DE10054476A1 - Verfahren zum Nachweis von Polynucleotidsequenzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis einer Polynucleotidsequenz A in einer Probe, welche eine Mehrzahl identischer oder verschiedener Polynucleotidsequenzen X als Einzelstränge enthält und die Polynucleotidsequenz A mit einer der Polynucleotidsequenzen X identisch sein kann oder als Sequenzabschnitt in einer der Polynucleotidsequenzen X enthalten sein kann, über die Abfrage des Bindungszustandes der in der Probe enthaltenen Polynucleotidsequenzen X an eine bekannte, zur Polynucleotidsequenz A komplementäre Test-Polynucleotidsequenz B, die folgenden Verfahrensschritte aufweisend: Präparation eines Testmediums, welches zur nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A komplementäre Test-Polynucleotidsequenzen B als Einzelstränge enthält, in Kontakt bringen der Probe mit dem Testmedium durch Ein- oder Aufbringen der Probe in oder auf das Testmedium, so dass die in der Probe enthaltenen Einzelstränge der Polynucleotidsequenzen X an die im Testmedium enthaltenen komplementären Test-Polynucleotidsequenzen B binden können. Zum Nachweis einer Bindung von Polynucleotidsequenzen X an Test-Polynucleotidsequenzen B folgender Schritt c) wird ausgeführt: Ermittlung zumindest einer Komponente des komplexen Brechungsindexes oder einer äquivalenten Größe der mit dem Testmedium in Kontakt befindlichen Probe durch Wechselwirkung mit einfallender elektromagnetischer Strahlung, deren Frequenz im Bereich zwischen 0,1 Terahertz (THz) und 20 THz, vorzugsweise zwischen 1 THz und ...

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis ei­ ner Polynucleotidsequenz in einer Probe, welche eine Mehrzahl identischer oder verschiedener Polynucleotidsequenzen in Form von Einzelsträngen ent­ hält, mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Hauptanspruchs. Derartige Verfahren werden verwendet zum Nachweis bestimmter Polynucleotidse­ quenzen, zum Beispiel aus DNA in einer Patientenprobe.

Entsprechende Verfahren zum Nachweis bestimmter Polynucleotidsequenzen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Das hier gattungsbestimmende Verfahren beruht auf der Verwendung einer Test-Polynucleotidsequenz, wel­ che zur nachzuweisenden Polynucleotidsequenz komplementär ist. Kommen die zueinander komplementären, in Form von Einzelsträngen vorliegenden Polynucleotidsequenzen in Kontakt, so binden sie aneinander unter Bildung eines Doppelstrangs. Da die Bindung zwischen den Einzelsträngen im we­ sentlichen über Wasserstoffbrückenbindungen vermittelt werden, liegen die Energien der einzelnen Bindungen zwischen den Einzelsträngen im Bereich von Millielektronenvolt. Mittels geeigneter Nachweisverfahren wird überprüft, ob eine in der Probe enthaltenes Polynucleotidsequenz an die Test-Polynuc­ leotidsequenzen gebunden hat oder nicht.

Die aus dem Stand der Technik vorbekannten Nachweisverfahren, welche auf diesem Nachweisprinzip beruhen, weisen im wesentlichen folgenden Verfahrensablauf auf.

• a) Präparation einer Probe, beispielsweise einer Patientenprobe, welche eine Mehrzahl identischer oder verschiedener Polynucleotidsequenzen, hier X genannt, in Form von Einzelsträngen enthält. Diese Probe kann die nach­ zuweisende Polynucleotidsequenz, hier A genannt, enthalten. Dabei kann die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A mit einer der in der Probe enthaltenen Polynucleotidsequenzen X identisch sein, oder als Baustein in einer solchen Polynucleotidsequenz X enthalten sein.
• b) Präparation eines Testmediums, welches zur nachzuweisenden Polynuc­ leotidsequenz A komplementäre Test-Polynucleotidsequenzen in Form von Einzelsträngen enthält. Im allgemeinen sind diese Test-Poly­ nucleotidsequenzen, im folgenden mit B bezeichnet, auf einem Substrat fixiert.
• c) Die Probe wird mit dem Testmedium in Kontakt gebracht, beispielsweise durch Auftropfen der in Form einer Lösung vorliegenden Probe auf das Substrat, auf welchem die komplementären Test-Polynucleotidsequenzen B fixiert sind. Unter geeigneten Bedingungen binden die eventuell in der Probe enthaltenen nachzuweisenden Polynucleotidsequenzen A an die auf dem Substrat fixierten komplementären Test-Polynucleotidsequenzen B. Eine solche Bindung zwischen den komplementären Polynucleotidse­ quenzen A und B ist sowohl möglich, wenn die Polynucleotidsequenz A in identischer Form in der Probe enthalten ist, als auch wenn die Polynucle­ otidsequenz A als Baustein einer längerkettigen Polynucleotidsequenz X in der Probe enthalten ist.
• d) In einem nun folgenden Nachweisschritt wird überprüft, ob in der in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe zu einem Doppelstrang A-B verbundene Polynucleotidsequenzen A und B enthalten sind. Bei Verwendung eines Substrats, auf welchem die Test-Polynucleotid­ sequenzen B fixiert sind, wird hierzu der Effekt ausgenutzt, dass sich die­ se gepaarten komplementären Polynucleotidsequenzen A und B in stark erhöhter Konzentration an der Oberfläche des Substrats befinden. Um diese zum Doppelstrang gepaarten Polynucleotidsequenzen A-B nachzu­ weisen, sind aus dem Stand der Technik mehrere Nachweisverfahren be­ kannt.

Weite Verbreitung haben Nachweisverfahren gefunden, die auf einer Markie­ rung der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A oder der hierzu komple­ mentären Test-Polynucleotidsequenz B mit Fluoreszenzfarbstoffen beruhen. Liegen derart markierte Polynucleotidsequenzen in verdünnter Form, zum Beispiel in Lösung vor, so wird bei geeigneter Beleuchtung der Lösung nur eine schwache Fluoreszenz beobachtet. Reichert sich die markierte Polynuc­ leotidsequenz jedoch beispielsweise aufgrund einer Anlagerung an eine kom­ plementäre Polynucleotidsequenz, welche auf einem Substrat fixiert ist, im Bereich einer Grenzfläche an, so erhöht sich dort lokal die Dichte der fluo­ reszierenden Moleküle um mehrere Größenordnungen. Bei entsprechender Beleuchtung erscheinen daher diejenigen Bereiche des Substrats, an denen die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A in erhöhtem Masse an das Sub­ strat, genauer an die auf diesem fixierte komplementäre Test-Polynucleotid­ sequenz B, angelagert ist, als deutlich nachweisbar fluoreszierender Bereich der Oberfläche. Mittels quantitativer Bestimmung der Fluoreszenz, bei­ spielsweise mittels fotografischer Aufnahme der Helligkeit der fluoreszieren­ den Bereiche, ist eine quantitative Bestimmung der an die komplementären Test-Polynucleotidesequenzen B gebundenen nachzuweisenden Polynucleo­ tidsequenzen A möglich.

Entsprechende Verfahren haben mittlerweile einen hohen Entwicklungstand erreicht. Die räumlich voneinander getrennte Anordnung verschiedener be­ kannter komplementärer Test-Polynucleotidsequenzen B, B' . . . in Form eines Arrays auf einem Substrat erlauben mittlerweile den gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl verschiedener Polynucleotidsequenzen A, A' . . . in einer Probe.

Entsprechende Verfahren sind beispielsweise aus [Chena 96] und [Chee 96] bekannt.

Jedoch weist die Markierung der Polynucleotidsequenzen mit Fluoreszenz­ farbstoffen eine Reihe wesentlicher Nachteile auf. Einerseits bedeutet es zu­ sätzlichen präparativen Aufwand, entweder die nachzuweisenden Polynucle­ otidsequenzen A oder die dazu komplementären Test-Polynucleotid­ sequenzen B mit geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren. Um die entsprechende Markierung durchführen zu können, sind biochemische Ver­ fahren erforderlich, die einerseits mit hohem Aufwand entwickelt werden müssen und andererseits bei der großtechnischen Anwendung einen weite­ ren Präparationsschritt bedeuten, der zusätzliche Kosten verursacht. Wei­ terhin ist aus Untersuchungen bekannt, dass die Markierung von Polynucle­ otidsequenzen, die in Form von Einzelsträngen vorliegen, mittels Fluores­ zenzfarbstoffen zu Konformationsänderungen des Polynucleotidstrangs füh­ ren können. Solche Konformationsänderungen können trotz vollständiger Komplementarität zweier einzelsträngiger Polynucleotidsequenzen zu einer verringerten Bindungswahrscheinlichkeit zwischen beiden Einzelsträngen führen, da die Konformation der Einzelstränge eine entscheidende Bedeu­ tung für die Bindungswahrscheinlichkeit besitzt. Entsprechende Ergebnisse sind beispielsweise aus [Osaki 92] bekannt.

Weiterhin ist bekannt, dass die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen die Quantifizierbarkeit der Ergebnisse negativ beeinflusst. Dies liegt beispiels­ weise darin begründet, dass die Stärke der Fluoreszenz der Fluoreszenzfarb­ stoffe stark davon abhängt, an welcher Bindungsstelle die Fluoreszenzfarb­ stoffe mit der einzelsträngigen Polynucleotidsequenz verbunden sind. Wei­ terhin können nachfolgende Bearbeitungsschritte zu Schwankungen der Ef­ fizienz des Markierungsprozesses führen. Entsprechende Ergebnisse haben [Zhu 94], [Zhu 97] und [Laramendi 98] präsentiert.

