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Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung und ein Verfahren zur Analyse von Proben.
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Aus der
DE 10 2011 078 770 A1 ist eine mikrofluidische Vorrichtung bekannt. Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst insbesondere fluidisch miteinander verbundene Kanäle. Die mikrofluidische Vorrichtung ist insbesondere zum Transport und zur Analyse von Fluiden geeignet.
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Weiterhin ist aus der
DE 10 2010 031 212 A1 ein Mehrlagensystems aus mehreren Materialschichten, sowie ein Herstellungsverfahren zur Herstellung eines solchen Mehrlagensystems bekannt.
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Hiervon ausgehend wird eine mikrofluidischen Vorrichtung, mit einem Verfahren und mit einem System gemäß den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche beschrieben. Durch die in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen aufgeführten Merkmale sind vorteilhafte Weiterbildungen und Verbesserungen der mikrofluidischen Vorrichtung und des Verfahrens möglich.
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Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung zur Analyse von Proben vorgestellt, die mindestens zwei fluidische Pfade zur Probenaufnahme und mindestens einen Erfassungsbereich für eine Detektionseinheit zur Messung von Licht, welche dazu eingerichtet ist, emittiertes Licht von Proben in den mindestens zwei fluidischen Pfaden über den Erfassungsbereich zu erfassen, umfasst.
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Der Begriff „mikrofluidisch“ bezieht sich hier vor allem auf die Größenordnung der mikrofluidischen Vorrichtung. Die mikrofluidische Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass in den darin angeordneten fluidischen Kanälen und Kammern physikalische Phänomene relevant sind, die im Allgemeinen der Mikrotechnik zugeordnet werden. Hierzu zählen beispielsweise Kapillareffekte, Effekte (insbesondere mechanische Effekte) die im Zusammenhang mit Oberflächenspannungen des Fluids stehen. Hinzu zählen weiterhin Effekte wie Thermophorese und Elektrophorese. Diese Phänomene sind in der Mikrofluidik üblicherweise dominat gegenüber Effekten wie der Schwerkraft. Die mikrofluidische Vorrichtung kann auch dadurch gekennzeichnet sein, dass sie zumindest teilweise mit einem schichtweisen Verfahren hergestellt ist und Kanäle zwischen Schichten des Schichtaufbaus angeordnet sind. Der Begriff „mikrofluidisch“ kann auch über die Querschnitte innerhalb der Vorrichtung charakterisiert werden, welche zur Führung des Fluids dienen. Üblich sind beispielsweise Querschnitte im Bereich von 100 µm [Mikrometer] mal 100 µm bis hin zu 800 µm mal 800 µm.
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Bei der mikrofluidischen Vorrichtung kann es sich insbesondere um ein sogenanntes „Lab on a Chip“ handeln. Ein solches „Lab on a Chip“ ist dazu bestimmt und eingerichtet, biochemische Prozesse durchzuführen. Das bedeutet, dass Funktionalitäten eines makroskopischen Labors z. B. in ein Kunststoffsubstrat integriert werden. Die mikrofluidische Vorrichtung kann z. B. Kanäle, Reaktionskammern, vorgelagerte Reagenzien, Ventile, Pumpen und/oder Aktuations-, Detektions- und Steuereinheiten aufweisen. Die mikrofluidische Vorrichtung kann ermöglichen, biochemische Prozesse vollautomatisch zu prozessieren. Damit können z. B. Tests an flüssigen Proben durchgeführt werden. Derartige Tests können z. B. in der Medizin Anwendung finden. Die mikrofluidische Vorrichtung kann auch als eine mikrofluidische Kartusche bezeichnet werden. Insbesondere durch Eingabe von Proben in die mikrofluidische Vorrichtung können in der mikrofluidischen Vorrichtung biochemische Prozesse durchgeführt werden. Dabei können den Proben auch zusätzliche Substanzen beigemischt werden, die biochemische Reaktionen auslösen, beschleunigen und/oder ermöglichen. Eine Auswertung kann über die Detektionseinheit erfolgen, indem die mikrofluidische Vorrichtung derart platziert wird, dass die Detektionseinheit zumindest den Erfassungsbereich abdecken kann (d. h. insbesondere Licht empfangen kann, welches aus dem Erfassungsbereich ausgesendet wird). Die Detektionseinheit ist kein Bestandteil der mikrofluidischen Vorrichtung. Insbesondere kann die mikrofluidische Vorrichtung unabhängig von der Detektionseinheit mit Proben befüllt werden.
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Die mikrofluidische Vorrichtung wird beispielhaft anhand molekulardiagnostischer Detektionsmethoden beschrieben. Weitere Anwendungsbereiche der mikrofluidischen Vorrichtung können beispielsweise im Bereich der Immunologie oder der klinischen Chemie liegen. Insbesondere kann die mikrofluidische Vorrichtung für die in-vitro Diagnostik eingesetzt werden.
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Die mikrofluidische Vorrichtung ist bevorzugt insbesondere dazu eingerichtet und bestimmt, Nukleinsäuren zu analysieren. Dies kann insbesondere eine Analyse von DNA umfassen. Die mikrofluidische Vorrichtung kann insbesondere die Durchführung mehrerer, insbesondere auch verschiedener Analyse- und/oder Detektionsmethoden erleichtern. Insbesondere kann die mikrofluidische Vorrichtung ermöglichen, dass mehrere Analyse- und/oder Detektionsmethoden gleichzeitig (bzw. sequentiell) und/oder im Kombination durchgeführt werden können. Insbesondere können in unterschiedlichen Bereichen der mikrofluidischen Vorrichtung bzw. in unterschiedlichen Bereichen der fluidischen Pfade unterschiedliche Analyse- und/oder Detektionsmethoden durchgeführt werden.
