WO2003021240A1 - Einkanal-mehrfarben-korrelationsanalyse - Google Patents

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WO2003021240A1
WO2003021240A1 PCT/EP2002/009610 EP0209610W WO03021240A1 WO 2003021240 A1 WO2003021240 A1 WO 2003021240A1 EP 0209610 W EP0209610 W EP 0209610W WO 03021240 A1 WO03021240 A1 WO 03021240A1
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optical
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excitation
luminescent molecules
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Rudolf Rigler
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Adrian Honegger
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Definitions

  • the invention relates to a method for determining luminescent molecules by optical excitation in confocal measurement volumes, wherein different species of luminescent molecules in a sample are excited at different times and the emission radiation originating from the different species from a measurement volume is collected by a single detector. Furthermore, a device suitable for carrying out the method is disclosed.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the fluorescence correlation spectroscopy can be carried out in conjunction with a so-called cross-correlation analysis, in which two species of luminescent molecules which differ with respect to at least one optical property are excited in a confocal measurement volume and the presence or absence of a correlation between the two measurement signals is analyzed.
  • a disadvantage of cross-correlation methods used to date is that the emission radiation originating from the different luminescent species had to be detected by * -separate detectors.
  • One object on which the present application was based was to provide methods and devices for determining luminescent moles, in particular the color-fluorescence correlation spectroscopy, which can be used to determine in a simple manner Allow cross correlations.
  • the invention thus relates to a method for determining luminescent molecules by optical excitation in confocal measurement volumes, comprising the steps: (a) providing a sample comprising luminescent molecules,
  • Molecules in at least one confocal measurement volume which is part of the sample, and (c) collecting and evaluating emission radiation from the at least one measurement volume, wherein in one measurement volume several species of luminescent molecules that are different with regard to an optical property are excited at different times and the emission radiation from the different species is captured and evaluated by a single detector.
  • the method according to the invention represents a single-channel multicolor correlation analysis, several, e.g. 2, 3, 4 or even more, with respect to at least one optical property, such as emission wavelength and / or luminescence decay time, different species of luminescent molecules are excited in a single measurement volume and the signals can be evaluated on a single detector.
  • at least one optical property such as emission wavelength and / or luminescence decay time
  • 2 or more, for example 3, separate light sources in particular lasers with different wavelengths, for example ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, are preferably used each used separate excitation of different species.
  • These separate light sources can be irradiated or coupled into the confocal measurement volume at one or more times by means of one or more adjustable optical switching elements and used therein to excite the emission.
  • suitable adjustable optical switching elements are acousto-optical modulators, adjustable reflection elements, such as, for example, piezo-controlled mirrors, adjustable diffraction elements, adjustable diffraction-optical elements and Kerr cells.
  • a single detector is used per measurement volume, which alternately records the signals emitted by the different excited species and defines them by suitable measures, for example a digital coding signal.
  • a signal processor, a data storage unit and a correlator are preferably also connected to the detector.
  • the signal picked up by the detector is preferably evaluated in a correlator with a coding signal corresponding to the clock frequency of the different light sources.
  • energy-dispersive detectors can also be used, which can differentiate between the individual types of emission radiation that come from the differently excited species.
  • the clock frequency with which the various light sources are radiated onto the measurement volume is related to the measurement signal to be expected. So when determining diffusion events, where the diffusion time, e.g. is in the range of about 1 ms, a clock frequency with a significantly shorter clock interval, e.g. with a clock interval of 0.1-10 ⁇ s (corresponding to 10-0.1 MHz), e.g. of approximately 1 ⁇ s (corresponding to 1 MHz). With other types of determinations, the cycle time is set accordingly.
  • ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 can be used to calculate autocorrelation functions (only taking a single signal into account) and cross correlations (taking into account several signals together), e.g. ⁇ 1 x ⁇ 2, ⁇ 2 x ⁇ 3, ⁇ 1 x ⁇ 3 or ⁇ 1 x ⁇ 2 x ⁇ 3 It is therefore a multiplexing method that can basically be transferred to a larger number of laser frequencies.
  • Corresponding electronic background analysis can be used to calculate a correlation or / and coincidence curve in which "correctly" occurring signals can be distinguished from signals which arise from undesired interference (crosstalk) from several marker groups.
  • dichroic filters and / or blocking filters e.g. Interference filters of various orders or notch filters for regulating the radiation, e.g. for selective transmission at certain wavelengths.
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention comprises a parallel determination of luminescent molecules in several samples.
  • the light emitted by the optical excitation device can be split into multiple light beams or foci, which are focused on measurement volumes in several samples.
  • the emitted light is split up by using one or more diffractive optical elements, as described in DE 1 01 26 083.0.
  • a diffractive optical element, which is arranged in the beam path before the beam combination, is particularly preferably used for each light source.
  • the diffractive optical elements that can be used are, for example, three-dimensional optical gratings, optionally applied to an optically transparent support, which diffract light that passes through and generate a predetermined diffraction pattern in the object plane through constructive and destructive interference, ie a desired arrangement of multiple optical foci, in any arrangement can.
  • the multiple optical foci are favorably caused by interference 1. Order formed, with only slight light losses due to interferences of the 0th or higher orders.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention relates to the detection of molecules luminescent in the confocal measurement volumes by fluorescence correlation spectroscopy.
  • the method can in principle be carried out according to the method described in EP-B-0 679 251.
  • the measurement is carried out preferably by one or a few analyte molecules in a measuring volume, wherein the concentration of the analyte to be determined is preferably 10 "6 mol / l and the measuring volume, preferably ⁇ 10" 1.
  • Substance-specific parameters are determined, which are determined by luminescence measurement on the analyte molecules.
  • a preferred feature of the method according to the invention is that the distance between the measurement volume in the sample liquid and the focusing optics of the light source is> 1 mm, preferably 1.5 to 10 mm and particularly preferably 2 to 5 mm. It is further preferred that a gas phase region is arranged between the carrier containing the sample liquid and the optical focusing device, which can contain air, protective gas or vacuum. Methods and devices for performing FCS with a large distance between focusing optics and confocal measurement volume are described in DE 101 1 1 420.6. However, for certain applications it is of course also possible to choose a smaller distance between focusing optics and measuring volume of ⁇ 1 mm. Direct contact between the specimen and the focusing optics, e.g. by using an immersion liquid.
  • the method according to the invention is basically suitable for carrying out any determination method.
  • a preferred embodiment relates to the determination of an analyte in a sample, for example for diagnostic applications or for screening to identify active substances which interact with a target substance.
  • one or more analyte-binding substances are added to the sample, which carry a marking group that can be detected by luminescence measurement, in particular a fluorescence marking group.
  • the method according to the invention preferably comprises determining the binding of the labeling substance to the analyte to be detected.
  • This proof can be, for example, by Multi-color cross-correlation determination is carried out, using at least two different markings, in particular fluorescence markings, the correlated signal of which is determined within the measurement volume.
  • This cross-correlation determination is, for example, by Schwüle et al. (Biophys. J. 72 (1 997), 1 878-1 886) and Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1 998), 97-1 09).
  • the method according to the invention is particularly suitable for the detection of biomolecules, e.g. Nucleic acids, proteins or other analyte molecules occurring in living organisms, especially in mammals such as humans.
  • biomolecules e.g. Nucleic acids, proteins or other analyte molecules occurring in living organisms, especially in mammals such as humans.
  • analytes that have been generated in vitro from biological samples can also be detected, e.g. cDNA molecules which have been produced by reverse transcription from mRNA or proteins which have been produced by in vitro translation from mRNA or from DNA.
  • the method is also suitable for the detection of analytes which are present as elements of a library and have predetermined characteristics, e.g. Binding to the detection reagent. Examples of such libraries are phage libraries or ribosomal libraries.
  • the determination comprises nucleic acid hybridization, one or more luminescence-labeled probes binding to a target nucleic acid as analytes.