Aus diesen Gründen wäre es wünschenswert, ein im Rahmen des gattungs­ gemäßen Verfahrens einsetzbares Nachweisverfahren für das Vorliegen von in Form eines Doppelstrangs miteinander verbundener Nuclcotidsequenzen A und B zu finden, welches keine zusätzlichen präparativen Schritte erfor­ derlich macht und keine negativen Auswirkungen auf die Gewinnung quan­ titativer Ergebnisse zeigt.

Ein im Vergleich zu der Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen eher physi­ kalischer ausgerichteter Ansatz ist die Untersuchung von einzelsträngig oder in gepaarter Form vorliegenden Polynucleotidsequenzen A und B, die an eine Grenzfläche angelagert sind, mittels spektroskopischer Methoden. So wurde beispielsweise die Methode der Forier-Transformation-Infrarotspektroskopie (kurz FTIR) zur Unterscheidung zwischen einzelsträngig und doppelsträngig vorliegenden Polynucleotidsequenzen vorgeschlagen. Jedoch zeigten die Er­ gebnisse nur eine schwache Abhängigkeit von der eigentlich relevanten Fra­ ge, nämlich, ob die komplementären Polynucleotidsequenzen A und B in Form von Einzelsträngen oder in gepaarter Form vorlagen. Bislang ist nicht zu erkennen, dass mittels der Methode der FTIR ein zuverlässiger und quantitativer Nachweis des Bindungszustands einer nachzuweisenden Poly­ nucleotidsequenz A an eine komplementäre Polynucleotidsequenz B möglich würde.

An dieser Stelle setzt nun die Erfindung ein. Sie hat es sich zur Aufgabe ge­ macht, das gattungsgemäße Verfahren so weiterzuentwickeln, dass auf eine Markierung der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A oder der dazu komplementären Polynucleotidsequenz B, z. B. mittels Fluoreszenzfarbstof­ fen verzichtet werden kann. Gleichzeitig soll gegenüber dem vorbekannten Verfahren, welches auf der Verwendung eines FTIR-basierten Nachweisver­ fahrens des Bindungszustands der Polynucleotidsequenzen A und B basiert, eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit erreicht werden, die einen Nachweis des Bindungszustands zwischen den komplementären Polynucleotidsequen­ zen A und B ermöglicht.

Insbesondere soll das gattungsgemäße Nachweisverfahren auch zur quanti­ tativen Bestimmung der Konzentration der nachzuweisenden Polynucleotid­ sequenz A in der Probe verwendet werden können.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Hauptanspruchs.

Es handelt sich somit um ein Verfahren zum Nachweis einer Polynucleotid­ sequenz A in einer Probe, wobei die Polynucleotidsequenz A in der Probe (auch) in Form von Einzelsträngen vorliegt. Die Probe enthält eine Mehrzahl identischer oder verschiedener Polynucleotidsequenzen X (auch) in Form von Einzelsträngen. Die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A kann dabei mit einer der Polynucleotidsequenzen X identisch sein oder kann in einer der Polynucleotidsequenzen X als Sequenzabschnitt enthalten sein.

Das Nachweisverfahren für die Polynucleotidsequenz A beruht auf der Bin­ dung der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A an eine bekannte, zur Polynucleotidsequenz A komplementäre Test-Polynucleotidsequenz B und an einer Abfrage des Bindungszustands, welcher zwischen den in der Probe enthaltenen Polynucleotidsequenzen X und der Test-Polynucleotidsequenz B vorliegt. Dabei weist das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte auf:

• a) Präparation eines Testmediums, welches zur nachzuweisenden Polynuc­ leotidsequenz A komplementäre Test-Polynucleotidsequenzen B in Form von Einzelsträngen enthält,
• b) In Kontakt bringen der Probe mit dem Testmedium durch Ein- oder Auf­ bringen der Probe in oder auf das Testmedium, so dass die in der Probe enthaltenen Einzelstränge der Polynucleotidsequenzen X an die im Test­ medium enthaltenen komplementären Test-Polynucleotidsequenzen B binden können. Dabei wird eine Bindung zwischen einer bestimmten Po­ lynucleotidsequenz X und der Test-Polynucleotidsequenz B im wesentli­ chen dann auftreten, wenn die bestimmte Polynucleotidsequenz X mit der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A identisch ist oder die nachzu­ weisende Polynucleotidsequenz A als Sequenzabschnitt enthält. Aufgrund der Komplementarität der Polynucleotidsequenzen A und B tritt dann ei­ ne Bindung auf.
• c) Abfrage des Bindungszustandes von Polynucleotidsequenzen X an Test- Polynucleotidsequenzen B durch Ermittlung zumindest einer Komponente des komplexen Brechungsindexes oder einer äquivalenten Größe der mit dem Testmedium in Kontakt befindlichen Probe. Dies geschieht durch Wechselwirkung der in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe mit einfallender elektromagnetischer Strahlung, deren Frequenz im Be­ reich zwischen 0,1 Terahertz (THz) und 20 THz, vorzugsweise zwischen 1 THz und 10 THz liegt. Nach der Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung mit der in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe werden die Eigenschaften der elektromagnetischen Strahlung analysiert, insbesondere im Hinblick auf Auftreten einer Zeit- oder Phasenverzöge­ rung, einer Absorption, einer Refraktion oder Dispersion der einfallenden elektromagnetischen Strahlung verursacht durch die Wechselwirkung mit der in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe.

Da eine Bindung zwischen einer Polynucleotidsequenz X und der Test- Polynucleotidsequenz B im wesentlichen nur dann auftritt, wenn die Test- Polynucleotidsequenz X mit der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A iden­ tisch ist oder diese in identischer Form enthält, ist der Nachweis einer Bindung von Polynucleotidsequenzen X an die Test-Polynucleotidsequenz B ein Nachweis dafür, dass die Probe die nachzuweisende Polynucleotidse­ quenz A entweder in identischer Form enthält oder als Abschnitt einer län­ gerkettigen Polynucleotidsequenz X.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst daher einen Verfahrensschritt (c, der zum Nachweis des Bindungszustands der Test-Polynucleotidsequenz B dient, d. h. zur Abfrage, ob die Test-Polynucleotidsequenz in denaturierter oder in hybridisierter vorliegt. Dieser Verfahrensschritt c) beruht auf der Wechselwirkung der in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe mit elektromagnetischer Strahlung im Terahertzbereich und der Erfassung min­ destens einer Komponente des komplexen Brechungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium beindlichen Probe oder einer dazu äquivalenten Größe wie z. B. Absorption, Transmission oder Reflexion.

In einer ersten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahren wird in ei­ nem nachfolgenden Verfahrensschritt die in Schritt d ermittelte Komponente des komplexen Brechungsindexes oder die dazu äquivalente Größe mit ei­ nem Referenzwert verglichen. Anhand des Vergleichs mit dem Referenzwert ist zumindest eine qualitative, oftmals aber auch eine quantitative Aussage bezüglich des Vorliegens einer Bindung zwischen Polynucleotidsequenzen X und der Test-Polynucleotidsequenz B möglich.

Im Rahmen von Vorversuchen hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, den Realteil des komplexen Brechungsindexes der mit dem Testmedium in Kon­ takt befindlichen Probe als den Bindungszustand kennzeichnende Größe he­ ranzuziehen. Beim Übergang der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A von der in der Probe vorliegenden Einzelstrangform und der im Testmedium in Einzelstrangform vorliegenden komplementären Test-Polynucleotid­ sequenz B zu einem miteinander verbundenen Doppelstrang A-B tritt eine Brechungsindexänderung im THz-Bereich der in Kontakt mit dem Testmedi­ um befindlichen Probe auf, die mittels aus dem Stand der Technik bekann­ ter experimenteller Methoden reproduzierbar auflösbar ist. Daher kann der Realteil des Brechungsindexes als Nachweis für das Vorliegen einer Bindung zwischen der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A und der dazu kom­ plementären Test-Polynucleotidsequenz B verwendet werden. Insbesondere kann dies durch Vergleich mit einem Referenzwert, der sich z. B. auf unge­ paarte Test-Polynucleotidsequenzen B bezieht, geschehen.

Eine Reihe theoretischer Arbeiten beschäftigt sich mit den Anregungszu­ ständen doppelsträngiger Polynucleotidsequenzen, siehe hierzu beispielswei­ se [Zhuang 90], [Young 90] und [Feng 91]. Diese sagen eine Vielzahl mögli­ cher Anregungszustände einzel- und doppelsträngiger Polynucleotidsequen­ zen, beispielsweise in Form von Vibrationsmoden etc. voraus. Dabei tritt eine Vielzahl möglicher Anregungszustände erst in dem Moment auf, in dem sich zwei einzelsträngige Polynucleotidsequenzen zu einem Doppelstrang binden. Ebenso ist es möglich, dass bestimmte Anregungszustände der Einzelstränge nicht mehr auftreten oder stark unterdrückt sind, wenn sie zu einem Dop­ pelstrang binden. Die Energiebereiche, in denen Anregungen der getrennt vorliegenden Einzelstränge auftreten, ist deutlich verschieden von dem Energie­ bereich, in dem Anregungszustände auftreten, die auf das Vorliegen einer doppelsträngigen Polynucleotidsequenz zurückzuführen sind.

Trotz dieser Aussagen, die sich aus den theoretischen Vorarbeiten ergeben, ist bislang eine konkrete Angabe des Energiebereichs, in welchem diese für das Vorliegen einer doppelsträngigen Polynucleotidsequenz typischen Anre­ gungen auftreten, nicht möglich. Es hat sich im Rahmen experimenteller Untersuchungen überraschend gezeigt, dass das Abfragen des Bindungszu­ standes zwischen zwei komplementären einzelsträngigen Polynucleotidse­ quenzen A und B mit hoher Effektivität in dem im Hauptanspruch genann­ ten Frequenzintervall möglich ist.

