DE19950823A1

DE19950823A1 - Quantitatives Verfahren zum Analysieren einer Targetnukleinsäure

Info

Publication number: DE19950823A1
Application number: DE1999150823
Authority: DE
Inventors: Masataka Kinjo
Original assignee: Individual
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2000-04-27
Also published as: JP4262336B2; JP2000125900A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein hochquantitatives Verfahren zum Nachweisen eines Targetnukleinsäuremoleküls unter Verwendung einer Amplifizierungsreaktion für eine Nukleinsäuresequenz, wobei keine Trennung zwischen gebundenen/freien Molekülen erforderlich ist. Dieses Verfahren umfaßt ein Mischen eines nicht-markierten ersten Primers und eines Fluoreszenz-markierten zweiten Primers in einer eine Probe enthaltenden Lösung in einem Verhältnis, bei welchem der zweite Primer in einer kleineren Menge als der erste Primer vorliegt, ein Durchführen einer geeigneten Anzahl von PCR-Zyklen, ein Erhalten von Meßdaten in Abhängigkeit von dem Verhalten der einzelnen fluoreszierenden Moleküle, welche durch Laserlicht zu einer Mehrzahl von Zeitpunkten in einem dreidimensionalen Mikronachweisfeld fokussiert werden, ein Umwandeln der Meßdaten in statistische Daten entsprechend der Positionsänderung und ein Bestimmen der Anzahl der Targetnukleinsäuremoleküle, die in der Probe enthalten sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Technik zum Analysieren eines Nukleinsäuremoleküls, welches in einer Testprobe vorliegt, und insbesondere ein Verfahren zum spe zifischen Messen von Nukleinsäuremolekülen unter Anwendung eines Nukleinsäureamplifizierungsverfahrens. Die vorlie gende Erfindung wird auf ein Nachweisverfahren angewendet, bei welchem Meßdaten in Bezug auf ein einzelnes Nukleinsäu remolekül erhalten werden können. Demgemäß ist die vorlie gende Erfindung wirkungsvoll auf alle solche Fälle anwend bar, die dem Zweck dienen, eine quantitative Information in Bezug auf die Anzahl von Targetnukleinsäuremolekülen (bzw. Zielnukleinsäuremolekülen) zu erhalten.

Die Sequenzierung von Nukleotiden, der Nachweis und die Messung von Molekulargewichten in Bezug auf Nukleinsäuren wie z. B. DNA und RNA sind die wichtigsten analytischen Mit tel in der biochemischen und molekularbiologischen For schung und sind in letzter Zeit ebenfalls ein wichtiges Werkzeug bei der Gendiagnose und Gentherapie geworden. Im allgemeinen werden in dem Fall, wo diese analytischen Mit tel auf biologische Testproben wie z. B. Blut, Urin, Cere brospinalflüssigkeit und Speichelflüssigkeit angewendet werden, die Analysen durchgeführt, nachdem die Nukleinsäu remoleküle, die in der Testprobe in einer extrem kleinen Menge vorliegen, zu einer geeigneten Konzentration amplifi ziert wurden, um die Genauigkeit bei der Analyse zu erhö hen. Beispielsweise arbeiten bei der PCR (Polymeraseketten reaktion), welche ein sehr wichtiges Genamplifizierungsver fahren ist, zwei Typen von Primern in einer Vielzahl von Amplifizierungszyklen zusammen, um eine Genamplifizierung zu erreichen. Ein durch geeignete Amplifizierungszyklen amplifiziertes Gen wird letztlich nachgewiesen, indem die amplifizierte Probe einer Gelelektrophorese unterzogen wird, um diese in Fraktionen in Bezug auf die Kettenlänge (Molekulargewicht) aufzutrennen, und dann das Vorliegen oder Fehlen einer Fraktion festgestellt wird, welche einer bestimmten Kettenlänge entspricht.

Das PCR-Produkt, welches durch ein Zusammenarbeiten von zwei Typen von Primern amplifiziert wurde, bildet immer eine doppelsträngige DNA (dsDNA). Die Hybridisierungsreak tion, welche eine Oligonukleotidsonde mit einer spezifi schen Nukleotidsequenz verwendet, wird benutzt, um eine Nukleotidsequenz des PCR-Produkts, nämlich der dsDNA, zu bestimmen. Jedoch weist die Hybridisierungsreaktion unter Verwendung der Oligonukleotidsonde in der Hinsicht Probleme auf, daß leicht eine nichtspezifische Hybridisierung statt findet, da wiederholt ein schnelles Annealing durchgeführt werden muß und da weiterhin beide DNA-Ketten im Hinblick auf die Nukleotidsequenz der Sonde ähneln.

Als ein quantitatives Verfahren zur Messung der Gesamt menge an dsDNA, nachdem diese durch das PCR-Verfahren amplifiziert wurde, wurden bisher einige Verfahren vorge schlagen. Beispielsweise ist eines der Verfahren wie folgt: Die PCR wird in vorher festgelegten Zyklen durchgeführt, wobei eine ausreichende Menge eines PCR-Primers verwendet wird, welcher mit einem Markermolekül wie z. B. einem Fluo reszenzfarbstoff markiert ist. Das PCR-Produkt, welches durch die vorher festgelegten Zyklen erhalten wurde, wird einer Elektrophorese unterzogen, um dieses in einen Primer, der durch die Polymerasereaktion verlängert wurde, und einen freien Primer, der nicht verlängert wurde, aufzutren nen (Gebunden/Frei = Trennung). Nach der Gebunden/Frei-Tren nung wird die Gesamtzahl der fluoreszierenden Moleküle durch ein Fluorometer auf der Grundlage der Fluoreszenz intensität, welche von einer Testlösung emittiert wird, in einem geeigneten Behälter oder αuf einer Platte gezählt.

Ebenfalls bekannt ist ein anderes Verfahren, welches als den Fluoreszenzmarker einen Interkalator (z. B. Acridin orange, Thiazolorange, Oxazolgelb usw.) verwendet, welcher keine Fluoreszenz emittieren kann, bis er sich während des Amplifizierungsprozesses in die dsDNA einlagert. Bei diesem Verfahren ist es möglich, die Intensität der Fluoreszenz zu messen, welche ausschließlich von dem Fluoreszenzfarbstoff emittiert wird, der an der dsDNA befestigt ist, welche in einer Testlösung hybridisiert hat, ohne eine Gebunden/Frei- Trennung zu bewirken.

Bei den oben beschriebenen Verfahren, welche die gesam te Fluoreszenzmenge messen, die aus der gesamten Testlösung erhalten wird, werden die Primer in einer ausreichenden Menge verwendet, so daß während des Nukleinsäureamplifizie rungsprozesses in vorher festgelegten Zyklen, unabhängig von der Anfangskonzentration eines Targetnukleinsäuremole küls, kein Mangel des Primers verursacht wird. Jedoch wer den bei der Amplifizierungsreaktion in dem PCR-Verfahren im allgemeinen verschiedene Reaktionskurven erhalten, was nicht nur von der Anzahl (oder der Menge), sondern eben falls den Typen der Targetnukleinsäuremoleküle abhängt, welche in einer Testprobe vorliegen. Es ist daher für ein herkömmliches analytisches Verfahren, welches die Gesamt menge der Markermoleküle mißt, die an den amplifizierten Nukleinsäuren befestigt sind, schwierig, den Reaktionspro zeß quantitativ zu überwachen. Insbesondere wird bei dem herkömmlichen PCR-Verfahren ein Signal, das von den freien markierten Molekülen stammt, eliminiert, und nur ein Signal von dem markierten Primer, welcher mit der Targetnuklein säure hybridisiert ist, wird gemessen, indem freie mar kierte Moleküle durch die Gebunden/Frei-Trennung oder durch den Einsatz eines Interkalators entfernt werden. Es ist daher unmöglich, zu überwachen, ob ein bestimmtes freies Primermolekül hybridisiert ist oder nicht. Demgemäß ist es bei der herkömmlichen Targetnukleinsäureanalyse unmöglich, eine quantitative Analyse in der Gegenwart eines freien Primermoleküls durchzuführen. Da weiterhin die Gesamtmenge der Fluoreszenz der gesamten Testlösung gemessen wird, muß die Menge der Testlösung erhöht werden, um die Empfindlich keit der Messung zu verbessern. Da zusätzlich die Messung nicht durchgeführt werden kann, bis eine Nukleinsäure hin reichend amplifiziert ist, ist es fast unmöglich, eine Tar getnukleinsäure in einem früheren Stadium der Amplifizie rung nachzuweisen. Genauer gesagt, ist es schwierig, eine quantitative Analyse zur Bestimmung der Anzahl (oder der Menge) der Targetnukleinsäuren in dem mittleren Stadium des PCR-Amplifizierungsprozesses oder gar in dem früheren Sta dium des Prozesses durchzuführen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht der oben erwähnten Umstände, die mit den Nukleinsäurenachweisverfah ren verbunden sind, gemacht.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver fahren zum genauen und quantitativen Nachweisen einer Menge eines Targetnukleinsäuremoleküls zur Verfügung zu stellen, indem ein markiertes freies Molekül ebenfalls als ein Ziel der Messung berücksichtigt wird. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum quantita tiven Messen einer PCR-Amplifizierungsreaktion zur Verfü gung zu stellen. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum quantitativen Nachwei sen eines Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung zu stellen, selbst wenn die Kopienzahl niedrig ist. Eine weitere Aufga be der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens eines Targetnuklein säuremoleküls zur Verfügung zu stellen, selbst wenn nur eine kleine Menge der Testprobe verfügbar ist. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Ver fahren zum Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens einer Targetnukleinsäure in einem frühen Stadium des Amplifizie rungsprozesses zur Verfügung zu stellen. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Messen eines Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, einen PCR-Amplifizierungspro zeß auf molekularer Ebene zu erforschen.