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Die mikrofluidische Vorrichtung ist dazu eingerichtet und bestimmt, Proben in den fluidischen Pfaden aufzunehmen. Dabei kann eine Probe auf eine Mehrzahl der fluidischen Pfade aufgeteilt werden. Alternativ können mehrere verschiedene Proben in den verschiedenen fluidischen Pfaden getrennt aufgenommen werden. Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst bevorzugt ein mikrofluidisches Netzwerk (welches insbesondere von den fluidischen Pfaden gebildet wird). Besonders bevorzugt ist das mikrofluidische Netzwerk hoch integriert ausgeführt. Das bedeutet, dass auf kleinem Raum eine große Funktionalität ermöglicht wird. Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst bevorzugt Pumpen, Ventile und Steuerungsvorrichtungen, die dazu bestimmt und eingerichtet sind, Proben in und/oder durch die fluidischen Pfade zu leiten. Insbesondere kann die mikrofluidische Vorrichtung durch verschiedene Einstellung von Ventilen für verschiedene Anwendungen genutzt werden.
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Die fluidischen Pfade sind bevorzugt zumindest im Wesentlichen voneinander getrennt. Das bedeutet, dass Flüssigkeiten und andere Substanzen in den einzelnen fluidischen Pfaden nicht miteinander in Berührung kommen und/oder miteinander vermischt werden, jedenfalls bis auf einzelne gewollte Schnittstellen, an denen eine Durchmischung explizit gewünscht ist und gezielt hervorgerufen wird. Beispielsweise können mehrere fluidische Pfade in einer gemeinsamen Reaktionskammer zusammengeführt werden (wodurch dann die gemeinsame Reaktionskammer eine Schnittstelle zwischen den einzelnen fluidischen Pfaden darstellt). In dem Fall sind die fluidischen Pfade mit Ausnahme von Öffnungen in diese gemeinsame Reaktionskammer voneinander getrennt. Auch können die fluidischen Pfade vollständig voneinander getrennt sein. In dem Fall gibt es keine Schnittstelle zwischen verschiedenen fluidischen Pfaden.
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Die fluidischen Pfade sind bevorzugt weiterhin thermisch voneinander getrennt, sodass die Proben(teile) in den verschiedenen fluidischen Pfaden verschiedene Temperaturen haben können. Vorzugsweise kann die Temperatur der einzelnen fluidischen Pfade individuell eingestellt werden. Auch ist es bevorzugt, dass zwischen den fluidischen Pfaden Strahlungsbarrieren vorgesehen sind. Damit kann insbesondere erreicht werden, dass eine externe Strahlung (z. B. zu Anregungszwecken) auf einen fluidischen Pfad bzw. lokal begrenzt eingekoppelt werden kann.
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Die Detektionseinheit umfasst bevorzugt einen Sensor, insbesondere einen optischen Sensor. Der optische Sensor ist bevorzugt dazu eingerichtet, elektromagnetische Strahlung (insbesondere Licht) zu detektieren und in ein elektronisches Signal umzuwandeln. Bevorzugt ist die Detektionseinheit dazu eingerichtet, eine zeit- und ortsaufgelöste Messung durchzuführen und ein zeit- und ortsaufgelöstes Messsignal zu generieren.
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Weiterhin umfasst die Detektionseinheit bevorzugt eine Signalverarbeitungseinheit zur elektronischen Verarbeitung des aufgenommenen Signals, sowie eine Signalwiedergabeeinheit zur visuellen Darstellung des aufgenommenen und verarbeiteten Signals. Die Signalverarbeitungseinheit ist bevorzugt als ein Computer (insbesondere aufweisend einen Computerprozessor) ausgeführt. Bevorzugt umfasst die Signalwiedergabeeinheit einen Bildschirm. Alternativ ist es bevorzugt, dass die Detektionseinheit lediglich einen Anschluss aufweist, der ein elektronisches Signal ausgibt, das zur Verarbeitung durch eine Signalverarbeitungseinheit und eine darauf folgende Darstellung durch eine Signalwiedergabeeinheit geeignet und bestimmt ist. Beispielsweise kann ein Computer an den Anschluss angeschlossen werden.
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Die Detektionseinheit ist bevorzugt dazu eingerichtet, insbesondere Licht einer derartigen Wellenlänge besonders gut zu detektieren, welches von Proben in der mikrofluidischen Vorrichtung emittiert wird bzw. von welchem zu erwarten ist, dass eine typischerweise in der mikrofluidischen Vorrichtung untersuchte Probe dieses Licht emittieren wird, wenn eine bestimmte Untersuchungsmethode mit der Probe durchgeführt wird. Bei dem Licht kann es sich insbesondere um elektromagnetische Wellen mit einer Wellenlänge im Bereich von 150 bis 900 nm [Nanometer], insbesondere im Bereich von 300 bis 700 nm handeln. Insbesondere kann es sich bei dem Licht um (für Menschen) sichtbares Licht handeln.
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Das Licht kann von den Proben in Folge von biochemischen Prozessen ausgesendet werden. Auch können die Proben durch biochemische Prozesse zumindest teilweise in eine Substanz umgesetzt werden, welche Licht emittieren kann. Weiterhin können auch durch biochemische Prozesse Substanzen freigesetzt werden, die Licht emittieren können. Das Licht kann insbesondere aufgrund von Fluoreszenz emittiert werden. Bevorzugt ist die mikrofluidische Vorrichtung derart eingerichtet, dass eine externe Anregung der Proben bzw. einer durch biochemische Prozesse gebildeten oder freigesetzten Substanz möglich ist. Dadurch kann eine Fluoreszenz besonders stark angeregt und besonders gut gemessen werden.
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Bei den biochemischen Prozessen kann es sich insbesondere um solche Prozesse handeln, die für eine Analyse von Nukleinsäuren (bzw. von DNA) üblicherweise durchgeführt werden. In Betracht kommen als Analysemethoden insbesondere (Echtzeit)amplifikation, Schmelzkurvenanalyse und Microarray-Analyse.