Aufgrund der theoretischen Arbeiten zu den Anregungszuständen gepaart vorliegender Polynucleotidsequenzen lässt sich die Hypothese aufstellen, dass mittels der Bestimmung mindestens einer Komponente des komplexen Brechungsindexes in dem im Hauptanspruch genannten Frequenzintervall eben diejenigen Anregungszustände der doppelsträngig vorliegenden Poly­ nucleotidsequenz abgefragt werden, welche im wesentlichen durch die Dop­ pelstrang-Konformation der Polynucleotidsequenz verursacht werden. Eine Optimierung des erindungsgemäßen Nachweisverfahrens sollte daher mög­ lich sein, indem die mindestens eine Komponente des komplexen Bre­ chungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe in einem solchen Frequenzbereich erfasst wird, in welchem Anregungszustände entweder nur der in denaturierter, das heißt in doppelsträngiger Form vor­ liegenden Polynucleotidsequenz oder nur der in einzelsträngiger Form vorlie­ genden Polynucleotidsequenz auftreten, die im wesentlichen auf die Doppel­ strangstruktur bzw. Einzelstrangstruktur zurückzuführen ist.

Besondere Vorteile bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah­ rens ergeben sich, wenn die Ermittlung der mindestens einen Komponente des komplexen Brechungsindexes oder der dazu äquivalenten Größe gemäß Verfahrensschritt c) des Hauptanspruchs mittels Terahertzspektroskopie (TS) erfasst wird.

Insbesondere hat es sich im Rahmen von Vorversuchen als besonders vor­ teilhaft herausgestellt, wenn die zur Terahertzspektroskopie verwendete Strahlung gepulst ist, das heißt, die Erfassung mittels gepulster Tera­ hertzspektroskopie (PTS) durchgeführt wird. Besondere Vorteile ergeben sich hierbei, wenn die verwendeten Terahertzpulse eine Pulsdauer zwischen 0,05 Picosekunden und 10 Picosekunden aufweisen. Um mindestens eine Kom­ ponente des komplexen Brechungsindexes oder einer dazu äquivalenten Größe im Rahmen der PTS zu erfassen, werden im Rahmen dieses Verfah­ rens die Pulse nach ihrer Wechselwirkung mit der in Kontakt mit dem Test­ medium beindlichen Probe zeitaufgelöst detektiert. Die zur gepulsten Tera­ hertzspektroskopie erforderlichen Techniken sind aus dem Stand der Tech­ nik bekannt. Die grundlegenden Techniken und Methoden sind beispielswei­ se in [Smith 88], [Nuss 98] und [Haring 99] beschrieben. Weitere Informati­ onen zur zeitaufgelösten PTS können auch [Wittlin 95] entnommen werden.

Die Generierung der erforderlichen gepulsten elektromagnetischen Strahlung in dem im Hauptanspruch angegebenen Frequenzbereich mit zur Durchfüh­ rung zeitaufgelöster Messungen geeigneter Pulsdauer kann beispielsweise mittels in Halbleitertechnik aufgebauten fotoleitenden Schaltern (photocon­ ductive switches) geschehen. Zur Generierung der Pulse im Terahertzbereich werden diese fotoleitenden Schalter mittels ultrakurzer Laserpulse, deren Dauer im Bereich von einigen 10 Femtosekunden liegt, und deren Wellen­ länge typisch im Bereich des nahen Infraroten liegt, hier insbesondere zwi­ schen 700 und 900 Nanometern, bestrahlt. Die zugrundeliegenden Mecha­ nismen können beispielsweise [Katzenellenbogen 92] entnommen werden. Insbesondere können zur Verbesserung der Ausstrahlungscharakteristik der Terahertzstrahlung geeignete Antennen verwendet werden, die in der Nähe des fotokonduktiven Schalters angeordnet werden und die Abstrahlungsei­ genschaften der THz-Quelle verbessern.

Der grundsätzliche Aufbau eines Systems zur Durchführung der zeitaufge­ lösten PTS kann beispielsweise [Cai 98] entnommen werden.

Grundsätzlich wird die zeitaufgelöste PTS wie folgt durchgeführt:

• 1. Generierung gepulster elektromagnetischer Strahlung, deren Frequenz im Terahertzbereich liegt, und deren Pulsdauer typisch 0,5 bis 5 Picosekun­ den beträgt. Insbesondere werden Pulse verwendet, deren Frequenzbreite etwa 1 bis 5 Gigahertz beträgt.
• 2. Die gepulste Terahertzstrahlung wird mittels geeigneter Strahlführungs­ einrichtungen zur Probe geführt.
• 3. Die gepulste Terahertzstrahlung wird in Wechselwirkung mit der zu un­ tersuchenden Probe gebracht, die sich in Kontakt mit dem Testmedium befindet.
• 4. Nach der Wechselwirkung mit der Probe wird die gepulste Tera­ hertzstrahlung mittels geeigneter Strahlführungseinrichtungen zu einem Detektor geleitet.
• 5. Im Detektor wird die einfallende gepulste Terahertzstrahlung, welche mit der Probe in Wechselwirkung gestanden hat, analysiert. Insbesondere wird der zeitliche Verlauf der im Detektor einfallenden Pulse zeitaufgelöst erfasst. Diese zeitaufgelöste Erfassung erfolgt vorzugsweise relativ zu Te­ rahertzpulsen, welche nicht mit der Probe in Wechselwirkung gekommen sind.

Zur zeitaufgelösten Erfassung der Terahertzpulse nach der Wechselwirkung mit der Probe sind zwei verschiedene Verfahren bekannt. Ein erstes Verfah­ ren beruht auf der Veränderung der optischen Eigenschaften eines elektro­ optischen Kristalls, welcher vom Terahertzpuls durchlaufen wird. Diese Ver­ änderung der optischen Eigenschaften des elektrooptischen Kristalls werden mittels eines zeitlich gesehen kürzeren Pulses im Bereich des sichtbaren Spektrums oder des nahen Infrarot, insbesondere mittels Femtosekunden­ pulsen im nahen Infrarot, zeitaufgelöst abgefragt.

In einem alternativen Zugang werden die Änderungen der Leitfähigkeit eines wiederum in Halbleitertechnik ausgeführten fotokonduktiven Schalters als Folge einfallenden Terahertzpulse auf rein elektronischem Wege zeitaufgelöst abgefragt. Beide Verfahren sind zueinander äquivalent und können im Rah­ men des hier beanspruchten Verfahrens alternativ verwendet werden. Ein­ zelheiten zur zweiten Methode können beispielsweise [Dahl 1998] entnom­ men werden.

Mittels geeigneter Fouriertransformationsverfahren kann aus dem zeitauf­ gelösten Verlauf der Terahertzpulse, welche mit der Probe in Wechselwir­ kung gestanden haben, beispielsweise der Intensitätsverlauf der Terahertz­ pulse als Funktion der Frequenz ermittelt werden. Durch Vergleich des In­ tensitätsverlaufs eines Pulses, welcher mit der Probe in Wechselwirkung ge­ standen hat, mit dem Intensitätsverlauf eines Referenzpulses, welcher nicht mit einer Probe in Wechselwirkung war, kann direkt die (frequenzabhängige) Transmission der Terahertzpulse durch die Probe erfasst werden. Auf diese Weise kann die Transmission durch eine zu untersuchende Probe mit der Transmission durch eine Probe verglichen werden, die sicher keine Mole­ kühle des nachzuweisenden Polynucleotids A enthält. Eine eventuell auftre­ tende Schwächung oder Zunahme der Intensität der durch die Probe trans­ mittierten Terahertzpulse relativ zur Referenz kann damit direkt als Nach­ weis dafür herangezogen werden, ob die in der Probe, welche sich in Kontakt mit dem Testmedium befindet, enthaltenen Polynucleotidsequenzen X in Ge­ genwart der Test-Polynucleotidsequenzen B weiterhin in einzelsträngiger Form vorliegen, das heißt, hybridisiert sind, oder ob sie sich zumindest zum Teil mit den Test-Polynucleotidsequenzen B zu Doppelsträngen verbunden haben, das heißt, nunmehr in denaturierter Form vorliegen. Eine eventuelle Intensitätsänderung ist dabei ein Maß für die Absorption, welche in der in Kontakt mit dem Testmedium beindlichen Probe auftritt und ist damit äqui­ valent zum Imaginärteil des komplexen Brechungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe.

Alternativ zur Erfassung der Absorption und damit des Imaginärteils des komplexen Brechungsindexes kann auch der Realteil des imaginären Bre­ chungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium beindlichen Probe er­ fasst werden, insbesondere auch eine Änderung des Realteils des komplexen Brechungsindexes. Auch eine solche Änderung des Realteils des komplexen Brechungsindexes kann zum Nachweis dafür verwendet werden, ob die in der Probe enthaltenen Polynucleotide X im wesentlichen in hybridisierter oder in denaturierter Form vorliegen, nachdem die Probe in Kontakt mit dem Testmedium gebracht wurde. Weitere Details hierzu ergeben sich aus den Ausführungsbeispielen.

Alternativ zur Verwendung der gepulsten Terahertzspektroskopie PTS, hier vorzugsweise zeitaufgelöst, kann die in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchzuführende Ermittlung der mindestens einen Komponente des komplexen Brechungsindexes oder der dazu äquivalenten Größe auch mittels Wechselwirkung der Probe mit Terahertzstrahlung durchgeführt wer­ den, die schmalbandig ist und frequenzaufgelöst detektiert wird. Insbeson­ dere kommen hierzu beispielsweise Transmissionsmessungen kontinuierli­ cher oder quasikontinuierlicher, das heißt schmalbandiger Terahertzstrah­ lung durch die in Kontakt mit dem Testmedium befindliche Probe hindurch in Frage. Weiterhin kann mittels Diffraktionsmessungen direkt der Realteil des komplexen Brechungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium be­ findlichen Probe vermessen werden. Schließlich kommen auch alle aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren in Frage, welche zur Erfassung mindestens einer Komponente des komplexen Brechungsindexes oder einer dazu äquivalenten Größe mittels schmalbandiger Terahertzstrahlung geeig­ net sind.

