WO2010063683A1 - Real-time-pcr mittels gigahertz- oder terahertz-spektrometrie - Google Patents

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WO2010063683A1
WO2010063683A1 PCT/EP2009/066081 EP2009066081W WO2010063683A1 WO 2010063683 A1 WO2010063683 A1 WO 2010063683A1 EP 2009066081 W EP2009066081 W EP 2009066081W WO 2010063683 A1 WO2010063683 A1 WO 2010063683A1
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pcr amplification
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PCT/EP2009/066081
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Tanja Danker
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Dritte Patentportfolio Beteiligungsgesellschaft Mbh & Co. Kg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • PCR amplifications in general are widely used in the amplification and analysis of DNA or RNA sequences found in many biological systems, but can also be used in principle with artificially engineered polynucleotide sequences.
  • the method described here relates to a spectroscopic real-time detection in a PCR amplification.
  • This refers both to evidence during the course of all reaction steps of a PCR amplification, as well as to appropriate evidence before and after.
  • substances used in preliminary steps prior to the execution of the actual PCR reaction steps for the replication of polynucleotide sequences can be examined qualitatively and quantitatively by means of spectroscopic detection.
  • spectroscopic examination steps can also be carried out during the PCR amplification, and even if the PCR amplification itself has already ended.
  • PCR amplifications are typically used to amplify relatively short and clearly-defined polynucleotide sequences as compared to the human genome. In contrast to living organisms, PCR amplification can only ensure the amplification of polynucleotide sequences of a few thousand base pairs per sequence. To carry out a PCR amplification, it first requires the preparation of a PCR solution which, in addition to a buffer solution as a suitable chemical environment, has a number of further starting substances necessary for the course of a PCR amplification.
  • These starting substances typically include an original polynucleotide sequence to be amplified, primers to define a start and an end portion of the polynucleotide sequence to be amplified, a corresponding polymerase to replicate the portion defined by the primers, and deoxynucleoside triphosphates, which are the building blocks of the replicated polynucleotide sequence.
  • a PCR solution may also contain a number of other functional components which allow, for example, to increase or optimize the progress of PCR amplification in terms of effectiveness.
  • a PCR amplification consists of a repetitive sequence of PCR reaction steps, as can be carried out in laboratory thermal cyclers. Each repeat includes the three PCR reaction steps of denaturation, primer hybridization and elongation. Denaturation initially melts double-stranded polynucleotide sequences, heating the PCR solution to a temperature of about 95 ° C to dissolve the hydrogen bonds that hold the two single-stranded polynucleotide sequences together. The temperature level is maintained until it is ensured that only single-stranded polynucleotide sequences are present in the PCR solution. In the PCR reaction step of primer hybridization, the temperature is typically held for a few seconds at a level which allows specific attachment of the primer to the polynucleotide sequence.
  • the designated temperature level is normally a few 0 C below the melting point of the resulting by the specific attachment primer sequences, and usually corresponds to a temperature between 55 ° C to 65 ° C.
  • the annealing of the primers to the predetermined sites of the polynucleotide sequence is complete, filling in the PCR reaction step of elongation by the missing strands or building blocks on free nucleotides under the action of the polymerase.
  • the primer forms the beginning of a new single strand, which is replicated piece by piece.
  • the temperature to be set during this PCR reaction step will depend on the labor optimum of the polymerase used in each case, but is typically at 10 0 C to 15 ° C above the temperature level of primer hybridization.
  • Real-time quantitative PCR a refinement of PCR amplification known in the art, performs PCR amplification to replicate polynucleotide sequences while providing a means of quantifying the polynucleotide sequences so obtained.
  • the quantification is based on the execution of fluorescence measurements that are made during the course of the PCR amplification.
  • the detected fluorescence signal increases in proportion to the amount of replicated polynucleotide sequences.
  • the real-time quantitative PCR allows a quantitative evaluation of the polynucleotide sequences which are replicated in the PCR amplification still during their amplification.
  • the real-time quantitative PCR requires fluorescent dyes or so-called fluorescence markers, which interact chemically or physically with the replicated polynucleotide sequences, and as a result change their own fluorescence behavior. Accordingly, the increase in the intensity of a detected fluorescence signal after the repeating PCR reaction steps correlates with a corresponding increase in replicated polynucleotide sequences. For example, detection of the course of PCR amplification via measured fluorescence signals may rely on the use of simple fluorescent dyes that bind relatively non-specifically to the polynucleotide sequence to be replicated.
  • Another commonly used fluorescent dye is ethidium bromide.
  • fluorescence markers such as FRET probes, Lightcycler probes, TaqMan probes, molecular beacons, Scorpion primers or Luxprimer® are also used, which indeed permit specific binding to individual sites of the polynucleotide sequence and consequently have narrowly defined fluorescence properties, but are comparatively more expensive.
  • molecular beacons are relatively complex structures which additionally require optimized and therefore expensive primers for carrying out the PCR amplification. Furthermore, such complex structures make it difficult to optimize the PCR reaction conditions and thus promote a relatively inefficient amplification of the polynucleotide sequences as well as the preparation of many unwanted by-products.
  • WO 03/102238 A2 proposes a method for detecting the representation of contiguous nucleic acid molecules in a PCR solution, and also an arrangement to carry out the said method.
  • the method comprises the provision of PCR starting materials in a chamber, as well as performing the repetitive PCR reaction steps of denaturation, primer hybridization and elongation.
  • the imaging of contiguous nucleic acid molecules is carried out by the irradiation of UV light into the PCR solution and the subsequent detection of the absorbed light intensity.
  • the PCR solution is in this case taken up by a chamber adapted for carrying out a PCR amplification, into which the light energy of the UV light source is irradiated.
  • WO 03/102238 A2 makes the use of fluorescent labels unnecessary, this method is very susceptible to interference with respect to individual components of the PCR solution or with respect to remaining residues from reaction steps of previous isolation reactions, eg , As phenols.
  • a further disadvantage of the quantitative determination by means of UV absorption can also be seen in the fact that only single-stranded of double-stranded nucleic acid molecules can be distinguished to a limited extent, and consequently only very unspecific detection capability for polynucleotide sequences is available.
  • WO 2008/109706 A1 describes the use of terahertz spectroscopy in a great variety of types. The detection of double-stranded and single-stranded DNA is also described. A real-time method for the detection of the PCR product is described in this document in any way.
  • WO 2006/064192 A1 describes a band filter in the terahertz range. A method for the detection of nucleic acid molecules is not described in this document.
  • US 2006/0216742 describes a method and system for detecting biomolecular binding events using gigahertz or terahertz radiation.
  • WO 03/100396 A1 discloses a method for detecting the specificity of a ligand to a biological sample.
  • DE 100 54 476 A1 describes a method for the detection of polynucleotide sequences, in which the refractive index or an equivalent size of the sample in contact with the test medium is determined by interaction with incident electromagnetic radiation.
  • WO 2004/024949 A2 describes a method for the rapid detection of mutations and nucleotide polymorphisms using spectral data.
  • terahertz radiation will detect the presence of biomolecular bonding of two molecules by emitting terahertz radiation from a source and detecting it by a detector after irradiation of a sample comprising the molecules.
  • the disclosed method does not permit the quantification of employed amounts of the molecules, and thus is unsuitable for use in real-time detection in a PCR amplification.
  • the object is achieved by a method for quantitative and spectroscopic real-time detection of nucleic acid molecules, in particular of polynucleotide tidsequenzen in a PCR amplification, the PCR amplification providing the necessary for the preparation of a PCR solution starting materials in a Buffer solution and the repetitive PCR reaction steps of denaturation, the primer hybridization and the elongation comprises, and wherein irradiated during defined PCR amplification at defined times from a radiation source electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime in the PCR solution to detect by means of a detector in a quantitative real-time detection at least the presence or absence of a polynucleotide sequence.
  • the object is achieved by a method for quantitative and real-time spectroscopic detection of nucleic acid molecules, in particular of polynucleotide sequences, in a PCR amplification, the PCR amplification providing the necessary for the preparation of a PCR solution starting substances in a buffer solution and the repetitive PCR reaction steps of denaturation, primer hybridization and elongation, and wherein during PCR amplification at defined times from a radiation source electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime in the PCR solution is irradiated to detect by means of a detector in a real-time detection at least the presence or absence of a polynucleotide sequence, and wherein the reaction step of the denaturation is effected by Tera-Hertz radiation from the radiation source.
  • a PCR arrangement for the quantitative spectroscopic real-time detection of polynucleotide sequences in a PCR amplification, wherein a substrate with a receiving area for a PCR solution consisting of the necessary starting substances and a buffer solution, temperature change means, by means of which the PCR solution can be heated to predetermined temperatures and / or cooled to the repeating PCR reaction steps of Denaturation, primer hybridization or elongation, a source of radiation to radiate electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime into the PCR solution, and a detector to quantitatively transmit radiation transmitted through the PCR solution to detect spectroscopically.
  • a central idea of the present methods and the PCR arrangement according to the invention is the execution of a PCR amplification and a spectroscopic real-time detection in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime of the electromagnetic spectrum.
  • radiations are between 100 gigahertz and 20 terahertz, in particular between 300 gigahertz and 10 terahertz.
  • These radiation frequencies are suitable for excitation of specific excitation states (typically vibrational vibrational modes) of single-stranded and double-stranded polynucleotide sequences. Excitation states of individual functional groups of these polynucleotide sequences are thus correlated to a predetermined frequency of the electromagnetic radiation and can be detected in absorbance measurements.
  • extinction measurements generally refer to all spectroscopic detections, including quantitative ones, which relate parts of the light intensity irradiated into the PCR solution to parts of the light intensity emerging from it and detected by a detector in order to draw conclusions about substances and structures to be detected Allow PCR solution.
  • excitation modes excitation frequencies
  • excitation frequencies are also characteristic of the chemical bonding states of these functional groups, and may be accompanied by a change in the binding state with a change in the electromagnetic excitation frequency.
  • excitation modes can be detected whose occurrence is characteristic of the presence of hydrogen bonds between the two single-stranded polynucleotide sequences in a double-stranded polynucleotide sequence. Accordingly, by means of extinction measurements in this designated frequency range, quantitative statements can be made as to whether a mixture of single-stranded or double-stranded polynucleotide sequences is present in a PCR solution.
  • Electromagnetic radiation in the Giga-Hertz and Tera-Hertz regime are typically able to cause only vibratory excitations and thus hardly interfere with the chemical reaction environment in a PCR solution in practical terms.