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Unter der Amplifikation ist insbesondere die Vermehrung von DNA durch ein Enzym (wie z. B. Polymerase) zu verstehen. Dabei können fluoreszierende Stoffe freigesetzt werden. Durch Messung des fluoreszierenden Lichts kann das Maß der Amplifikation ermittelt werden. Das heißt, dass eine Lichtintensität und/oder eine räumliche Ausdehnung eines Lichtsignales Aufschluss über den Vermehrungsgrad der DNA geben kann. Bevorzugt wird das gesamte von einer Probe emittierte Licht erfasst, insbesondere über die gesamte Ausdehnung der Probe. Alternativ kann ein repräsentativer Ausschnitt der Probe betrachtet werden.
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Repräsentativ bedeutet, dass nur ein Teil der Probe gemessen wird, wobei die gemessenen Werte auf die gesamte Probe umgerechnet werden können. Bei einem repräsentativen Ausschnitt einer Probe entspricht bevorzugt ein für eine nichtskalierende Eigenschaft gemessener Wert einem Durchschnitt der gesamten Probe. Eine nichtskalierende Eigenschaft hängt nicht von der Menge der betrachteten Probe ab, wie z. B. eine Dichte. Außerdem ist ein, an dem repräsentativen Ausschnitt der Probe gemessener Wert, einer skalierenden Eigenschaft (wie z. B. einer Masse) entsprechend dem Anteil des Ausschnitts an der Gesamtprobe kleiner, als ein für die Gesamtprobe messbarer Wert dieser Eigenschaft.
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Wird das Licht in Echtzeit gemessen, so kann man die Amplifikation auch als eine Echtzeitamplifikation bezeichnen. Durch Echtzeitamplifikation kann ein zeitlicher Verlauf der Amplifikation erfasst werden. Insbesondere kann mittels (Echtzeit)amplifikation ein quantitativer Vermehrungsgrad der DNA erfasst werden. Bei der Echtzeitamplifikation kann es sich beispielsweise um eine sogenannte „real-time polymerase chain reaction (real-time PCR)“ handeln. Der Begriff Kettenreaktion („chain reaction“) bezieht sich dabei darauf, dass ein Produkt einer Amplifikationsreaktion wiederum Ausgangsstoff einer erneuten Amplifikationsreaktion sein kann.
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Da die (Echtzeit)amplifikation mit der beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtung in verschiedenen voneinander getrennten fluidischen Pfaden stattfinden kann, kann man auch von einer Multiwell-(Echtzeit)amplifikation sprechen. Die Multiwell-(Echtzeit)amplifikation wird bevorzugt in einer Multiwell-Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung durchgeführt, in der eine Vielzahl von Vertiefungen (den wells) vorgesehen ist. Die Multiwell-Kammer hat bevorzugt ein Volumen im Bereich von 5 µl bis 50 µl [Mikroliter], insbesondere im Bereich von 10 µl bis 25 µl. Die Vertiefungen haben bevorzugt jeweils ein Volumen im Pico- oder Nanoliter-Bereich.
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Die Schmelzkurvenanalyse kann insbesondere ein Erwärmen von DNA umfassen. Dabei kann bei einer charakteristischen Temperatur eine fluoreszierende Substanz emittiert werden. Die charakteristische Temperatur kann beispielsweise eine Identifizierung eines DNA-Abschnitts ermöglichen. Durch Messung einer Intensität an fluoreszierendem Licht gegenüber einer (insbesondere kontinuierlich und kontrolliert gesteigerten) Temperatur kann DNA identifiziert werden. Wie auch bei der (Echtzeit)amplifikation ist für die Schmelzkurvenanalyse bevorzugt, dass Licht, das von der Probe emittiert wird, über eine gesamte Ausdehnung der Probe erfasst werden kann.
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Für die Microarray-Analyse kann insbesondere ein Microarray (d. h. eine Anordnung mit Spalten und Zeilen mit Strukturen im Bereich von Mikrometern) aus einer Vielzahl von Testzellen verwendet werden. Insbesondere können mehrere Tausend Testzellen in einem Microarray angeordnet sein. Die verschiedenen Testzellen können mit verschiedenen (bekannten) Testsubstanzen versehen werden, insbesondere durch Einsatz von automatisierten Geräten. Durch Zugabe einer Probe auf das Microarray kann es zur Hybridisierung (d. h. Anlagerung) von Bestandteilen der Probe und verschiedenen der Testsubstanzen kommen. Dabei kann es zur Emission von fluoreszentem Licht bzw. zur Freisetzung und/oder Bildung von fluoreszierenden Substanzen kommen. Auch kann die Probe mit einem Fluoreszenzmittel versehen sein, sodass die Emission von fluoreszentem Licht auf das Vorhandensein von (einem Bestandteil) der Probe in einer bestimmten Testzelle hinweist. Durch Messung, in welchen der Testzellen (d. h. durch welche der Testsubstanzen) es zur Emission von fluoreszentem Licht kommt, können Bestandteile der Probe identifiziert werden.
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Die Microarray-Analyse kann auch mit zwei oder mehr Proben gleichzeitig durchgeführt werden. Dabei kann z. B. eine erste Probe mit einem ersten Fluoreszenzmittel versetzt werden und eine zweite Probe mit einem zweiten Fluoreszenzmittel. Unterscheidet sich das Licht, das von dem ersten und dem zweiten Fluoreszenzmittel emittiert wird, in der Wellenlänge (d. h. in der Farbe), können beide Proben durch wellenlängenselektive Messung des Lichts gleichzeitig analysiert werden. Eine derartige Microarray-Analyse mit verschiedenen Proben kann beispielsweise dazu genutzt werden, zwei Proben zu vergleichen, insbesondere gesunde und kranke Zellen. Mit der beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtung kann der Vergleich innerhalb eines geschlossenen Systems stattfinden (d. h. innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung), wodurch Fehler reduziert werden können.