Wird die verwendete schmalbandige Terahertzstrahlung frequenzaufgelöst detektiert, so ist eine Übertragung der aus der Optik bekannten Streume­ thoden wie Ramanstreuung bzw. Brillouinstreuung an Molekülen im Tera­ hertzbereich möglich. Auch mittels entsprechender Streuversuche können die Komponenten des komplexen Brechungsindexes oder dazu äquivalente Größen in dem im Hauptanspruch genannten Frequenzintervall ermittelt werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der gepulsten Terahertzspektroskopie PTS sind wiederum mehrere Möglich­ keiten denkbar, in welcher Weise die zu untersuchende Probe, welche sich in Kontakt mit dem Testmedium befindet, in Wechselwirkung mit der gepulsten Terahertzstrahlung gebracht werden kann.

In einer ersten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens propagiert die gepulste Terahertzstrahlung nach ihrer Erzeugung mittels einer dazu ge­ eigneten THz-Quelle frei, bis sie in Wechselwirkung mit der in Kontakt mit dem Testmedium beindlichen Probe gebracht wird. Nach der Wechselwir­ kung propagiert die gepulste Terahertzstrahlung wiederum frei, bis sie zu ei­ nem THz-Detektor gelangt. Dieses Verfahren wird im folgenden als "Frei­ strahlanordnung" bezeichnet.

Alternativ hierzu kann eine sogenannte "Nahfeldanordnung" realisiert wer­ den. Diese beruht auf der Erkenntnis, dass eine besonders hohe Intensität der für das erfindungsgemäße Verfahren erforderlichen Terahertzstrahlung im Nahfeld von speziell hierzu geeigneten Nahfeldemittern erzielt werden kann. In einer weiteren Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher die erforderliche Terahertzstrahlung mittels eines Nahfeldemitters in unmittelbarer Nähe der in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe generiert. Nach der Wechselwirkung der Terahertzstrahlung mit der im Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe kann die Terahertzstrah­ lung mittels konventioneller Strahlführungsmethoden zu einem geeigneten Detektor geführt werden.

Alternativ hierzu ist auch eine komplementäre Anordnung möglich, bei der die Terahertzstrahlung mittels eines konventionellen Terahertzemitters er­ zeugt wird und mittels konventioneller Strahlführungsvorrichtungen wie z. B. metallischer Spiegel zur in Kontakt mit dem Testmedium befindlichen Probe geführt werden. Nach der Wechselwirkung der Terahertzstrahlung mit der in Kontakt mit dem Testmedium beindlichen Probe kann die Tera­ hertzstrahlung mittels eines geeigneten Terahertznahfelddetektors detektiert und analysiert werden.

Beide Ausbildungen der Nahfeldanordnung bieten den Vorteil, dass eine ho­ he Ortsauflösung erzielt werden kann, die besonders dann von Vorteil ist, wenn die nachzuweisenden hybridisierten oder denaturierten Polynucleotid­ sequenzen auf ein Substrat aufgebracht sind, insbesondere wenn die Test- Polynucleotidsequenz B auf einem Substrat fixiert ist. Analog zu den aus dem Stand der Technik bekannten Array-Nachweisverfahren zur gleichzeiti­ gen Analyse einer Probe auf verschiedene Polynucleotidsequenzen A, A' . . . ei­ nem Substrat kann die Probe anhand der zusätzlich verfügbaren Ortsinfor­ mation auf das Vorhandensein einer Vielzahl verschiedener Polynucleotidse­ quenzen A gleichzeitig untersucht werden.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfah­ rens propagiert die zur Spektroskopie erforderliche Terahertzstrahlung vor, während oder nach der Wechselwirkung mit der in Verbindung mit dem Testmedium befindlichen Probe auf oder in einem Wellenleiter. Hierdurch ergibt sich eine sehr hohe Effizienz der Strahlführung. Weiterhin können mittels vorbekannter Strukturierungsverfahren, beispielsweise aus dem Be­ reich der Halbleitertechnik, miniaturisierte Vorrichtungen realisiert werden, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.

Schließlich ergeben sich besondere Vorteile bei der Durchführung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens, wenn die Wellenleiterstruktur im Bereich der in Verbindung mit dem Testmedium befindlichen Probe so ausgebildet ist, dass sich aufgrund veränderter Eigenschaften der Terahertzstrahlung in diesem Bereich eine erhöhte Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt. Insbesondere kann die Wellenleiterstruktur hierzu im Bereich der in Verbin­ dung mit dem Testmedium befindlichen Probe eine Resonatorstruktur auf­ weisen, welche die Feldstärke der Terahertzstrahlung lokal erhöht. Weiterhin ist es möglich, mittels geeigneter Wellenleiterstrukturen, beispielsweise mit­ tels eines Frequenzfilters, die Wellenleitereigenschaften dergestalt zu beein­ flussen, dass sie frequenzabhängig werden. Hierdurch kann beispielsweise eine scharfe Kante in der frequenzabhängigen Transmission durch die Wel­ lenleiterstruktur erzeugt werden, welche durch zumindest eine Komponente des komplexen Brechungsindexes der in Verbindung mit dem Testmedium stehenden Probe oder einer hierzu äquivalenten Größe beeinflusst werden kann. Insbesondere kann beispielsweise durch eine Änderung des komple­ xen Brechungsindexes, beispielsweise durch eine Änderung der Absorption, eine Verschiebung der Frequenzkante auftreten.

In Analogie zu den aus dem Stand der Technik vorbekannten Nachweisver­ fahren für Polynucleotidsequenzen, welche auf der Markierung der nachzu­ weisenden Polynucleotidsequenz A mittels Fluoreszenzfarbstoffen beruhen, hat es sich als besonders vorteilhaft zur Durchführung des erfindungsgemä­ ßen Verfahrens erwiesen, wenn die im Testmedium enthaltenen komple­ mentären Test-Polynucleotidsequenzen B auf oder in einem Substrat fixiert sind. Auf diese Weise kann eine hohe Konzentration der nachzuweisenden Polynucleotidsequenzen A im denaturierten Zustand an derjenigen Oberflä­ che erzielt werden, an welcher die komplementären Test-Polynucleotid­ sequenzen B fixiert sind. Insbesondere in Verbindung mit oberflächen- oder grenzflächensensitiven Nachweisverfahren für das Vorliegen denaturierter Polynucleotidsequenzen, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgeführt werden, ist eine solche erhöhte Konzentration an der Grenzfläche vorteilhaft.

In einer weiteren Verbesserung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nach Verfahrensschritt b) die in der Probe enthaltenen, aber nicht an die komplementären Test-Polynucleotidsequenzen B gebundenen Polynucleotid­ sequenzen X vor der Ermittlung der zumindest einen Komponente des kom­ plexen Brechungsindexes oder der dazu äquivalenten Größe vom Testmedi­ um entfernt. Insbesondere kann dies mittels Abwaschen des in Kontakt mit der Probe beindlichen Testmediums geschehen. Dieser zusätzliche Zwi­ schenschritt vermeidet Probleme, welche dadurch verursacht werden kön­ nen, dass in der Probe selbst nicht nur die nachzuweisende einzelsträngige Polynucleotidsequenz A enthalten sein kann, sondern auch die dazu kom­ plementäre Polynucleotidsequenz B in Form von Einzelsträngen. Ein solches gleichzeitiges Vorliegen der komplementären Polynucleotidsequenzen A und B kann beispielsweise durch vorangegangene Verfahrensschritte zur Hybri­ disierung von in der Probe enthaltenen Polynucleotidsequenzen X und nachfolgender ungenügender Trennung der Einzelstränge verursacht wer­ den.

Vorzugsweise wird dabei das Testmedium dergestalt abgewaschen, dass die in der Probe enthaltenen Polynucleotidsequenzen X, welche an die vorzugs­ weise auf einem Substrat fixierten komplementären Polynucleotidsequenzen B gebunden sind, haften bleiben, während der Rest der Probe entfernt wird.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens wird eine Mehrzahl N verschiedener Polynucleotidsequenzen A (1), . . .., A (N) in der Probe gleichzeitig nachgewiesen. Hierzu wird eine Mehrzahl N von Testmedien präpariert, die jeweils eine zu den nachzuweisenden Poly­ nucleotidsequenzen A (1), . . ., A (N) komplementäre Test-Polynucleotid­ sequenz B (1), . . ., B (N) enthält. Dabei werden die Testmedien an voneinan­ der verschiedenen Orten auf oder in einem Substrat fixiert. Mittels der Ver­ fahrensschritte b) und c) wird nunmehr für jedes einzelne, in Verbindung mit der Probe befindliche Testmedium zumindest eine Komponente des komplexen Brechungsindexes oder einer dazu äquivalenten Größe ermittelt. Dies kann mittels lokal auflösender Nachweisverfahren realisiert werden. Insbesondere können hierzu die Wechselwirkung mit fokussierter Tera­ hertzstrahlung oder die Verwendung von Terahertz-Nahfeldemittern oder- Nahfeldprobern herangezogen werden.