  • Hybridization methods of this type can be used, for example, to analyze gene expression, for example to determine a gene expression profile, to analyze mutations, for example single nucleotide polymorphisms (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphisms
  • the method according to the invention is also suitable for determining enzymatic reactions and / or for determining nucleic acid amplifications, in particular in a thermocycling process.
  • Preferred methods for determining nucleic acid polymorphisms are in DE 100 56 226.4 and DE 100 65 631 .5 described. A two-color or multicolor cross-correlation determination is particularly preferably carried out.
  • the determination comprises the detection of a protein-protein or protein-ligand interaction, the protein ligands being e.g. low molecular weight active substances, peptides, nucleic acids etc. can be used.
  • a two- or multi-color correlation measurement is preferably also carried out for such determinations.
  • so-called “molecular beacon” probes or primers can be used which, when they are in free form, give a measurement signal which differs in terms of luminescence intensity or / and decay time than in the bound state.
  • a further preferred embodiment of the invention comprises a method for the selection of particles in a substance library, wherein a particle with a predetermined property is selected from a population comprising a large number of different particles.
  • a population of different particles is preferably provided, particles which have a predetermined property are marked, the particles are guided in a microchannel through a detection element, comprising multiple confocal volume elements, in order to differentiate between marked and unmarked particles and separated marked particles.
  • the steps of guiding and separating are preferably repeated at least once, the concentration of the particles in a subsequent cycle being preferably reduced by at least a factor of 10 4 compared to a previous cycle.
  • the particles can be selected, for example, from cells, parts of cell surfaces, cell organelles, viruses, nucleic acids, proteins and low-molecular substances.
  • the method is also suitable for Selection of particles from a combinatorial library, which can contain genetic packaging such as phages, cells, spores or ribosomes.
  • the particle population preferably contains more than 10 6 and particularly preferably more than 10 10 different particles.
  • the particles are preferably labeled with a luminescent labeling group.
  • Yet another embodiment comprises performing a sequence analysis of polymers, in particular biopolymers, wherein luminescent fragments of an analyte present in the sample are determined.
  • This embodiment is particularly suitable for performing nucleic acid sequencing.
  • a carrier particle with a nucleic acid molecule immobilized thereon is preferably provided, with essentially all nucleotide building blocks of at least one base type bearing a fluorescent label in at least one strand of the nucleic acid molecule.
  • the carrier particle is introduced into a sequencing device comprising a microchannel, there, e.g. held with an IR capture laser and, e.g.
  • nucleic acid building blocks are then passed through a microchannel, preferably by means of a hydrodynamic flow, and there the base sequence of the nucleic acid molecule is determined in confocal volume elements on the basis of the sequence of the cleaved nucleotide building blocks.
  • the light beams originating from the light sources are split into several optical foci.
  • the light beam is preferably split into 2-32, in particular 4-16 optical foci.
  • confocal volume elements are imaged in the sample from these optical foci.
  • the confocal volume elements advantageously have one Size from 10 "18 to 10 " 9 I, preferably from 10 " 18 to 10 " 12 1 and particularly preferably from 10 -16 to 10 "14 I.
  • a separate detector per volume unit or a spatially resolving detection matrix e.g. an avalanche photodiode matrix or an electronic detector matrix, e.g. a CCD camera.
  • these confocal volume elements are each provided in separate containers of a carrier, preferably a microstructure.
  • the volume of these containers is preferably in the range from 10 "6 I and particularly preferably ⁇ 10 " 8 I to 10 ⁇ 12 I.
  • the carrier can comprise a microwave structure with several wells for receiving sample liquid, for example, a diameter between 10 and 1000 microns exhibit. Suitable microstructures are described, for example, in DE 100 23 421 .6 and DE 100 65 632.3. These microstructures can be used, for example, to determine nucleic acid hybridization in solution.
  • the carrier preferably comprises at least one temperature control element, for example a Peltier element, which enables temperature regulation of the carrier and / or individual sample containers therein.
  • the carrier used for the method is expediently designed in such a way that it enables optical detection of the sample.
  • a carrier which is optically transparent at least in the region of the sample containers is therefore preferably used.
  • the carrier can either be completely optically transparent or an optically transparent base and contain an optically opaque cover layer with cutouts in the sample containers.
  • Suitable materials for supports are, for example, composite supports made of metal (for example silicon for the cover layer) and glass (for the base). Such supports can be produced, for example, by applying a metal layer to the glass with predetermined cutouts for the sample containers.
  • plastic carriers made of polystyrene or polymers based on acrylate or methacrylate can be used. It is further preferred that the carrier has a cover for the sample containers in order to provide a closed system which is essentially isolated from the surroundings during the measurement.
  • a carrier which contains a lens element which is arranged in the beam path between the measurement volume and the light source or detector of the optical device.
  • the lens element can be attached to the bottom of a microwave structure.
  • a lens element can be made, for example, by heating and molding a photoresist using a master mold, e.g. made of metal such as silicon, and then applied to the carrier.
  • a master mold e.g. made of metal such as silicon
  • supports made of fully plastic structure e.g. when using supports made of fully plastic structure - the lens elements integrated in the support, e.g. are produced during injection molding.
  • the numerical aperture of the optical measuring arrangement can be enlarged by using a lens element, preferably a convex lens element. This numerical aperture is preferably in the range from 0.5 to 1.2.
  • the support is also preferably coated with a transparent anti-reflective coating to produce a higher refractive index.
  • a transparent anti-reflective coating for example, transparent oxides or nitrides can be used as antireflection coatings.
  • Anti-reflective coatings are preferably also used on the optics.
  • electric fields can be generated in the carrier, in particular in the area of the sample containers, in order to achieve a concentration of the analytes to be determined in the measurement volume. Examples of electrodes that are suitable for generating such electrical fields are described, for example, in DE 101 03 304.4.
  • the molecule to be determined can be bound to a carrier particle, in particular in the case of a determination in microwave format or in the case of single molecule sequencing.
  • the carrier particle has a size that enables movement in microchannels and retention in a desired position within a sequencing device.
  • the particle size is preferably in the range from 0.5-1 ⁇ m and particularly preferably from 1-3 ⁇ m.
  • suitable materials for carrier particles are plastics, such as polystyrene, glass, quartz, metals or semimetals, such as silicon, metal oxides, such as silicon dioxide, or composite materials which contain several of the aforementioned components.
  • Optically transparent carrier particles for example made of plastics or particles with a plastic core and a silicon dioxide shell, are particularly preferably used.
  • Nucleic acid molecules are preferably immobilized on the carrier particle via their 5 'end, e.g. through covalent or non-covalent interaction.
  • the binding of polynucleotides to the support is particularly preferably carried out by high-affinity interactions between the partners of a specific binding pair, e.g. Biotin / streptavidin or avidin etc.
  • nucleic acid molecules can also be bound to the support by adsorption or covalently.
  • Carrier particles to which only a single nucleic acid molecule is bound are preferably used. Such carrier particles can be produced in that the intended for the determination
  • Nucleic acid molecules in a molar ratio of preferably 1: 5 to 1:20, for example 1:10, are brought into contact with the carrier particles under conditions in which the nucleic acid molecules are immobilized on the carrier.
  • the nucleic acid molecules bound to a support e.g. DNA molecules or RNA molecules can be in single-stranded form or double-stranded form.
  • the nucleic acid molecules are preferably in single-stranded form.
  • a fluorescent labeling group e.g. at least 90%, preferably at least 95% of all nucleotide building blocks of at least one base type, a fluorescent labeling group.
  • all nucleotide building blocks of at least 2 base types, for example 2, 3 or 4 base types can carry a fluorescent label, each base type advantageously containing a different fluorescent label group.
  • Such labeled nucleic acids can be obtained by enzymatic primer extension on a nucleic acid template using a suitable polymerase, e.g. a thermostable DNA polymerase. A detailed description of this method can be found in DE 100 31 840.1 and DE 100 65 626.9 and the literature citations given there.