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Bei der Microarray-Analyse ist eine ortsaufgelöste Messung des emittierten Lichts bevorzugt, insbesondere mit einer Auflösung, die eine Auswertung der einzelnen Testzellen ermöglicht (d. h. dass ein Pixel eines Messsignals zumindest kleiner ist, als eine Testzelle). Bevorzugt ist die Auflösung mindestens so groß, dass eine Testzelle mit mindestens zehn Pixeln dargestellt werden kann.
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Die beschriebenen Analysemethoden werden bevorzugt in Kombination miteinander durchgeführt. Beispielsweise ist es bevorzugt, zunächst eine Amplifikation durchzuführen (insbesondere unter quantitativer Messung eines Vermehrungsgrades in Echtzeit) und anschließend die in vergrößerter Menge vorliegende DNA mittels Microarray-Analyse qualitativ zu untersuchen bzw. die Bestandteile der DNA in einer Probe zu identifizieren. Mit der beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtung können insbesondere die beschriebenen Analysemethoden durchgeführt werden. Dies kann insbesondere gleichzeitig oder zeitlich unmittelbar aufeinander folgend realisiert werden. Insbesondere ist die mikrofluidische Vorrichtung bevorzugt derart ausgeführt, dass der Erfassungsbereich für die Detektionseinheit einen solchen Teil der mikrofluidischen Vorrichtung umfasst, der für die (parallele) Durchführung verschiedener Analysemethoden eingerichtet und bestimmt ist.
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Mit der Detektionseinheit kann es insbesondere möglich sein, innerhalb des Erfassungsbereichs eine Gesamtintensität von emittiertem Licht zu erfassen (wie es z. B. für die (Echtzeit)amplifikation und die Schmelzkurvenanalyse erforderlich ist). Dabei bedeutet Gesamtintensität, dass das gesamte Licht, das innerhalb des Erfassungsbereichs von den Proben emittiert wird, in Summe erfasst wird. Es wird also die Lichtintensität über den Erfassungsbereich integriert. Auch kann es möglich sein, eine Intensität nicht für den gesamten Erfassungsbereich zu bestimmen, sondern nur für einen Teil davon. Dies kann insbesondere sinnvoll sein, um Licht, das von einem der fluidischen Pfade (oder von einem Teil eines der fluidischen Pfade, insbesondere z. B. von einer Reaktionskammer) emittiert wird, zu erfassen. In dem Fall ist es z. B. möglich, mit der Detektionseinheit für zwei fluidische Pfade getrennt und gleichzeitig eine (Echtzeit)amplifikation durchzuführen, wobei eine quantitative Aussage über einen Vermehrungsgrad von DNA in den jeweiligen fluidischen Pfaden erhalten werden kann. Führt man anschließend beispielsweise eine Microarray-Analyse durch (z. B. in einer Reaktionskammer, die mit Proben aus zwei ansonsten getrennten fluidischen Pfaden befüllt werden kann und die ebenfalls innerhalb des Erfassungsbereichs der Detektionseinheit angeordnet ist), so kann für die Microarray-Analyse die gleiche Detektionseinheit verwendet werden. Für die Microarray-Analyse ist eine ortsaufgelöste Erfassung von emittiertem Licht bevorzugt.
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Das bedeutet, dass zum einen bevorzugt Räume für verschiedene Prozesse vorgesehen sind (z. B. für mehrere getrennte (Echtzeit)amplifikationen und für eine Microarray-Analyse). Zum anderen ist es bevorzugt, dass eine ortsaufgelöste Erfassung von emittiertem Licht möglich ist. Die Detektionseinheit kann insbesondere dann kostengünstig ausgeführt sein, wenn entweder nur ein besonders großer Erfassungsbereich oder nur eine besonders hohe Ortsauflösung realisiert sind. Eine hohe Ortsauflösung über einen großen Erfassungsbereich kann nur unter großem (Kosten)Aufwand realisiert werden. Die beschriebene mikrofluidische Vorrichtung bietet hier den Vorteil, auf besonders kleinem Raum ausgeführt zu sein. Damit können innerhalb des Erfassungsbereichs der Detektionseinheit sowohl z. B. mehrere getrennte (Echtzeit)amplifikationen, als auch eine Microarray-Analyse durchgeführt werden, wobei die Ortsauflösung insbesondere für die Microarray-Analyse ausreichend ist. Die kann insbesondere Kosten für die Detektionseinheit einsparen (weil keine besonders hochauflösende Detektionseinheit benötigt wird) bzw. es kann auf die Verwendung einer Mehrzahl von Detektionseinheiten verzichtet werden.
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Der Erfassungsbereich weist bevorzugt eine Fläche von 200 bis 2000 mm2 [Quadratmillimeter], insbesondere im Bereich von 500 bis 1500 mm2 auf. Beispielsweise kann der Erfassungsbereich als ein Quadrat mit 30 mm mal 30 mm [Millimeter] ausgeführt sein. Die Position des Erfassungsbereichs auf der mikrofluidischen Vorrichtung kann variabel sein. Das bedeutet, dass durch Verschieben der mikrofluidischen Vorrichtung relativ zu der Detektionseinheit der Erfassungsbereich auf der mikrofluidischen Vorrichtung verschoben werden kann.
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Durch die Aufteilung in mehrere fluidische Pfade können biochemische Prozesse getrennt voneinander durchgeführt werden. Dabei können insbesondere Reaktionen zwischen verschiedenen Proben bzw. Bestandteilen einer Probe unterdrückt werden und eine robustere Prozessführung erreicht werden. Derartige Reaktionen zwischen (Bestandteilen von) Proben in verschiedenen fluidischen Pfaden können auch als Querreaktionen bezeichnet werden. Querreaktionen sind in den meisten Anwendungen unerwünscht und hinderlich. Beispielsweise können bei einem hohen Multiplex-Grad von mehr als vier Primer-Paaren (beispielsweise insbesondere von 6 bis 60 Primer-Paaren) oder bei paralleler RNA- und DNA Amplifikation ungewünschte Reaktionen auftreten.