  • the radiation frequency of Giga-Hertz and Tera-Hertz radiation is suitable for detecting hybridization states of co-pendant nucleic acid molecules or polynucleotide sequences, respectively.
  • detections according to the method according to the invention can detect the presence of individual hybridization states, in particular the presence of single-stranded and double-stranded polynucleotide sequences.
  • This quantitative detection which is sometimes decisive for carrying out a PCR amplification, allows conclusions to be drawn regarding the progress and the quality of the reaction steps taking place in the PCR solution and thus an increase in the efficiency of the PCR amplification in general.
  • the radiation source used for the spectroscopic real-time detection can also be used to bring about the reaction step of denaturation in the PCR amplification by electromagnetic radiation.
  • the radiated frequency range is quite suitable for melting the hydrogen bonds between the two single strands in a double-stranded polynucleotide sequence, without having to add thermal energy directly to the entire system of the PCR solution.
  • the denaturing reaction step there is no need to raise the temperature of a PCR solution to cause the melting of chemical bonds between individual strands of a polynucleotide sequence.
  • the radiation source melts double-stranded polynucleotide sequences without the PCR solution itself having to undergo a strong temperature change.
  • Such a method thus shortens the necessary for the repetitive PCR reaction steps heating and cooling phases of the PCR solution and allows a temporally faster representation of a desired amount of polynucleotide sequences to be amplified.
  • the starting substances necessary for the preparation of a PCR solution are contained in a buffer.
  • no chemical or physical detection markers, in particular no fluorescence markers are markers which are added as unnecessary starting substances for the preparation of a PCR solution described above, in order to be able to detect the preparation of polynucleotide sequences in a measuring method which is known from the prior art.
  • the PCR solution provided for the method according to the invention can consequently be limited to the necessary starting substances, such as are necessary for ordinary PCR amplification without real-time detection. On the one hand, possible interferences of a chemical and physical nature in the process of PCR amplification are thus reduced, and at the same time the controllability of the reaction conditions is increased.
  • the intensity of the irradiated electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime is selected such that it penetrates a predetermined layer thickness of the PCR solution.
  • the layer thickness can relate either to the entire sample cross section, which is penetrated by the irradiated electromagnetic radiation, or else only to a partial region of the sample cross section.
  • the layer thickness is suitable for detecting an extinction signal upon irradiation of a given radiation intensity and the presence of a number of polynucleotide sequences above a certain detection threshold.
  • the extinction signal which results from attenuation of the electromagnetic radiation intensity, may result from absorption, scattering, diffraction, and reflection, for example.
  • the irradiated layer thickness is constant and the irradiated electromagnetic radiation is immutable in its intensity, it is possible to deduce the amount of polynucleotide sequences shown, for example, if the extinction cross section of the polynucleotide sequences is known.
  • the frequency of the irradiated electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime is between 100 GHz and 20 THz, in particular between 300 GHz and 10 THz. These frequency ranges cover the spectroscopically easily detectable excitation frequencies of most polynucleotide sequences and thus allow the excitation vibrations to be detected spectroscopically, in particular spectroscopically quantitatively.
  • the buffer solution of the PCR solution with respect to a frequency of the radiated electromag- is selected in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime so that the radiation intensity after transmission of a predetermined layer thickness of the PCR solution with the detector can be detected largely unattenuated.
  • the buffer solution itself is thus selected with respect to the electromagnetic radiation frequencies used so that the irradiated electromagnetic radiation of predetermined frequency ranges undergoes the greatest possible transmission.
  • this is characterized in that the PCR solution is applied to a substrate, in particular in a predetermined receiving area of the substrate, which is largely transparent to the radiated electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime is.
  • a receiving area may be formed by a limited volume, or merely as a surface for applying a PCR solution.
  • the substrate itself may be a mineral substrate, for example glass, or else a plastic substrate. If the substrate itself is largely transparent to the incident electromagnetic radiation, it causes only a small proportion of the extinction signal detected in the spectroscopic real-time detection method.
  • the substrate if it is a plastic, can be adapted by the selection of a suitable plastic to the useful frequency range of the irradiated electromagnetic radiation in order to bring about the lowest possible attenuation of the radiation intensity.
  • the substrate comprises at least one electromagnetic radiation waveguide in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime.
  • This waveguide can on the one hand serve as a radiation guiding means and at the same time as a substrate with a possible receiving area for the PCR solution. Accordingly, the irradiation of electromagnetic radiation into the PCR solution can be done locally in a well-controlled manner. In addition, the scattered radiation or loss radiation, as occurs in conventional collimation and focusing methods, can be reduced and the spectroscopic real-time detection can be improved. Particularly advantageously, a waveguide can be used if the predetermined receiving area for the PCR solution is located in an area which is penetrated by the evanescent radiation field of the waveguide. Detection of the polynucleotide sequences thus takes place with electromagnetic radiation which is guided on the one hand through the waveguide but on the other hand communicates with regions of the surface outside the waveguide.
  • further temperature-changing means are provided, by means of which the PCR solution can be heated to predetermined temperatures and / or cooled.
  • Such temperature change agents may either directly or indirectly heat or cool the PCR solution.
  • a direct increase in temperature can be based, for example, on direct radiant heating or resistance heating.
  • Cooling can be effected, for example, by suitably arranged Peltier elements or else by a cooling medium, for example air, which is in communication with a heat exchanger.
  • the temperature change means ensure that the fastest possible and exact change of the temperatures necessary for the individual PCR reaction steps is made possible.
  • the temperature-changing means heat and / or cool a heat medium which indirectly heats and / or cools the PCR solution via the substrate.
  • the heat capacity of the substrate itself is low and the thermal conductivity is as large as possible.
  • the heat medium can interact in a planar manner, or else penetrate it in guide means provided for this purpose, for example in channels.
  • electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime from the radiation source into the PCR solution before and / or after a step of denaturation, and / or the primer hybridization and / or the elongation is radiated. Accordingly, the initial conditions and reaction successes can be checked by means of spectroscopic detection after each of the reaction steps taking place in the PCR amplification. Should it prove, for example, that the starting conditions for a subsequent PCR reaction step are unfavorable, appropriate changes in the reaction conditions, for example in the choice of temperature, can be made in order to bring about improved success.
  • the electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Terahertz regime can be irradiated during the PCR amplification reaction steps of denaturation, primer hybridization or elongation, for example, to draw conclusions on the temporal binding behavior of individual molecular building blocks ,
  • the frequency of the electromagnetic radiation is selected to excite defined vibratory excitation modes of single- and / or double-stranded polynucleotide sequences in order to detect these, in particular the modes characteristic of the presence of hybridization states of double-stranded polynucleotide sequences.
  • the presence of certain molecular structures of the polynucleotide sequences can be detected by which the quality of the PCR amplification process can be verified and detected.
  • termination of the PCR amplification can also be initiated after detection of the polynucleotide sequences.
  • a conclusion on the structure of the polynucleotide sequences, in particular on their hybridization state can also be obtained by detecting the shift in the excitation frequency of defined excitation modes.
  • temporally preceding proofs by means of the electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime are taken into account during the PCR amplification as a background for subsequent detection in the analysis of the evidence.
  • the time-preliminary evidence may be subtracted from subsequent evidence for background subtraction, which is indispensable in absorbance measurements, either directly, averaged, or filtered. This for obtaining quantitative results
  • the necessary step of the subsoil subtraction thus requires no further prior knowledge of the specific extinction behavior of the PCR arrangement, but allows a good background determination in a timely manner.
  • electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime is generated from the radiation source prior to performing a PCR amplification in a solution of starting substances to be used in the PCR amplification irradiated to determine chemical or physical properties of individual starting materials, in particular their quality, specificity and their binding behavior, by means of spectroscopic evidence.
  • quality or specificity and their binding behavior quality of the polynucleotide sequences, primer binding, primer specificity, amounts of amplification
  • this separate verification can be dispensed with, and the physical and chemical properties of individual starting substances can be determined directly by means of a PCR arrangement according to the invention.
  • the primers typically used in PCR amplifications are designed for use in ordinary PCR assemblies without spectroscopic real-time detection, and require use in a PCR array with real-time spectroscopic detection based on the use of Fluoreszenzmarken a new optimization of the reaction conditions for the primer-containing PCR solution with fluorescent markers.
  • reaction vessels used in fluorescence measurements in the UV regime due to contamination, such as fingerprints, can easily give rise to erroneous measurements and this can sometimes result in incorrect absorption values.
  • Electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Te Because of the longer wavelength, the ra-Hertz regime is much less sensitive to such contamination of the reaction vessels as well as the buffer solution components.
  • according to the present method eliminates the use of spoiled or inaccurately prepared fluorescent dyes as a possible source of error for spectroscopic detection.
  • 1 is a flowchart for illustrating the time sequence of individual
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the extinction behavior of a PCR solution in the course of a PCR amplification at radiation frequencies which coincide with excitation states of predetermined polynucleotide sequences in a PCR solution;
  • FIG. 3 shows a partial view of a schematic representation of a second embodiment of the PCR arrangement according to the invention.
  • FIG. 4 shows a partial view of a third embodiment of a PCR arrangement according to the invention.
  • FIG. 5 shows a partial view of a fourth embodiment of a PCR arrangement according to the invention.
  • FIG. 6 shows a partial view of a fifth embodiment of a PCR arrangement according to the invention.
  • FIG. 7 shows a sixth embodiment of a PCR arrangement according to the invention, which is based on the partial view of the fourth embodiment shown in FIG. 5; 8 shows a schematic representation of the extinction behavior of a buffer solution used for producing a PCR solution and of a polynucleotide sequence in the frequency regime of the Giga-Hertz and / or Tera-Hertz regime.
  • FIG. 1 shows a schematic flow diagram of the typical sequence of an embodiment of the method according to the invention for the spectroscopic real-time detection of polynucleotide sequences 10 in a PCR amplification.
  • a buffer solution 13 in which the starting substances necessary for the preparation of a PCR solution are taken up or dissolved.
  • Necessary starting materials 12 are the polynucleotide sequence 10 to be replicated, suitable primers, a polymerase, and deoxynucleoside triphosphates for synthesizing polynucleotide sequences.
  • the quality, specificity and the formation behavior of individual starting substances 12 can be determined in a spectroscopic real-time detection.