Weitere Vorteile und Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie den nun folgenden Ausführungsbei­ spielen, welche nicht einschränkend zu verstehen sind und anhand der Zeichnung erläutert werden. In dieser zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Freistrahlanordnung,

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer ersten Nahfeldanord­ nung,

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer zweiten Nahfeldanord­ nung,

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer weiteren Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, einen Wellenlei­ ter für die Terahertzstrahlung umfassend,

Fig. 5a eine Vorrichtung gemäß Fig. 4, wobei in den Wellenleiter eine Re­ sonatorstruktur integriert ist,

Fig. 5b eine Vorrichtung gemäß Fig. 4, wobei in den Wellenleiter eine Fil­ terstruktur integriert ist,

Fig. 6 ein zweidimensionales Array von Wellenleiterstrukturen beispiels­ weise gemäß Fig. 4,

Fig. 7a Ergebnisse einer Transmissionsmessung mittels zeitaufgelöster Te­ rahertzspektroskopie durch eine Probe, welche eine nachzuweisende Polynucleotidsequenz in denaturierter Form enthält,

Fig. 7b Ergebnisse einer Transmissionsmessung durch eine Probe, welche die nachzuweisende Polynucleotidsequenz in hybridisierter Form enthält,

Fig. 8 den frequenzabhängigen Verlauf des Realteils des komplexen Bre­ chungsindexes einer Probe, die nachzuweisende Polynucleotidse­ quenz in hybridisierter oder denaturierter Form enthält und

Fig. 9 die Ergebnisse einer Transmissionsmessung durch eine planare Wellenleiterstruktur.

Fig. 1 zeigt eine erste Anordnung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Als Probe 1 wird eine wässrige Lösung verwendet, in der ver­ schiedene, in Form von Einzelsträngen vorliegende, d. h. denaturierte Poly­ nucleotidsequenzen X gelöst sind. Nachzuweisen ist, ob in der Probe 1 eine bestimmte einzelsträngige Polynucleotidsequenz A enthalten ist. Dabei kann A entweder mit einer der Polynucleotidsequenzen X identisch sein oder in dieser in identischer Form enthalten sein, d. h. entweder

X = A
oder
X = Y Z A V Z

wobei V, Y, Z beliebige andere Polynucleotidsequenzen darstellen können.

Die Probe 1 ist auf die Oberfläche eines Substrats 2 aufgebracht, welches aus einem Saphir-Plättchen mit einer Dicke von ca. lmm besteht. Auf der Substratoberfläche 2 sind einzelsträngige Test-Polynucleotidsequenzen B fi­ xiert, welche zur nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A komplementär sind. Das Substrat 2 bildet gemeinsam mit den darauf fixierten Test- Polynucleotidsequenzen B das Testmedium 4.

Die in der Probe 1 enthaltenen Polynucleotidsequenzen X gelangen in der wässrigen Lösung an die Oberfläche des Substrats 2 und damit der darauf fixierten Test-Polynucleotidsequenzen B. Ist eine der Polynucleotidsequenzen X mit A identisch oder A in X in identischer Form enthalten, so kann diese Polynucleotidsequenz X an eine Test-Polynucleotidsequenz B binden, d. h. in Verbindung mit B eine hybridisierte (also doppelsträngige) Polynucleotidse­ quenz X-B bilden. Da eine Bindung zwischen X und B nur auftritt, wenn A mit X identisch ist oder A in X als Sequenzabschnitt enthalten ist, liegt somit die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A in hybridisierter Form in der in Kontakt mit dem Testmedium 4 befindlichen Probe 1 vor. Da B an der Ober­ fläche des Substrats 4 fixiert ist, ist auch die doppelsträngige Polynucleotid­ sequenz X-B an der Oberfläche fixiert. Im Laufe der Zeit nimmt daher die Konzentration der die gesuchte Polynucleotidsequenz A enthaltenden oder mit dieser identischen einzelsträngigen Polynucleotidsequenzen X in der Probelösung ab, gleichzeitig steigt die Konzentration der doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen X-B an der Substratoberfläche. An der Substrat­ oberfläche wird damit eine starke Anreicherung von A gegenüber der Probe 1 erreicht.

Mittels geeigneter Verfahren wird nunmehr unter Verwendung elektromag­ netischer Strahlung im Frequenzbereich zwischen 0,1 THz und 20 THz zu­ mindest eine Komponente des komplexen Brechungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium 4 befindlichen Probe 1 oder eine dazu äquivalente Größe bestimmt.

Um den Einfluss eventuell noch in der wässrigen Probe 1 enthaltener weite­ rer Polynucleotidsequenzen auf diese Verfahren zu minimieren, ist es vor­ teilhaft, das Substrat 2 abzuwaschen und zu trocken, so dass möglichst nur noch die an die Test-Polynucleotidsequenzen B gebundenen Polynucleotid­ sequenzen X aus der Probe auf der Substratoberfläche verbleiben, während der Rest der Probe 1 einschließlich des Lösungsmittels, hier Wasser, entfernt wird. Es entsteht an der Substratoberfläche ein dünner Film, der im wesent­ lichen nur noch aus doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen X-B und eventuell Einlagerungen von Wasser besteht.

Mittels einer THz-Quelle 6 wird nunmehr breitbandige gepulste elektromag­ netische Strahlung erzeugt, deren Frequenz im Frequenzintervall zwischen 0,1 THz und 20 THZ liegt. Typische Pulsdauern liegen zwischen 0,01 Picose­ kunden (ps) und 10 ps, die Pulswiederholraten liegen im Bereich von mehre­ ren 10 bis 100 MHz.

Die gepulste THz-Strahlung wird mittels geeigneter Mittel zur Strahlführung 8 zum Substrat 2 geführt und auf dieses abgebildet. Insbesondere wird der­ jenige Bereich des Substrats 2 bestrahlt, in dem sich die doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen X-B an der Substratoberfläche angereichert haben, falls die gesuchte Polynucleotidsequenz A in der Probe 1 enthalten war. Zur Strahlführung kommen beispielsweise metallische Hohlspiegel in Frage.

Die in Kontakt mit dem Testmedium 4 befindliche Probe 1, hier also der fragliche Bereich der Substratoberfläche, insbesondere die hierin enthalte­ nen, entweder denaturierten Test-Polynucleotidsequenzen B oder hybridi­ sierten doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen X-B, wird der THz- Strahlung ausgesetzt und wechselwirkt mit dieser. Hieraus ergeben sich Än­ derungen der eingestrahlten THz-Strahlung, welche einen Rückschluss auf das Vorliegen oder die Abwesenheit von doppelsträngigen Polynucleotidse­ quenzen X-B zulassen und damit auf das Vorliegen der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A in der Probe 1.

Nach der Wechselwirkung mit der in Kontakt mit dem Testmedium 4 beind­ lichen Probe 1 wird die durch das Substrat 2 transmittierte THz-Strahlung wiederum mittels geeigneter Mittel zur Strahlführung 8 von der Probe 1 zu einem THz-Detektor 10 geführt und dort analysiert. Fig. 1 zeigt daher eine Freistrahl-Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah­ rens, bei der die THz-Strahlung vor und nach der Wechselwirkung mit der in Kontakt mit dem Testmedium 4 beindlichen Probe 1 frei propagiert.

Eine alternative Anordnung ist aus Fig. 2 ersichtlich. Bei gleicher Anord­ nung der Probe 1 auf dem Substrat 2 wird die THz-Strahlung in unmittelba­ rer Nähe der Substratoberfläche, insbesondere desjenigen Bereichs, in dem die Test-Polynucleotidsequenzen B fixiert sind, mittels eines relativ zur Sub­ stratoberfläche frei positionierbaren THz-Nahfeldemitters 12 erzeugt. Ein solcher THz-Nahfeldemitter 12 kann eine z. B. in Halbleitertechnik ausge­ führte miniaturisierte THz-Quelle sein, welche insbesondere mit einer THz- Antenne zur gerichteten Abstrahlung von THz-Strahlung kombiniert sein kann. Eine THz-Quelle 6 mit Abmessungen, die deutlich unter der Wellen­ länge der THz-Strahlung liegen, ein sogenannter THz-Nahfeldemitter 12 kann beispielsweise mit Techniken realisiert werden, die aus der nahfeldop­ tischen Mikroskopie bekannt sind. Hierzu wird auf die Vielzahl von Veröf­ fentlichungen zum Thema "scanning nearfield optical microscopy" (kurz: SNOM) verwiesen.

Grundsätzlich wird in der Nahfeldoptik angestrebt, auch bei optischen Nachweisverfahren ein Auflösungsvermögen unterhalb der Wellenlänge des verwendeten Lichts zu erzielen. Dies ist mittels spezieller optischer Nahfeld­ emitter möglich, die in ihrem optischen Nahfeld, welches sich nur einige 10 Nanometer von der Emissionsfläche des Nahfeldemitters erstreckt, eine Kon­ zentration der abgestrahlten Intensität in einem Strahlungsbündel erzielen, welches einen Durchmesser aufweist, der um zumindest eine Größenord­ nung unterhalb der Wellenlänge der emittierten Strahlung liegt. Bringt man einen Nahfeldemitter in einem solchen Abstand vor eine Probe, dass die Pro­ be im Nahfeld des Nahfeldemitters liegt, so ist eine hoch-ortsaufgelöste Ab­ frage optischer Eigenschaften der Probe möglich.

Wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens in analoger Weise ein THz-Nahfeldemitter 12 verwendet, so können die "THz-optischen" Eigen­ schaften der hier zu untersuchenden Probe 1 in gleicher Weise mit hoher Ortsauflösung erfasst werden. Insbesondere kann der komplexe Bre­ chungsindex der Probe 1, zumindest eine Komponente hiervon, oder eine hierzu äquivalente Größe mit hoher Ortsauflösung abgefragt werden.

Die vom THz-Nahfeldemitter 12 emittierte THz-Strahlung trifft auf die mit dem Testmedium 4 in Kontakt befindliche Probe 1 und wechselwirkt mit die­ ser. Nach der Wechselwirkung mit der Probe 1 wird die transmittierte THz- Strahlung wiederum mittels geeigneter Mittel zur Strahlführung 8 zu einem THz-Detektor 10 geführt und von diesem detektiert.