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Auch kann durch die Aufteilung in die fluidischen Pfade eine Prozesszeit reduziert werden, insbesondere auch ohne Qualitätsverlust. Das ist beispielsweise in der Ausführungsform der Fall, in der in einem ersten der fluidischen Pfade eine RNA-Amplifikation und in einem zweiten der fluidischen Pfade eine DNA-Amplifikation stattfindet. Durch die Aufteilung der Proben in die unterschiedlichen fluidischen Pfade kann ein Komplexitätsgrad einer (chemischen bzw. biochemischen) Reaktion, insbesondere einer Multiplexreaktion reduziert werden. Dies kann Reaktions- und/oder Prozesszeiten reduzieren.
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Weiterhin kann durch die Aufteilung in die fluidischen Pfade erreicht werden, dass verschiedene Analysen zu verschiedenen Zeiten durchgeführt werden können und/oder dass zumindest die Auswertung verschiedener Analysen zu verschiedenen Zeiten erfolgen kann. So können insbesondere Analysen kombiniert werden, die unterschiedlich lange dauern. Auch können Vorab- oder Zwischenergebnisse ermittelt werden. Die Proben können nach einem Vorab- bzw. Zwischenergebnis weiterprozessiert werden. Optional können auch mehrere Vorab- bzw. Zwischenergebnisse zwischen verschiedenen Prozessschritten ermittelt werden.
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Auch können Referenz- und Zielmoleküle einer Analyse getrennt prozessiert werden. Insbesondere können die Referenz- und Zielmoleküle unter Verwendung von nur einer Wellenlänge (fluoreszierenden) Lichts analysiert werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der mikrofluidischen Vorrichtung ist die Detektionseinheit mit einer Kamera ausgeführt.
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Die Kamera kann beispielsweise als eine CCD- oder CMOS-Kamera ausgeführt sein bzw. einen CCD- oder CMOS-Chip aufweisen. Bevorzugt ist die Kamera dazu eingerichtet, ortsaufgelöst und großflächig den Erfassungsbereich der mikrofluidischen Vorrichtung zu erfassen (d. h. Licht zu detektieren, welches aus dem Erfassungsbereich ausgesendet wird, insbesondere von Proben in der mikrofluidischen Vorrichtung). Die Kamera ist insbesondere bevorzugt zur Detektion von Fluoreszenz, Chemolumineszenz und/oder Biolumineszenz eingerichtet. Bevorzugt ist die Kamera insbesondere für elektromagnetische Strahlung (d. h. insbesondere für Licht) mit Wellenlängen im Bereich von 150 bis 900 nm [Nanometer], insbesondere im Bereich von 300 bis 700 nm sensitiv.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die mikrofluidische Vorrichtung einen Einkopplungsbereich zur Einkopplung einer von einer Anregungsvorrichtung ausgesendeten Anregung in die Proben auf.
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Bei der Anregungsvorrichtung handelt es sich bevorzugt um eine Quelle für Strahlung, insbesondere elektromagnetische Strahlung. Bevorzugt ist die Anregungsvorrichtung dazu eingerichtet, elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge im Bereich von 150 bis 900 nm [Nanometer] auszusenden.
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Bevorzugt handelt es sich bei der Anregungsvorrichtung um eine Wärmequelle. Besonders bevorzugt umfasst die Anregungsvorrichtung einen Laser. Der Laser ist bevorzugt zur Fluoreszenz-Anregung (insbesondere innerhalb der Proben) eingerichtet. Die Anregungsvorrichtung ist kein Bestandteil der mikrofluidischen Vorrichtung.
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Eine Einwirkung der Anregungsvorrichtung auf die Proben ist über den (gesamten) Einkopplungsbereich möglich, wobei nicht an allen Stellen des Einkopplungsbereichs gleichzeitig eingewirkt werden muss. Der Einkopplungsbereich ist der Bereich, in dem eine Einwirkung möglich ist. Bevorzug überlappt der Einkopplungsbereich der Anregungsvorrichtung mit dem Erfassungsbereich der Detektionseinheit. Insbesondere ist es bevorzugt, dass der Einkopplungsbereich der Anregungsvorrichtung und der Erfassungsbereich der Detektionseinheit (vollständig) deckungsgleich sind.
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In einer Ausführungsform ist die Anregungsvorrichtung dazu eingerichtet, mit elektromagnetischer Strahlung einer oder mehrerer (diskreter) Wellenlängen auf die Proben in der mikrofluidischen Vorrichtung einzuwirken, bzw. dazu, eine solche elektromagnetische Strahlung in die Proben in der mikrofluidischen Vorrichtung einzukoppeln. Durch eine derartige Einwirkung bzw. Einkopplung kann insbesondere innerhalb der Proben Fluoreszenz erzeugt werden.
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Insbesondere bei der (Echtzeit)amplifikation, der Multi-well Echtzeitamplifikation und der Schmelzkurvenanalyse erfolgt bevorzugt eine Excitation, d. h. Anregung der Probe. Eine Microarray-Analyse wird bevorzugt ebenfalls unter Anregung durchgeführt. Alternativ kann eine Microarray-Analyse aber auch autofluoreszent (d. h. ohne externe Anregung) stattfinden.
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Auch ist es bevorzugt, dass die Anregung über ein Anregungslicht und insbesondere über ein Filtersystem (insbesondere zum Einstellen einer Anregungswellenlänge) erfolgt.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der mikrofluidischen Vorrichtung ist in jedem der fluidischen Pfade mindestens eine Kammer zur Aufnahme zumindest eines Teils der Probe vorgesehen.