  • Spectroscopic real-time proofs can thus be carried out during the entire sequence of the PCR amplification by means of the method according to the invention, and the time course of the polynucleotide sequences occurring in the PCR amplification can also be quantitatively characterized. Furthermore, it is of course also possible to carry out spectroscopic detection measurement after the end of the PCR amplification.
  • PCR reaction step of the denaturation by irradiation of electromagnetic radiation in the Tera-Hertz regime would be a radiation of appropriate electromagnetic radiation at the time of denaturation.
  • Fig. 2 shows a schematic representation of the Extin mecanicsverlaufes in a PCR solution, which can be determined spectroscopically according to an embodiment of the present invention with electromagnetic radiation in the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime.
  • the frequency of the irradiated electromagnetic radiation is chosen so that it coincides with the frequency of predetermined excitation states of individual polynucleotide sequences and is attenuated by appropriate irradiation in the PCR solution of these.
  • the measurement points of spectroscopic real-time extinction evidence lie on an exponential curve.
  • the individual proofs of the extinction of the PCR solution are illustrated by crosses.
  • the time course is determined according to physical as well as chemical parameters, which can influence the efficiency or speed of the PCR amplification. From the extinction measurements, the amount of specific polynucleotide sequences can subsequently be determined by computational method.
  • a detection threshold D 1 is as low as possible and below which the detection threshold D 1 is for electromagnetic radiation of other frequencies. Consequently, fewer PCR reaction steps must be performed than in conventional real-time quantitative PCR methods. Furthermore, the earliest time T 2 is as low as possible, in particular shorter than T 1 for electromagnetic radiation of the other frequencies.
  • a radiation source 20 emits electromagnetic radiation in the gigahertz and / or Tera-Hertz regime in a PCR solution 11.
  • the PCR solution 11 is located in the receiving region 23 of a substrate 24, which defines by its formation the layer thickness S of the PCR solution through which the electromagnetic radiation 21 passes.
  • a receiving region 23 is presently formed by an at least partially limited volume, such as a container.
  • the frequency of the radiation is set such that it coincides with the frequency of predetermined excitation states in the PCR solution 11 located polynucleotide sequences 10.
  • optical elements typical of the optical structure, such as focusing elements, collimation elements, beam guiding elements and filters.
  • the additional provision of such conventional beam conditioning optical elements will be apparent to those skilled in the art.
  • the second embodiment according to FIG. 4 shows a further partial view of an embodiment of a PCR arrangement for the spectroscopic real-time detection of polynucleotide sequences in a PCR amplification.
  • the second embodiment according to FIG. 4 does not provide a double-walled receiving region 23, but only a single-walled one, to which the PCR solution 11 is accommodated.
  • This may be, for example, a film application of a PCR solution to the receiving region 23 of the substrate.
  • the arrangement of the PCR solution 11 on the receiving region 23 of the substrate 24 in the field of gravity can be oriented so that a constant layer thickness S can be ensured during the spectroscopic real-time detection.
  • the receiving region 23 of the substrate 24 may still contain constructive arrangements which increase the adhesion between the PCR solution 11 and the receiving region 23 of the substrate 24.
  • Such arrangements are, for example, fine surface structures which assist in adhering the PCR solution 11 to the substrate 24.
  • FIG. 5 shows a partial view of a fourth embodiment of the PCR arrangement according to the invention for the spectroscopic real-time detection of polynucleotide sequences in a PCR amplification.
  • the direction of the electromagnetic radiation 21 emitted from the radiation source 20 and the direction of the radiation detected by the detector 22 are not arranged in extension to one another. Rather, the electromagnetic radiation 21 from the PCR solution 11 and / or the substrate of the Receiving area 23 deflected such that no straight line of rays takes place.
  • Such a beam path is advantageous, for example, in the case of scatter measurements.
  • Such a relative arrangement of radiation source 20 and detector 22 may also contribute to an improved spatial arrangement of various components, which contributes to reducing the overall size of the PCR assembly of the invention.
  • the electromagnetic radiation 21 is guided in a waveguide W suitable for the frequency range of the radiation.
  • the electromagnetic radiation 21 can be coupled directly to the radiation source 20 in the waveguide W or only after suitable conditioning.
  • the waveguide W can be directly connected to the detector 22 or the radiation can only be conditioned for detection by means of the detector 22.
  • the waveguide W is designed to emit in the receiving region 23 electromagnetic radiation 21 as an evanescent radiation field, which consequently can cause an extinction of the electromagnetic radiation 21 through the interaction with a waveguide W externally applied PCR solution.
  • the embodiments of the waveguide W may comprise insulated waveguide structures, or else waveguide sections integrated into further recording devices. In a preferred embodiment, the waveguide W is integrated in a chip construction.
  • FIG. 7 shows an embodiment of a PCR arrangement based on the partial view of the fourth embodiment in FIG. 5 for the spectroscopic real-time detection of polynucleotide sequences in a PCR amplification, which as a further element represents the temperature change means 25 associated with the Substrate 24 of the receiving area
  • the temperature changing means 25 are adapted to the substrate
  • the temperature changing means 25 can heat and / or cool an air flow which is conducted directly to the substrate 24 and, after appropriate heat conduction through the substrate 24, changes the temperature of the PCR solution 11 accordingly.
  • FIG. 8 shows the extinction behavior 13 'of the buffer solution 13 necessary for producing the PCR solution 11 and the extinction behavior 10' of predetermined excitation states of the polynucleotide sequence 10 to be detected in a frequency range of the Giga-Hertz or Tera-Hertz regime. Due to its refractive behavior, the extinction of the buffer solution 13 varies detectably over a predetermined frequency range. Many standard laboratory buffer solutions 13 have such an extinction behavior. For the lowest possible possible detection of an excitation state of a polynucleotide sequence 10, it may be necessary to select a buffer solution 13 which has a minimum of its extinction behavior in the frequency range of the designated excitation state of the polynucleotide sequence 10.
  • the absorbance of the electromagnetic radiation 21 irradiated into the PCR solution 11 by the buffer solution 13 is small as compared with the absorbance by the polynucleotide sequences 10 in the PCR solution 11, and the detection of the extinction of the excited state of the polynucleotide sequence 10 is performed with little interference by the Buffer solution 13.
  • the buffer solution 13 By appropriate choice or adjustment of the buffer solution 13 to the polynucleotide sequence 10 to be detected and its excitation frequency, a favorable signal to noise ratio can be achieved.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einer PCR-Amplifikation (PCR=Polymerase-Kettenreaktion), wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangssubstanzen in einem Puffer sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz-oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors in einem real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz nachzuweisen.

Description

Real-Time-PCR mittels Gigahertz- oder Terahertz-Spektrometrie
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einer PCR- Amplifikation, sowie eine entsprechende PCR-Anordnung (PCR=Polymerase- Kettenreaktion) .
Derartige Verfahren sowie PCR-Anordnungen werden typischerweise zur quantitativen Analyse der Expression bestimmter Gensequenzen eingesetzt. PCR-Amplifikationen allgemein finden bei der Vervielfältigung und Untersuchung von DNS- bzw. RNS- Sequenzen, wie sie in vielen biologischen Systemen vorzufinden sind, häufige Verwendung, können jedoch auch im Prinzip mit künstlich hergestellten Polynucleotidsequenzen verwendet werden.
Das vorliegend beschriebene Verfahren bezieht sich auf einen spektroskopischen real- time Nachweis in einer PCR-Amplifikation. Damit wird sich sowohl auf Nachweise während des Ablaufs aller Reaktionsschritte einer PCR-Amplifikation bezogen, als auch auf zweckdienliche Nachweise davor und danach. So können beispielsweise in einleitenden Schritten vor der Ausführung der eigentlichen PCR-Reaktions schritte zur Replikation von Polynucleotidsequenzen eingesetzte Substanzen mittels eines spektroskopischen Nachweises qualitativ wie quantitativ untersucht werden. Weiterhin können ebenso spektroskopische Untersuchungs schritte während der PCR-Amplifikation vorgenommen werden, und auch dann, wenn die PCR-Amplifikation an sich bereits beendet wurde.
PCR-Amplikationen werden typischerweise dafür eingesetzt, im Vergleich zum menschlichen Genom relativ kurze und in ihrem Aufbau klar definierte Polynucleotidsequenzen zu vervielfältigen. Im Gegensatz zu lebenden Organismen vermag die PCR-Amplifikation lediglich die Vervielfältigung von Polynucleotidsequenzen mit wenigen tausend Basenpaaren pro Sequenz zu gewährleisten. Zur Durchführung einer PCR-Amplifikation bedarf es zunächst der Herstellung einer PCR-Lösung, welche neben einer Pufferlösung als geeignete chemische Umgebung eine Anzahl an weiteren, für den Ablauf einer PCR- Amplifikation notwendigen Ausgangssubstanzen aufweist. Diese Ausgangssubstanzen umfassen typischerweise eine originale, zu vervielfältigende Polynucleotidsequenz, Primer zur Festlegung eines Anfangs- sowie eines Endabschnittes der zu vervielfältigenden Polynucleotidsequenz eine entsprechende Polymerase, um den durch die Primer definierten Abschnitt zu replizieren, sowie Desoxynukleosidtriphosphate, welche die Bausteine der replizierten Polynucleotidsequenz darstellen. Neben diesen Ausgangssubstanzen kann eine PCR-Lösung zudem eine Anzahl an weiteren funktionellen Komponenten enthalten, welche etwa erlauben, den Ablauf der PCR-Amplifikation in Bezug auf die Effektivität zu steigern oder zu optimieren.