Um die oben genannten Aufgaben zu lösen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum quantitativen Ana lysieren eines Targetnukleinsäuremoleküls zur Verfügung, welches in einer biologischen Probe vorliegt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
einen Amplifizierungsschritt zum Amplifizieren der Tar getnukleinsäure, wobei erste und zweite Primermoleküle ver wendet werden, welche Sequenzen aufweisen, die zu zwei ein zelnen entsprechenden Nukleotidsequenzbereichen des Target nukleinsäuremoleküls komplementär sind, wobei wenigstens einer von dem ersten und zweiten Primer mit einem nachweis baren Markermolekül markiert ist und wenigstens die Anzahl der markierten Primermoleküle bekannt ist;
einen Meßschritt zum Erhalten von Meßdaten in Bezug auf das markierte Molekül unter Verwendung wenigstens eines Teils einer Testlösung, die wenigstens einem einzigen Amplifizierungsschritt unterzogen wurde; und
einen Bestimmungsschritt zum Bestimmen der Anzahl oder der Größe der Targetnukleinsäuremoleküle auf der Grundlage der Meßdaten.

Unter dem dritten Aspekt ist das Mischungsverhältnis des ersten Primers und des zweiten Primers nicht gleich. Hierbei wird auf ein asymmetrisches PCR-Verfahren Bezug genommen, welches von Gyllenaten, U. B. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7652-7656, 1988) offenbart wird. Jedoch ist das asymmetrische PCR-Verfahren, welches von Gyllena ten, U. B. et al. offenbart wird, auf die Herstellung einer einzelsträngigen DNA (ssDNA) als einem PCR-Produkt gerich tet, um die Bestimmung der Nukleotidsequenz zu vereinfa chen. Daher wird bei der asymmetrischen PCR, wenn die PCR unter Verwendung von zwei Typen von PCR-Primern in einem asymmetrischen Verhältnis durchgeführt wird (das heißt, diese sind nicht in einer äquimolaren Menge enthalten), nachdem der Primer, der in geringerer Menge vorlag, voll ständig während des PCR-Zyklus aufgebraucht wurde, in jedem folgenden PCR-Zyklus nur ssDNA hergestellt. Die vorliegende Erfindung ist einzigartig darin, daß das asymmetrische PCR- Verfahren modifiziert wurde, um nicht die Nukleotidsequenz zu bestimmen, sondern um quantitativ die Targetnukleinsäure zu bestimmen. Genauer gesagt, wird bei der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäureamplifizierungsreaktion durchge führt, wobei ein Markermolekül an den Primer, welcher in geringerer Menge vorliegt, gebunden wird und ein Signal gemessen wird, welches von dem Markermolekül stammt, das an den Primer, welcher in geringerer Menge vorliegt, gebunden ist. Daher ist es, selbst wenn die Hybridisierungswahr scheinlichkeiten des Hauptprimers und des Primers, welcher in geringerer Menge vorliegt, mit der Targetnukleinsäure nicht gleich sind, möglich, freie Markermoleküle sicher und vollständig zu eliminieren, ohne eine Gebunden/Frei-Tren nung wie beispielsweise durch eine zentrifugale Trennung oder eine Gelelektrophorese durchzuführen. Als Folge wird das S/N-Verhältnis extrem hoch. Mittels des hohen S/N-Ver hältnisses bringt die vorliegende Erfindung eine epochema chende Wirkung mit sich, indem eine quantitative Analyse einer Nukleinsäure mit einer hohen Nachweisempfindlichkeit erreicht wird. Demgemäß macht es das Verfahren der vorlie genden Erfindung ebenfalls möglich, das Targetnukleinsäure molekül während oder vor der PCR-Amplifizierung mit einer hohen Genauigkeit nachzuweisen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die begleitenden Zeichnungen, welche in die Beschrei bung eingearbeitet sind und einen Teil davon darstellen, stellen derzeit besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar und dienen zusammen mit der allgemeinen Beschreibung, die oben angegeben wurde, und der detaillier ten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, welche folgt, dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm einer asymmetri schen PCR gemäß der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 ist eine schematische Ansicht, welche ein Bei spiel einer Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung zeigt;

Fig. 3A ist eine teilvergrößerte Ansicht der Vorrich tung, welche in Fig. 2 gezeigt ist;

Fig. 3B ist eine vergrößerte schematische Ansicht, wel che ein Mikrofeld aus der Ansicht in Fig. 2 zeigt;

Fig. 4 ist eine typische Kurve, welche die Änderung der Autokorrelationsfunktion mit der Zeit in einem PCR-Reakti onsprozeß zeigt;

Fig. 5A und 5B sind Photographien, welche jeweils die Ergebnisse der Agarosegelelektrophorese eines amplifizier ten Zielprodukts (500 bp) zeigen, welche nach einer quan titativen Messung durch FCS durchgeführt wurde;

Fig. 6 ist eine Kurve, welche Fluoreszenzautokorrelati onsfunktionen in einem Fall zeigt, wo die anfängliche Matrizenkonzentration vor der PCR in einer Reaktionslösung (25 µl) von 1,9 × 10⁷ auf 1,9 Moleküle verändert wird, um die Empfindlichkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfin dung zu untersuchen;

Fig. 7 zeigt eine durchschnittliche Anzahl an fluores zierenden Molekülen in einem optischen Meßfeld (einem Mikronachweisfeld) gegenüber der anfänglichen Matrizenkon zentration, welche in Fig. 6 gezeigt ist;

Fig. 8 ist eine Kurve, welche die Ausbeute (%) eines 500 bp-Produkts gegenüber der anfänglichen Matrizenkonzen tration zeigt;

Fig. 9 ist eine Kurve, welche die Anzahl der anfängli chen Matrizen, die in einer gemischten Lösung (25 µl) vor liegen, gegenüber der Ausbeute (%) von jedem der PCR-Pro dukte zeigt, die durch eine unterschiedliche Anzahl von PCR-Zyklen erhalten wurden; und

Fig. 10 ist eine Kurve, welche die PCR-Produkte pro anfänglichem Matrizen-DNA-Molekül zeigt, die durch unter schiedliche PCR-Zyklen erhalten wurden, wobei die Kurve durch ein Teilen der Meßdaten aus Fig. 9 durch die Anzahl an anfänglichen Matrizen-DNA-Molekülen abgeleitet wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bei der einmaligen (unique) asymmetrischen PCR, die bei der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, ist es wich tig, daß die Menge des zweiten Primers kleiner gemacht wird als die des ersten Primers und daß der zweite Primer mit einem optisch nachweisbaren Markermolekül markiert wird. Was die Anzahl der ersten und der zweiten Primermoleküle betrifft, ist es bevorzugt, daß die niedrigsten Werte von diesen so angesetzt werden, daß wenigstens ein Zyklus des Amplifizierungszyklus bei Vorliegen einer überschüssigen Menge der markierten Primermoleküle bewirkt wird, so daß diese mit den Targetnukleinsäuremolekülen bei einer über schüssigen Menge der Markermoleküle in wenigstens einem Schritt des Amplifizierungsreaktionsprozesses hybridisiert werden. Wie in einem abstrakten Diagramm (Fig. 1) der ein maligen asymmetrischen PCR gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt ist, ist weiterhin die Anzahl (oder Menge) der zweiten Primermoleküle, welche mit Markern markiert sind, ein kritischer Faktor, um die notwendigen Wiederholungen des Hybridisierungszyklus bei der einmaligen asymmetrischen PCR zu bestimmen. Fig. 1 zeigt den Fall, wo fünf zweite Primermoleküle mit einer überschüssigen Menge des ersten Primers pro Targetnukleinsäuremoleküle gemischt sind. Der Amplifizierungsreaktionsschritt wird in diesem Fall vor zugsweise bei einem gewissen Mischungsverhältnis der ersten und zweiten Primermoleküle durchgeführt, welches so ausge wählt wird, daß eine asymmetrische Nukleinsäureamplifizie rung erreicht wird. Insbesondere ist es weiterhin bevor zugt, daß einer der Primer mit weniger Molen als der andere Primer enthalten ist und daß der Primer, von dem weniger vorhanden ist, mit dem Markermolekül markiert wird. Das Mischungsverhältnis der zwei Primertypen, welche in der Testflüssigkeit enthalten sind, fällt vorzugsweise in den Bereich von 2 : 1 bis 20 : 1, da die Produktionseffizienz bei der Amplifizierungsreaktion in diesem Bereich hoch wird. Darüber hinaus fällt das Mischungsverhältnis im Hinblick auf die Konzentrationen der zwei Primertypen in der Test flüssigkeit vorzugsweise in einen Bereich von 800 nM : 400 nM bis 800 nM : 40 nM, da die Ausbeute des PCR-Produkts in diesem Bereich hoch wird.