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Bei der Kammer kann es sich beispielsweise um eine Prozess- oder Reaktionskammer zur Durchführung einer (bio)chemischen Reaktion, eine Amplifikationskammer zur Durchführung einer (Echtzeit)Amplifikation, eine Detektionskammer zur Messung (insbesondere von Fluoreszenz und insbesondere mittels der Detektionseinheit), eine Mischkammer zum Vermischen einer Probe mit einer (Test)substanz und/oder eine Lagerkammer zum (Zwischen)lagern einer Probe, eines Reaktions(zwischen)produkts oder einer (Test)Substanz handeln. Auch kann eine Kammer für mehrere verschiedene Zwecke zeitgleich oder nacheinander genutzt werden. Jede der Kammern kann in eine Vielzahl von Zellen unterteilt sein, um ein Microarray für eine Microarray-Analyse zu bilden.
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In einer Ausführungsform ist eine Amplifikationskammer (d. h. eine Kammer, in der eine Amplifikation stattfinden kann) für eine DNA- und/oder RNA-Amplifikation so angeordnet, dass die gesamte Amplifikationskammer oder zumindest ein repräsentativer Teil davon (z. B. mit einer Größe von 2 mm mal 2 mm [Millimeter]) im Erfassungsbereich der Detektionseinheit liegt. Somit können direkt in der Amplifikationskammer eine Schmelzkurvenanalyse oder eine (Echtzeit)amplifikation durchgeführt und erfasst werden. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die mindestens zwei fluidischen Pfade derart angeordnet sind, dass Amplifikationskammern aller Pfade zugleich im Erfassungsbereich der Detektionseinheit angeordnet sind.
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Auch bevorzugt ist die Ausführungsform, bei der eine Detektionskammer an eine Amplifikationskammer (strömungstechnisch) angeschlossen ist, sodass eine Probe aus der Amplifikationskammer in die Detektionskammer transferiert werden kann. Insbesondere ist bevorzugt, dass die Detektionskammer innerhalb des Erfassungsbereichs der Detektionsvorrichtung liegt.
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Es ist bevorzugt, dass die Kammern insbesondere zwischen 25°C und 100°C temperiert werden können, bevorzugt sogar zwischen 15°C und 100°C. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die Kammern einzeln auf unabhängige Temperaturen gebracht werden können. Zum Kühlen und/oder Heizen der Kammern sind bevorzugt Kühlmittel und/oder Heizmittel vorgesehen. Bei den Heizmitteln kann es sich beispielsweise um Heizdrähte zur Erzeugung resistiver Wärme oder um Strahlungsquellen zur Erzeugung radiativer Wärme handeln. Bei den Kühlmitteln kann es sich beispielsweise um Kühlleitungen für ein Kühlmedium handeln.
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Die Kammern sind bevorzugt innerhalb einer gemeinsamen Ebene angeordnet. Alternativ ist es bevorzugt, dass die Kammern in mehreren Ebenen angeordnet sind, die insbesondere parallel zu dem Erfassungsbereich (bzw. einer Oberfläche der mikrofluidischen Vorrichtung) angeordnet sind.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die mikrofluidische Vorrichtung weiterhin eine Endkammer auf, die mit den mindestens zwei fluidischen Pfaden verbunden ist. Auch die Endkammer kann in eine Vielzahl von Zellen unterteilt sein, um ein Microarray für eine Microarray-Analyse zu bilden.
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Bei der Endkammer kann es sich beispielsweise um eine Prozess- oder Reaktionskammer zur Durchführung einer (bio)chemischen Reaktion, eine Amplifikationskammer zur Durchführung einer (Echtzeit)Amplifikation, eine Detektionskammer zur Messung (insbesondere von Fluoreszenz und insbesondere mittels der Detektionseinheit), eine Mischkammer zum Vermischen einer Probe mit einer (Test)substanz und/oder eine Lagerkammer zum (Zwischen)lagern einer Probe, eines Reaktions(zwischen)produkts oder einer (Test)Substanz handeln. Auch kann die Endkammer für mehrere verschiedene Zwecke zeitgleich oder nacheinander genutzt werden. Bevorzugt ist auch, dass die Endkammer als die weiter vorne beschriebene Multiwell-Kammer ausgeführt ist.
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Die Endkammer ist bevorzugt derart mit den mindestens zwei fluidischen Pfaden verbunden, dass die Proben aus den fluidischen Pfaden in die Endkammer geleitet und dort vermischt werden können. Es ist bevorzugt, das mit Ausnahme einer indirekten Verbindung der fluidischen Pfade über die Endkammer keine Verbindung zwischen den fluidischen Pfaden besteht (dass diese also voneinander getrennt sind).
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In der Endkammer ist bevorzugt ein Microarray vorgesehen. Bevorzugt liegt die Endkammer vollständig innerhalb des Erfassungsbereichs der Detektionseinheit. Alternativ liegt zumindest das Microarray (vollständig) innerhalb des Erfassungsbereichs.
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In einer Ausführungsform ist eine (Echtzeit)Amplifikation (z. B. in Form einer real-time PCR) einer Microarray-Analyse vorgeschaltet. Dabei kann die (Echtzeit)Amplifikation in einem oder mehreren der fluidischen Pfade (insbesondere getrennt voneinander) durchgeführt werden, während die Microarray-Analyse bevorzugt in der Endkammer durchgeführt wird. Dafür kann das Reaktionsprodukt bzw. die Reaktionsprodukte der (Echtzeit)Amplifikation mit einem Hybridisierungspuffer vermischt werden, in die Endkammer (die hier als Analysekammer dient) gepumpt werden und in der Endkammer hybridisiert werden. Dieses Vorgehen hat den Vorteil, dass über die (Echtzeit)Amplifikation, sowohl quantitative Informationen generiert werden können, als auch über die Detektion auf dem Microarray eine Multiplex-Detektion durchgeführt werden kann.
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Die mikrofluidische Umsetzung in den fluidischen Pfaden, die in der Endkammer enden, kann eine flächendichte Umsetzung in mehreren voneinander getrennten Bereichen (insbesondere innerhalb verschiedener Kammern) insbesondere innerhalb des Erfassungsbereichs der Detektionseinheit ermöglichen.
