützen. 15 bezeichnet
eine Optik, mit der die Fluoreszenz durch das transparente Material 1 hindurch
gemessen werden kann und die z. B. eine CCD-Kamera umfassen kann,
die an eine nicht gezeigte Elektronik bzw. einen Auswertemikroprozessor
angeschlossen ist.
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Die Analysevorrichtung kann derart
ausgestaltet sein, daß als
Träger
auch konventionelle Slides oder kommerzielle Microarraychips eingesetzt werden
können.
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2 zeigt
eine andere Ausführungsform, wobei
gleiche Elemente mit den gleichen Bezugsziffern bezeichnet sind.
Diese Ausführungsform
eignet sich zur Verwendung eines Trägers 1 für Spots 3,
der selbst über
einen Interdigitaltransdu cer 18 zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen
verfügt.
Dieser Interdigitaltransducer 18 kann mit Hilfe der nur
schematisch dargestellten Spule 19 drahtlos angeregt werden.
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Sowohl der Interdigitaltransducer
14 der
1 als auch der Interdigitaltransducer
18 der
2 können wie Interdigitaltransducer
ausgestaltet sein, wie sie aus der Oberflächenwellenfiltertechnologie
bekannt sind und wie sie in
DE-A-101
03 954 beschrieben sind.
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Weder die 1 noch die 2 zeigen
die Einrichtungen zur Befüllung
des Probenflüssigkeitsraumes 5.
Diese sind im Detail in 3 gezeigt.
In dem Metallkörper 7 sind
Kanäle 23, 21 und 25 vorgesehen.
Der trichterförmige
Kanal 23 dient zur Befüllung
und ist über
den schematisch dargestellten Kanal 21 mit dem Probenflüssigkeitsaufenthaltsraum 5 verbunden.
Zur Entlüftung
während
des Befüllvorganges
dient der Entlüftungskanal 25.
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4 zeigt
die Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung im Ausschnitt.
Gezeigt ist der Blick durch den transparenten Träger 1, an dessen Unterseite
sich die Spots 3 befinden. Durch den transparenten Träger 1 hindurch
erkennt man den Probenaufenthaltsraum 5. Seitlich des Trägers 1 ist die
Oberfläche
des Metallkörpers 7 mit
den Öffnungen
zur Befüllung 23 und
zur Entlüftung 25 sichtbar. Der
Träger 1 ist
mit schematisch dargestellten Federklemmen 27 gehalten,
die ein leichtes Auswechseln des Arrays in dem Experimentieraufbau
ermöglichen. Nicht
gezeigt ist in 4 der
die gesamte Einrichtung umgebende Kunststoffkörper 9. Ebenfalls
nicht dargestellt ist der seitliche Abschluß des Probenflüssigkeitsraumes 5,
der auch aus Metall gebildet sein kann.
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Um die Befüllöffnung kann eine Kunststoffumrandung
ausgebildet sein, die bei der Ausführungsform der 4 nicht vorhanden ist. Ebenso kann der
gesamte Befüllkanal 23, 21 als
Einsatz aus einem anderen Material als der Metallkörper 7 gebildet
sein, z. B. aus Kunststoff. Die Befüllöffnung ist so ausgestaltet,
daß eine
handelsübliche
Pipette satt aufgesetzt werden kann.
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In 5 ist
der seitliche Schnitt durch eine andere Ausführungsform im Ausschnitt gezeigt.
Hier befindet sich der Träger 101 mit
den Spots 103 gegenüber
den Befüllöffnungen 123 bzw.
Entlüftungsöffnungen 125.
Der Probenaufenthaltsraum 105 ist getrennt durch eine Passivierungsschicht 117 durch den
Metallkörper 107 abgeschlossen.
An der Außenseite
des Metallkörpers 107 befindet
sich ein Kunststoffkörper 109. 5 zeigt nur einen Ausschnitt,
so daß die
seitlichen Abschlüsse
des Probenaufenthaltsraumes 105 nicht sichtbar sind. Bei
dieser Ausführungsform
können
ebenfalls wie bei den Ausführungsformen
der 1 und 2 zusätzliche Vorrichtungen zur Durchmischung
bzw. Homogenisierung der Flüssigkeit
in dem Probenaufenthaltsraum 5, z. B. entsprechende Interdigitaltransducer,
vorgesehen sein. Ebenso kann der Metallkörper 107 Kanäle zur Aufnahme
von Heiz- oder Kühlelementen
umfassen.
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Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann wie folgt
durchgeführt
werden. Auf einen Träger 1 werden möglichst
dicht Spots 3 mit Sondenmolekülen aufgebracht. Bei dem beschriebenen
Beispiel seien die Sondenmoleküle
bekannt und von Spot zu Spot unterschiedlich. Der so präparierte
Träger 1 wird
ggf. mit einer Dichtung kopfüber
in den Metallkörper 7 eingelegt
und dort mit den Federklemmen 27 fixiert. Dabei liegt er
auf in den Figuren nicht gesondert gezeigten Ansätzen auf. Durch die Öffnung 23 wird
Probenflüssigkeit
mit Probenmolekülen
in den Probenaufnahmeraum eingefüllt.
Dazu wird eine Pipette eingesetzt, die satt auf das Befülloch 23 aufgesetzt
wird. Es wird soviel Flüssigkeit
verwendet, daß ein Überstand
auf dem Befülloch
verbleibt, so daß ein
Verdampfen der Probenlösung
verhindert wird. Dies wird durch die ggf. vorhandene Kunststoffumrandung
des Befülloches
bei den Ausführungsformen
der 1 bis 4 bzw. durch den umgebenden
Kunststoff 109 bei einer Ausführungsform gemäß 5 günstig beeinflußt, da dieser
in der Regel kühler
ist.