Eine PCR-Amplifikation besteht aus einer sich wiederholenden Abfolge von PCR- Reaktionsschritten, wie sie etwa in laborüblichen Thermocyclern durchgeführt werden können. Jede Wiederholung umfasst hierbei die drei PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation. Bei der Denaturierung kommt es zunächst zu einem Aufschmelzen von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen, unter Erhitzen der PCR-Lösung auf eine Temperatur von etwa 95°C, um die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden einzelsträngigen Polynucleotidsequenzen zusammenhalten, zu lösen. Das Temperaturniveau wird solange beibehalten, bis gewährleistet ist, dass in der PCR-Lösung nur noch einzel strängige Polynucleotidsequenzen vorliegen. In dem PCR-Reaktionsschritt der Primerhybridisierung, wird die Temperatur typischerweise für einige Sekunden lang auf einem Niveau gehalten, welches eine spezifische Anlagerung des Primers an die Polynucleotidsequenz erlaubt. Das bezeichnete Temperaturniveau liegt dabei normalerweise um wenige 0C unter dem Schmelzpunkt der durch die spezifische Anlagerung entstehenden Primersequenzen, und entspricht meist einer Temperatur zwischen 55°C bis 65°C. Ist die Anlagerung der Primer an die vorbestimmten Stellen der Polynucleotidsequenz abgeschlossen, erfolgt in dem PCR-Reaktionsschritt der Elongation das Auffüllen durch die fehlenden Stränge oder Bausteine an freien Nucleotiden unter Einwirkung der Polymerase. Hierbei bildet der Primer den Anfang eines neuen Einzelstrangs, welcher stückweise repliziert wird. Die während dieses PCR-Reaktionsschrittes einzustellende Temperatur hängt von dem Arbeitsoptimum der jeweils verwendeten Polymerase ab, liegt jedoch typischerweise um 100C bis 15°C über dem Temperaturniveau der Primerhybridisierung. Nach Abschluss des PCR-Reaktionsschrittes der Elongation wiederholt sich die Reaktionsabfolge, und die gewünschten Polynucleotidsequenzen vermehren sich im besten Reaktionsfalle exponentiell, da in jedem weiteren Reaktions schritt auch die zuvor synthetisierten Polynucleotidsequenzen als Matrizen für eine weiteren Strangsynthese dienen können. In der Real-Time-quantitative PCR, einer aus dem Stande der Technik bekannten Weiterentwicklung der PCR-Amplifikation, wird eine PCR-Amplifikation zur Replikation von Polynucleotidsequenzen durchgeführt und gleichzeitig eine Möglichkeit der Quantifizierung der so gewonnenen Polynucleotidsequenzen bereit gestellt. Die Quantifizierung beruht hierbei auf der Ausführung von Fluoreszenzmessungen, die während des Ablaufes der PCR-Amplifikation vorgenommen werden. Das nachgewiesene Fluoreszenz signal nimmt dabei proportional mit der Menge an replizierten Polynucleotidsequenzen zu. Dementsprechend erlaubt die Real-Time-quantitative PCR im Gegensatz zu den meisten herkömmlichen quantitativen Nachweismethoden, welche erst nach der PCR- Amplifikation angewendet werden können, eine quantitative Auswertung der in der PCR- Amplifikation replizierten Polynucleotidsequenzen noch während ihrer Vervielfältigung.
Hierbei soll darauf hingewiesen werden, dass hier und im Folgenden ein quantitativer Nachweis im Sinne der Quantifizierung in Verbindung mit einer Real-Time-quantitative PCR zu verstehen ist. Dieser können verschiede bekannte Quantifizierungsmodelle zugrunde liegen. In einem einfachen Fall kann etwa die Tatsache benutzt werden, dass zwischen dem Logarithmus der eingesetzten Menge an der zu replizierenden Polynucleo- tidsequenz und dem CT (Threshold Cycle = "Schwellenwert-Zyklus", d.h. dem Zyklus, zu welchem die nachgewiesene Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrund- Fluoreszenz liegt) eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung besteht. Ist die eingesetzte Menge etwa zunächst bekannt, kann eine Standardkurve erzeugt werden, gegen deren Steigung jede unbekannte Menge an Polynucleotidsequenz verglichen und quantifiziert werden kann. Ist andererseits die Ausgangsmenge unbekannt, kann mitunter durch Bestimmung des CT auch auf die Ausgangsmenge zurückgeschlossen werden. Weitere Berechnungsmethoden sind dem Fachmann bekannt.
Die Real-Time-Quantitative PCR bedarf dabei Fluoreszenzfarbstoffe oder sogenannter Fluoreszenzmarker, welche chemisch oder physikalisch mit den replizierten Polynucleotidsequenzen in Wechselwirkung treten, und infolgedessen ihr eigenes Fluoreszenzverhalten ändern. Dementsprechend korreliert die Zunahme der Intensität eines nachgewiesenen Fluoreszenzsignals nach den sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritten mit einer entsprechenden Zunahme an replizierten Polynucleotidsequenzen. Der Nachweis des Verlaufs einer PCR-Amplifikation über gemessene Fluoreszenzsignale, kann sich beispielsweise auf die Verwendung von einfachen Fluoreszenzfarbstoffen stützen, die sich relativ unspezifisch an die zu replizierende Polynucleotidsequenz binden. Solche Fluoreszenzfarbstoffe sind etwa SybrGreen, welches ein asymmetrisches Cyanin-Farbstoffmolkül ist und mit zu replizierenden DNA-Molekülen einen DNA-Fluoreszenzfarbstoff- Komplex bildet, welcher blaues Licht bei einer Wellenlänge von λmax — 494 nm absorbiert und grünes Licht bei einer Wellenlänge von λmax = 521 nm emittiert. Ein weiterer häufig verwendeter Fluoreszenzfarbstoff ist Ethidiumbromid. In Ergänzung zu diesen Fluoreszenzfarbstoffen kommen auch noch Fluoreszenzmarker wie FRET-Sonden, Lightcycler- Sonden®, TaqMan-Sonden®, Molecular-beacons, Scorpionprimer oder auch Luxprimer® zum Einsatz, welche zwar eine spezifische Bindung an einzelne Stellen der Polynucleo- tidsequenz erlauben und folglich eng definierte Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, aber vergleichsweise teurer sind. Folglich finden solche Fluoreszenzmarker nicht die breite Anwendung, wie sie etwa für die Fluoreszenzfarbstoffe typisch ist. Weiterhin stellen sich etwa Molecular-beacons als relativ komplexe Strukturen dar, die zusätzlich optimierter und damit teuerer Primer zur Durchführung der PCR-Amplifikation bedürfen. Weiterhin erschweren derartige komplexe Strukturen eine optimierte Einstellung der PCR- Reaktionsbedingungen und fördern so eine relativ ineffiziente Vervielfältigung der PoIy- nucleotidsequenzen als auch die Darstellung vieler unerwünschter Nebenprodukte.
Zur Vermeidung dieser Nachteile der auf den Nachweis von Fluoreszenzsignalen beruhenden Real-Time-quantitative PCR schlägt die aus dem Stand der Technik bekannte WO 03/102238 A2 ein Verfahren zum Nachweis der Darstellung von zusammenhängenden Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Lösung vor, sowie eine Anordnung vor, um das besagte Verfahren auszuführen. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung von PCR- Ausgangs Stoffen in einer Kammer, sowie die Durchführung der sich wiederholenden PCR-Reaktions schritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation. Während der Ausführung dieser PCR-Reaktionsschritte wird die Darstellung zusammenhängender Nukleinsäuremoleküle durch die Einstrahlung von UV-Licht in die PCR- Lösung und dem darauf folgenden Nachweis der absorbierten Lichtintensität vorgenommen. Die PCR-Lösung wird hierbei von einer für die Durchführung einer PCR- Amplifikation angepassten Kammer aufgenommen, in welche die Lichtenergie der UV- Lichtquelle eingestrahlt wird.
Obwohl das in der WO 03/102238 A2 beschriebene Verfahren die Verwendung von FIu- oreszenzmarkern unnötig werden lässt, zeigt sich diese Methode als sehr störanfällig in Bezug auf einzelne Komponenten der PCR-Lösung oder in Bezug auf verbliebene Überreste aus Reaktionsschritten von vorhergehenden Isolierungsreaktionen, z. B. Phenole. Ein weiterer Nachteil der quantitativen Bestimmung mittels UV-Absorption ist auch darin zu sehen, dass einzel strängige von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen nur begrenzt unterschieden werden können und folglich eine nur sehr unspezifische Nachweismöglichkeit für Polynucleotidsequenzen zur Verfügung steht. WO 2008/109706 Al beschreibt die Anwendung von Terahertz-Spektroskopie in verschiedenster Art. Dabei wird auch die Detektion doppelsträngiger und einzel strängiger DNA beschrieben. Eine real-time Methode zum Nachweis des PCR-Produktes wird in dieser Druckschrift in keiner Weise beschrieben.
WO 2006/064192 Al beschreibt einen Bandfilter im Terahertzbereich. Ein Verfahren bezüglich dem Nachweis von Nucleinsäuremolekülen wird in dieser Druckschrift nicht beschrieben.
Die US 2006/0216742 beschreibt ein Verfahren und ein System zum Nachweis biomolekularer Bindungsereignisse unter Verwendung von Gigahertz- oder Terahertzstrahlung.
Die WO 03/100396 Al offenbart ein Verfahren zum Nachweis der Spezifität eines Liganden zu einer biologischen Probe.
Die DE 100 54 476 Al beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Polynucleotidse- quenzen, bei dem der Brechungsindex oder eine äquivalente Größe der mit dem Testmedium in Kontakt befindlichen Probe durch Wechselwirkung mit einfallender elektromagnetischer Strahlung bestimmt wird.
Die WO 2004/024949 A2 beschreibt ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mutationen und Nucleotidpolymorphismen unter Einsatz von Spektraldaten.
Eine spezifischere Methode zum Nachweis des Vorliegens einer biomolekularischen Bindung zwischen zwei Molekülen wird von der US 2006/0216742 Al vorgeschlagen, welche eine Nachweismethode sowie eine entsprechende Vorrichtung betrifft. Gemäß der Offenbarung wird über Teraherzstrahlung das Vorliegen einer biomolekularischen Bindung zweier Moleküle nachweisen, indem aus einer Quelle Teraherzstrahlung ausgesendet wird und nach Durchstrahlung einer die Moleküle umfassenden Probe von einem Detektor nachgewiesen wird. Hierbei erlaubt die offenbarte Methode jedoch nicht die Quantifizierung eingesetzter Mengen der Moleküle, und ist folglich für eine Verwendung zum Real- Time-Nachweis in einer PCR-Amplifikation ungeeignet.
Es stellt sich demnach die Aufgabe dar, ein markerfreies Verfahren zum Real-Time- Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation vorzuschlagen, welches einen spezifischen und quantitativen Nachweis von Polynucleotidsequenzen, insbe- sondere eine Unterscheidung zwischen einzel- und doppelsträngigen Polynucleotidse- quenzen, ermöglicht, und von der Reinheit oder Qualität der Lösung weitgehend unbeein- flusst ist.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 und 15 sowie eine PCR-Anordnung gemäß Patentanspruch 14.
Insbesondere wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum auch quantitativen spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere von Polynucleo- tidsequenzen, in einer PCR-Amplifikation gelöst, wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangssubstanzen in einer Pufferlösung sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors in einem quantitativen real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz nachzuweisen.