Bei der Amplifizierungsreaktion, welche die einmalige asymmetrische PCR der vorliegenden Erfindung anwendet, ist es bevorzugt, daß, selbst wenn eine Testprobe eine große Menge der Targetnukleinsäure enthält, wenigstens ein Zyklus der Amplifizierungsreaktion vollständig durchgeführt werden kann, ohne einen Mangel des zweiten Primers zu verursachen. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es mög lich, die Targetnukleinsäure nachzuweisen, selbst wenn die Targetnukleinsäure in einer kleinen Menge vorliegt. Daher kann der zweite Primer weiter verringert werden, wenn die die Testprobe enthaltende Flüssigkeit verringert wird. Die Anzahl (oder Menge) der zweiten Primermoleküle kann stati stisch bestimmt werden, so daß einer oder mehrere PCR- Zyklen vollständig ausgeführt werden, selbst wenn die Tar getnukleinsäure in der höchsten Menge vorliegt, die natür lich in einer Testprobe auftreten kann, welche einer PCR unterzogen wird. Daher müssen in dem Fall, daß die Amplifi zierungsreaktionen durchgeführt werden, indem die Targetnu kleinsäuremoleküle in verschiedenen Mengen und der zweite Primer in einer konstanten Menge verwendet wird, wenn die kleinere Menge des Targetnukleinsäuremoleküls verwendet wird, um so mehr Zyklen wiederholt werden, bis diese ein zufriedenstellendes Amplifizierungsniveau erreichen, d. h. bis der zweite Primer vollständig aufgebraucht ist. Daher ist es bevorzugt, daß die Menge des zweiten Primers so angesetzt wird, daß der zweite Primer in einer angemessenen Zahl von PCR-Zyklen aufgebraucht wird, selbst wenn nur ein Targetnukleinsäuremolekül in der Testprobe vorliegt, welche der Messung unterzogen wird. Wie man in Fig. 1 sieht, haben die Menge des zweiten Primers und die Menge der Target nukleinsäure, welche in der Testprobenflüssigkeit enthalten sind, einen Einfluß auf die Zeit oder die Anzahl der PCR- Zyklen, welche benötigt werden, bis die asymmetrische PCR- Amplifizierungsreaktion ein Plateau erreicht oder gesättigt ist. Bei der vorliegenden Erfindung wird angenommen, daß, wenn die Menge von entweder dem ersten oder dem zweiten Primer auf einen relativ und signifikant niedrigeren Wert gesetzt wird, die Anzahl der Primermoleküle, die auf den niedrigeren Wert gesetzt wurden, bekannt sein sollte. Wenn die bekannte Anzahl der Primermoleküle klein ist, können beide Primer mit demselben Markermolekül markiert werden. Demgemäß kann in diesem Fall wenigstens einer von dem ersten und zweiten Primer markiert werden. Andererseits ist es, da der Hauptprimer nicht direkt zu der Messung der vor liegenden Erfindung beiträgt, prinzipiell unnötig, die Anzahl der Hauptprimermoleküle zu kennen.

Nach Abschluß der effektiven PCR-Zyklen wird wenigstens ein Teil der Testprobenflüssigkeit als ein Aliquot entnom men und einer geeigneten Messung unterzogen. Alternativ kann die Messung mit der Testflüssigkeitsmischung durchge führt werden, die in einem PCR-Reaktionsbehälter oder der gleichen enthalten ist. Jedes Meßverfahren kann verwendet werden, solange es die Änderung bei der Größe des markier ten Moleküls im Verlauf der Amplifizierung messen kann. Als Beispiele können Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese, ein Fließzytometer zur Fluoreszenzmessung, ein Abbildungs zytometer und Fluoreszenzmikroskopie wirkungsvoll einge setzt werden. Wenn der Meßschritt in einem dreidimensiona len Mikronachweisfeld durchgeführt wird, kann die freie Bewegung des markierten Moleküls in der Testprobenflüssig keit entsprechend den Ergebnissen der PCR-Reaktion genau bestimmt werden, während es in seinem natürlichen Zustand gehalten wird. Das Mikronachweisfeld kann gebildet werden, indem Licht von einer Halogenlampe gebündelt wird oder indem das Licht durch eine Öffnung (Lochblende (pin hole) oder Monomode-Faserende) geleitet wird, welche einen extrem kleinen Durchschnittsradius aufweist. In diesem Fall wird jedoch vorzugsweise gebündeltes Laserlicht verwendet. Ins besondere ist es bevorzugt, ein optisches System zu verwen den, bei welchem eine Objektivlinse mit einer geeigneten Vergrößerung und einer numerischen Apertur eingesetzt wird, so daß der Brennpunkt an einer geeigneten Stelle innerhalb der Testflüssigkeit gebildet wird.

Wenn das Mikronachweisfeld des Meßschrittes durch ein konfokales optisches System gebildet wird, können Meßdaten, die eine hohe Tiefenschärfe aufweisen, erhalten werden. Im Ergebnis können jegliche individuellen Markermoleküle immer in dem Nachweisfeld fokussiert werden, und die genaue Posi tion der Markermoleküle und die Fluoreszenzausgabedaten können zu der Meßeinrichtung geleitet werden.

Wenn das Mikronachweisfeld in einen beugungsbegrenzten Bereich in der Nähe eines Brennpunkts fällt, können die einzelnen Markermoleküle mit einem hohen Signal-Rausch (S/N)-Verhältnis gemessen werden.

Wenn der beugungsbegrenzte Bereich durch eine Lochblen de gebildet wird, welche einen Durchschnittsdurchmesser von 15 ± 5 µm aufweist, können die Meßdaten effizient von einer kleinen Anzahl ausgewählter Markermoleküle erhalten werden.

Wenn das Mikronachweisfeld ein nahezu zylindrischer Bereich mit einem durchschnittlichen Radius von 200 ± 50 nm und einer durchschnittlichen Länge auf der optischen Achse von 2000 ± 500 nm ist, ist es möglich, die freie Mikrobewe gung des Markermoleküls, die in dem Meßnachweisfeld sicht bar ist, effizient einzufangen.

Bei der vorliegenden Erfindung wird die Mobilität der Markermoleküle, welche sich in das Mikronachweisfeld hin ein- und daraus herausbewegen, gemessen, indem eine Zunah me/Abnahme oder ein Auftreten/Verschwinden der Intensität der Signalausgabe von jedem Markermolekül verwendet wird, welches in einem vorher festgelegten Raum vorliegt. Demge mäß ist der Typ des Markermoleküls, mit dem das zweite Pri mermolekül markiert werden soll, vorzugsweise in der Lage, an einer Vielzahl von Meßzeitpunkten ein konstantes Signal abzugeben. Als das Material, welches als ein Markermolekül verwendet werden kann, kommt ein lumineszierendes Material, ein fluoreszierendes Material, ein magnetisches Material, ein radioaktives Material und dergleichen in Frage. Insbe sondere wird als ein lumineszierendes Material und als ein fluoreszierendes Material vorzugsweise ein Farbstoff ausge wählt, welcher für eine lange Zeit eine Lumineszenz oder Fluoreszenz emittiert. Wenn ein Markermolekül verwendet wird, welches einen lumineszierenden Farbstoff oder einen fluoreszierenden Farbstoff aufweist, kann die Messung auf molekularer Ebene durchgeführt werden, indem eine Vorrich tung mit einer optisch einfachen Struktur verwendet wird. Als bevorzugte fluoreszierende Farbstoffe, die in der Lage sind, vor und nach der Hybridisierung ein nachweisbares Signal zu emittieren, können FITC, Rhodamin, DAPI, Cy 3, Cy 3,5, Cy 5, Cy 5,5, Cy 7 und dergleichen genannt werden.

Wenn eine Positionsänderung des Fluoreszenzmoleküls in dem Meßschritt gemessen wird, kann das Fluoreszenzsignal durch eine Fluoreszenzmeßeinrichtung wie z. B. einen Photo multiplier oder eine Photodiode aufgenommen werden. Die Fluoreszenzmeßeinrichtung, die einen Meßmodus aufweist, welcher in der Lage ist, ein einzelnes Photon zu messen, ist zur Messung von einzelnen fluoreszierenden Molekülen nützlich.

Wenn in dem Meßschritt die Fluktuationsbewegung der Markermoleküle in einer Flüssigkeit gemessen wird, stellt die vorliegende Erfindung eine effektivere Ausführungsform dar, da die Mikrobewegung jedes Markermoleküls genau gemes sen wird. In dem Fall, wo die Fluktuationsbewegung gemessen wird, kann ein Rechenvorgang vorzugsweise durchgeführt wer den, indem die Autokorrelationsfunktion angewendet wird. Insbesondere wenn ein fluoreszierender Farbstoff als das Markermolekül verwendet, wird, ist es bevorzugt, daß die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (einfach als "FCS" bezeichnet) verwendet wird. Die FCS-Meßdaten eines biologi schen Materials können in Bezug auf einen Bericht, der von Kinjo et al. stammt, bei welchem FCS in einer Hybridisie rungsreaktion zwischen einer markierten Nukleinsäuresonde und einem Targetnukleinsäuremolekül verwendet wird (Kinjo, M., Rigler, R., Nucleic Acids Research 23, 1795-1799, 1995), rechnerisch verarbeitet werden.