  • Yet another object of the present invention is a device for determining luminescent molecules, in particular for carrying out a method as described above
  • an optical excitation and focusing device comprising a plurality of separate light sources, and an adjustable optical switching element for coupling the separate light sources at different times to a confocal measurement volume, which is part of the sample, and (c) an optical detection device, each comprising a single detector per measurement volume for the detection of luminescence.
  • the carrier is preferably a microstructure with a plurality, preferably at least 10, particularly preferably at least 10 2 containers for holding a sample liquid, the sample liquid in the separate containers being able to come from one or more sources.
  • the sample liquid can be introduced into the containers of the carrier, for example by means of a piezoelectric liquid dispensing device.
  • the containers of the carrier are designed in such a way that they enable the detection reagent to be bound with the analyte in solution.
  • the containers are preferably depressions in the carrier surface, whereby these depressions can in principle have any shape, for example circular, square, diamond-shaped, etc.
  • the carrier can also comprise 10 3 or more separate containers.
  • the carrier can also contain a microchannel structure with one or more microchannels, which is particularly suitable for a single-molecule sequencing method, as described in DE 100 31 840.1 and DE 100 65 626.9, or for a particle selection method, as described in DE 100 31 028.1, are suitable.
  • the optical excitation and focusing device comprises a plurality of strongly focused light sources, preferably laser beams, which are focused on the measurement volume in the sample liquid by means of corresponding optical devices.
  • the individual laser beams are focused on the measurement volume with adjustable optical switching elements at different times in a predetermined time cycle.
  • the optical device preferably contains dichroic filters and / or blocking filters and - for splitting the laser beams into multiple foci - one or more diffractive optical elements.
  • the diffractive optical elements can be arranged before or / and after the combination of the different laser beams.
  • a diffractive optical element is preferably used for each laser before the beam combination.
  • the detection device can contain, for example, a fiber-coupled avalanche photodiode detector or an electronic detector. However, excitation and / or detection can also be used. Matrices consisting of a dot matrix of laser dots generated by diffractive optics or a quantum well laser and a detector matrix generated by an avalanche photodiode matrix or an electronic detector matrix, e.g. a CCD camera can be used.
  • the carrier can be provided in a prefabricated form, with luminescence-marked next-to-re-g a n e zi e s being filled into several separate containers of the carrier, and prior to this sweeping hybridization probes or primers.
  • the carrier containing the detection reagents is then advantageously dried.
  • a prefabricated carrier which contains a multiplicity of separate, for example 100 containers, in which different detection reagents, for example reagents for detecting nucleic acid hybridization such as primers and / or probes, are present.
  • This carrier can then be filled with a sample originating from an organism to be examined, for example a human patient, so that different analytes from a single sample are determined in the respective containers.
  • Such carriers can be used, for example, to create a gene expression profile, for example for the diagnosis of diseases, or for Determination of nucleic acid polymorphisms, for example for the detection of a certain genetic predisposition, can be used.
  • FIG. 1 shows the schematic representation of an embodiment of the method according to the invention.
  • Three light sources e.g. Lasers (1, 2,3) with wavelengths ⁇ 1, ⁇ l and ⁇ 3 are activated by means of suitable optical switching elements, e.g. acousto-optical modulators, connected to enable the individual laser beams to be coupled into the beam path over a predetermined time cycle.
  • the laser beam which alternates between the wavelengths ⁇ 1, ⁇ l and ⁇ 3 - in the specified time cycle - strikes a dichroic filter (6), which directs it via a focusing lens (8) to a confocal measuring volume in the sample (10).
  • Emission radiation emanating from luminescent molecules in the sample (10) is passed through the dichroic filter (6) and a blocking filter (1 2) and then via a pinhole (14) into a detector (1 6) with a signal processor, data storage and correlator.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the time-dependent signal flow l (t) at the detector.
  • the signal originating from the emission radiation ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 from luminescent molecules in the sample is recorded by the detector and provided with a coding signal for the respective time cycle of the wavelengths ⁇ 1, ⁇ l and ⁇ 3.
  • the corresponding auto and cross correlation functions can be calculated from the time profiles of ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3.
  • FIG. 3A shows the reflection (R) or transmission (T) of the dichroic filter (6) according to FIG. 1, which is dependent on the wavelength ⁇ .
  • the transmission is minimal at the excitation wavelengths ⁇ 1, ⁇ l and ⁇ 3.
  • FIG. 3B shows the wavelength-dependent transmission (T) of a blocking filter (1 2) according to FIG. 1.
  • the transmission is minimal in the range of the excitation wavelengths ⁇ 1, ⁇ l and ⁇ 3, but maximum in the range of the emission wavelengths ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3 (not shown).
  • FIG. 4 shows the schematic representation of a particularly preferred embodiment of the method according to the invention.
  • 3 lasers 21, 22, 23
  • the laser beam passes through a diffractive optical element (26) and is there divided into a plurality, e.g. 9 optical foci (shown in cross section), with a changing wavelength ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3.
  • the split light beam is directed onto a sample matrix (1 2) via a dichroic mirror (28) and a focusing lens (1 0), which may consist of several sub-elements.
  • This sample matrix consists e.g. corresponding to the matrix of the multiple optical foci from several separate samples, each containing a measurement volume.
  • Emission radiation originating from the measurement volumes of the sample matrix (32) is directed through the dichroic filter (28) and a blocking filter (34) onto a detector matrix (36).
  • the matrix of emission beams with a wavelength of ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 - depending on the timing and the molecules excited in the sample - is shown in cross section.
  • the signals originating from the individual measurement volumes are collected and evaluated in separate detectors in the detector matrix (36).
  • Figure 5 shows another particularly preferred embodiment.
  • a diffractive optical element 34, 35, 36
  • Each laser beam can thus be split into multiple optical foci before the beams are combined by means of optical switching elements (37a, 37b). Otherwise the determination according to FIG. 4 is carried out.
  • the embodiments according to FIGS. 4 and 5 are suitable for a single-channel multiplex multicolor correlation determination.
  • a fluorescence cross-correlation determination of 2 marker groups in a sample with 2 laser beams was carried out on the Confocor 2 (Zeiss) instrument.
  • the data were evaluated in such a way that a temporally alternating change in the wavelength of the excitation light was simulated.
  • the alternating frequency was 1 MHz, i.e. the fluorescence from a first marker group was set to 0 for a time segment of 1 ⁇ s and the fluorescence from the second marker group was set to 0 for the next time segment of 1 ⁇ s.
  • the frequency for a complete cycle was 0.5 MHz (corresponding to a period of 2 ⁇ s).

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina, wobei verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen in einer Probe zu jeweils verschiedenen Zeiten angeregt werden und die von den verschiedenen Spezies aus einem Messvolumen stammende Emissionsstrahlung durch einen einzigen Detektor aufgefangen wird. Weiterhin wird eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung offenbart.

Description

Einkanal-Mehrfarben-Korrelationsanalyse
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina, wobei verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen in einer Probe zu jeweils verschiedenen Zeiten angeregt werden und die von den verschiedenen Spezies aus einem Messvolumen stammende Emissionsstrahlung durch einen einzigen Detektor aufgefangen wird. Weiterhin wird eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung offenbart.
Die Verwendung der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum Nachweis von Analyten ist bekannt. EP-B-0 679 251 offenbart Verfahren u nd Vorrichtu ngen zur Detektion von Analyten mittels Fluoreszenzspektroskopie, wobei die Bestimmung in einem konfokalen Messvolumen durchgeführt wird, das Teil der zu untersuchenden Probe ist.