Fernerhin wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum auch quantitativen spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere von Polynucleotid- sequenzen, in einer PCR-Amplifikation gelöst, wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangs Substanzen in einer Pufferlösung sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors in einem real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz nachzuweisen, und wobei der Reaktionsschritt der Denaturierung durch Tera-Hertz-Strahlung aus der Strahlungsquelle bewirkt wird.
Überdies wird die Aufgabe durch Eine PCR-Anordnung zum auch quantitativen spektroskopischen real-time Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation gelöst, wobei diese ein Substrat mit einem Aufnahmebereich für eine PCR-Lösung, bestehend aus den notwendigen Ausgangssubstanzen und einer Pufferlösung, Temperaturänderungsmittel, mittels derer die PCR-Lösung auf vorgegebene Temperaturen geheizt und/oder gekühlt werden kann, um die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung oder der Elongation zu ermöglichen, eine Strahlungsquelle, um elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung einzustrahlen, und einen Detektor, um durch die PCR-Lösung transmit- tierte Strahlung auch quantitativ spektroskopisch nachzuweisen, umfasst.
Ein Kerngedanke der vorliegenden Verfahren sowie der erfindungsgemäßen PCR- Anordnung liegt in der Ausführung einer PCR-Amplifikation sowie einem spektroskopischen Real-Time-Nachweis im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime des elektromagnetischen Spektrums. Typischerweise in diesem Frequenzbereich verwendete Strahlungen liegen zwischen 100 Gigahertz und 20 Terahertz, insbesondere zwischen 300 Gigahertz und 10 Terahertz. Diese Strahlungsfrequenzen sind geeignet, bestimmte Anregungszustände (typischerweise vibratorische Schwingungsmoden) von einzelsträngigen und doppelsträn- gigen Polynucleotidsequenzen anzuregen. Anregungszustände einzelner funktioneller Gruppen dieser Polynucleotidsequenzen sind folglich mit einer vorbestimmten Frequenz der elektromagnetischen Strahlung korreliert, und können in Extinktionsmessungen nachgewiesen werden. Unter Extinktionsmessungen werden im Folgenden allgemein alle spektroskopischen Nachweise, auch quantitative, bezeichnet, welche Teile der in die PCR-Lösung eingestrahlten Lichtintensität mit Teilen der aus ihr austretenden und mit einem Detektor nachgewiesenen Lichtintensität in Beziehung setzt, um Rückschlüsse auf nachzuweisende Stoffe und Strukturen in der PCR-Lösung zu erlauben. Diese Anregungsmoden (Anregungsfrequenzen) sind überdies charakteristisch für die chemischen Bindungszustände dieser funktionellen Gruppen, und können infolge einer Veränderung des Bindungszustandes mit einer Veränderung der elektromagnetischen Anregungsfrequenz einhergehen. Insbesondere lassen sich Anregungsmoden nachweisen, deren Auftreten charakteristisch für das Vorliegen von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden einzelsträngigen Polynucleotidsequenz in einer doppelsträngigen Polynucleotidse- quenz ist. Dementsprechend können durch Extinktionsmessungen in diesem bezeichneten Frequenzbereich quantitative Aussagen darüber gewonnen werden, ob in einer PCR- Lösung ein Gemisch von einzel- oder doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen vorliegt.
Der Nachweis vorbestimmter Anregungszustände von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Lösung mittels spektroskopischer Extinktionsmessungen erfordert im Vergleich zum bisher herkömmlichen Verfahren des Nachweises mittels Fluoreszenzmessungen keinerlei Fluoreszenzmarker, welche einer PCR-Lösung zugegeben werden müssen. Damit gestaltet sich einerseits die Herstellung einer PCR-Lösung als weniger komplex und kostengünstiger. Andererseits kann auf den Einsatz von für die PCR-Lösung mitunter schädlichen UV-Lichts verzichtet werden. Gerade durch UV-Licht, welches elektronische An- regungen in biologischen Makromolekülen bewirkt, sind die möglichen Fehlerquellen durch chemische Nebenreaktionen, welche durch die Einstrahlung von UV-Licht mitunter initiiert werden, sehr problematisch. Elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- sowie Tera-Hertz-Regime vermögen jedoch typischerweise nur vibratorische Anregungen hervorzurufen und stören somit die chemische Reaktionsumgebung in einer PCR-Lösung in praktischer Hinsicht kaum. Überdies ist die Strahlungsfrequenz von Giga-Hertz- und Tera-Hertz-Strahlung geeignet, um Hybridisierungszustände von zusammen hängenden Nucleinsäuremolekülen bzw. von Polynucleotidsequenzen nachzuweisen. Anders als in einem Real-Time-Quantitative PCR- Verfahren mittels Fluoreszenzmessung im UV- Regime können folglich Nachweise entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens das Vorliegen einzelner Hybridisierungszustände, insbesondere das Vorliegen von ein- zelsträngigen und doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen, nachweisen. Dieser für die Durchführung einer PCR-Amplifikation mitunter entscheidende, auch quantitative Nachweis erlaubt Schlüsse auf den Fortschritt sowie die Qualität der in der PCR-Lösung stattfindenden Reaktionsschritte und damit eine Erhöhung der Effizienz der PCR- Amplifikation allgemein.
Ein weiterer Kerngedanke des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt fernerhin darin, dass die zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis eingesetzte Strahlungsquelle auch dafür eingesetzt werden kann, den Reaktionsschritt der Denaturierung in der PCR- Amplifikation durch elektromagnetische Strahlung herbeizuführen. Der eingestrahlte Frequenzbereich ist nämlich durchaus geeignet, die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Einzelsträngen in einer doppelsträngigen Polynucleotidsequenz aufzuschmelzen, ohne dass dem gesamten System der PCR-Lösung direkt thermische Energie hinzugefügt werden muss. Folglich bedarf es in dem Reaktionsschritt der Denaturierung nicht einer Temperaturerhöhung einer PCR-Lösung um das Aufschmelzen der chemischen Verbindungen zwischen einzelnen Strängen einer Polynucleotidsequenz zu bewirken. Vielmehr bewirkt die Strahlungsquelle durch Einstrahlen elektromagnetischer Strahlung einer vorbestimmten Frequenz im Giga-Hertz- sowie Tera-Hertz-Regime in die PCR- Lösung ein Aufschmelzen doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen ohne dass die PCR- Lösung selbst eine starke Temperaturänderung erfahren muss. Ein derartiges Verfahren verkürzt somit die für die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte nötigen Aufheiz- und Abkühlphasen der PCR-Lösung und ermöglicht eine zeitlich schnellere Darstellung einer gewünschten Menge an zu vervielfältigenden Polynucleotidsequenzen.
In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangs Substanzen in einer Puf- ferlösung keine chemischen oder physikalischen Nachweismarker, insbesondere keine Fluoreszenzmarker, umfassen. Hierbei handelt es sich um Marker, welche für die Herstellung einer weiter oben beschriebenen PCR-Lösung als nicht notwendige Ausgangs Substanzen zugesetzt werden, um in einem Messverfahren, das aus dem Stande der Technik bekannt ist, die Darstellung von Polynucleotidsequenzen nachweisen zu können. Die für das ausführungsgemäße Verfahren bereitgestellte PCR-Lösung, kann folglich auf die notwendigen Ausgangssubstanzen beschränkt werden, wie sie etwa für eine gewöhnliche PCR-Amplifikation ohne Real-Time-Nachweis notwendig sind. Damit werden einerseits mögliche Störeinflüsse chemischer sowie physikalischer Natur in dem Verfahren der PCR-Amplifikation vermindert, und gleichzeitig die Kontrollierbarkeit der Reaktionsbedingungen erhöht.
In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Intensität der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime so ausgewählt wird, dass sie eine vorbestimmte Schichtdicke der PCR-Lösung durchdringt. Die Schichtdicke kann sich hierbei entweder auf den gesamten Probenquerschnitt, welcher von der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung durchdrungen wird, oder aber auch nur auf einen Teilbereich des Probenquerschnittes beziehen. Die Schichtdicke ist geeignet, bei Einstrahlung einer vorgegebenen Strahlungsintensität und Vorliegen einer Anzahl an Polynucleotidsequenzen oberhalb einer bestimmten Detektionsschwelle ein Extinktionssignal nachzuweisen. Das Extinktionssignal, welches aus einer Abschwächung der elektromagnetischen Strahlungsintensität resultiert, kann etwa aus Absorption, Streuung, Beugung sowie Reflexion resultieren. Ist die durchstrahlte Schichtdicke konstant, sowie die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung in ihrer Intensität unveränderlich, kann auf die Menge an dargestellten Polynucleotidsequenzen etwa bei bekanntem Extinktionsquerschnitt der Polynucleotidsequenzen rückgeschlossen werden.
In einer weiterführenden Ausführungsform des Verfahrens ist vorgesehen, dass die Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz- Regime zwischen 100 GHz und 20 THz, insbesondere zwischen 300 GHz und 10 THz liegt. Diese Frequenzbereiche decken die spektroskopisch leicht nachweisbaren Anregungsfrequenzen der meisten Polynucleotidsequenzen ab und erlauben somit die Anregungsschwingungen spektroskopisch, insbesondere spektroskopisch quantitativ, nachzuweisen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Pufferlösung der PCR-Lösung in Bezug auf eine Frequenz der eingestrahlten elektromag- netischen Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime so ausgewählt wird, dass die Strahlungsintensität nach Transmission einer vorbestimmten Schichtdicke der PCR- Lösung mit dem Detektor weitgehend ungeschwächt nachgewiesen werden kann. Die Pufferlösung selbst wird somit in Bezug auf die eingesetzten elektromagnetischen Strahlungsfrequenzen so ausgewählt, dass die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung vorbestimmter Frequenzbereiche eine möglichst große Transmission erfährt. Überlappen diese Frequenzbereiche mit nachzuweisenden Anregungszuständen der Polynucleotidse- quenzen, ist gewährleistet, dass eine Verringerung der elektromagnetischen Strahlungsintensität nach Wechselwirkung mit der PCR-Lösung nicht auf dem Extinktionsverhalten der Pufferlösung selbst, sondern lediglich auf das der Ausgangssubstanzen sowie mit den dargestellten Molekülen beruht. Kann weiterhin eine Extinktion durch Nebenprodukte der PCR-Amplifikation ausgeschlossen werden, beruht die Abschwächung der elektromagnetischen Strahlungsintensität in den Bereichen der Anregungszuständen der PoIy- nucleotidsequenzen weitgehend alleinig auf der Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung mit den Polynucleotidsequenzen. Das Verhältnis von Nutzsignal und ungewünschter Abschwächung der elektromagnetischen Strahlung wird infolge erhöht und die Qualität des auch quantitativen spektroskopischen Real-Time-Nachweises verbessert.