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Die in dem Probenflüssigkeitsaufnahmeraum 5 vorhandene
Luft kann durch die Entlüftungsöffnung 25, 125 während des
Befüllens
entweichen. Um eine gute Verteilung der Probenmoleküle in dem Probenflüssigkeitsaufnahmeraum 5 zu
gewährleisten,
wird mit Hilfe des Interdigitaltransducers 14 (1) eine Oberflächen schallwelle
auf dem Festkörperchip 13 angeregt.
Diese Oberflächenschallwelle überträgt ihren
Impuls in die Probenflüssigkeit
und kann so die homogene Verteilung günstig beeinflussen. An den
Interdigitaltransducer wird dabei ein Hochfrequenzfeld im Bereich
von einigen bis einigen 100 MHz angelegt. Dies kann drahtlos geschehen oder
durch nicht gezeigte elektrische Zuführungsleitungen. Dabei kann
die Mischeffizienz auf die Arraygröße derart abgestimmt werden,
daß für alle Spots die
Reaktionskinetik meßbar
wird, also z. B. derart, daß auch
für Zeiten,
die sehr viel größer als
die Reaktionszeit sind, keine Verarmungszonen um die Sondenspots
entstehen. Während
die Probenflüssigkeit
mit den Spots 3 im Probenflüssigkeitsaufnahmeraum 5 in
Kontakt ist, wird mit Hilfe der Optik 15 Fluoreszenz aufgenommen.
Dazu wird fluoreszenzanregendes Licht durch den Träger 1 eingestrahlt.
Finden spezifische Bindungen zwischen den Probenmolekülen in der
Probenflüssigkeit
und den Sondenmolekülen
an den Spots 3 statt, so konzentriert sich die so angeregte
Fluoreszenz im Bereich der Grenzfläche zwischen dem Träger 1 und
dem Probenflüssigkeitsraum 5.
Fluoreszenzmarkierte Probenmoleküle,
die im nicht gebundenen Zustand noch im Probenflüssigkeitsaufnahmeraum 5 vorhanden
sind, werden weniger von dem fluoreszenzanregenden Licht erfaßt, da die
Spots 3 die Beleuchtung der nicht gebundenen Probenmoleküle abschatten.
Dazu ist es vorteilhaft, wenn das Array mit Spots 3 möglichst
dicht bespottet ist. Dennoch von ihnen möglicherweise auftretende Fluoreszenz
wird von der Optik 15 weniger erfaßt, da die Spots 3 das
Fluoreszenzlicht in Richtung der Optik 15 abschatten. Die
Fluoreszenz wird in bekannter Weise von der Optik 15 registriert
und durch eine nicht gezeigte elektronische Recheneinheit verarbeitet
und ausgewertet. Die Spots 3 enthalten unterschiedliche
Sondenmoleküle,
so daß aus
der Lage und der Stärke
der Fluoreszenz an den einzelnen Spots 3 erkannt werden
kann, welche Sondenmoleküle
in welchem Maße
mit den in dem Probenflüssigkeitsaufnahmeraum 5 vorhandenen
Probenmolekülen
reagieren.
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Die Fluoreszenz kann also in-situ
während der
Reaktion aufgenommen werden, um Information über die Reaktionskinetik zu
erhalten. Durch Heizen mit einem Heizelement in dem Heizkanal 11 kann
zusätzlich
untersucht werden, wie die Temperatur das Reaktionsverhalten zwischen
Probenmolekülen
und Sondenmolekülen beeinflußt. Es können temperaturabhängige Meßkurven
aufgenommen werden. Typische Werte für die Temperaturen liegen im
Bereich zwischen 20°C
und 75°C.
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Bei einer Ausführungsform der 2 kommt ein Array 1 zum Einsatz, das
selbst einen Interdigitaltransducer 18 trägt. Dazu
ist das Array 1 aus transparentem, nicht fluoreszierendem
piezoelektrischen Material, z. B. Lithiumniobat einer Dicke von
etwa 500 μm
hergestellt. Der Interdigitaltransducer 18 entspricht einem
Device, wie es z. B. aus der Oberflächenwellenfiltertechnologie
bekannt ist und auch in der 1 auf
den Chip 13 aufgebracht ist. Zur Anregung des Interdigitaltransducers
zur Abstrahlung von Oberflächenschallwellen
ist eine Spule 19 im Meßaufbau vorgesehen, die z.
B. über
nicht gezeigte elektrische Zuführungen
zur Abstrahlung von elektromagnetischer Energie mit einer Frequenz
von einigen bis einigen 100 MHz angeregt werden kann. Diese Energie
wird von dem Interdigitaltransducer 18 aufgenommen, der
daraufhin eine Oberflächenschallwelle
abstrahlt, um wie auch mit Bezug zum Interdigitaltransducer 14 der 1 beschrieben Oberflächenwellen
abzustrahlen und eine Durchmischung der Probenflüssigkeit in dem Probenflüssigkeitsaufnahmeraum 5 zu
befördern.
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Die beschriebenen Hybridisierungskammern können so
ausgestaltet sein, daß sie
mechanisch und optisch mit herkömmlichen
Fluoreszenzmikroskopen kompatibel sind. Eine Auswertung kann jedoch
auch mit einem einfachen Aufbau, der eine CCD-Kamera enthält, eingesetzt
werden.