Die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie kann in Verbindung mit einer sogenannten Kreuzkorrelationsanalyse, durchgeführt werden, wobei zwei hinsichtlich mindestens einer optischen Eigenschaft verschiedenen Spezies von lumineszierenden Molekülen in einem konfokalen Messvolumen angeregt und das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit einer Korrelation zwischen beiden Messsignalen analysiert wird. Ein Nachteil bisher verwendeter Kreuzkorrelationsverfahren besteht jedoch darin, dass die von den verschiedenen lumineszierenden Spezies stammenden Emissionsstrahlungen durch jeweils* -separate Detektoren nachgewiesen werden musste. Eine der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung von lumineszierenden M o l e kü l e n , i n sbeso nd ere d u rc h M e h rf a rben- Fl u o resze nz- Korrelationsspektroskopie bereitzustellen, die auf einfache Weise eine Bestimmung von Kreuzkorrelationen erlauben.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Probe umfassend lumineszierende Moleküle,
(b) Bestrahlen der Probe mit einer optischen Anregungs- und
Fokussiereinrichtung zur optischen Anregung von lumieszierenden
Molekülen in mindestens einem konfokalen Messvolumen, das Teil der Probe ist, und (c) Auffangen und Auswerten von Emissionsstrahlung aus dem mindestens einen Messvolumen, wobei in einem Messvolumen mehrere hinsichtlich einer optischen Eigenschaft verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen zu jeweils verschiedenen Zeiten angeregt werden und die von den verschiedenen Spezies stammende Emissionsstrahlung durch einen einzigen Detektor aufgefangen und ausgewertet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine Einkanal-Mehrfarben- Korrelationsanalyse dar, wobei mehrere, z.B. 2, 3, 4 oder noch mehr, hinsichtlich mindestens einer optischen Eigenschaft, wie Emissionswellenlänge oder/und Lumineszenz-Abklingzeit, verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen in einem einzigen Messvolumen angeregt und die Signale auf einem einzigen Detektor ausgewertet werden können.
Hierzu werden vorzugsweise 2 oder mehr, z.B. 3, separate Lichtquellen, insbesondere Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen, z.B. λ 1 , Λ2, Λ3, zur jeweiligen separaten Anregung verschiedener Spezies verwendet. Diese separaten Lichtquellen können mittels eines oder mehrerer stellbarer optischer Schaltelemente zu jeweils verschiedenen Zeiten in das konfokale Messvolumen eingestrahlt bzw. eingekoppelt und zur Anregung der Emission darin verwendet werden. Beispiele für geeignete stellbare optische Schaltelemente sind akustooptische Modulatoren, stellbare Reflexionselemente, wie etwa piezogesteuerte Spiegel, stellbare Beugungselemente, stellbare diffraktionsoptische Elemente und Kerrzellen. Zum Nachweis der Signale wird pro Messvolumen nur ein einziger Detektor verwendet, der abwechselnd die von den verschiedenen angeregten Spezies emittierten Signale aufnimmt und durch geeignete Maßnahmen, z.B. eine digitales Kodierungssignal, definiert. An den Detektor angeschlossen sind vorzugsweise weiterhin ein Signalprozessor, eine Datenspeicherungseinheit und ein Korrelator.
Das vom Detektor aufgenommene Signal wird vorzugsweise mit einem der Taktfrequenz der verschiedenen Lichtquellen entsprechenden Kodierungssignal in einem Korrelator ausgewertet. Alternativ können auch energiedispersive Detektoren verwendet werden, die zwischen den einzelnen Emissionsstrahlungsarten, die von den jeweils verschieden angeregten Spezies stammen, unterscheiden können. Die Taktfrequenz, mit der die verschiedenen Lichtquellen auf das Messvolumen eingestrahlt werden, steht in Relation zu dem zu erwartenden Messsignal. So wird bei der Bestimmung von Diffusionsereignissen, wo die Diffusionszeit, z.B. im Bereich von etwa 1 ms liegt, eine Taktfrequenz mit einem erheblich geringeren Taktintervall, z.B. mit einem Taktintervall von 0, 1 -10 μs (entsprechend 10-0, 1 MHz), z.B. von etwa 1 μs (entsprechend 1 MHz), eingestellt. Bei anderen Arten von Bestimmungen erfolgt eine entsprechende Einstellung der Taktzeit.
Aus dem Zeitverlauf der einzelnen, von jeweils verschiedenen lumineszierenden Spezies stammenden Emissionssignalen, z.B. μ1 , μ2, μ3, können Autokorrelationsfunktionen (lediglich Berücksichtigung eines einzelnen Signals) sowie Kreuzkorrelationen (gemeinsame Berücksichtigung mehrerer Signale), z.B. μ1 x μ2, μ2 x μ3, μ1 x μ3 oder μ1 x μ2 x μ3, berechnet werden. Es handelt sich somit um ein Multiplexverfahren, das grundsätzlich auf eine größere Anzahl von Laserfrequenzen übertragbar ist.
Durch entsprechende elektronische Hintergrundanalyse kann eine Korrelations- oder/und Koinzidenzkurve berechnet werden, bei der "korrekt" auftretende Signale von solchen Signalen unterschieden werden können, die durch unerwünschte Interferenz (Crosstalk) mehrerer Markierungsgruppen entstehen.
Um die Genauigkeit des Verfahrens zu verbessern, insbesondere um ein Übersprechen der Emissionslinien μ1 , μ2, μ3 und vor allem der Exzitationslinien Λ1 , Λ2, Λ3 zu verringern, können dichroitische Filter oder/und Blockierungsfilter, z.B. Interferenzfilter verschiedener Ordnungen oder Notch-Filter zur Regelung der Strahlung, z.B. für eine selektive Durchlässigkeit bei bestimmten Wellenlängen, eingesetzt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst eine parallele Bestimmung von lumineszierenden Molekülen in mehreren Proben. Dabei kann das von der optischen Anregungseinrichtung ausgestrahlte Licht in multiple Lichtstrahlen bzw. Foci aufgespalten werden, die auf Messvolumina in mehreren Proben fokussiert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufspaltung des ausgestrahlten Lichts durch Verwendung eines oder mehrerer diffraktiver optischer Elemente, wie in DE 1 01 26 083.0 beschrieben. Besonders bevorzugt wird für jede Lichtquelle ein diffraktives optisches Element verwendet, das vor der Strahlenvereinigung in den Strahlengang angeordnet wird. Als diffraktive optische Elemente können beispielsweise dreidimensionale, gegebenenfalls auf einen optisch transparenten Träger aufgebrachte optische Gitter verwendet werden, welche hindurchtretendes Licht beugen und in der Objektebene durch konstruktive und destruktive Interferenz ein vorbestimmtes Beugungsmuster, d.h. eine gewünschte Anordnung multipler optischer Foci, in beliebigen Anordnungen erzeugt werden können. Die multiplen optischen Foci werden dabei günstigerweise durch Interferenzen 1 . Ordnung gebildet, wobei nur geringe Lichtverluste durch Interferenzen der 0. bzw. höherer Ordnungen auftreten.
Die Herstellung geeigneter diff raktiver optischer Elemente ist beispielsweise in der Dissertation von F. Nikolaef am Chalmers Institute of Technologies ( 1 999), in der Dissertation von M. Johansson am Chalmers Institute of Technologies (2001 ) sowie in der Publikation Johansson und Hard (Applied Optics 38 (1 999), 1302-1310) beschrieben. Als Materialien zur Herstellung der optischen Elemente sind Kunststoffe, Glas und Verbundstoffe bzw. andere Materialien mit optischer Transparenz für eine gegebene Wellenlänge geeignet, die durch photolithographische Ätzung bearbeitet werden können.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren betrifft den Nachweis von in den konfokalen Messvolumina lumineszierenden Molekülen durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Das Verfahren kann grundsätzlich nach der in EP-B-0 679 251 beschriebenen Methode durchgeführt werden. Dabei erfolgt vorzugsweise die Messung von einem oder wenigen Analytmolekülen in einem Messvolumen, wobei die Konzentration der zu bestimmenden Analytmoleküle vorzugsweise 10"6 mol/l beträgt und das Messvolumen vorzugsweise < 10"1 1 ist. Es werden stoffspezifische Parameter bestimmt, die durch Lumineszenzmessung an den Analytmolekülen ermittelt werden. Bei diesen Parametern kann es sich um Translationsdiffusions- Koeffizienten, Rotationsdiffusions-Koeffizienten oder/und um die Exzitationswellenlänge, die Emissionswellenlänge oder/und die Lebensdauer eines angeregten Zustandes eines lumineszierenden Moleküls oder die Kombination von einer oder mehrerer dieser Messgrößen handeln. Auf Einzelheiten zu apparativen Details wird auf die Offenbarung von EP 0 679 251 verwiesen.