Der gegenwärtige Erfinder hat bei seinen eigenen Unter suchungen gefunden, daß eine quantitative Messung der PCR möglich ist, indem die FCS verwendet wird. Bei seinen Untersuchungen wurde die PCR unter Verwendung von zwei Typen von Primern in einer gleichen Menge durchgeführt und indem ein fluoreszierendes Markermolekül mit dUTP, welches eines der Nukleotidmonomere ist, die bei der PCR-Amplifi zierung verwendet wurden, konjugiert wurde. Als Folge konn te das Targetnukleinsäuremolekül nachgewiesen werden, selbst wenn die PCR nur, mit einer kleinen Anzahl von Zyklen wiederholt wurde. Jedoch war es bei dem so gefundenen Ver fahren notwendig, einen Schritt zum Entfernen des fluores zierenden Moleküls durchzuführen, das nicht in das Amplifi zierungsprodukt eingebaut wurde, bevor die Fluoreszenzmes sung durchgeführt wurde. Dann forschte der gegenwärtige Erfinder weiter und fand ein neues Verfahren, welches in der Lage ist, das Targetnukleinsäuremolekül durch PCR zu quantifizieren, ohne das nichtgebundene Markermolekül zu entfernen.

Eine Vorrichtung zur Durchführung einer FCS ist schema tisch in Fig. 2 gezeigt. Die FCS-Vorrichtung umfaßt ein umgekehrtes Fluoreszenzmikroskop 1, welches ein konfokales optisches System, einen Photodetektor wie z. B. einen Pho tomultiplier 2 zum Messen der Fluoreszenz aus einer Test probe, eine datenverarbeitende Vorrichtung 3 zur Aufnahme der Meßdaten aus dem Photomultiplier 2 und zur Durchführung eines Rechenvorgangs durch Anwenden einer Autokorrelations funktion, wodurch die Meßdaten numerisch oder graphisch angezeigt werden, und eine Anzeigevorrichtung 4 zum Anzei gen des Ergebnisses des Rechenvorgangs auf einem Schirm verwendet.

Eine Testprobenflüssigkeit 11 kann einfach auf einen Glasträger 13, welcher auf einem Probenhalter 12 angebracht ist, aufgebracht werden, indem die Flüssigkeit darauf trop fenweise aufgetragen wird, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Bei dieser Vorrichtung wird, da die Testprobenflüssigkeit 11 in einer extrem kleinen Menge verwendet wird, eine Abdeckung 14 auf dem Glasträger 13 angeordnet, um eine Verdunstung von einer Feuchtigkeitsmenge aus der Flüssigkeit zu verhin dern. Es ist bevorzugt, daß die Abdeckung 14 aus einem Material gebildet ist, welches eine minimale Lichtdurchläs sigkeit aufweist, da dann gleichzeitig eine Luftdichtheit und Lichtabschirmungseigenschaften erhalten werden können. Die innere Oberfläche der Abdeckung kann jedoch vorzugs weise aus einem Material mit einem minimalen Lichtreflekti onsvermögen gebildet werden, um eine Reflektion eines Anre gungslichtstrahls zu verhindern. Unmittelbar unter dem Bereich des Glasträgers 13, auf welchem die Testprobenflüs sigkeit 11 angeordnet wird, ist eine Objektivlinse 15 auf eine solche Weise montiert, daß der Brennpunkt innerhalb der Testprobenflüssigkeit 11 liegt. Man beachte, daß das Fluoreszenzmikroskop 1, welches hierin verwendet wird, ein Fluoreszenzmikroskop vom Reflektionstyp sein kann. Bei dem Fluoreszenzmikroskop vom Reflektionstyp kann die testpro benhaltige Flüssigkeit 11 direkt tropfenweise auf die unte re Oberfläche der Objektivlinse 15 aufgetragen werden. In Fig. 2 wird ein Argon (Ar)-Ionenlaser als die lasererzeu gende Vorrichtung 16 verwendet, welche als eine Lichtquelle für das Fluoreszenzmikroskop 1 dient. Jedoch kann die Lichtquelle in Abhängigkeit von dem Fluoreszenztyp variiert werden. Insbesondere können ein Krypton-Argon (Kr-Ar)- Ionenlaser, ein Helium-Neon (He-Ne)-Laser und ein Helium- Cadmium (He-Cd)-Laser verwendet werden. Zusätzlich können verschiedene Vorgänge einschließlich des Beladens/Entladens von dem Glasträger 13 in/aus dem Fluoreszenzmikroskop 1, die tropfenweise Auftragung der Testprobenflüssigkeit auf den Glasträger 13 und der Öffnungs-/Schließvorgang der Abdeckung 14, wenn nötig, automatisch durchgeführt werden.

Fig. 3 ist eine vergrößerte Ansicht, welche den Meßbe reich des Fluoreszenzmikroskops 1 zeigt. In Fig. 3A wird ein Mikronachweisfeld 20 gebildet, indem die Positionen des Glasträgers 13 und einer Objektivlinse 15 mit einer vorher festgelegten numerischen Apertur (NA = 1,2 in der Figur) passend angeordnet werden. Wie in Fig. 3B gezeigt ist, bil det das Mikronachweisfeld 20 faktisch einen nahezu zylin drischen Bereich, welcher ein gewisses Volumen aufweist, das sich von einem Brennpunkt des Laserstrahls aus nach oben und unten erstreckt (ein verengter Mittelbereich). Das Nachweisfeld 20 ist definiert durch eine Länge Z entlang der optischen Achse und einen Durchschnittsradius W von einem Brennpunkt (Referenzpunkt). Wenn das Mikronachweis feld 20 auf ein minimales Ausmaß verringert wird, um die Mikrobewegung der fluoreszierenden Moleküle zu überwachen, ist es möglich, einzelne fluoreszierende Moleküle genau zu messen, da ein Rauschen, das von einem fluoreszierenden Molekül (in der Testprobenflüssigkeit 11) stammt, welches nicht in der Nähe des Brennpunkts vorliegt, wirksam elimi niert werden kann.

Auf der Grundlage der oben erwähnten verschiedenen Aus führungsformen ist die vorliegende Erfindung auf die Dia gnose von genetischen Krankheiten, die Identifizierung von Eltern/Kind-Beziehungen, kriminaltechnische Untersuchungen, eine Genbehandlung, die molekularbiologische Forschung, die Entwicklung von medizinischen Produkten und dergleichen anwendbar. Es sollte klar sein, daß die oben erwähnte Aus führungsform verändert und modifiziert werden kann, ohne den Umfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Bei spielsweise wird in einer Meßvorrichtung wie sie in den oben erwähnten Ausführungsformen erklärt wurde, eine Test probe auf einem Halter angeordnet und auf dieselbe Weise unter dem Fluoreszenzmikroskop gemessen wie bei der mikro skopischen Beobachtung. Wenn jedoch eine Vorrichtung, wie sie in der Europäischen Patentschrift Nr. 640828A1 offen bart ist, optisch in einer solchen Weise verbessert wird, daß das Laserlicht, welches durch eine Objektivlinse emit tiert wird, in der Testprobenflüssigkeit innerhalb eines Temperaturwechslers fokussiert wird, kann die Amplifizie rungsreaktion kontinuierlich ausgewertet werden, ohne die Testprobenflüssigkeit auf einen Glasträger zu überführen. Eine Vielzahl von Daten kann im Verlauf des PCR-Zyklus, entweder kontinuierlich oder mit Unterbrechungen, nach einer vorher festgelegten Zeit nach Abschluß eines vorher festgelegten Zyklus erhalten werden. Alternativ kann eine geeignete Anzahl von Meßdaten in jedem unterschiedlichen Zyklus erhalten werden.

Nun wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispie len veranschaulicht. Diese Beispiele sollen aber nicht so ausgelegt werden, daß sie die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise beschränken. Die vorliegende Erfindung kann in unterschiedlicher Weise modifiziert werden, ausge hend von dem Kern der vorliegenden Erfindung und innerhalb des Umfangs, welcher sich aus dem Stand der Technik ergibt, der zur Zeit, als die vorliegende Erfindung angemeldet wurde, bekannt war.

Durch einen Rho-Primer amplifizierte Menge an 500 bp- DNA und die Gesamtzahl der fluoreszierenden Moleküle, die rechnerisch unter Verwendung einer FCS-Messung berechnet wurde (1) Implementierung einer einmaligen asymmetrischen PCR Herstellung eines Primers und einer gemischten Lösung für die PCR

Asymmetrische Primerpaare wurden aus zwei Typen von nichtmarkierten Primern, d. h. dem Primer 1: 5'-GATGAGTTCGT GTCCGTACAACTGG-3' und dem Primer 2: 5'-GGTTATCGAAATCAGCCAC AGCGC-3' (hergestellt von Hokkaido System Science) und zwei Typen von Primern, dem Rho-Primer 1 und dem Rho-Primer 2 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), welche herge stellt werden, indem die oben erwähnten Primer 1, 2 mit einem fluoreszierenden Molekül Rhodamin markiert wurden, in Kombinationen und Konzentrationen, die in Tabelle 1 gezeigt sind, ausgewählt. Jedes der Primerpaare wurde mit einer Lambda-Phagen-DNA in voller Länge (48,5 kbp, 3,2 × 10⁷ Da, 1 bp = 660 Da), die als eine Matrize diente, einem Puffer (25 µl), welcher 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ und 0,001% Gelatine enthielt, mit pH 8,3, zusammen mit 2,5 U Polymerase AmplitaqGold™ (hergestellt von PE Applied Biosystems) und 0,2 mM dNTP gemischt. Die Konzentration der Matrize wurde zwischen 1 ng/25 µl und 0,1 fg/25 µl vari iert, was 1,9 × 10⁷ bis 9 × 10¹ Molekülen/25 µl entspricht.