Im Vergleich zu der in Fig. 1 gezeigten Anordnung kann mit der in Fig. 2 gezeigten Anordnung daher eine deutlich erhöhte räumliche Auflösung er­ zielt werden, welche Vorteile bei der Miniaturisierung der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Vorrichtung, sowie bei der simultanen Durchführung des Verfahrens an einer Vielzahl von Proben 1 oder mittels einer Vielzahl von Testmedien 4 bietet.

Eine vergleichbar hohe Auflösung bietet auch die aus Fig. 3 ersichtliche Vor­ richtung zur Durchführung des Verfahrens. Erzeugung und Strahlführung der THz-Strahlung zur Probe 1 sowie Wechselwirkung der THz-Strahlung mit der Probe entspricht derjenigen in Fig. 1. Jedoch wird die durch die in Kon­ takt mit dem Testmedium 4 befindliche Probe 1 transmittierte THz- Strahlung nunmehr mittels eines frei positionierbaren THz-Nahfelddetektors 14 mit hoher Ortsauflösung detektiert. Dabei weist der THz-Nahfelddetektor 14 analoge "nahfeldoptische" Eigenschaften auf wie der Nahfeldemitter 12 in Fig. 2 und ist im Nahfeld der Probe angeordnet.

Fig. 4 zeigt einen alternativen Zugang zur Durchführung des erfindungsge­ mäßen Verfahrens auf. In das Substrat 4, auf welches die zu untersuchende Probe 1 aufgetropft ist, ist eine Wellenleiterstruktur 16 für die THz- Strahlung integriert, längs der die THz-Strahlung propagieren kann. Die Probe 1 ist auf die Oberfläche der Wellenleiterstruktur 16 aufgebracht. Da das Feld der THz-Strahlung als evaneszente Welle auch aus der Wellenleiter­ struktur 16 senkrecht zu deren Oberfläche herausreicht, kann die längs des Wellenleiters 16 propagierende THz-Strahlung mit der Probe 1 zumindest im oberflächennahen Bereich der Wellenleiterstruktur 16 wechselwirken. Tat­ sächlich ist die Feldstärke der evaneszenten Welle an der Oberfläche der Wellenleiterstruktur 16 sogar erhöht gegenüber frei im Raum propagierender THz-Strahlung.

Nach der Wechselwirkung der THz-Strahlung mit der zu untersuchenden Probe 1 wird die längs der Wellenleiterstruktur transmittierte THz-Strahlung mittels eines geeigneten THz-Detektors 10 detektiert. Dieser kann entweder analog zu dem aus Fig. 1 ersichtlichen THz-Detektor 10 für frei propagieren­ de THz-Strahlung ausgebildet sein, oder alternativ z. B. in Halbleitertechnik in die Wellenleiterstruktur 16 integriert sein.

Fig. 5a zeigt eine Wellenleiterstruktur 16, in welche zusätzlich eine Resona­ torstruktur 18 integriert ist, welche resonant für die verwendete THz- Strahlung ist. Im Bereich der Resonatorstruktur 18 ergibt sich eine stark er­ höhte Feldstärke der in der Wellenleiterstruktur propagierenden THz- Strahlung. Bringt man die Probe 1 im Bereich der Resonatorstruktur 18 auf den Wellenleiter auf, so ist dort die Feldstärke der evaneszenten Welle nochmals erhöht, woraus sich eine erhöhte Sensitivität der Anordnung auf­ grund eines verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnisses ergibt.

Fig. 5b zeigt eine weitere Wellenleiterstruktur, in welche ein frequenzselekti­ ves Element 20, z. B. ein Kurzpassfilter für die längs der Wellenleiterstruktur propagierende THz-Strahlung integriert ist. Dieses frequenzselektive Element weist bezüglich seiner Transmissivität für THz-Strahlung zumindest eine scharfe Abschneidekante auf. Die genaue Lage dieser Abschneidekante wird durch die Eigenschaften des frequenzselektiven Elements 20 bestimmt und kann unter anderem auch stark von den Oberflächeneigenschaften des Sub­ strats, in oder auf welchem das frequenzselektive Element 20 ausgebildet ist, abhängig sein. Veränderungen an der Substratoberfläche, z. B. des Realteils des komplexen Brechungsindexes einer oberflächennahen Schicht durch Anlagerung von Polynucleotidsequenzen X an die dort fixierten Test- Polynucleotidsequenzen B, kann zu einer starken Veränderung der Eigen­ schaften des frequenzselektiven Elements 20 führen, insbesondere zu einer Verschiebung der Abschneidekante. Diese Verschiebung kann wiederum ausgenutzt werden, um zumindest eine Komponente des komplexen Bre­ chungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium 4 befindlichen Probe oder eine dazu äquivalente Größe, hier z. B. eine veränderte Transmission der THz-Strahlung durch das frequenzselektive Element 20, zu erfassen.

Schließlich ist aus Fig. 6 ein 2-d Array von Wellenleiterstrukturen 16 er­ sichtlich, welche den aus Fig. 4 ersichtlichen Aufbau aufweisen. Als THz- Detektoren 10 werden elektrooptische Kristalle verwendet ("EO-Proben"), de­ ren durch einfallende THz-Strahlung beeinflusste optischen Eigenschaften mittels geeigneter Verfahren zeitaufgelöst erfasst werden. Zur optimalen Einkopplung der längs der Wellenleiterstruktur 16 propagierenden THz- Strahlung können diese EO-Prober frei auf der Oberfläche des Substrats 2 positioniert werden. Das aus Fig. 6 ersichtliche Array ermöglicht eine paral­ lele Durchführung des erindungsgemäßen Verfahrens an einer Vielzahl ver­ schiedener Proben 1 oder mittels einer Vielzahl verschiedener Testmedien 4.

Alle voranstehend beschriebenen Anordnungen beruhen auf der Detektion und Analyse transmittierter THz-Strahlung. Selbstverständlich sind alle An­ ordnungen in analoger Weise auch in Reflexion möglich, ebenso kann bei der Wechselwirkung mit der Probe 1 gestreute THz-Strahlung detektiert und analysiert werden.

Versuchsreihe 1

In einer ersten Versuchsreihe wurde des Vorliegen einer bestimmten (DNA-)Poly­ nucleotidsequenz A in denaturierter oder hybridisierter Form in einer Probe untersucht. Als nachzuweisende Polynucleotidsequenz wurde hierzu der Vector "pcDNA3" (bezogen von Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ausge­ wählt, der eine Größe von 5,4 kB aufweist. Der Vektor wurde in E.coli ampli­ iiziert und unter Verwendung des Nucleobond-PC500-Systems (bezogen von Macherey-Nagel, Düren, BRD) gereinigt. Die Konzentration der (DNA-)Poly­ nucleotidsequenz A, d. h. des Vektors peDNA3, wurde in einer ersten Probe auf 17 µg/µl und in einer zweiten Probe auf 5 µg/µl in zweifach destilliertem Wasser eingestellt.

Die in der Probe in doppelsträngiger Form vorliegenden (DNA-)Polynucleo­ tidsequenzen wurden in einem Teil der Probelösungen denaturiert, indem die Temperatur der Probelösung über einen Zeitraum von 5 Minuten auf 95°C erhöht wurde. Der Denaturierungsprozess wurde durch Abkühlung mittels Eis schockartig gestoppt, um eine Renaturierung der nunmehr in ein­ zelsträngiger Form vorliegenden (DNA-)Polynucleotide zu unterdrücken. In derjenigen Lösung, in der der Denaturierungsprozess abrupt gestoppt wurde, lag somit das nachzuweisende Polynucleotid A in Form separierter Einzelstränge vor. In der Terminologie des Hauptanspruchs enthielt diese Lösung daher gleichzeitig das nachzuweisende (einzelsträngige)Polynucleo­ tid A und das dazu komplementäre Test-Polynucleotid B in Form der vonein­ ander getrennten Einzelstränge des Vektors pcDNA3.

In derjenigen Lösung, in der keine Denaturierung des Vektors pcDNA3 vor­ genommen wurde, lag in der Terminologie des Hauptanspruchs somit das nachzuweisende (einzelsträngige)Polynucleotid A in an das komplementäre Test-Polynucleotid B gebundener Form in der Probelösung vor.

In beiden Fällen stellte somit die Probelösung die Probe 1 im Sinne des Hauptanspruchs dar, die sich in Kontakt mit dem Testmedium 4 befand.

In einer ersten Versuchsreihe wurden Untersuchungen an den Polynucleo­ tidproben in Freistrahlanordnung durchgeführt. Hierzu wurden 2 µl große Tropfen der Probelösung, welche Polynucleotide in denaturierter oder hybri­ disierter Form in einer Konzentration von 17 µg/µl enthielten, auf Saphir- Substrate aufgebracht und 48 Stunden getrocknet, um die Restfeuchte auf unter 1% zu reduzieren. Der Wassergehalt der Proben hat sich in Untersu­ chungen von [Markelz 00] als relevant für den Brechungsindex der Proben im THz-Bereich herausgestellt. Nach dem Eintrocknen der Tropfen ergaben sich dünne Filme mit einem Durchmesser von etwa 2 mm und einer Dicke von etwa 30 µm.

An den präparierten dünnen Filmen wurden Transmissionsmessungen bei 300 Kelvin in trockener Atmosphäre durchgeführt. Hierzu wurde ein Stan­ dard-Aufbau zur zeitaufgelösten gepulsten Terahertzspektroskopie verwen­ det, wie er aus beispielsweise aus [Smith 88] bekannt ist. Als Lichtquelle zur Erzeugung der THz-Pulse wurde ein kommerzielles Femtosekunden- Ti : Saphir-Lasersystem verwendet, welches Pulse mit einer Pulsdauer von et­ wa 100 fs im nahen Infraroten erzeugte.