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Als weiterer Aspekt wird ein Verfahren zur Analyse von Proben unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung wie beschrieben vorgestellt, umfassend zumindest die Analyse von Nukleinsäuren nach mindestens zwei verschiedenen Analysemethoden, wobei jeweils verschiedene Analysemethoden in verschiedenen fluidischen Pfaden der Vorrichtung durchgeführt werden.
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Die weiter vorne beschriebenen besonderen Vorteile und Ausgestaltungsmerkmale der mikrofluidischen Vorrichtung sind auf das beschriebene Verfahren anwendbar und übertragbar, und umgekehrt.
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Dass das Verfahren zumindest die Analyse von Nukleinsäuren nach mindestens zwei verschiedenen Analysemethoden umfasst, bedeutet, dass mindestens zwei Analysemethoden durchgeführt werden, was nacheinander oder (zumindest teilweise) gleichzeitig erfolgen kann. Auch können die mindestens zwei verschiedenen Analysemethoden an verschiedenen Stellen oder (zumindest im Falle der nacheinander durchgeführten Analysemethoden) an einer einzigen Stelle der mikrofluidischen Vorrichtung durchgeführt werden. Weiterhin können die mindestens zwei verschiedenen Analysemethoden mit der gleichen Probe (bzw. mit dem gleichen Teil einer Probe) oder aber auch mit verschiedenen Proben durchgeführt werden. Im letzten Fall ist es bevorzugt, dass es eine Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Proben gibt. Das kann beispielsweise bedeuten, dass zwei Proben zunächst getrennt voneinander jeweils nach einer Analysemethode behandelt werden, wobei anschließend eine gemeinsame Analyse durchgeführt wird, wozu die beiden Proben vermischt werden.
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Bevorzugt wird eine Probe auf eine Mehrzahl der fluidischen Pfade aufgeteilt. Alternativ ist es bevorzugt, mehrere verschiedene Proben in den verschiedenen fluidischen Pfaden getrennt aufzunehmen. Auch ist es bevorzugt, eine erste Probe auf eine erste Mehrzahl der fluidischen Pfade aufzuteilen und eine zweite Probe in einem weiteren fluidischen Pfad aufzunehmen oder auf eine zweite Mehrzahl von fluidischen Pfaden zu verteilen.
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Durch die Ausbildung der mikrofluidischen Vorrichtung mit zwei Pfaden ist es möglich, zwei Analysemethoden, mit zwei verschiedenen Proben, mit einer mikrofluidischen Vorrichtung durchzuführen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens sind die mindestens zwei Analysemethoden aus der folgenden Gruppe ausgewählt:
- - (Echtzeit)amplifikation,
- - Endpunkt-Amplifikation
- - Schmelzkurvenanalyse und
- - Mikroarray-Analyse.
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Bei der (Echtzeit)amplifikation handelt es sich bevorzugt um eine Polymerase Chain Reaction (PCR). Unter Endpunkt-Amplifikation ist insbesondere eine Amplifikation zu verstehen, bei der in einer späten Phase oder am Endpunkt der Amplifikation eine Messung der Amplifikation stattfindet. Als Endpunkt-Amplifikation ist eine Endpunkt-PCR bevorzugt.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird zumindest ein Teil der Probe zwischen mindestens zwei Kammern mit unterschiedlichen Temperaturen alternierend gepumpt, so dass der Teil der Probe einen thermischen Zyklus durchläuft.
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Besonders bevorzugt ist, wenn mindestens zwei Proben in einer Endkammer zusammengeführt werden, welche mit den mindestens zwei fluidischen Pfaden der Vorrichtung verbunden ist. Besonders bevorzugt werden die mindestens zwei Proben in der Endkammer miteinander vermischt. Weiter bevorzugt ist, wenn in der Endkammer eine Mikroarray-Analyse mit den vermischten Proben durchgeführt wird.
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Bei einem solchen Verfahren können in den beiden Pfaden jeweils Verfahren mit den reinen, nicht vermischten Proben durchgeführt werden. In der Endkammer kann dann zusätzlich eine abschließende Analyse der vermischten Probe erfolgen.
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Die Reaktionsmischung (d. h. die Proben, zu denen ggf. weitere Substanzen zugegeben wurden) werden in dieser Ausführungsform bevorzugt zwischen zwei (oder auch mehr) verschiedenen Kammern hin- und hergepumpt, d. h. zyklisch von einer ersten Kammer in eine zweite Kammer, von der zweiten Kammer in die erste Kammer usw. Dabei kann die Reaktionsmischung thermisch zyklisiert werden, indem die erste und die zweite Kammer auf verschiedenen Temperaturen gehalten werden. Dieses Vorgehen kann ein besonders schnelles thermisches Zyklisieren ermöglichen, weil nur die Temperatur der Reaktionsmischung verändert wird, während die Umgebung, d. h. die mikrofluidische Vorrichtung und insbesondere die Reaktionskammern, auf (verschiedenen) konstanten Temperaturen gehalten werden können. Würde die Reaktionsmischung in einer einzelnen Reaktionskammer thermisch zyklisiert, müsste neben der Temperatur der Reaktionsmischung auch die Temperatur der Reaktionskammer (d. h. insbesondere von Wänden der Reaktionskammer) ebenfalls zyklisiert werden. Dies kann einen größeren Zeitaufwand bedeuten.
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Die am thermischen Zyklisieren beteiligten Kammern sind bevorzugt innerhalb des Erfassungsbereichs der Detektionseinheit angeordnet. Dadurch kann zwischen einzelnen Zyklen eine (Zwischen)Messung über die Detektionseinheit stattfinden. Eine (Zwischen)Messung kann auch innerhalb eines Auslesezyklus zwischen zwei thermischen Zyklen stattfinden. Bevorzugt wird die Kammer, in der sich die Reaktionsmischung im Auslesezyklus befindet, zumindest für einen Teil der Dauer des Auslesezyklus extern angeregt (z. B. durch einen Laser). Dadurch kann die Aussendung eines Fluoreszenzsignals angeregt werden, welches durch die Detektionseinheit erfasst werden kann.