Implementierung der PCR-Amplifizierungsreaktion

Die PCR-Reaktion einer Nukleotidsequenz einer 500 bp- Matrizen-DNA wurde durchgeführt, indem ein programmierbarer Temperaturregler, Modell PC-700 (hergestellt von Astech) verwendet wurde. Zuerst wurde für 15 Minuten bei 96°C eine Vorinkubation als ein Vordenaturierungsschritt durchge führt. Danach wurde ein PCR-Zyklus, welcher aus einem Annealingschritt bei 55°C für eine Minute, einem Elongati onsschritt bei 72°C für zwei Minuten und einem Denaturie rungsschritt bei 96°C für eine Minute bestand, mit 50 Zyklen durchgeführt.

(2) Messung der Amplifizierungsreaktionsergebnisse unter Verwendung von FCS Messung einer Testprobenmischungslösung

Nach 50 Zyklen der Amplifizierungsreaktion wurde eine geeignete Menge (10 µl) einer Testprobenmischungslösung tropfenweise durch Pipettieren auf ein Deckglas Lab-Tek (Handelsname, hergestellt von Nalge Nung) aufgetragen. Dann wurde das Deckglas auf einem Probenhalter einer umgekehrten FCS-Vorrichtung angebracht, welche ein konfokales optisches System, ConfoCor (Handelsname, hergestellt von Carl Zeiss) aufwies. Eine Objektivlinse C-Apocromat (Handelsname, Carl Zeiss) mit einer numerischen Apertur von 1,2 wurde auf die Testprobenflüssigkeit auf dem Deckglas fokussiert. Um eine Verdunstung der Testprobenflüssigkeit während der Messung (eine Minute) unter Verwendung von Argonlaser-Anregungs licht zu verhindern, wurde ein weiteres ähnliches Deckglas angeordnet, um das Tröpfchen der testprobenhaltigen Flüs sigkeit, die auf das Deckglas aufgetragen wurde, abzudek ken. Dann wurde die Fluoreszenz bei Raumtemperatur gemes sen. Nebenbei wurde das Volumen des Nachweisbereichs, wel ches ein Mikronachweisfeld der FCS-Vorrichtung ist, defi niert, indem die Diffusionszeit unter Verwendung von Rhoda min 6G als einer Referenztestprobe gemessen wurde. Als Er gebnis betrug das Verhältnis S des Durchmessers zu der Länge des Nachweisbereichs ca. 5,2. Das Volumenelement betrug gemäß der arithmetischen Berechnung 1 × 10^-15 l. Nach der FCS-Messung wurde die Testprobenmischung einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, wodurch die Fraktionen identifiziert wurden.

Umwandlung der Meßdaten in statistische Daten

Die Intensitätsverteilung des Laserstrahls an einem Brennpunkt entsprach einer Gauß-Verteilung. Jedoch wurde der Fluoreszenzbeobachtungsbereich durch eine nahezu zylin drische Gestalt ausgedrückt. Der Laserstrahl, welcher in der Testprobenflüssigkeit fokussiert wurde, bildet ein extrem kleines (mikro)zylindrisches Feld, in welches sich die fluoreszierenden Partikel durch Brownsche Bewegung hin ein- und herausbewegen. Als Folge kann die Fluktuation der Fluoreszenzintensität, welche durch eine Änderung bei der Anzahl der fluoreszierenden Partikel in dem mikrozylindri schen Feld verursacht wird, überwacht werden. Die Fluktua tion der Fluoreszenzintensität wurde analysiert, indem eine Autokorrelationsfunktion angewendet wurde, um eine durch schnittliche Anzahl von Molekülen innerhalb eines Brenn punktbereichs und eine translationale Diffusionszeit zu erhalten.

Der Wert der Fluoreszenzautokorrelationsfunktion G(t) wurde durch ein einfaches Zweikomponentenmodell der folgen den Gleichung 1 angenähert, worin N die durchschnittliche Anzahl der fluoreszierenden Moleküle ist, τ_free die Trans lationszeit eines freien Primers ist und (τ_poly) die eines Extensionsprimers ist, welches auf einem Verfahren basiert, das von Rigler et al. offenbart wurde (siehe Fluorescence Spectroscopy - New Methods and Applications, Springer, Ber lin 13-24, In J. R. Lakowicz (Herausgeber), 1992).

In Gleichung 1 ist τ_free, _poly = Wo²/4D_free, _poly und S = Wo/Zo, y ist das Verhältnis des Extensionsprimers; Wo ist ein Durchmesser eines Volumenelements in einem Meßbereich und 2Zo ist eine Länge des Bereichs. D_free und D_poly sind Translationsdiffusionskoeffizienten des freien Primers bzw. des Extensionsprimers. Die Diffusionszeit in einem Volumen element hängt mit einem Diffusionskoeffizienten zusammen.

Die Datenanalyse von der FCS wurde durch ein Computer programm durchgeführt, welches "FCS ACCESS" genannt wird (EVOTEC BioSystems Co., Ltd.), welches die nichtlineare Methode der kleinsten Quadrate anwendet.

Tabelle 1

[Gleichung 1]

In Tabelle 1 wurden beim Einpassen (fitting) τ_free (0,17 ms) und τ_poly (1,98 ms) festgelegt, um die Anzahl an freien Parameter zu verringern. In Tabelle 1 ist a eine Ausbeute des verlängerten mit Rhodamin markierten Primers, b ist eine durchschnittliche Anzahl von fluoreszierenden Molekülen in dem fokussierten Feld, c ist eine Gesamtaus beute, die berechnet wurde, indem eine anfängliche Konzen tration eines fluoreszierenden Primers und eine Ausbeute des verlängerten mit Rhodamin markierten Primers (y) ver wendet wurden, d ist eine Konzentration des mit Rhodamin markierten Primers und e zeigt "nicht nachgewiesen" an.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse eines vorläufigen Expe riments, welches durchgeführt wurde, um ein optimales Ver hältnis für einen Primersatz zu bestimmen, welcher in der asymmetrischen PCR verwendet werden sollte. Sechs Primer verhältnisse wurden getestet, 3 für Primer 1 : Rho-Primer 2 (800 : 400 nM, 800 : 40 nM und 800 : 4 nM) und 3 für Rho- Primer 1 : Primer 2 (400 : 800 nN, 40 : 800 nM und 4 : 800 nM) in Gegenwart von 1 ng Matrize. Nach 50 Zyklen der PCR wurden 10 µl der Reaktionslösung auf das Deckglas gegeben und dann für 1 Minute durch FCS gemessen. Fig. 4 zeigt typische Fluoreszenz-Autokorrelationsfunktionen. Die Trans lationsdiffusionszeit des Rho-Primers 2 (τ_free = 0,164 ms) wurde ausgehend von einer Kontrollprobe definiert, die kei nem Temperaturzyklus unterzogen wurde (ausgefüllte Kreise in Fig. 4).

Nach 50 PCR-Zyklen wurden die Autokorrelationsfunkti onskurve eines freien Rho-Primers (in Fig. 10 als Kreise aufgetragen) und die Autokorrelationsfunktionskurve eines asymmetrischen PCR-Produkts erhalten, indem deren Daten in Gleichung 1 eingesetzt wurden. Dann wurden die Translati onsdiffusionszeit des freien Rho-Primers (τ_free = 0,164 ms) und die Translationsdiffusionszeit einer amplifizierten Produkt-DNA (τ_poly = 1,98 ms) und deren Ausbeute (y = 0,6) in Gleichung 1 eingegeben. Eine weitere Kontrollprobe ohne Enzym, aber unter Anwendung des Temperaturzyklus, wurde ebenfalls gemessen (Daten sind nicht gezeigt), und das Ergebnis betrug 0,169 ms. Die Translationsdiffusionszeit der 500 bp-DNA (PCR-Produkte) wurde durch ein Einpassen (von) Autokorrelationsdaten in eine Kurve ausgewertet, was τ_poly 1,98 ms ergab (eine Kurve, die in Fig. 4 mit Qua draten dargestellt ist). Der Wert stimmte gemäß einer theo retischen Berechnung der Translationsdiffusionskonstante von stabförmigen Molekülen mit einer DNA in einer Länge von 500 bp überein. Daher wurde das amplifizierte Produkt gut über die Änderung bei der Autokorrelationsfunktion identi fiziert. Aufgrund der unterschiedlichen Translationsdiffu sionszeiten des freien Primers und des amplifizierten Pri mers war man in der Lage, die Fraktionen der amplifizierten Produkte zu quantifizieren.