Abwechselnd wurden jeweils mindestens 10 unabhängige Referenzmessun­ gen an unbeschichteten Substraten und Messungen an mit der zu untersu­ chenden Probe beschichteten Substraten durchgeführt. Um den Einfluss unvermeidlicher experimenteller Schwankungen zu minimieren, wurden alle Messungen an mehreren verschiedenen Proben wiederholt.

Fig. 7a zeigt ein frequenzaufgelöstes THz-Transmissionsspektrum, welches aus einer Fouriertransformation der zeitaufgelöst erfassten Pulse nach der Wechselwirkung mit Proben gewonnen wurde, die die nachzuweisende Poly­ nucleotidsequenz A, d. h. den Vektor pcDNA3 in denaturierter, also ein­ zelsträngiger Form enthielten. Dabei wurden die Transmissionsmessungen in Freistrahlanordnung unter senkrechtem Einfall auf die Probe durchge­ führt.

Fig. 7b zeigt dagegen das zeitaufgelöste THz-Transmissionsspektrum, wel­ ches in der gleichen Versuchsanordnung an den Proben gewonnen wurde, die die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A in hybridisierter, also dop­ pelsträngiger Form enthielten.

Beide Fig. 7a und 7b zeigen den Verlauf der Transmissionsspektren ei­ nerseits der unbedeckten Saphirsubstrate (gepunktete Linie) und anderer­ seits der mit den dünnen Filmen beschichteten Saphirsubstrate (gestrichelte Linie). Als dünne durchgezogene Linie ist jeweils die komplexe Differenz der Transmissionsspektren des unbedeckten und des bedeckten Substrats ge­ zeigt.

Für beide Proben sind die Transmissionsspektren von unbedecktem und mit der jeweiligen Probe beschichtetem Substrat sehr ähnlich, was durch die ge­ ringe Dicke der Probe bedingt ist. Die Differenzspektren (dünne durchgezo­ gene Linie) beider Proben zeigen jedoch einen Verlauf, der stark davon ab­ hängt, ob die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A, d. h. der Vektor pcDNA3, in Form von Einzelsträngen, d. h. denaturiert, oder in Form von Doppelsträngen, d. h. hybridisiert, vorliegt. Die dünne gepunktete Linie in Fig. 7a zeigt den Mittelwert der frequenzabhängigen komplexen Differenz zwischen unbedecktem Saphirsubstrat und mit der Probe beschichtetem Saphirsubstrat.

Im Fall derjenigen Probe, welche die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A in denaturierter Form enthielt, ergibt sich nur eine geringe komplexe Diffe­ renz, welche praktisch frequenzunabhängig ist, wie aus Fig. 7a ersichtlich ist. Im Gegensatz dazu ergibt sich im Fall derjenigen Probe, welche die nach­ zuweisende Polynucleotidsequenz A in hybridisierter Form enthielt, eine deutlich erhöhte komplexe Differenz, welche eine starke Frequenzabhängig­ keit zeigt. Aus dem Vergleich beider komplexer Differenzen ergibt sich, dass die komplexe Differenz im Fall der hybridisierten Probe um ca. 20 dB über der komplexen Differenz im Fall der denaturierten Probe liegt.

Eine Unterscheidung zwischen hybridisierter und denaturierter Polynucleo­ tidsequenz A oder dazu komplementärer Test-Polynucleotidsequenz B im Sinne des Hauptanspruchs ist daher z. B. bereits anhand der Unterschiede zwischen den komplexen Differenzen zwischen einem Testmedium 4, wel­ ches nur die komplementäre Test-Polynucleotidsequenz B enthält, und ei­ nem in Kontakt mit der Probe 1 befindlichen Testmedium 4 möglich. Enthält die Probe 1 die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A, so liegt A in hybri­ disierter Form vor, nämlich gebunden an die komplementäre Test- Polynucleotidsequenz B. Enthält die Probe 1 dagegen die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A nicht, so liegt nur die denaturierte Test- Polynucleotidsequenz B vor. Werden wie vorstehend beschrieben die kom­ plexen Differenzen der Transmissionsspektren durch einerseits das Testme­ dium 4 alleine und andererseits durch das in Kontakt mit der Probe 1 be­ findliche Testmedium 4 miteinander verglichen, so ist anhand des Verlaufs der komplexen Differenzen eine Unterscheidung möglich, ob die komple­ mentäre Test-Polynucleotidsequenz B in denaturierter oder in hybridisierter Form vorliegt. Im ersten Fall enthält die Probe 1 die nachzuweisende Poly­ nucleotidsequenz nicht, im zweiten Fall ist A in der Probe enthalten. Damit ist der komplexe Brechungsunterschied eine zum komplexen Brechungsin­ dex äquivalente Größe im Sinne des Hauptanspruchs.

Weiterhin können sowohl der Realteil als auch der Imaginärteil des komple­ xen Brechungsindexes der Probe als Nachweiskriterium für den Bindungs­ zustand der Test-Polynucleotidsequenz B und damit das Vorliegen der nach­ zuweisenden Polynucleotidsequenz A in der Probe 1 herangezogen werden. Aus den frequenzabhängigen Transmissionsspektren der Fig. 7a und 7b können unter Verwendung der Fresnel-Formeln direkt die komplexen Bre­ chungsindices der Proben berechnet werden. Der Realteil des komplexen Brechungsindexes ist dabei ein Maß für die Dispersion der in Kontakt mit dem Testmedium 4 befindlichen Probe.

Die untere Kurve in Fig. 8 zeigt den Verlauf des Realteils der komplexen Bre­ chungsindices derjenigen Proben, welche die nachzuweisende Polynucleotid­ sequenz A in einzelsträngiger, d. h. denaturierter Form enthielten. Die obere Kurve in Fig. 8 zeigt dagegen den Verlauf des Realteils des komplexen Bre­ chungsindices derjenigen Proben, welche die nachzuweisende Polynucleotid­ sequenz A in doppelsträngiger, d. h. hybridisierter Form enthielten. Beide Kurven sind klar voneinander zu unterscheiden, da sie einen Unterschied von ca. Δn ≧ 0,1 im gezeigten Frequenzintervall aufweisen. Damit ist anhand einer Bestimmung des Unterschieds zwischen den Realteilen der komplexen Brechungsindices zweier Proben, von denen die eine nur die Test- Polynucleotidsequenz B enthält, welche somit in denaturierter Form vorliegt, und die andere die Test-Polynucleotidsequenz B in Kontakt mit der Probe 1 enthält, somit also die Test-Polynucleotidsequenz B in hybridisierter Form enthält, falls die nachzuweisende Polynucleotidsequenz A in der Probe 1 enthalten ist, ein Nachweis der gesuchten Polynucleotidsequenz A in der Probe 1 möglich.

Analoge Aussagen sind auch anhand des Imaginärteils des komplexen Bre­ chungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium 4 befindlichen Probe 1 möglich, welche die Absorption in der Probe charakterisiert. Dies ist hier je­ doch nicht explizit gezeigt. Es hat sich gezeigt, dass der Realteil des komple­ xen Brechungsindexes eine geringere Anfälligkeit für Verunreinigungen auf­ weist und daher i. a. eine erhöhte Genauigkeit des erindungsgemäßen Ver­ fahrens bei Verwendung des Realteils des komplexen Brechungsindexes der Probe als Nachweiskriterium erzielt werden kann.

Die Tatsache, dass die Probe, welche die nachzuweisende Polynucleotidse­ quenz in hybridisierter Form enthielt, einen deutlich erhöhten Brechungsin­ dex aufweist, deutet in Übereinstimmung mit den bereits zitierten theoreti­ schen Vorarbeiten von [Saxena 89] und [Zhuang 90] darauf hin, dass in doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen Anregungszustände existieren, de­ ren Anregungsenergien in dem im Hauptanspruch genannten Frequenzbe­ reich der THz-Strahlung liegen, wobei diese Anregungszustände in ein­ zelsträngigen Polynucleotidsequenzen nicht vorhanden oder stark unter­ drückt sind. Eine Abfrage dieser Anregungszustände ist daher ein geeignetes Mittel zur Unterscheidung zwischen denaturierten oder hybridisierten Poly­ nucleotidsequenzen, insbesondere der Test-Polynucleotidsequenz B, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass auch eine reine Absorpti­ onsmessung in dem im Hauptanspruch genannten Frequenzintervall eine Möglichkeit zur Ermittlung zumindest einer Komponente des komplexen Brechungsindexes oder einer dazu äquivalenten Größe der in Kontakt mit dem Testmedium 4 beindlichen Probe 1 darstellt, da die in der Probe auf­ tretende Absorption direkt mit dem Imaginärteil des komplexen Brechungs­ indexes verknüpft ist.

Versuchsreihe 2

In einer zweiten Versuchsreihe wurden die Proben nicht in einer Freistrahl­ anordnung, sondern einer Wellenleiteranordnung untersucht. Dabei wurde von der Verschiebung der Transmissionscharakteristik eines in eine Wellen­ leiterstruktur integrierten Resonators durch Änderung der dielektrischen Ei­ genschaften einer Deckschicht auf den Resonator Gebrauch gemacht.

Hierzu wurde eine planare Wellenleiterstruktur realisiert, in die ein Resona­ tor mit einer Resonanzfrequenz von ca. 600 GHz integriert war. Fig. 9 zeigt den frequenzabhängigen Verlauf der die Transmission durch den Resonator kennzeichnenden Größe S₂₁ im Frequenzintervall zwischen 0,1 und 1 THz. Die dünne gestrichelte Kurve zeigt den Verlauf für einen unbedeckten Reso­ nator.