In einer weiterführenden Ausführungsform des Verfahrens zeichnet sich dieses dadurch aus, dass die PCR-Lösung auf einem Substrat, insbesondere in einem vorbestimmten Aufnahmebereich des Substrats aufgebracht ist, welches für die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime weitgehend transparent ist. Ein derartiger Aufnahmebereich kann durch ein begrenztes Volumen ausgebildet sein, oder aber lediglich auch als Fläche zum Auftrag einer PCR-Lösung. Das Substrat selbst kann ein mineralisches Substrat, beispielsweise Glas, oder aber auch ein Kunststoffsubstrat sein. Ist das Substrat selbst für die eingestrahlten elektromagnetische Strahlung weitgehend transparent, verursacht es lediglich einen geringen Anteil des in dem spektroskopischen Real-Time-Nachweisverfahren nachgewiesenen Extinktionssignals. Die nachgewiesene Extinktion beruht damit weitgehend auf der Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung und der PCR-Lösung, bzw. der darin enthaltenen Stoffe, falls die Pufferlösung der PCR-Lösung selbst ebenfalls in dem Frequenzbereich der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung keine oder nur geringe Schwächung der Strahlungsintensität verursacht. Weiterhin kann das Substrat, falls es ein Kunststoff ist, durch die Auswahl eines geeigneten Kunststoffes an den Nutzfrequenzbereich der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung angepasst werden, um eine möglichst geringe Abschwächung der Strahlungsintensität zu bewirken. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens umfasst das Substrat wenigstens einen Wellenleiter für elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime. Dieser Wellenleiter kann einerseits als Strahlungsführungsmittel als auch gleichzeitig als Substrat mit einem möglichen Aufnahmebereich für die PCR-Lösung dienen. Dementsprechend kann die Einstrahlung von elektromagnetischer Strahlung in die PCR-Lösung örtlich in gut kontrollierbarer Weise erfolgen. Zudem kann die Streustrahlung bzw. Verluststrahlung, wie sie in gewöhnlichen Kollimations- und Fokussierverfahren auftritt, verringert und der spektroskopische Real-Time-Nachweis verbessert werden. Besonders vorteilhaft lässt sich ein Wellenleiter einsetzen, wenn der vorbestimmte Aufnahmebereich für die PCR-Lösung sich in einem Bereich befindet, welcher von dem evaneszenten Strahlungsfeld des Wellenleiters durchdrungen wird. Ein Nachweis der Polynucleotidsequen- zen findet folglich mit elektromagnetischer Strahlung statt, welche einerseits durch den Wellenleiter geführt wird, andererseits jedoch mit Bereichen der Oberfläche außerhalb des Wellenleiters kommuniziert.
In einer weiterführenden Ausführungsform des Verfahrens zum spektroskopischen Real- Time-Nachweis sind fernerhin Temperaturänderungsmittel bereitgestellt, mittels derer die PCR-Lösung auf vorgegebene Temperaturen geheizt und/oder gekühlt werden kann. Derartige Temperaturänderungsmittel können entweder direkt oder indirekt die PCR- Lösung heizen oder kühlen. Eine direkte Temperaturerhöhung kann beispielsweise auf einer direkten Strahlungsheizung oder einer Widerstandsheizung beruhen. Eine Kühlung kann etwa durch geeignet angeordnete Peltierelemente oder aber auch durch ein Kühlmedium, beispielsweise Luft, bewirkt werden, welches mit einem Wärmeaustauscher in Verbindung steht. Die Temperaturänderungsmittel gewährleisten dabei, dass ein möglichst schnelles und genaues Wechseln der für die einzelnen PCR-Reaktionsschritte notwendigen Temperaturen ermöglicht wird.
In einer weiterführenden Ausführungsform des Verfahrens ist vorgesehen, dass die Temperaturänderungsmittel ein Wärmemedium heizen und/oder kühlen, welches über das Substrat die PCR-Lösung indirekt heizt und/oder kühlt. Ferner ist zu berücksichtigen, dass die Wärmekapazität des Substrats selbst gering und die Wärmeleitfähigkeit möglichst groß ist. Ausführungsgemäß kann das Wärmemedium flächig in Wechselwirkung stehen, oder aber auch dieses in dafür vorgesehenen Führungsmitteln, beispielsweise in Kanälen, durchdringen. Mittels der Heizung oder Kühlung des Substrats wird bei geeignetem Kontakt der PCR-Lösung mit dem Substrat die Temperatur der PCR-Lösung entsprechend verändert. Folglich können die für den Ablauf der PCR-Reaktionsschritte notwendigen Temperaturbedingungen gewährleistet werden. In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens ist vorgesehen, dass elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime aus der Strahlungsquelle in die PCR- Lösung vor und/oder nach einem Schritt der Denaturierung, und/oder der Primerhybri- disierung und/oder der Elongation eingestrahlt wird. Dementsprechend können die Ausgangsbedingungen sowie Reaktionserfolge nach jeder der in der PCR-Amplifikation stattfindenden Reaktions schritte mittels eines spektroskopischen Nachweises überprüft werden. Sollte sich etwa durch den Nachweis herausstellen, dass die Ausgangsvoraussetzungen für einen nachfolgenden PCR-Reaktionsschritt ungünstig sind, können entsprechende Veränderungen der Reaktionsbedingungen, beispielsweise in der Temperaturwahl, vorgenommen werden, um einen verbesserten Erfolg herbeizuführen. In einer alternativen Ausgestaltung kann auch die elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera- Hertz-Regime während der PCR-Amplifikation stattfindenden Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung oder der Elongation eingestrahlt werden, um beispielsweise Rückschlüsse auf das zeitliche Bindungsverhalten einzelner molekularer Bausteine zu gewinnen.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung ausgewählt, um definierte vibratorische Anregungsmoden von einzel- und/oder doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen zu erregen, um diese, insbesondere die für das Vorliegen von Hybridisierungszuständen von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen charakteristischen Moden, nachzuweisen. Folglich kann während der PCR-Amplifikation das Vorliegen bestimmter molekularer Strukturen der Polynucleotidsequenzen nachgewiesen werden, mittels derer die Qualität des Ablaufs der PCR- Amplifikation überprüft und nachgewiesen werden kann. Weiterhin kann auch nach erfolgtem Nachweis der Polynucleotidsequenzen ein Abbruch der PCR-Amplifikation eingeleitet werden. Insbesondere kann auch über den Nachweis der Verschiebung der Anregungsfrequenz definierter Anregungsmoden ein Rückschluss auf die Struktur der Polynucleotidsequenzen, insbesondere auf deren Hybridisierungszustand, gewonnen werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden während der PCR-Amplifikation zeitlich vorausgehende Nachweise mittels der elektromagnetischen Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime als Untergrund für zeitlich nachfolgende Nachweise in der Analyse der Nachweise berücksichtigt. Die zeitlich vorausgehenden Nachweise können für die Untergrundsubtraktion, welche in Extinktionsmessungen unerlässlich sind, entweder in direkter, gemittelter, oder in gefilterter Weise von nachfolgenden Nachweisen abgezogen werden. Dieser für den Erhalt von quantitativen Ergebnissen notwendige Schritt der Untergrundsubtraktion bedarf somit keiner weiteren Vorkenntnisse über das konkrete Extinktionsverhalten der PCR-Anordnung, sondern erlaubt eine gute Untergrundbestimmung in zeitlich naher Weise.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens zum spektroskopischen Real-Time- Nachweis von Polynucleotidsequenzen wird elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime aus der Strahlungsquelle vor Durchführen einer PCR- Amplifikation in eine Lösung von in der PCR-Amplifikation zu verwendenden Ausgangssubstanzen eingestrahlt, um chemische oder physikalische Eigenschaften einzelner Ausgangssubstanzen, insbesondere deren Qualität, Spezifität und deren Bindungsverhalten, mittels spektroskopischer Nachweise zu bestimmen. Hierbei ist anzuführen, dass typischerweise vor dem Durchführen einer Real-Time-quantitative PCR die meisten Anwender von PCR-Amplifikationen die Qualität bzw. Spezifität und deren Bindungsverhalten (Qualität der Polynucleotidsequenzen, Primerbindung, Primerspezifität, Amplifikations- mengen) aus Kostengründen in einer PCR- Vorrichtung, welche nicht die Möglichkeit eines spektroskopischen Real-Time-Nachweises unter Einsatz von Fluoreszenzmessungen bereit hält, testen. Gemäß einer Durchführung des ausführungsgemäßen Verfahrens kann folglich diese separate Überprüfung entfallen, und die physikalischen und chemischen Eigenschaften einzelner Ausgangssubstanzen mittels einer erfindungsgemäßen PCR- Anordnung direkt bestimmt werden. Weiterhin sind die in PCR-Amplifikationen typischerweise verwendete Primer für die Verwendung in gewöhnlichen PCR-Anordnungen ohne spektroskopischen Real-Time-Nachweis ausgelegt, und erfordern in der Verwendung in einer PCR-Anordnung mit spektroskopischem Real-Time-Nachweis auf der Grundlage des Einsatzes von Fluoreszenzmarken eine neuerliche Optimierung der Reaktionsbedingungen für die die Primer enthaltenden PCR-Lösung mit Fluoreszenzmarkern. Diese erneute Optimierung wird meist deswegen notwendig, weil der Zusatz von Fluoreszenzmarken die Schmelzpunkte der Polynucleotidsequenzen und damit die Primerbindung beeinflusst. Kann die Primerbindung bzw. Primerspezifität vorab in einer PCR- Anordnung bestimmt werden, in welcher zu einem späteren Zeitpunkt auch die spektroskopischen Real-Time-Nachweise von Polynucleotidsequenzen mit Giga-Hertz oder Tera- Hertz Strahlung durchgeführt werden, entfallen folglich aufwändige Optimierungsanstrengungen.