Bei der Analyse wurden die Werte für τ_poly, τ_free und S beim Einpassen festgelegt, um die Anzahl an freien Parame tern zu verringern und das Verhältnis von freien zu verlän gerten Primern (y) klar zu trennen. Obwohl der freie Primer und die PCR-Produkte nach dem Temperaturzyklus nicht physi kalisch getrennt wurden, war es möglich, die Fraktionen der Produkte durch diese Analyse zu messen (Tabelle 1). In dem Fall, wo Primer 1 : Rho-Primer 2 800 nM : 40 nM war, war das Verhältnis zwischen dem restlichen freien Primer und dem PCR-Produkt (y = 0,6) besser als bei den anderen. Bei dem Primerverhältnis von 800 : 400 nM war das Gesamtprodukt von 500 bp besser als bei den anderen Primerverhältnissen. Jedoch blieben immer noch ungefähr 70% des freien Primers zurück. Obwohl erwartet wurde, daß bei dem Primerverhältnis von 800 : 4 nM der gesamte Rho-Primer 2 in das PCR-Produkt eingebaut würde, konnte nur ungefähr die Hälfte des mar kierten Primers 2 (Y = 0, 52) eingebaut werden, so daß die Ausbeute des Produkts nicht besser war als bei dem Verhält nis von 800 : 40 nM. Daher betrug ein bevorzugtes Primer konzentrationsverhältnis entweder 800 nM : 400 nM oder 800 nM : 40 nM. Somit kann das Primerkonzentrationsverhältnis aus dem Bereich zwischen diesen Primerkonzentrationsver hältnissen ausgewählt werden. Im allgemeinen wird angenom men, daß ein bevorzugtes Primerverhältnis von 2 : 1 bis 20 : 1 reicht. Anschließend wurde das Markermolekül umgekehrt an dem Primer 1 befestigt. Wenn die PCR durchgeführt wurde, indem der Rho-Primer 1 und der Primer 2 in einem Verhältnis von 400 : 800 nM, 40 : 800 nM und 4 : 800 nM verwendet wur den, betrug die Ausbeute des PCR-Produkts 0,35 oder weni ger. Somit ist es bevorzugt, das Markermolekül geeigneter weise an jeden von dem Primerpaar zu binden, wobei dieses von dem Typ des Targetnukleinsäuremoleküls und dem Primer molekül wie auch deren Kettenlänge abhängt, um die PCR-Aus beute zu erhöhen.

Die Fig. 5A und 5B zeigen die Elektrophoreseergebnisse (Agarosegel) eines amplifizierten Zielprodukts mit 500 bp, die nach der quantitativen Bestimmung durch eine FCS-Mes sung erhalten wurden. Die Lösung einer asymmetrischen PCR (3 µl) nach 50 Zyklen wurde auf ein 1,4%iges Agarosegel aufgetragen, um die asymmetrischen PCR-Produkte bei unter schiedlichen Primerverhältnissen durch eine Agarosegelelek trophorese zu charakterisieren. Fig. 5A zeigt einen Fall, wo keine Anfärbung mit Ethidiumbromid durchgeführt wurde.

Fig. 5B zeigt einen Fall, wo eine Anfärbung mit Ethidium bromid durchgeführt wurde. Bahn 1: ϕX 174-Marker, verdaut mit Hae III; Bahn 2: das Verhältnis von Primer 1 : Rho-Pri mer 2 beträgt 800 : 400 nM; Bahn 3: das Verhältnis von Pri mer 1 : Rho-Primer 2 beträgt 800 : 40 nN; Bahn 4: das Ver hältnis von Primer 1 : Rho-Primer 2 beträgt 800 : 4 nN; Bahn 5: das Verhältnis von Rho-Primer 1 : Primer 2 beträgt 400 : 800 nM; Bahn 6: das Verhältnis von Rho-Primer 1 Primer 2 beträgt 40 : 800 nM; Bahn 7: das Verhältnis von Rho-Primer 1 : Primer 2 beträgt 4 : 800 nN; Bahn 8: Kon trolle (die PCR wird unter Verwendung von normalen Primern durchgeführt); und Bahn 9: Kontrolle (unter Verwendung von Rho-Primer 2), und Kontrolle (die PCR wird unter Verwendung von Rho-Primer 1 und Rho-Primer 2 durchgeführt). Die Posi tionen von 500 bp und dem Rho-Primer 2 werden durch Pfeile angezeigt. Die schwache und breite Bande zwischen 500 bp und dem Rho-Primer ist der Bromphenolblau-Farbstoff.

In allen Fällen konnte die fluoreszierende Rhodamin bande mit 500 bp ohne eine Ethidiumanfärbung nachgewiesen werden. (Fig. 5A). Die PCR-Produkte wurden ebenfalls durch eine Ethidiumanfärbung nachgewiesen, welche nach der Elek trophorese durchgeführt wurde (Fig. 5B). Eine ssDNA (Einzelstrang-DNA) mit 500 bp war in dem Gel nicht klar sichtbar, da die Fluoreszenzintensität der ssDNA bei diesem Anfärbungsverfahren geringer ist als die der dsDNA (doppelsträngigen DNA). In den Fällen, wo das Verhältnis von Rho-Primer 1 : Primer 2 40 : 800 nM und 4 : 800 nM betrug, wurden auf dem Gel eine schmierende und eine nichtspezifische Bande nachgewiesen (Fig. 5A und 5B, Bah nen 5-7). Umgekehrt war in den Fällen, wo das Verhältnis von Primer 1 : Rho-Primer 2 800 : 400 nM, 800 : 40 nM und 800 : 4 nM betrug, die 500 bp-Bande klar nachweisbar, und deren Intensität sank, wenn sich das Primerverhältnis von 1 : 0,05 auf 1 : 0,005 änderte (Fig. 5A und 5B, Bahnen 2-4). Diese Ergebnisse entsprachen genau den Ergebnissen der FCS- Bestimmung (Tabelle 1). Das Verhältnis von Primer 1 : Rho- Primer 2 (800 : 40 nM) wurde bei dieser Arbeit in weiteren Experimenten verwendet, da die Ausbeute an 500 bp (y = 0,6) besser war als bei anderen Verhältnissen. Ein auf FCS basierender FA-PCR-Nachweis hätte die Vorteile einer quan titativen Genauigkeit und einer einfachen Durchführung. Man kann ein Targetgen durch eine einminütige FCS-Messung mit nur 10 µl der Reaktionslösung nach einer FA-PCR-Amplifizierung nachweisen. Es wäre interessant, wenn eine geringe Kopien zahl der Matrizengene durch FA-PCR amplifiziert und dann durch FCS nachgewiesen werden könnte.

Fig. 6 zeigt die Ergebnisse, welche erhalten wurden, indem die anfängliche Matrizenkonzentration einer Reakti onslösung (25 µl) vor der PCR von 1,9 × 10⁷ auf 1,9 Molekü le verändert wurde, um die Empfindlichkeit des oben beschriebenen Verfahrens der vorliegenden Erfindung zu untersuchen (ein umgekehrtes offenes dreieckiges Symbol zeigt 1,9 × 10⁷ an, ein ausgefülltes dreieckiges Symbol zeigt 1,9 × 10⁶ an, ein offenes rundes Symbol zeigt 1,9 × 10⁵ an, ein ausgefülltes quadratisches Symbol zeigt 1,9 × 10⁴ an, ein offenes rautenförmiges Symbol zeigt 1,9 × 10³ an, ein offenes umgekehrtes dreieckiges Symbol zeigt 1,9 × 10² an, ein offenes dreieckiges Symbol zeigt 1,9 × 101 an und ein ausgefülltes rundes Symbol zeigt 1,9 an). Die Auto korrelationsfunktion G(t) des Rho-Primers 2 verschob sich zu einer längeren Korrelationszeit hin (zur rechten Seite in Fig. 6 hin) proportional zu einem Ansteigen bei der Matrizenzahl nach 50 Temperaturzyklen. Diese Verschiebung entspricht einer Zunahme des verlängerten Rho-Primers 2. Die Ausbeute und die Anzahl an FA-PCR-Produkten wurden durch Gleichung 1 berechnet.

Eine durchschnittliche Anzahl der fluoreszierenden Moleküle in einem optischen Feld ist in Fig. 7 gezeigt. Es wurde kein bestimmter Einfluß auf die Anzahl der markierten DNA-Moleküle beobachtet, so daß bei diesem Experiment eine spezifische oder nichtspezifische Adhäsion oder Aufteilung an der Oberfläche des Röhrchens und/oder Glases nicht nach gewiesen wurde. Fig. 5 ist eine Kurve, welche eine Ausbeute (%) von 500 bp gegenüber einer Ausgangsmatrizenkonzentra tion zeigt. Die Ausbeute des Produkts hing von der Aus gangsanzahl an Matrizenmolekülen von 10² bis 10⁴ Moleküle pro 25 µl ab, was als der Quantifizierungsbereich verwendet werden kann. Selbst bei dem anfänglichen Vorliegen von 190 Matrizenmolekülen in 25 µl wurde der Korrelationsabfall der amplifizierten DNA aufgelöst (separated) und konnte klar nachgewiesen werden. Ein Sättigungseffekt wurde bei über 10⁵ Matrizenmolekülen nach 50 Zyklen beobachtet. Obwohl eine Anzahl von Faktoren zu dem Sättigungseffekt beigetra gen haben könnte, hing er einfach von der Anzahl der Zyklen ab. Daher wird der Quantifizierungsbereich optimiert, indem die Anzahl der Temperaturzyklen für eine höhere Konzentra tion an anfänglichen Matrizenmolekülen verringert wird.

Die gegenwärtigen Erfinder führten Experimente durch, um die PCR-Reaktionsbedingungen optimaler zu machen. Als Folge wurde selbst in dem Fall, wo 20 der Matrizen-DNA- Moleküle in einer Testprobe vorhanden waren, der Nachweis der Matrizen-DNA-Moleküle erfolgreich durchgeführt. Wenn andere Bedingungen für die PCR stärker optimiert werden, wird erwartet, daß es leicht ist, das Nachweisverfahren in einer solchen Weise zu gestalten, daß 5 Matrizen-DNA-Mole küle oder weniger nachgewiesen werden können. Solche expe rimentellen Ergebnisse legen nahe, daß nur ein Molekül der Matrizen-DNA im Prinzip bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden könnte.