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Als weiterer Aspekt wird ein System vorgestellt, umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung wie beschrieben, eine Detektionseinheit und bevorzugt weiterhin eine Anregungsvorrichtung.
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Die weiter vorne beschriebenen besonderen Vorteile und Ausgestaltungsmerkmale der mikrofluidischen Vorrichtung und des Verfahrens sind auf das beschriebene System anwendbar und übertragbar.
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Die Erfindung und das technische Umfeld werden nachfolgend anhand der Figuren näher erläutert. Die Figuren zeigen besonders bevorzugte Ausführungsbeispiele, auf die die Erfindung jedoch nicht begrenzt ist. Insbesondere ist darauf hinzuweisen, dass die Figuren und insbesondere die dargestellten Größenverhältnisse nur schematisch sind. Es zeigen schematisch:
- 1: eine mikrofluidische Vorrichtung zur Analyse von Proben und
- 2: ein System umfassend insbesondere die mikrofluidische Vorrichtung aus 1.
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1 zeigt eine Schnittansicht einer mikrofluidischen Vorrichtung 1 zur Analyse von Proben. Die mikrofluidische Vorrichtung 1 umfasst einen ersten fluidischen Pfad 2 und einen zweiten fluidischen Pfad 3 zur Aufnahme von Proben. Außerdem umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 1 einem Erfassungsbereich 11 für eine (in 2 dargestellte) Detektionseinheit 4 zur Messung von Licht, welche dazu eingerichtet ist, emittiertes Licht von Proben in den beiden fluidischen Pfaden 2, 3 zu erfassen. Der Erfassungsbereich 11 ist durch gestrichelte Linien dargestellt. In dem ersten fluidischen Pfad 2 ist eine erste Kammer 8 zur Aufnahme zumindest eines Teils der Probe vorgesehen. In dem zweiten fluidischen Pfad 3 ist eine zweite Kammer 9 zur Aufnahme zumindest eines Teils der Probe vorgesehen.
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Die mikrofluidische Vorrichtung 1 weist weiterhin einen Einkopplungsbereich 12 auf zur Einkopplung einer von einer (in 2 gezeigten) Anregungsvorrichtung 6 ausgesendeten Anregung in die Proben. Der Einkopplungsbereich 12 ist durch gepunktete Linien dargestellt. Der Einkopplungsbereich 12 überlappt teilweise den Erfassungsbereich 11.
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Außerdem weist die mikrofluidische Vorrichtung 1 eine Endkammer 10 auf, die sowohl mit dem ersten fluidischen Pfad 2, als auch mit dem zweiten fluidischen Pfad 3 verbunden ist.
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Die mikrofluidische Vorrichtung 1 kann beispielsweise dazu genutzt werden, zwei verschiedene Proben, die jeweils zu analysierende DNA enthalten, im ersten fluidischen Pfad 2 und im zweiten fluidischen Pfad 3 zunächst getrennt voneinander zu prozessieren. Beispielsweise kann in der ersten Kammer 8 und in der zweiten Kammer 9 eine (Echtzeit)amplifikation durchgeführt werden. Diese kann quantitativ durch die Detektionseinheit 4 erfasst werden, weil der Erfassungsbereich 11 die erste Kammer 8 und die zweite Kammer 9 vollständig umfasst. Anschließend können die Proben in der Endkammer 10 weiter prozessiert werden. Dazu kann beispielsweise ein Microarray in der Endkammer 10 vorgesehen sein. Eine Microarray-Analyse in der Endkammer 10 kann ebenfalls mit der Detektionseinheit 4 durchgeführt werden, weil auch die Endkammer 10 innerhalb des Erfassungsbereichs 11 liegt. Über die Anregungsvorrichtung 6 können die Proben angeregt werden. Dabei ist eine Anregung in der ersten Kammer 8, in der zweiten Kammer 9 und in der Endkammer 10 jeweils zum Teil möglich, weil der Einkopplungsbereich 11 die jeweiligen Kammern jeweils teilweise umfasst.
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2 zeigt ein System 13 umfassend die mikrofluidische Vorrichtung 1 aus 1, eine Detektionseinheit 4 und eine Anregungsvorrichtung 6. Die Detektionseinheit 4 ist mit einer Kamera 5 ausgeführt. Die Anregungsvorrichtung 6 ist mit einem Laser 7 ausgeführt.
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Mittels der Detektionseinheit 4 bzw. mittels der Kamera 5 kann Licht erfasst werden, das von Proben innerhalb des Erfassungsbereichs 11 der mikrofluidischen Vorrichtung emittiert wird. Durch gepunktete Linien ist angedeutet, welchen Bereich die Kamera 5 abdecken kann. Der Erfassungsbereich 11 ist auf der Oberfläche der mikrofluidischen Vorrichtung 1 zwischen den gepunkteten Linien ausgebildet.
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Mittels der Anregungsvorrichtung 6 bzw. mittels des Lasers 7 kann auf die mikrofluidische Vorrichtung 1 bzw. auf eine darin befindliche Probe eingewirkt werden. Dies ist durch eine gestrichelte Linie angedeutet. Bevorzugt kann die Anregungsvorrichtung 6 derart verstellt werden, dass eine Anregung an jeder Stelle des (insbesondere des gesamten) Erfassungsbereichs 11 möglich ist. Alle mit dem Laser 7 erreichbaren Stellen der Oberfläche der mikrofluidischen Vorrichtung 1 gemeinsam bilden den (nur in 1 dargestellten) Einkopplungsbereich 12. Die Anregung durch die Anregungsvorrichtung 6 kann zeitlich begrenzt stattfinden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102011078770 A1 [0002]
- DE 102010031212 A1 [0003]