Ein bevorzugtes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen in der Probenflüssigkeit und der Fokussieroptik der Lichtquelle > 1 mm, vorzugsweise 1 ,5 bis 10 mm und besonders bevorzugt 2 bis 5 mm beträgt. Weiterhin ist bevorzugt, dass zwischen dem die Probenflüssigkeit enthaltenden Träger und der optischen Fokussiereinrichtung ein Gasphasenbereich angeordnet ist, der Luft, Schutzgas oder Vakuum enthalten kann. Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von FCS mit großem Abstand zwischen Fokussieroptik und konfokalem Messvolumen sind in DE 101 1 1 420.6 beschrieben. Für gewisse Anwendungen kann jedoch selbstverständlich auch ein geringerer Abstand zwischen Fokussieroptik und Messvolumen von < 1 mm gewählt werden. Ebenso kann auch ein unmittelbarer Kontakt zwischen Probe und Fokussieroptik, z.B. durch Verwendung einer Immersionsflüssigkeit, bestehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich zur Durchführung beliebiger Bestimmungsverfahren geeignet. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, z.B. für diagnostische Anwendungen oder für ein Screening zur Identifizierung von Wirkstoffen, die mit einer Zielsubstanz wechselwirken. Hierzu werden eine oder mehrere Analyt-bindende Substanzen der Probe zugegeben, die eine durch Lumineszenzmessung nachweisbare Markierungsgruppe, insbesondere Fluoreszenz-Markierungsgruppe tragen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in diesem Fall vorzugsweise eine Bestimmung der Bindung der Markierungssubstanz an den nachzuweisenden Analyten. Dieser Nachweis kann beispielsweise durch Mehrfarben-Kreuzkorrelationsbestimmung erfolgen, wobei mindestens zwei unterschiedliche Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, eingesetzt werden, deren korreliertes Signal innerhalb des Messvolumens bestimmt wird. Diese Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei Schwüle et al. (Biophys. J. 72 ( 1 997), 1 878-1 886) und Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1 998), 97-1 09) beschrieben.
Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, z.B. Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen, in lebenden Organismen, insbesondere in Säugern wie dem Menschen vorkommenden, Analytmolekülen. Darüber hinaus können auch Analyten nachgewiesen werden, die in vitro aus biologischen Proben erzeugt worden sind, z.B. cDNA-Moleküle, die durch Reverse Transkription aus mRNA hergestellt worden sind, oder Proteine, die durch in vitro Translation aus mRNA bzw. aus DNA hergestellt worden sind. Weiterhin eignet sich das Verfahren zum Nachweis von Analyten, die als Elemente einer Bibliothek vorliegen und vorbestimmte Charakteristika, z.B. Bindung an das Nachweisreagenz, zeigen sollen. Beispiele solcher Bibliotheken sind Phagenbibliotheken oder ribosomale Bibliotheken.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bestimmung eine Nukleinsäurehybridisierung, wobei eine oder mehrere lumineszenzmarkierte Sonden an eine Zielnukleinsäure als Analyten binden. Derartige Hybridisierungsverfahren können beispielsweise zur Analyse der Genexpression, z.B. zur Ermittlung eines Genexpressionsprofils, zur Analyse von Mutationen, z.B. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch auch zur Bestimmung enzymatischer Reaktionen oder/und zur Bestimmung von Nukleinsäureamplifikationen, insbesondere in einem Thermocycling- Prozess. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäure- Polymorphismen sind in DE 100 56 226.4 und DE 100 65 631 .5 beschrieben. Dabei wird besonders bevorzugt eine Zwei- oder Mehrfarben- Kreuzkorrelationsbestimmung durchgeführt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bestimmung den Nachweis einer Protein-Protein- oder Protein-Ligand- Wechselwirkung, wobei als Proteinliganden z.B. niedermolekulare Wirkstoffe, Peptide, Nukleinsäuren etc. eingesetzt werden können. Auch für derartige Bestimmungen wird bevorzugt eine Zwei- oder Mehrfarbenkorrelationsmessung durchgeführt.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform können sogenannte "Molecular Beacon" Sonden oder Primer eingesetzt werden, die - wenn sie in freier Form vorliegen - ein hinsichtlich der Lumineszenzintensität oder/und -abklingzeit verschiedenes Messsignal als in gebundenem Zustand ergeben.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Selektion von Partikeln in einer Substanzbibliothek, wobei ein Partikel mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population, umfassend eine Vielzahl von unterschiedlichen Partikeln, selektioniert wird. Hierzu wird vorzugsweise eine Population von unterschiedlichen Partikeln bereitgestellt, Partikel, die eine vorbestimmte Eigenschaft aufweisen, markiert, die Partikel in einem Mikrokanal durch ein Detektionselement, umfassend multiple konfokale Volumenelemente, geleitet, um zwischen markierten und nichtmarkierten Partikeln zu unterscheiden und markierte Partikel abgetrennt. Die Schritte des Leitens und des Abtrennens werden vorzugsweise mindestens einmal wiederholt, wobei die Konzentration der Partikel in einem nachfolgenden Zyklus gegenüber einem vorhergehenden Zyklus vorzugsweise um mindestens den Faktor 104 verringert wird. Die Partikel können beispielsweise aus Zellen, Teilen von Zelloberflächen, Zellorganellen, Viren, Nukleinsäuren, Proteinen und niedermolekularen Substanzen ausgewählt werden. Das Verfahren eignet sich auch zur Selektion von Partikeln aus einer kombinatorischen Bibliothek, die genetische Packungen wie Phagen, Zellen, Sporen oder Ribosomen enthalten kann. Die Partikelpopulation enthält vorzugsweise mehr als 1 06 und besonders bevorzugt mehr als 1010 unterschiedliche Partikel. Die Partikel werden vorzugsweise mit einer Lumineszenzmarkierungsgruppe markiert.
Noch eine weitere Ausführungsform umfasst die Durchführung einer Sequenzanalyse von Polymeren, insbesondere Biopolymeren, wobei lumeszierende Fragmente eines in der Probe vorhandenen Analyten bestimmt werden. Diese Ausführungsform ist insbesondere zur Durchführung einer Nukleinsäure-Sequenzierung geeignet. Hierzu wird vorzugsweise ein Trägerpartikel mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindesten einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoieküls eine Fluoreszenzmarkierung tragen. Das Trägerpartikel wird in eine Sequenziervorrichtung umfassend einen Mikrokanal eingebracht, dort, z.B. mit einem IR-Einfanglaser festgehalten und, z.B. durch Behandlung mit einer Exonuklease, fortschreitend einzelne Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül abgespalten. Die abgespaltenen Nukleotidbausteine werden dann durch einen Mikrokanal, vorzugsweise mittels eines hydrodynamischen Flusses, geleitet und dort in konfokalen Volumenelementen die Basenfolge des Nukleinsäuremoieküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Aufspaltung der von den Lichtquellen stammenden Lichtstrahlen in mehrere optische Foci. Vorzugsweise wird der Lichtstrahl in 2-32, insbesondere in 4-16 optische Foci aufgespalten. Durch Verwendung einer geeigneten Fokussieroptik werden aus diesen optischen Foci konfokale Volumenelemente in der Probe abgebildet. Die konfokalen Volumenelemente haben günstigerweise eine Größe von 10"18 bis 1 0"9 I, vorzugsweise von 1 0"18 bis 10"12 1 und besonders bevorzugt von 10-16 bis 10"14 I.