Fig. 9 zeigt die anfängliche Matrizenzahl, die in einer Mischungslösung von 25 µl vorhanden ist, gegenüber der Aus beute (%) des PCR-Produkts in Bezug auf jeden der verschie denen PCR-Zyklen. Anhand der Ergebnisse wird gezeigt, daß eine asymmetrische PCR mit 20 Zyklen ausreicht, um die Tar get-DNA in dem Fall zu quantifizieren, wo die anfänglichen Matrizenmoleküle in so großen Zahlen wie 10⁶ oder mehr vor liegen. In ähnlicher Weise werden 30 Zyklen in dem Bereich von 10⁴ bis 10⁶, 40 Zyklen in dem Bereich von 10² bis 10⁴ und 50 Zyklen oder mehr in dem Bereich von 10³ oder weniger geeigneterweise bei der Quantifizierung der Target-DNA ver wendet. Insbesondere wenn die anfänglichen Matrizen in einer hohen Konzentration vorliegen, kann der zur Quantifi zierung verfügbare Bereich optimiert werden, indem die Anzahl der PCR-Zyklen verringert wird. Wenn Daten innerhalb der eine Quantifizierung sicherstellenden Anzahl von Zyklen, wie sie oben erwähnt ist, erhalten wurden, ist es möglich, die anfängliche Anzahl an Matrizen beispielsweise dadurch zu bestimmen, daß mit der Zahl der Zyklen multipli ziert wird.

Fig. 10 ist eine Kurve, welche die Ausbeute eines PCR- Produkts gegenüber der Anzahl der PCR-Zyklen in Bezug auf die anfängliche Anzahl der Matrizen-DNA zeigt (die Daten wurden von jenen aus Fig. 9 abgeleitet). Durch die Ergeb nisse wird gezeigt, daß, wenn die Matrizen mit einer anfänglichen Anzahl von 2 × 10³ vorliegen, die Bestimmung präzise durchgeführt werden kann. Unter Berücksichtigung der Daten aus Fig. 9 ist es vorstellbar, daß eine Bestim mung selbst dann durchgeführt werden kann, wenn die Matri zen mit einer anfänglichen Anzahl von 2 × 10² vorliegen.

Kürzlich wurden einige Berichte in Bezug auf ein Ver fahren zum Nachweisen eines Targetgens unter Verwendung von FCS veröffentlicht. Es wurde gefunden, daß eine auf einer Nukleinsäuresequenz basierende Amplifizierung (NASBA) mit FCS kombiniert werden konnte und sich als ein nützliches Nachweisverfahren für die Diagnose des menschlichen Immun defizienzvirus (HIV) in Plasma erwiesen hat (siehe Oehlen schlager, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12811- 12816, 1996). Bei dem NASBA-Verfahren, welches eines der Nukleinsäureamplifizierungsverfahren ist, werden zwei Pri mer und ein zusätzlicher Fluoreszenz-markierter Primer, welcher als eine Sonde dient, in Gegenwart von drei Enzy men, nämlich T7-RNA-Polymerase, reverser Transkriptase und RNaseH benötigt. Ein einfacheres Verfahren, der sogenannte Amplifizierte-Sonden-Extensions (APEX)-Nachweis durch FCS, wurde von derselben Gruppe berichtet. Dieses verwendet aber immer noch einen zusätzlichen Fluoreszenz-markierten Primer als eine Sondensequenz neben einem Satz von einem Vorwärts primer und einem Rückwärtsprimer (Walter, N. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12805-12810, 1996). In die sem Experiment wurde eine Zeitverschiebung der Autokorrela tionsfunktion nach 26 Zyklen beobachtet.

Von einem auf einer Fluoreszenzauslöschung basierenden PCR-Quantifizierungsverfahren wie z. B. einer Fluoreszenz energietransferanalyse wurde vorher berichtet (Heid, C. A. et al., Genome Res., 6, 986-994, 1996, Livak, K. J., PCR Method, Appl., 4, 357-362, 1995) und dieses wurde kommer zialisiert. Dieses Verfahren benutzt zwei Arten von Farb stoffen in einer einzigen Sondensequenz neben einem Paar von PCR-Primern wie bei dem NASBA-Verfahren und dem APEX- Verfahren, welche oben beschrieben wurden. Um eine Oligonu kleotidsequenz der Sonde zu planen, ist es nicht nur not wendig, eine Nukleotidsequenz zur Verfügung zu stellen, die nicht mit der Sequenz des Primers konkurriert, sondern ebenfalls die Schmelztemperatur T(m) zu berücksichtigen. Zusätzlich beeinflußt die Position zwischen dem Donor- und dem Akzeptorfarbstoff die Effizienz der Zunahme der Fluo reszenzintensität sowie die 5'-Nukleaseaktivität der Poly merase.

Ein weiteres Fluktuationsspektroskopieverfahren (Fluo reszenzkreuzkorrelationsspektroskopie) ist als ein Nach weisverfahren für ein spezifisches Targetgen in einer homo genen Lösung berichtet worden (Gastro, A. et al., Anal. Chem., 67, 3915-3920, 1997, Rudolf Rigler et al., J. Bio technology, 63, 97-109, 1998). Bei dem Kreuzkorrelations verfahren werden zwei Sonden oder Primer, welche an unter schiedliche Stellen auf der Targetnukleinsäure binden, mit zwei Typen von Fluoreszenzfarbstoffen markiert, die eine unterschiedliche Absorptionswellenlänge aufweisen. Als Folge ist das optische System einer Meßvorrichtung unver meidbar groß und kompliziert, um beobachten zu können, daß Primer, welche mit zwei Typen von Fluoreszenzmarkern mar kiert sind, mit einem einzigen Nukleinsäuremolekül hybridi siert sind. Obwohl der Einsatz der zwei Typen von Farbstof fen ermöglicht, daß eine extrem kleine Menge der Target nukleinsäuresequenz nachgewiesen wird, benötigt dieses Ver fahren immer noch zwei Typen von Fluoreszenzsonden (Primern) und ist daher nachteilig in Bezug auf eine leich te Handhabung und die Reagenzkosten.

Aus dem Gesichtspunkt der einfachen Durchführung bietet das auf FCS basierende PCR-Quantifizierungsverfahren einen großen Vorteil gegenüber den Energietransfer- und Kreuzkor relationsverfahren. Die Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit der PCR sind stark von dem Typ des Enzyms (Pol I-Typ oder α- Typ), der Auswahl der Primersequenz und den Reaktionsbe dingungen abhängig. Wenn diese Bedingungen festgelegt wur den, kann eine auf FCS basierende FA-PCR unmittelbar auf den gewöhnlichen PCR-Test angewendet werden, wobei nur eine leichte Modifizierung des Primerverhältnisses notwendig ist. Daher werden Bedingungen für eine routinemäßige PCR leicht zu Bedingungen für eine FA-PCR modifiziert. Darüber hinaus können andere Amplifizierungsverfahren wie bei spielsweise eine reverse Transkriptions (RT)-PCR für dieses Verfahren modifiziert werden, und es sollte möglich sein, in der Zukunft die mRNA in einzelnen Zellen zu quantifizie ren.

In der Gelelektrophorese und Säulenchromatographie wird das PCR-Produkt von dem Primer und den Nebenprodukten abge trennt. Jedoch wird das Zielprodukt während der Elektropho rese und der Exträktionsverfahren aus den Gelmaterialien verdünnt und kann dann mit Nukleasen in Kontakt kommen, was zu einem Abbau führt. Umgekehrt ist das FCS-Verfahren für eine Probensammlung nach der Messung gut geeignet; ein Tropfen der Probe wird auf ein Deckglas gegeben, und die FCS ist ein nichtinvasives Verfahren, so daß die PCR-Lösung während der Messung nicht verdünnt oder zerstört wird. Bei dem oben beschriebenen FA-PCR-Nachweisverfahren, welches auf der FCS basiert, wird unter den Reaktionsbedingungen nur der Primer, welcher mit Fluoreszenz markiert ist, benö tigt, ohne daß ein physikalisches Trennverfahren wie z. B. ein Gelfiltrationsverfahren angewendet werden muß. Obwohl die Auflösung der Gelelektrophorese höher ist und diese einen Unterschied in der Länge von einem einzigen Nukleotid nachweisen kann, ist die sehr kurze Analysedauer (1 Min. in dem Beispiel) der FCS-Messung verglichen mit der Gelelek trophorese (1 h) vorteilhaft bei der Analyse von sehr vie len Proben (z. B. in der Diagnose und beim Screenen). Dia gescreente Probe aus der FCS kann unmittelbar einer detail lierten Analyse wie z. B. einer Gelelektrophorese unterzogen werden, um die FCS-Ergebnisse zu bestätigen oder um die Nukleotidsequenz zu analysieren. Darüber hinaus kann die gesammelte Probe in weiteren Experimenten verwendet werden (beispielsweise als eine Hybridisierungssonde). Wenn man die amplifizierte Probe nach der FCS-Messung nicht sammeln muß, kann sie ohne ein Risiko einer Übertragungskontamina tion weggeworfen werden, da die FCS ein Meßverfahren ohne direkten Kontakt ist.