Weiterhin sei auch darauf hingewiesen, dass die in Floureszenzmessungen im UV-Regime eingesetzten Reaktionsgefäße aufgrund von Verschmutzungen, wie beispielsweise Fingerabdrücken, leicht Anlass zu Fehlmessungen sein können und daraus mitunter falsche Absorptionswerte resultieren können. Elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz oder Te- ra-Hertz Regime ist aufgrund der größeren Wellenlänge weitaus unempfindlicher gegenüber derartiger Verunreinigungen der Reaktionsgefäße sowie auch der Pufferlösungsbestandteile. Zudem entfällt entsprechend der vorliegenden Verfahrens die Verwendung von verdorbenen oder ungenau angesetzten Fluoreszenzfarbstoffen als mögliche Fehlerquelle für den spektroskopischen Nachweis.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben, die anhand der Abbildungen näher erläutert werden.
Hierbei zeigen:
Fig. 1 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung der zeitlichen Abfolge einzelner
Schritte in einem Verfahren zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 2 eine schematische Darstellung des Extinktionsverhaltens einer PCR-Lösung im Verlauf einer PCR-Amplifikation bei Strahlungsfrequenzen, welche mit Anre- gungszuständen vorbestimmter Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Lösung übereinstimmen;
Fig. 3 eine Teilansicht einer schematischen Darstellung einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen PCR-Anordnung;
Fig. 4 eine Teilansicht einer dritten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR- Anordnung;
Fig. 5 eine Teilansicht einer vierten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR- Anordnung;
Fig. 6 eine Teilansicht einer fünften Aus führungs form einer erfindungsgemäßen PCR- Anordnung;
Fig. 7 eine sechsten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR-Anordnung, welche auf der in Fig. 5 gezeigten Teilansicht der vierten Aus führungs form beruht; Fig. 8 eine schematische Darstellung des Extinktionsverhaltens einer zur Herstellung einer PCR-Lösung verwendeten Pufferlösung sowie einer Polynucleotidsequenz im Frequenzregime der Giga-Hertz- und/oder Tera-Hertz-Regime.
Fig. 1 zeigt ein schematisches Flussdiagramm des typischen Ablaufes einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen 10 in einer PCR-Amplifikation. In einem solchen Verfahren bedarf es zunächst der Bereitstellung einer Pufferlösung 13 in welcher die für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangssubstanzen aufgenommen oder gelöst werden. Notwendige Ausgangssubstanzen 12 sind die zu replizierende Polynucleotidsequenz 10, geeignete Primer, eine Polymerase sowie Desoxynukleosidtriphosphate zur Synthetisierung von Polynucleotidsequenzen. Bereits vor der Herstellung der PCR-Lösung 11 kann die Qualität, Spezifität und das Bildungsverhalten einzelner Ausgangssubstanzen 12 in einem spektroskopischen Real-Time-Nachweis bestimmt werden. Dieser Nachweis findet zu einem in der Fig. 1 mit 1 dargestellten Zeitpunkt statt. Nach Herstellung der PCR- Lösung 11 können erneut weitere spektroskopische Real-Time-Nachweise der PCR- Lösung 11 vorgenommen werden (Zeitpunkt 2). Erst dann findet durch die Wiederholung der PCR-Reaktions schritte der Denaturierung, Primerhybridisierung, und Elongation eine Vervielfältigung der zu replizierenden Polynucleotidsequenzen statt, wobei nach jedem erfolgten PCR-Reaktionsschritt spektroskopische Real-Time-Nachweise durchgeführt werden können (Zeitpunkte 3, 4 und 5). Hierbei werden bevorzugt Anregungszustände der einsträngigen Polynucleotidsequenzen nach dem PCR-Reaktionsschritt der Denaturierung gemessen (Zeitpunkt 3), wobei Anregungszustände von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen in geeigneter Weise nach dem PCR-Reaktionsschritt der Elongation (Zeitpunkt 5) gemessen werden. Mittels des ausführungsgemäßen Verfahrens können somit spektroskopische Real-Time-Nachweise während der gesamten Abfolge der PCR- Amplifikation ausgeführt werden, und der zeitliche Verlauf der in der PCR-Amplifikation auftretenden Polynucleotidsequenzen auch quantitativ charakterisiert werden. Ferner ist es natürlich auch möglich, noch nach Ablauf der PCR-Amplifikation spektroskopische Nachweismessung durchzuführen.
Sollte gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt des vorliegenden Verfahrens der PCR- Reaktionsschritt der Denaturierung durch Einstrahlung von elektromagnetischer Strahlung im Tera-Hertz-Regime bewirkt werden, so würde dieses Verfahren eine Einstrahlung von entsprechender elektromagnetischer Strahlung zum Zeitpunkt des Ablaufes der Denaturierung erfolgen. Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Extinktionsverlaufes in einer PCR-Lösung, welcher nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit elektromagnetischer Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime spektroskopisch bestimmt werden kann. Die Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung ist dabei so gewählt, dass diese mit der Frequenz von vorbestimmten Anregungszuständen einzelner Polynucleotidsequenzen übereinstimmt und nach entsprechender Einstrahlung in die PCR-Lösung von diesen abgeschwächt wird. Da in einer PCR-Amplifikation typischerweise die Anzahl an zu replizierenden Polynucleotidsequenzen zeitlich exponentiell zunehmend ist, liegen die Messpunkte spektroskopischer Real-Time-Nachweise zur Extinktion auf einer Kurve mit exponentiellem Verlauf. Vorliegend sind die einzelnen Nachweise der Extinktion der PCR-Lösung durch Kreuze veranschaulicht. Der Zeitverlauf bestimmt sich dabei nach physikalischen wie nach chemischen Größen, welche die Effizienz bzw. Geschwindigkeit der PCR-Amplifikation beeinflussen können. Aus den Extinktionsmessungen kann nachfolgend mittels rechnerischer Methode die Menge an spezifischen Polynucleotidsequenzen bestimmt werden.
In der praktischen Durchführung von spektroskopischen Real-Time-Nachweisen von Polynucleotidsequenzen während der PCR-Amplifikation findet man, dass nur solche Nachweise oberhalb einer vorbestimmten Detektionsschwelle D1 eindeutige Nachweisergebnisse liefern, welche auch zur weiteren Auswertung verwendet werden können. Nachweiswerte unterhalb dieser Detektionsschwelle D1 sind lediglich theoretischer Natur, da das Signal-zu-Rauschverhältnisse keine eindeutige Extinktionsbestimmungen erlauben. Der früheste Zeitpunkt T1 für einen eindeutigen spektroskopischen Real-Time-Nachweis tritt folglich dann auf, wenn die gemessene Extinktion über der Detektionsschwelle D1 liegt. Durch eine entsprechende Frequenzwahl der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung kann erreicht werden, dass eine Detektionsschwelle D2 möglichst gering ist und unter der der Detektionsschwelle D1 für elektromagnetische Strahlung anderer Frequenzen liegt. Folglich müssen weniger PCR-Reaktionsschritte durchlaufen werden als in herkömmlichen Real-Time-quantitative PCR- Verfahren. Ferner ist auch der früheste Zeitpunkt T2 möglichst gering, insbesondere kürzer als T1 für elektromagnetische Strahlung der anderen Frequenzen.
Fig. 3 zeigt eine Teilansicht einer schematischen Darstellung einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR-Anordnung zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation. Gemäß dieser Ausführungsform emittiert eine Strahlungsquelle 20 elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- und/oder Tera-Hertz-Regime in eine PCR-Lösung 11. Die PCR-Lösung 11 befindet sich in dem Aufnahmebereich 23 eines Substrats 24, welches durch seine Formung die Schichtdicke S der PCR-Lösung definiert, durch welche die elektromagnetische Strahlung 21 hindurchstrahlt. Ein derartiger Aufnahmebereich 23 ist vorliegend durch ein wenigstens teilweise begrenztes Volumen, wie einem Behälter ausgebildet. Die Frequenz der Strahlung ist dabei derart eingestellt, dass sie mit der Frequenz vorbestimmter Anregungszustände sich in der PCR-Lösung 11 befindender Polynucleotidsequenzen 10 übereinstimmt. Nach Transmission der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung 21 durch den Querschnitt des Aufnahmebereichs 23 wird die entsprechend geschwächte Intensität der elektromagnetischen Strahlung 21 von einem Detektor 22 nachgewiesen.
Vorliegend wurde verzichtet, die im optischen Aufbau typischen weiteren optischen Elemente wie Fokussierelemente, Kollimationselemente, Strahlführungselemente und Filter anzugeben. Das zusätzliche Vorsehen solcher herkömmlicher optischer Elemente zur Strahlkonditionierung stellen sich für einen Fachmann als offensichtlich dar.
Fig. 4 zeigt eine weitere Teilansicht einer Ausführungsform einer PCR-Anordnung zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR- Amplifikation. Im Gegensatz zum Aufnahmebereich 23 der ersten Ausführungsform gemäß Fig. 3, sieht die zweite Ausführungsform gemäß Fig. 4 keinen doppelwandigen Aufnahmebereich 23 vor, sondern lediglich einen einwandigen, an welchen die PCR-Lösung 11 aufgenommen ist. Hierbei kann es sich beispielsweise um einen Filmauftrag einer PCR-Lösung auf den Aufnahmebereich 23 des Substrats handeln. Weiterhin kann auch die Anordnung der PCR-Lösung 11 auf dem Aufnahmebereich 23 des Substrats 24 im Feld der Erdanziehung so orientiert sein, dass während des spektroskopischen Real-Time- Nachweises eine gleichbleibende Schichtdicke S gewährleistet werden kann. Zudem kann der Aufnahmebereich 23 des Substrats 24 noch konstruktive Anordnungen enthalten, welche die Adhäsion zwischen PCR-Lösung 11 und dem Aufnahmebereich 23 des Substrats 24 erhöhen. Solche Anordnungen sind beispielsweise feine Oberflächenstrukturen, welche ein Festhaften der PCR-Lösung 11 auf dem Substrat 24 unterstützen.
Fig. 5 zeigt eine Teilansicht einer vierten Ausführungsform der erfindungsgemäßen PCR- Anordnung zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation. Bei dieser ist die Richtung der aus der Strahlungsquelle 20 emittierten elektromagnetischen Strahlung 21 und die Richtung der von dem Detektor 22 nachgewiesenen Strahlung nicht in Verlängerung zueinander angeordnet. Vielmehr wird die elektromagnetische Strahlung 21 von der PCR-Lösung 11 und/oder dem Substrat des Aufnahmebereichs 23 derart umgelenkt, dass kein geradliniger Strahlengang erfolgt. Ein derartiger Strahlengang ist etwa bei Streuungsmessungen vorteilhaft. Eine derartige relative Anordnung von Strahlungsquelle 20 und Detektor 22 kann zudem zu einer verbesserten räumlichen Anordnung verschiedener Komponenten beitragen, welche zur Verringerung der Gesamtgröße der ausführungsgemäßen PCR-Anordnung beiträgt.