Zum Auffangen von Strahlung, insbesondere Emissionsstrahlung aus den multiplen konfokalen Volumenelementen, wird vorzugsweise jeweils ein separater Detektor pro Volumeneinheit oder eine ortsauflösende Detektionsmatrix, z.B. eine Avalanche-Fotodiodenmatrix oder eine elektronische Detektormatrix, z.B. eine CCD-Kamera, verwendet.
Die Aufspaltung des Lichtstrahls in mehrere optische Foci erlaubt die parallele Bestimmung in separaten konfokalen Volumenelementen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese konfokalen Volumenelemente in jeweils separaten Behältnissen eines Träger, vorzugsweise einer MikroStruktur, vorgesehen.
Das Volumen dieser Behältnisse liegt vorzugsweise im Bereich von 10"6 I und besonders bevorzugt < 10"8 I bis 10~12 I. So kann der Träger eine Mikrowellstruktur mit mehreren Vertiefungen zur Aufnahme von Probeflüssigkeit umfassen, die beispielsweise einen Durchmesser zwischen 10 und 1000μm aufweisen. Geeignete MikroStrukturen sind z.B. in DE 100 23 421 .6 und DE 100 65 632.3 beschrieben. Diese MikroStrukturen können beispielsweise zur Bestimmung einer Nukleinsäure-Hybridisierung in Lösung eingesetzt werden. Weiterhin umfasst der Träger vorzugsweise mindestens ein Temperatur-Steuerungselement, z.B. ein Peltier-Element, welches eine Temperaturregelung des Träger oder/und einzelner Probenbehältnisse darin ermöglicht.
Der für das Verfahren verwendete Träger ist zweckmäßigerweise so ausgestaltet, dass er eine optische Detektion der Probe ermöglicht. Vorzugsweise wird daher ein zumindest im Bereich der Probenbehältnisse optisch transparenter Träger verwendet. Der Träger kann dabei entweder vollständig optisch transparent sein oder eine optisch transparente Basis und eine optisch undurchlässige Deckschicht mit Aussparungen in den Probenbehältnissen enthalten. Geeignete Materialien für Träger sind beispielsweise Verbundstoffträger aus Metall (z.B. Silicium für die Deckschicht) und Glas (für die Basis) . Derartige Träger können beispielsweise durch Aufbringen einer Metallschicht mit vorgegebenen Aussparungen für die Probenbehältnisse auf das Glas erzeugt werden. Alternativ können Plastikträger, z.B. aus Polystyrol oder Polymeren auf Acrylat- oder Methacrylatbasis eingesetzt werden. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Träger eine Abdeckung für die Probenbehältnisse aufweist, um während der Messung ein geschlossenes und von der Umgebung im Wesentlichen isoliertes System bereitzustellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Träger verwendet, der ein Linsenelement enthält, das im Strahlengang zwischen Messvolumen und Lichtquelle bzw. Detektor der optischen Vorrichtung angeordnet ist. Beispielsweise kann das Linsenelement am Boden einer Mikrowellstruktur angebracht sein. Ein derartiges Linsenelement lässt sich beispielsweise durch Erhitzen und Formen eines Fotoresists unter Verwendung einer Master-Form, z.B. aus Metall wie Silicium, erzeugen und dann auf den Träger aufgebracht werden. Alternativ können - z.B. bei Verwendung von Trägern aus Vollplastikstruktur - die Linsenelemente in den Träger integriert, z.B. während der Hersteilung durch Spritzgießen erzeugt werden. Durch Verwendung eines Linsenelements, vorzugsweise eines konvexen Linsenelements, kann die numerische Apertur der optischen Messanordnung vergrößert werden. Diese numerische Apertur liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 1 ,2.
Der Träger ist weiterhin vorzugsweise mit einem transparenten Antireflexionsüberzug beschichtet, um einen höheren Brechungsindex zu erzeugen. Als Antireflexionsüberzüge können beispielsweise transparente Oxide oder Nitride eingesetzt werden. Antireflexionsbeschichtungen werden vorzugsweise auch auf der Optik verwendet. Weiterhin können im Träger elektrische Felder, insbesondere im Bereich der Probenbehältnisse erzeugt werden, um eine Konzentrierung der zu bestimmenden Analyten im Messvolumen zu erreichen. Beispiele für Elektroden, die zur Erzeugung solcher elektrischen Felder geeignet sind, sind z.B. in DE 101 03 304.4 beschrieben.
Das zu bestimmende Molekül kann - insbesondere bei einer Bestimmung im Mikrowellformat oder bei der Einzelmolekülsequenzierung - an ein Trägerpartikel gebunden sein. Das Trägerpartikel hat eine Größe, die eine Bewegung in Mikrokanälen und das Festhalten an einer gewünschten Position innerhalb einer Sequenzierungsvorrichtung ermöglicht. Die Partikelgröße liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5-1 O μm und besonders bevorzugt von 1 -3 μm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe, wie Polystyrol, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle, wie Silicium, Metalloxide, wie Siliciumdioxid, oder Verbundmaterialien, die mehrere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststoffen oder Partikel mit einem Kunststoffkern und einer Siliciumdioxidhülle eingesetzt.
Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise über ihr 5'-Ende auf dem Trägerpartikel immobilisiert, z.B. .durch kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkung. Besonders bevorzugt erfolgt die Bindung von Polynukleotiden an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z.B. Biotin/Streptavidin oder Avidin etc. Alternativ können Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv oder kovalent an den Träger gebunden werden.
Vorzugsweise verwendet man Trägerpartikel, an die nur ein einziges Nukleinsäuremolekül gebunden ist. Derartige Trägerpartikel können dadurch erzeugt werden, dass die zur Bestimmung vorgesehenen
Nukleinsäuremoleküle in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 1 :5 bis 1 :20, z.B. 1 : 10, mit den Trägerpartikeln unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, bei denen eine Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger stattfindet.
Die an einen Träger gebundenen Nukleinsäuremoleküle, z.B. DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, können in einzelsträngiger Form oder doppelsträngiger Form vorliegen. Vorzugsweise liegen die Nukleinsäuremoleküle in einzelsträngiger Form vor. Beim Einsatz für die Sequenzierung tragen im Wesentliche alle, z.B. mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 % aller Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp, eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe. Es können auch im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens 2 Basentypen, beispielsweise 2, 3 oder 4 Basentypen, eine Fluoreszenzmarkierung tragen, wobei jeder Basentyp günstigerweise eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsgruppe enthält. Derart markierte Nukleinsäuren können durch enzymatische Primerextension an einer Nukleinsäurematrize unter Verwendung einer geeigneten Polymerase, z.B. einerthermostabilen DNA-Polymerase, erzeugt werden. Eine genaue Beschreibung dieses Verfahrens findet sich in DE 100 31 840.1 und DE 100 65 626.9 sowie den dort angegebenen Literaturzitaten.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens wie zuvor beschrieben, umfassend
(a) einen Träger zur Aufnahme einer Probe, die mehrere verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen enthält,
(b) eine optische Anregungs- und Fokussiereinrichtung, umfassend mehrere separate Lichtquellen, und ein stellbares optisches Schaltelement zur Einkopplung der separaten Lichtquellen zu verschiedenen Zeiten auf ein konfokales Messvolumen, das Teil der Probe ist, und (c) eine optische Detektionseinrichtung, umfassend jeweils einen einzigen Detektor pro Messvolumen zum Nachweis von Lumineszenz.