Da die FCS nicht invasiv ist und eine direkte Messung erlaubt, ist das PCR-Volumen von dem Meßvolumen abhängig, das für die FCS benötigt wird. Derzeitige Messungen bei der FCS wurden mit einem Probenvolumen von 10 µl durchgeführt, obwohl das Probenvolumen theoretisch auf ein Volumenelement in der Größenordnung von 10^-15 l verringert werden kann. Jedoch kann das PCR-Volumen auf 1 µl verringert werden, und somit hätte dieses Verfahren aus einem ökonomischen Gesichtspunkt einen großen Vorteil im Vergleich zu anderen Verfahren. Darüber hinaus basiert die FCS auf einer Fluo reszenzmikroskopie, und das Nachweisfeld befindet sich auf dem Objektiv, so daß dieses Verfahren in der Lage sein wird, spezifische RNA und DNA aus einer in situ-PCR zu quantifizieren.

Die gegenwärtigen Erfinder haben ein Zweikomponentenmo dell zur Analyse der PCR-Lösung verwendet und gute Ergeb nisse erhalten. Jedoch könnten in anderen Experimenten viele DNA-Spezies vorhanden sein. In solchen Fällen können die DNA-Spezies gut durch herkömmliche Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Obwohl die Lücke in der Korrelations kurve aus der Modellfunktion zu den beobachteten Daten der FCS einige andere Komponenten nahelegen könnte, die in der Lösung verteilt sind, scheint das einfache Zweikomponenten modell in solchen Fällen die Grenze zu sein. Demgemäß soll te, wenn eine detailliertere quantitative Analyse notwendig ist, eine Mehrkomponenten-FCS-Analyse (13) entwickelt wer den, um die Verteilungsfunktion zu erhalten, wobei ein Com puterprogramm wie z. B. CONTIN (Max Planck Institut für Bio physikalische Chemie, Göttingen, Deutschland) verwendet werden kann.

Ohne einen physikalischen Trennungsvorgang zu benutzen, ist dieses Verfahren nicht invasiv, beinhaltet keinen direkten Kontakt und verwendet ein kleines Probenvolumen. Die physikalische Handhabung eines solchen kleinen Proben volumens kann durchgeführt werden, indem ein Kapillar röhrchen verwendet wird oder indem eine kleine Probenver tiefung auf einer Glasoberfläche verwendet wird, welche für eine Online-Analyse von einem dünnen Deckgläschen oder von einer Folie abgedeckt wird. Mit diesen Eigenschaften und Verbesserungen ist es unkompliziert zu verwenden, und das Verfahren, welches verwendet wird, um die Amplifizierung zu überwachen, ist einfach (Online-Überwachung) und kann mit einem automatischen Nachweissystem (Roboter) verwendet wer den. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung schließen daher, daß die auf FCS basierende FAPCR-Quantifizierung Vorteile im Hinblick auf die Empfindlichkeit, quantitative Genauigkeit und einfache Handhabung aufweist. Da das räum liche (dreidimensionale) Auflösungsvermögen der Mikrosko pie, welche verwendet wird, die Auflösung der FCS ist, kann leicht gemessen werden, indem räumlich ein Teil der Zelle ausgewählt wird. Beispielsweise kann ein intrazellulärer molekularer Transport eines Fusionsproteins unter Verwen dung von GFP (grün fluoreszierendes Protein) gemessen wer den. Weiterhin wird erwartet, daß das Verfahren der vorlie genden Erfindung nicht nur für ein schnelles Screenen nütz lich sein wird, sondern sich ebenfalls für das neue Gebiet der molekularen Diagnose anbietet.

Wie in diesem Beispiel beschrieben wurde, wird das PCR- Amplifizierungsverfahren durchgeführt, indem ein Primer mit einem Markermolekül markiert wird. Weiterhin wird das Ver halten jedes Markermoleküls statistisch durch die Beobach tung innerhalb eines Mikronachweisfeldes analysiert. Es ist daher möglich, die Menge der Targetnukleinsäure, welche in einer Testprobe vorhanden ist, genau nachzuweisen. Da zusätzlich das Markermolekül an einen zweiten Primer gebun den ist, der relativ und signifikant in einer kleinen Menge vorliegt, wird ein freies Markermolekül sicher und voll ständig während der PCR-Zyklen aufgebraucht, mit dem Ergeb nis, daß eine Gebunden/Frei-Trennung der Markermoleküle nicht nötig ist. Demgemäß ist dieses Verfahren leicht zu handhaben, auf automatisierte Vorgänge anwendbar und weist verminderte Kosten für die Reagenzien auf.

Claims

1. Verfahren zum quantitativen Analysieren eines Target nukleinsäuremoleküls, das in einer biologischen Probe vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
einen Amplifizierungsschritt zum Amplifizieren der Tar getnukleinsäure, wobei erste und zweite Primermoleküle verwendet werden, welche Sequenzen aufweisen, die zu zwei einzelnen entsprechenden Nukleotidsequenzbereichen des Targetnukleinsäuremoleküls komplementär sind, wobei wenigstens einer von dem ersten und zweiten Primer mit einem nachweisbaren Markermolekül markiert ist und wenigstens die Anzahl der markierten Primermoleküle bekannt ist;
einen Meßschritt zum Erhalten von Meßdaten in Bezug auf das markierte Molekül unter Verwendung wenigstens eines Teils einer Testlösung, die wenigstens einem einzigen Amplifizierungsschritt unterzogen wurde; und
einen Bestimmungsschritt zum Bestimmen der Anzahl oder der Größe der Targetnukleinsäuremoleküle auf der Grund lage der Meßdaten.

2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß der Amplifizierungsschritt durchge führt wird, indem erste und zweite Primer verwendet werden, welche in einem Mischungsverhältnis enthalten sind, das ausgewählt wurde, um eine asymmetrische Nukleinsäureamplifizierung zu erreichen.

3. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß die Anzahl von einem des ersten und zweiten Primers niedriger ist als die des anderen Pri mers und daß der Primer, der in einer geringeren Anzahl vorliegt, mit einem Markermolekül markiert ist.

4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 3, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß das Mischungsverhältnis des ersten und zweiten Primers in der Testlösung in einem Bereich von 2 : 1 bis 20 : 1 fällt.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 3, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß das Mischungskonzentrationsverhältnis des ersten und zweiten Primers in der Testlösung in einem Bereich von 800 nM : 400 nM bis 800 nM : 40 nM fällt.

6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß der Meßschritt die folgenden Schritte umfaßt:
einen Schritt zum Erhalten einer Vielzahl von Meßdaten innerhalb eines vorbestimmten Zeitintervalls in einem Mikronachweisfeld, welcher individuelle Markermoleküle zu identifizieren vermag;
einen Schritt zum Umwandeln der Vielzahl von Meßdaten in statistische Daten, welche eine Positionsänderung mit der Zeit anzeigen; und
einen Schritt zum Bestimmen der Anzahl von Target nukleinsäuremolekülen auf der Grundlage der statisti schen Daten.

7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß es weiterhin einen Schritt der Durch führung einer Rechenoperation mit den statistischen Daten unter Verwendung einer Autokorrelationsfunktion umfaßt.

8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 7, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß in dem Meßschritt eine Fluktuations bewegung des Markermoleküls in der Testlösung gemessen wird.

9. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Bestimmungsschritt auf der Grundlage einer Kurve durchgeführt wird, welche durch Auftragen der statistischen Daten erhalten wurde und welche eine dynamische Veränderung des Targetmole küls zeigt.

10. Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß der Meßschritt in einem dreidimensio nalen Mikronachweisfeld durchgeführt wird.

11. Ein Verfahren gemäß Anspruch 10, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Mikronachweisfeld in dem Meßschritt durch ein konfokales optisches System gebil det wird.

12. Ein Verfahren gemäß Anspruch 11, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Mikronachweisfeld ein beu gungsbegrenzter Bereich nahe einem Brennpunkt ist.

13. Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der beugungsbegrenzte Bereich durch eine Lochblende gebildet wird, welche einen durchschnittlichen Durchmesser von 30 ± 20 µm aufweist.

14. Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der beugungsbegrenzte Bereich durch eine Lochblende gebildet wird, welche einen durchschnittlichen Durchmesser von 20 ± 10 µm aufweist.

15. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9-14, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Mikronachweisfeld faktisch ein zylindrischer Bereich mit einem durch schnittlichen Radius von 200 ± 50 nm und einer durch schnittlichen Länge auf einer optischen Achse von 2000 ± 500 nm ist.

16. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß das Markermolekül einen fluoreszie renden Farbstoff umfaßt.

17. Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der fluoreszierende Farbstoff sowohl vor als auch nach der Hybridisierung ein nach weisbares Signal erzeugt.

18. Ein Verfahren gemäß Anspruch 17, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der fluoreszierende Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus FITC, DAPI, Rhodamin, Cy 3, Cy 3,5, Cy 5,5 und Cy 7 ausgewählt wird.

19. Ein Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Meßschritt über einen Meßmodus zur Messung einzelner Photonen durchge führt wird.

20. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, welches dadurch gekenn zeichnet ist, daß der Amplifizierungsschritt in der Anzahl von Zyklen durchgeführt wird, welche in Abhän gigkeit von der Menge des Targetnukleinsäuremoleküls bestimmt wird.