Im Vergleich zu den Ausführungsformen des freien Strahlenganges der elektromagnetischen Strahlung 21 in den Darstellungen gemäß Fig. 3 bis Fig. 5 wird in der Teilansicht der Ausführungsform gemäß Fig. 6 die elektromagnetische Strahlung 21 in einem für den Frequenzbereich der Strahlung geeigneten Wellenleiter W geführt. Hierbei kann die elektromagnetische Strahlung 21 direkt an der Strahlungsquelle 20 in den Wellenleiter W eingekoppelt werden oder jedoch erst nach geeigneter Konditionierung. Entsprechend kann der Wellenleiter W mit dem Detektor 22 direkt in Verbindung stehen oder die Strahlung erst für den Nachweis mittels des Detektors 22 konditioniert werden. Der Wellenleiter W ist dazu ausgebildet, in dem Aufnahmebereich 23 elektromagnetische Strahlung 21 als evaneszentes Strahlungsfeld abzugeben, welches folglich durch die Wechselwirkung mit einer auf dem Wellenleiter W äußerlich aufgebrachten PCR-Lösung eine Extinktion der elektromagnetischen Strahlung 21 hervorrufen kann. Die Ausführungsformen des Wellenreiters W können isolierte Wellenleiterstrukturen umfassen, oder jedoch auch in weitere Aufnahmevorrichtungen integrierte Wellenleiterabschnitte. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wellenleiter W in einer Chipkonstruktion integriert.
Fig. 7 zeigt eine auf der Teilansicht der vierten Aus führungs form in Fig. 5 beruhenden Ausführungsform einer PCR-Anordnung zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation, welche als weiteres Element die Temperaturänderungsmittel 25 darstellt, die mit dem Substrat 24 des Aufnahmebereichs
23 wechselwirkt. Die Temperaturänderungsmittel 25 sind dafür ausgebildet, das Substrat
24 auf der Seite zu heizen und/oder zu kühlen, welche der Seite des Aufnahmebereiches 23 zur Aufnahme der PCR-Lösung 11 gegenüberliegt. Durch die Veränderung der Temperatur des Substrats 24 erfolgt durch entsprechende Wärmeleitung eine Temperaturänderung der PCR-Lösung 11. Ist der Wärmewiderstand des Substrates 24 gering, sowie die Wärme- und/oder Kühlleistung der Temperaturänderungsmittel 25 im Vergleich zur Wärmekapazität der aufgetragenen PCR-Lösung 11 groß, erfolgt eine relativ schnelle Temperaturänderung der PCR-Lösung 11, und eine rasche Abfolge der sich wiederholenden PCR-Reaktions schritte kann gewährleistet werden. Zur verbesserten Wärmeleitung kann zwischen den Temperaturänderungsmitteln 25 sowie dem Substrat 24 Mittel vorgesehen sein, die eine Wärmeleitung unterstützen. In einer Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen PCR-Anordnung können die Temperaturänderungsmittel 25 einen Luftstrom heizen und/oder kühlen, welcher direkt auf das Substrat 24 geleitet wird, und nach entsprechender Wärmeleitung durch das Substrat 24 die Temperatur der PCR-Lösung 11 entsprechend ändert.
Fig. 8 zeigt das Extinktionsverhalten 13' der zur Herstellung der PCR-Lösung 11 notwendigen Pufferlösung 13 sowie das Extinktionsverhalten 10' vorbestimmter Anregungs- zustände der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz 10 in einem Frequenzbereich des Giga-Hertz- bzw. Tera-Hertz-Regimes. Aufgrund ihres Brechungsverhaltens variiert die Extinktion der Pufferlösung 13 über einen vorbestimmten Frequenzbereich nachweisbar. Viele laborübliche Pufferlösungen 13 weisen ein derartiges Extinktionsverhalten auf. Für den möglichst rauscharmen Nachweis eines Anregungszustandes einer Polynucleotidsequenz 10 kann es erforderlich sein, eine Pufferlösung 13 zu wählen, welche in dem Frequenzbereich des bezeichneten Anregungszustandes der Polynucleotidsequenz 10 ein Minimum ihres Extinktionsverhaltens aufweist. Dementsprechend ist die Extinktion der in die PCR-Lösung 11 eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung 21 durch die Pufferlösung 13 im Vergleich zur Extinktion durch die Polynucleotidsequenzen 10 in der PCR- Lösung 11 gering, und der Extinktionsnachweis des Anregungszustandes der Polynucleotidsequenz 10 erfolgt mit nur geringer Störung durch die Pufferlösung 13. Durch entsprechende Wahl oder Einstellung der Pufferlösung 13 auf die nachzuweisende Polynucleotidsequenz 10 und deren Anregungsfrequenz kann ein vorteilhaftes Signal zu Rauschverhältnis erreicht werden.
An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, dass alle oben beschriebenen Teile für sich allein gesehen und in jeder Kombination, insbesondere den in Zeichnungen dargestellten Details als erfindungswesentlich beansprucht werden. Änderungen hiervon sind dem Fachmann geläufig.
Bezugszeichen:
10 Polynucleotidsequenz
10' Extinktion des Anregungszustandes einer Polynucleotidsequenz
11 PCR-Lösung
12 Ausgangssubstanz
13 Pufferlösung
13' Extinktion der Pufferlösung 14 Marker
20 Strahlungsquelle
21 Elektromagnetische Strahlung
22 Detektor
23 Aufnahmebereich
24 Substrat
25 Temperaturänderungsmittel
26 Wärmemedium
S Schichtdicke
W Wellenleiter
D1 Detektionsschwelle
D2 Detektionsschwelle
T Frühester Zeitpunkt für die Detektion

Claims

25Ansprüche
1. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen, in einer PCR-Amplifikation, wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR- Lösung (11) notwendigen Ausgangssubstanzen (12) in einer Pufferlösung (13) sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle (20) elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera- Hertz-Regime in die PCR-Lösung (11) eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors (22) in einem real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz (10) nachzuweisen.
2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Nucleinsäuremolekülen um Polynucleotidsequenzen handelt.
3. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach Anspruch 1 oder 2 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s dass die für die Herstellung der PCR-Lösung (11) notwendigen Ausgangssubstanzen (12) in einer Pufferlösung (13) keine chemischen oder physikalischen Nachweismarker (14), insbesondere keine Fluoreszenzmarker, umfassen.
4. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s dass die Intensität der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung (21) im Giga- Hertz- oder Tera-Hertz-Regime so ausgewählt wird, dass sie eine vorbestimmte Schichtdicke (S) der PCR-Lösung (11) durchdringt. 26
5. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s dass die Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung (21) im Giga- Hertz- oder Tera-Hertz-Regime zwischen 100 GHz und 20 THz, insbesondere zwischen 300 GHz und 10 THz liegt.
6. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s dass die Pufferlösung (13) der PCR-Lösung (11) in Bezug auf eine Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz- Regime so ausgewählt wird, dass die Strahlungsintensität nach Transmission einer vorbestimmten Schichtdicke (S) der PCR-Lösung mit dem Detektor (22) weitgehend ungeschwächt nachgewiesen werden kann.
7. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s dass die PCR-Lösung (11) auf einem Substrat (24), insbesondere in einem vorbestimmten Aufnahmebereich (23) des Substrats (24) aufgebracht ist, welches für die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz- Regime weitgehend transparent ist.
8. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s dass das Substrat (24) wenigstens einen Wellenleiter (W) für elektromagnetische
Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime umfasst.
9. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s ferner Temperaturänderungsmittel (24) bereit gestellt werden, mittels derer die PCR- Lösung (11) auf vorgegebene Temperaturen geheizt und/oder gekühlt werden kann. 27
10. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die Temperaturänderungsmittel (24) ein Wärmemedium (26) heizen und/oder kühlen, welches über das Substrat die PCR-Lösung (11) direkt oder indirekt heizt und/oder kühlt.
11. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime aus der Strahlungsquelle (20) in die PCR-Lösung (11) vor und/oder nach einem Schritt der Denaturierung, und/oder der Primerhybridisierung und/oder der Elongation eingestrahlt wird.
12. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung ausgewählt wird, um definierte vibratorische Anregungsmoden von einzel- und/oder doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen (10) zu erregen, um diese, insbesondere die für das Vorliegen von Hybridisierungszuständen von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen (10) charakteristischen Moden, nachzuweisen.
13. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s dass während der PCR-Amplifikation zeitlich vorausgehende Nachweise mittels der elektromagnetischen Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime als Untergrund für zeitlich nachfolgende Nachweise in einer Analyse der Nachweise berücksichtigt werden.
14. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s dass elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime aus der Strahlungsquelle (20) vor Durchführen einer PCR-Amplifikation in eine Lösung 28
von in der PCR-Amplifikation zu verwendenden Ausgangssubstanzen (12) eingestrahlt wird, um chemische oder physikalische Eigenschaften einzelner Ausgangssubstanzen (12), insbesondere deren Qualität, Spezifität und deren Bindungsverhalten, mittels spektroskopischen Nachweises zu bestimmen.
15. Eine PCR-Anordnung zum spektroskopischen real-time Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation, wobei diese
- Ein Substrat (24) mit einem Aufnahmebereich (23) für eine PCR-Lösung (11), bestehend aus den notwendigen Ausgangssubstanzen (12) und einer Pufferlösung (13),
- Temperaturänderungsmittel (24), mittels derer die PCR-Lösung (11) auf vorgegebene Temperaturen geheizt und/oder gekühlt werden kann, um die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung oder der Elongation zu ermöglichen,
- eine Strahlungsquelle (20), um elektromagnetische Strahlung (13) im Giga-Hertz - oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung (11) einzustrahlen,
- und einen Detektor (22), um durch die PCR-Lösung (11) transmittierte Strahlung spektroskopisch nachzuweisen, umfasst.
16. Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäure- molekülen in einer PCR-Amplifikation, wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR- Lösung (11) notwendigen Ausgangssubstanzen (12) in einer Pufferlösung (13) sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle (20) elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera- Hertz-Regime in die PCR-Lösung (11) eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors (22) in einem spektroskopischen real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz (10) nachzuweisen, und wobei der Reaktionsschritt der Denaturierung durch Tera-Hertz-Strahlung aus der Strahlungsquelle (20) bewirkt wird.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei den Nucleinsäuremolekülen um Polynucleotidsequenzen handelt.
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