Der Träger ist vorzugsweise eine MikroStruktur mit mehreren, vorzugsweise mindestens 1 0, besonders bevorzugt mindestens 102 Behältnissen zur Aufnahme einer Probeflüssigkeit, wobei die Probeflüssigkeit in den separaten Behältnissen aus einer oder mehreren Quellen stammen kann. Das Einbringen der Probeflüssigkeit in die Behältnisse des Trägers kann z.B. mittels einer piezoelektrischen Flüssigkeitsabgabe-Vorrichtung erfolgen.
Die Behältnisse des Trägers sind so ausgestaltet, dass sie eine Bindung des Nachweisreagenz mit dem Analyten in Lösung ermöglichen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Behältnissen um Vertiefungen in der Trägeroberfläche, wobei diese Vertiefungen grundsätzlich eine beliebige Form aufweisen können, z.B. kreisförmig, quadratisch, rautenförmig etc. Der Träger kann auch 103 oder mehr separate Behältnisse umfassen.
Alternativ kann der Träger auch eine Mikrokanalstruktur mit einem oder mehreren Mikrokanälen enthalten, die insbesondere für ein Einzelmolekül- Sequenzierungsverfahren, wie in DE 100 31 840.1 und DE 100 65 626.9 beschrieben, oder für ein Partikel-Selektionsverfahren, wie in DE 100 31 028.1 beschrieben, geeignet sind.
Die optische Anregungs- und Fokussiereinrichtung umfasst mehrere stark fokussierte Lichtquellen, vorzugsweise Laserstrahlen, die mittels entsprechender optischer Einrichtungen auf das Messvolumen in der Probenflüssigkeit fokussiert werden. Die einzelnen Laserstrahlen werden mit stellbaren optischen Schaltelementen zu jeweils verschiedenen Zeiten in einem vorgegebenen Zeittakt auf das Messvolumen fokussiert. Weiterhin enthält die optische Einrichtung vorzugsweise dichroitische Filter oder/und Blockierungsfilter sowie - zur Aufspaltung der Laserstrahlen in multiple Foci - ein oder mehrere diffraktive optische Elemente. Die diffraktiven optischen Elemente können vor oder/und nach der Vereinigung der unterschiedlichen Laserstrahlen angeordnet werden. Vorzugsweise wird je ein diffraktives optisches Element für jeden Laser vor der Strahlenvereinigung verwendet.
Die Detektionseinrichtung kann beispielsweise einen fasergekoppelten Avalanche-Fotodiodendetektor oder einen elektronischen Detektor enthalten. Es können jedoch auch Anregungs- oder/und Detektions- . Matrices, bestehend aus einer Punktmatrix von Laserpunkten, erzeugt durch eine Diffraktionsoptik oder einen Quanten-Well-Laser sowie einer Detektormatrix, erzeugt durch eine Avalanche-Fotodiodenmatrix oder eine elektronische Detektormatrix, z.B. eine CCD-Kamera, verwendet werden.
Der Träger kann in vorgefertigter Form bereit gestellt werden, wobei in mehrere separate Behältnisse des Trägers lumineszenzmarkierte N a c h we i s re a g e n zi e n , vo rzu g swe i s e l u mi n e sze n zm arki e rte Hybridisierungssonden bzw. -primer eingefüllt werden. Anschließend wird der die Nachweisreagenzien enthaltende Träger günstigerweise getrocknet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein vorgefertigter Träger bereitgestellt, der eine Vielzahl von separaten, z.B. 100 Behältnissen enthält, in die jeweils unterschiedliche Nachweisreagenzien, z.B. Reagenzien zum Nachweis einer Nukleinsäurehybridisierung wie Primer oder/und Sonden eingefüllt vorliegen. Dieser Träger kann dann mit einer aus einem zu untersuchenden Organismus, z.B. einem menschlichen Patienten, stammenden Probe gefüllt werden, so dass in den jeweiligen Behältnissen unterschiedliche Analyten aus einer einzigen Probe bestimmt werden. Derartige Träger können beispielsweise zur Erstellung eines Genexpressionsprofils, z.B. für die Diagnostik von Krankheiten, oder zur Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen, z.B. zum Nachweis einer bestimmten genetischen Prädisposition, verwendet werden.
Weiterhin soll die Erfindung durch die beiliegenden Figuren erläutert werden.
Figur 1 zeigt die schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Drei Lichtquellen, z.B. Laser (1 ,2,3) mit Wellenlängen Λ 1 , λl und Λ3, werden mittels geeigneter optischer Schaltelemente, z.B. akustooptischen Modulatoren, verbunden, um ein Einkoppeln der einzelnen Laserstrahlen über einen vorgegebenen Zeittakt in den Strahlengang zu ermöglichen. Der Laserstrahl, der - im vorgegebenen Zeittakt - zwischen den Wellenlängen Λ 1 , λl und Λ3 alterniert, trifft auf einen dichroitischen Filter (6), der ihn über ein Fokussierobjektiv (8) auf ein konfokales Messvolumen in der Probe (10) lenkt. Von lumineszierenden Molekülen in der Probe ( 10) ausgehende Emissionsstrahlung wird durch den dichroitischen Filter (6) und einen Blockierungsfilter ( 1 2) und anschließend über eine Lochblende ( 14) in einen Detektor ( 1 6) mit Signalprozessor, Datenspeicherung und Korrelator geleitet.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung des zeitabhängigen Signalflusses l(t) am Detektor. Das aus der Emissionsstrahlung μ1 , μ2, μ3 von in der Probe befindlichen lumineszierenden Molekülen stammende Signal wird vom Detektor aufgezeichnet und mit einem Kodierungssignal für den jeweiligen Zeittakt der Wellenlängen Λ 1 , λl und Λ3 versehen. Aus den Zeitverläufen von μ1 , μ2 und μ3 können die entsprechenden Auto- und Kreuzkorrelationsfunktionen berechnet werden.
Figur 3A zeigt die von der Wellenlänge λ abhängige Reflexion (R) bzw. Transmission (T) des dichroitischen Filters (6) gemäß Figur 1 . Die Transmission ist bei den Anregungswellenlängen Λ 1 , λl und Λ3 minimal. Figur 3B zeigt die wellenlängenabhängige Transmission (T) eines Blockierungsfilters (1 2) gemäß Figur 1 . Die Transmission ist im Bereich der Anregungswellenlängen Λ1 , λl und Λ3 minimal, im Bereich der Emissionswellenlängen μ1 , μ2 und μ3 (nicht gezeigt) jedoch maximal.
Figur 4 zeigt die schematische Darstellung einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. 3 Laser (21 , 22, 23) werden mittels optischer Schaltelemente (24a, 24b) in einem vorgegebenen Zeittakt in den Strahlengang eingekoppelt. Der Laserstrahl tritt durch ein diffraktives optisches Element (26) hindurch und wird dort in eine Vielzahl, z.B. 9 optischer Foci (im Querschnitt gezeigt), mit einer im Zeittakt wechselnden Wellenlänge Λ 1 , Λ2 und λ3 aufgespalten. Der aufgespaltene Lichtstrahl wird über einen dichroitischen Spiegel (28) und ein, gegebenenfalls aus mehreren Subelementen, bestehendes Fokussierobjektiv ( 1 0) auf eine Probenmatrix ( 1 2) geleitet. Diese Probenmatrix besteht z.B. entsprechend der Matrix der multiplen optischen Foci aus mehreren separaten Proben, die jeweils ein Messvolumen enthalten. Von den Messvolumina der Probenmatrix (32) stammende Emissionsstrahlung wird durch den dichroitischen Filter (28) und einen Blockierungsfilter (34) auf eine Detektormatrix (36) gelenkt. Die Matrix von Emissionsstrahlen mit einer Wellenlänge μ1 , μ2, μ3 - abhängig vom Zeittakt und den in der Probe angeregten Molekülen - ist im Querschnitt gezeigt. In der Detektormatrix (36) werden die aus den einzelnen Messvolumina stammenden Signale in separaten Detektoren aufgefangen und ausgewertet.