Wird auf ein Tropfen der Probelösung auf die planare Wellenleiterstruktur im Bereich des Resonators aufgebracht und dort eingetrocknet, so wird der Re­ sonator an seiner Oberfläche mit einer dünnen Schicht dielektrischen Mate­ rials beschichtet, nämlich mit den in der Probelösung enthaltenen, entweder denaturierten oder hybridisierten Polynucleotidsequenzen A (pcDNA3). Diese dielektrische Deckschicht verändert die Transmissionscharakteristik des Re­ sonators.

Die dicke durchgezogene Kurve in Fig. 9 zeigt den Verlauf von S₂₁ für eine Deckschicht bestehend aus einer eingetrockneten Probe (Konzentration: 5 µg/µl, Tropfenvolumen: 0,6 µl, Trocknungszeit: 2 h), welche die Polynucleo­ tidsequenz A in denaturierter Form enthielt. Die dünne strichpunktierte Kurve in Fig. 9 zeigt dagegen den Verlauf von S₂₁ für eine Deckschicht be­ stehend aus einer eingetrockneten Probe, welche die Polynucleotidsequenz A in hybridisierter Form enthielt. Man erkennt deutliche Unterschiede zwi­ schen beiden Kurven. Um die Unterschiede zu charakterisieren, kann z. B. die Verschiebung Δν des Transmissionsmaximums bzw. die Veränderung ΔT der Höhe des Transmissionsmaximums herangezogen werden. Im gezeigten Beispiel ergeben sich im Vergleich zum unbedeckten Resonator:

• 1. für die Probe, welche die nachzuweisende Polynucleotidsequenz pcDNA3 in denaturierter Form enthielt: Δν = -45 GHz, ΔT = -9 dB, und
• 2. für die Probe, welche die nachzuweisende Polynucleotidsequenz pcDNA3 in hybridisierter Form enthielt: Δν = -120 GHz, ΔT = -12 dB.

Die Verschiebung und die Veränderung der Höhe des Transmissionsmaxi­ mums des Resonators sind dabei direkt mit dem komplexen Brechungsindex der auf den Resonator aufgebrachten Proben korreliert. Daher sind beide Größen als zu den Komponenten des komplexen Brechungsindexes der in Kontakt mit dem Testmedium 4 befindlichen Probe 1 äquivalente Größen im Sinne des Hauptanspruchs zu verstehen.

Der Bindungszustand einer auf den Resonator aufgebrachten Test- Polynucleotidsequenz B (hybridisiert vs. denaturiert) kann daher beispiels­ weise anhand der Größen Δν und ΔT des Resonators bestimmt werden. An­ hand dieser Größen kann daher unterschieden werden, ob in der Probe 1 die nachzuweisende Polynucleotidsequenz vorhanden war oder nicht.

Im allgemeinen wird in einer Wellenleiteranordnung, insbesondere unter Verwendung sensitivitätssteigernder frequenzabhängiger Strukturen wie Filter oder Resonatoren, eine höhere Nachweisempfindlichkeit erzielt werden können als in einer Freistrahlanordnung. Die Wellenleiteranordnung eignet sich daher besonders für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah­ rens im Maßstab eines medizinischen Labors.

Abschließend wird festgestellt, dass die hier vorgestellten Ausführungsbei­ spiele auf der Generation von THz-Strahlung unter Verwendung eines Fem­ tosekunden-Lasersystems beruhen. Künftige Fortschritte vor allem in der Halbleitertechnik lassen jedoch erwarten, dass bereits in naher Zukunft effi­ ziente Quellen für THz-Strahlung im relevanten Frequenzbereich zur Verfü­ gung stehen werden, die eine kommerzielle Anwendung des Verfahrens er­ möglichen werden.

Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auf Polynucleotid­ sequenzen (praktisch) beliebiger Länge angewendet werden, insbesondere auch auf kurzkettige Polynucleotidsequenzen mit weniger als 20 Basen(-paaren), die in der Literatur oftmals als Oligonucleotidsequenzen bezeichnet werden.

Literaturverzeichnis

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[Smith 88] P. R. Smith, D. H. Auston and M. C. Nuss, IEEE J. Quantum Electron. QE 24, 255, 1988.

Claims (14)

1. Verfahren zum Nachweis einer Polynucleotidsequenz A in einer Probe, welche eine Mehrzahl identischer oder verschiedener Polynucleotidse­ quenzen X als Einzelstränge enthält und die Polynucleotidsequenz A mit einer der Polynucleotidsequenzen X identisch sein kann oder als Se­ quenzabschnitt in einer der Polynucleotidsequenzen X enthalten sein kann, über die Abfrage des Bindungszustandes der in der Probe enthal­ tenen Polynucleotidsequenzen X an eine bekannte, zur Polynucleotidse­ quenz A komplementäre Test-Polynucleotidsequenz B, die folgenden Verfahrensschritte aufweisend:

• a) Präparation eines Testmediums, welches zur nachzuweisenden Poly­ nucleotidsequenz A komplementäre Test-Polynucleotidsequenzen B als Einzelstränge enthält,
• b) In Kontakt bringen der Probe mit dem Testmedium durch Ein- oder Aufbringen der Probe in oder auf das Testmedium, so dass die in der Probe enthaltenen Einzelstränge der Polynucleotidsequenzen X an die im Testmedium enthaltenen komplementären Test-Polynucleotid­ sequenzen B binden können,

dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis einer Bindung von Poly­ nucleotidsequenzen X an Test-Polynucleotidsequenzen B folgender Schritt c) ausgeführt wird:

• a) Ermittlung zumindest einer Komponente des komplexen Brechungsin­ dexes oder einer äquivalenten Größe der mit dem Testmedium in Kontakt befindlichen Probe durch Wechselwirkung mit einfallender elektro­ magnetischer Strahlung, deren Frequenz im Bereich zwischen 0,1 Terahertz (THz) und 20 THz, vorzugsweise zwischen 1 THz und 10 THz liegt, und nachfolgender Analyse der Eigenschaften der elektro­ magnetischen Strahlung nach der Wechselwirkung, insbesondere im Hinblick auf Zeit- oder Phasenverzögerung, Absorption, Refraktion oder Dispersion der einfallenden elektromagnetischen Strahlung verur­ sacht durch die Wechselwirkung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt c) ermittelte Komponente des komplexen Brechungsindexes oder die da­ zu äquivalente Größe mit einem Referenzwert verglichen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt c) ermittelte Komponente des komplexen Brechungsindexes oder die da­ zu äquivalente Größe in einem Frequenzbereich ermittelt wird, der im Energie­ bereich der typischen Anregungsenergien der Kollektivanregungs­ zustände der an die komplementäre Polynucleotidsequenz B gebundenen nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A liegt, wobei unter Kollektivan­ regungszustände solche Anregungszustände zu verstehen sind, die im wesentlichen nur im an die komplementäre Polynucleotidsequenz B ge­ bundenen Zustand der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz A auf­ treten, insbesondere die auf Kollektivanregungen der Tertiärstruktur der aneinander gebundenen Polynucleotidsequenzen X und B zurückzufüh­ ren sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) die Komponente des komplexen Brechungsindexes oder die dazu äqui­ valente Größe mittels Terahertz-Spektroskopie (TS) erfasst wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die verwen­ dete Terahertz-Strahlung gepulst ist ("gepulste Terahertz-Spektroskopie" PTS), wobei die Pulse eine Pulsdauer zwischen 0,05 Picosekunden (ps) und 10 ps aufweisen und zeitaufgelöst detektiert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die verwen­ dete Terahertz-Strahlung schmalbandig ist und frequenzaufgelöst detek­ tiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Spektroskopie verwendete Terahertz-Strahlung vor und nach der Wech­ selwirkung mit der in Verbindung mit dem Testmedium befindlichen Probe frei im Raum propagiert, d. h. die Komponente des komplexen Bre­ chungsindexes oder die dazu äquivalente Größe dielektrischen Eigen­ schaften in einer Freistrahlanordnung erfasst wird.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Spektroskopie verwendete Terahertz-Strahlung vor, während oder nach der Wechselwirkung mit der in Verbindung mit dem Testmedium befind­ lichen Probe auf oder in einem Wellenleiter propagiert.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die in Ver­ bindung mit dem Testmedium befindliche Probe auf eine Wellenleiter­ struktur aufgebracht ist.

10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellen­ leiterstruktur im Bereich der in Verbindung mit dem Testmedium be­ findlichen Probe eine Resonatorstruktur oder einen Frequenzfilter auf­ weist, welche/r die Feldstärke der Terahertz-Strahlung lokal erhöht.

11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Tera­ hertz-Strahlung im optischen Nahfeld der in Verbindung mit dem Test­ medium befindlichen Probe generiert oder detektiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die im Test­ medium enthaltenen komplementären Polynucleotidsequenzen B auf oder in einem Substrat fixiert sind.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt b) die in der Probe enthaltenen, aber nicht an die komplementären Poly­ nucleotidsequenzen B gebundenen Polynucleotidsequenzen X vor der Ermittelung der zumindest einen Komponente des komplexen Bre­ chungsindexes oder der dazu äquivalenten Größe entfernt werden, ins­ besondere mittels Abwaschen.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mehr­ zahl N verschiedener Polynucleotidsequenzen A (1), . . ., A (N) in der Probe nachgewiesen werden soll, wozu eine Mehrzahl N von Testmedien präpa­ riert wird, die jeweils eine zu den nachzuweisenden Polynucleotidsequen­ zen A (1), . . ., A (N) komplementäre Test-Polynucleotidsequenz B (1) . . ., B (N) enthält, wobei die Testmedien an voneinander verschiedenen Orten auf oder in einem Substrat fixiert sind, und mittels der Verfahrensschritte b) und c) für jedes einzelne, in Verbindung mit der Probe befindliche Test­ medium zumindest eine Komponente des komplexen Brechungsindexes oder einer dazu äquivalenten Größe ermittelt werden.