Figur 5 zeigt eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform. Dabei ist in Abweichung zu der in Figur 4 gezeigten Anordnung direkt nach jedem Laser (31 , 32, 33) jeweils ein diffraktives optisches Element (34, 35, 36) angeordnet. Somit kann jeder Laserstrahl in multiple optische Foci aufgespalten werden, bevor die Strahlenvereinigung mittels optischer Schaltelemente (37a, 37b) erfolgt. Ansonsten wird die Bestimmung gemäß Figur 4 durchgeführt. Die Ausführungsformen gemäß den Figuren 4 und 5 eignen sich für eine Einkanal-Multiplex-Mehrfarbenkorrelationsbestimmung.
Beispiel
Es wurde eine Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsbestimmung von 2 Markierungsgruppen in einer Probe mit 2 Laserstrahlen an dem Gerät Confocor 2 (Zeiß) durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgte derart, dass eine zeitlich alternierende Änderung der Wellenlänge des Anregungslichts simuliert wurde. Die Wechselfrequenz war 1 MHz, d.h. die von einer ersten Markierungsgruppe stammende Fluoreszenz wurde auf 0 für ein Zeitsegment von 1 μs gesetzt und die von der zweiten Markierungsgruppe stammende Fluoreszenz wurde auf 0 für das nächste Zeitsegment von 1 μs gesetzt. Folglich war die Frequenz für einen kompletten Zyklus 0,5 MHz (entsprechend einer Zeitdauer von 2 μs) .
Für eine Zeitdauer von 1 s wurden 200 Mio. Datenpunkte aufgezeichnet. Pro Zeitsegment von 1 μs wurden daher 20 Datenpunkte aufgezeichnet. Um eine Verzögerung zu simulieren, die durch einen Wellenlängenwechsel entstehen könnte, wurden zusätzlich 2 bzw. 10 Datenpunkte pro Zeitsegment auf 0 gesetzt (entsprechend einer Verzögerung von 100 ns bzw. 500 ns). Die Berechnung der Kreuzkorrelation erfolgte auf Basis der Rohdaten des Geräts.
Es wurde gefunden, dass trotz schneller wiederholter Änderung der We l l e n l ä n g e d es An reg u ng sl ichts ei n e Auswertun g d er Kreuzkorrelationsfunktion möglich ist. Insbesondere bei einer Verzögerungsdauer von > 200 μs (entsprechend Kreuzkorrelationskanälen von 76 und höher) waren keine signifikanten Unterschiede zu einer Standardauswertung zu erkennen.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina, umfassend die
Schritte:
(a) Bereitstellen einer Probe, umfassend lumineszierende Moleküle,
(b) Bestrahlen der Probe mit einer optischen Anregungs- und Fokussiereinrichtung zur optischen Anregung von lumineszierenden Molekülen in mindestens einem konfokalen Messvolumen, das Teil der Probe ist, und
(c) Auffangen und Auswerten von Emissionsstrahlung aus dem mindestens einem Messvolumen, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Messvolumen mehrere hinsichtlich mindestens einer optischen Eigenschaft verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen zu jeweils verschiedenen Zeiten angeregt werden und die von den verschiedenen Spezies stammende Emissionsstrahlung durch einen einzigen Detektor aufgefangen und ausgewertet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass 2, 3 oder 4 hinsichtlich der optischen Eigenschaften verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen angeregt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Anregungseinrichtung mehrere separate
Lichtquellen, insbesondere Laser, zur jeweiligen Anregung verschiedener Spezies in einem Messvolumen umfasst.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die separaten Lichtquellen durch ein stellbares optisches Schaltelement zu jeweils verschiedenen Zeiten in den Strahlengang eingekoppelt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das stellbare optische Schaltelement aus akustooptischen Modulatoren, Reflexionselementen, Beugungselementen, diffraktiven optischen Elementen und Kerrzellen ausgewählt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kreuzkorrelation von mindestens 2 der angeregten lumineszierenden Spezies bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die angeregten lumineszierenden Spezies sich in mindestens einer optischen Eigenschaft, ausgewählt aus Emissionswellenlänge und Lumineszenz-Abklingzeit, unterscheiden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die separate Auswertung der von verschiedenen Spezies stammenden Emissionsstrahlungen die Einstellung eines Taktsignals auf dem Detektor umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Frequenz des Taktsignals im Bereich von 10-0, 1 MHz einstellt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die separate Auswertung der von verschiedenen Spezies stammenden Emissionsstrahlungen die Verwendung eines energiedispersiven Detektors umfasst.
1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das auf das Messvolumen eingestrahlte Anregungslicht oder/und das vom Messvolumen abgestrahlte Emissionslicht optisch gefiltert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man dichroitische Filter oder/und Blockierungsfilter zur optischen Filterung verwendet.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine elektronische Hintergrundanalyse durchführt, um
Signale herauszufiltem, die durch unerwünschte Interferenz mehrerer Spezies von lumineszierenden Molekülen entstehen.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger mehrere separate Behältnisse zur Aufnahme von Proben enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Mikrowellstruktur mit mehreren Vertiefungen umfasst, die vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 10 und 1 000 μm aufweisen.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine parallele Bestimmung von lumineszierenden Molekülen in mehreren Messvolumina, insbesondere aus mehreren
Proben durchführt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das von der optischen Anregungseinrichtung ausgestrahlte
Licht in multiple Foci aufgespalten wird, die auf jeweils verschiedene Messvolumina fokussiert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufspaltung des ausgestrahlten Lichts durch Verwendung eines oder mehrerer diffraktiver optischer Elemente erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass für jede Lichtquelle ein separates diffraktives optisches Element verwendet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als diffraktives optisches Element ein dreidimensionales, gegebenenfalls auf einen optisch transparenten Träger aufgebrachte optische Gitter verwendet, das hindurchtretendes Licht beugt und ein vorbestimmtes Beugungsmuster, umfassend multiple optische Foci, erzeugt.
21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zum parallelen Auffangen von Emissionsstrahlung aus mehreren Messvolumina eine Detektionsmatrix, umfassend mehrere Detektoren, verwendet wird, wobei ein Detektor jeweils für ein Messvolumen vorgesehen ist.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen und der Fokussieroptik > 1 mm beträgt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen der Fokussieroptik 1 ,5-10 mm und besonders bevorzugt 2-5 mm beträgt.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe von der Lichtquelle und insbesondere von der Fokussieroptik thermisch isoliert ist.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung eines in der Probe vorhandenen Analyten.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Nukleinsäure-Analyten bestimmt.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung umfasst:
(a) eine Mutationsanalyse bei Nukleinsäuren,
(b) eine Genexpressionsanalyse, (c) eine Nukleinsäure-Sequenzierung oder
(d) eine Partikel-Selektion.
28. Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 27, umfassend
(a) einen Träger zur Aufnahme einer Probe, die mehrere verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen enthält,
(b) eine optische Anregungs- und Fokussiereinrichtung, umfassend mehrere separate Lichtquellen, ein stellbares optisches Schaltelement zur Einkopplung der separaten Lichtquellen zu verschiedenen Zeiten auf ein konfokales Messvolumen, das Teil der Probe ist, und
(c) eine optische Detektionseinrichtung, umfassend jeweils einen einzigen Detektor pro Messvolumen zum Nachweis von
Lumineszenz.
29. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin ein oder mehrere diffraktionsoptische Elemente zur Aufspaltung des Anregungslichts in multiple Foci enthält.
30. Vorrichtung nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass für jede Lichtquelle ein separates diffraktives optisches Element vorgesehen ist.
31 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin eine Detektormatrix, umfassend mehrere Detektoren, zum parallelen Auffangen von Emissionsstrahlung aus mehreren Messvolumina enthält, wobei ein Detektor für jeweils ein
Messvolumen vorgesehen ist.
32. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 31 für die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie.
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