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STAND DER TECHNIK
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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Vorrichtungen,
die zum Feststellen des Vorhandenseins eines Analysen in einer Probe
verwendet werden können.
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STAND DER TECHNIK
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Die
oberflächenverstärkte Raman-Streuung
(SERS) ist ein empfindliches spektroskopisches Verfahren zum Nachweis
eines Analyten. Die Raman-Spektroskopie untersucht schwingungserregbare
Niveaus eines Analyten. Sobald ein Schwingungsniveau durch ein Photon
erregt wird, ändert
sich die Energie des Photons um einen Betrag, der gleich dem des
Niveaus ist (Raman-Streuung). Ein Raman-Spektrum besteht, ähnlich wie
ein Infrarotspektrum, aus einer Wellenlängenverteilung von Bändern, die
den molekularen Schwingungen entsprechen, welche spezifisch für die Probe
sind, die gerade untersucht wird (Analyt). In der Praxis der Raman-Spektroskopie
wird der Strahl von einer Strahlungsquelle auf die Probe fokussiert,
um so unelastisch gestreute Strahlung zu erzeugen, die optisch gesammelt
und in ein wellenlängendispersives
Spektrometer gelenkt wird, in dem ein Detektor die Energie der auftreffenden
Photonen in eine elektrische Signalstärke umwandelt. Bei SERS werden
die Analytenmoleküle
auf Edelmetall-Nanoteilchen adsorbiert. Diese Nanoteilchen verursachen
nach der Erregung durch Licht Plasmonenmoden, die wiederum Nahfelder
um jedes Teilchen herum erzeugen. Diese Felder können in den Nahfeldbereichen
an Analytmoleküle
koppeln. Im Ergebnis dessen tritt eine Konzentration von einfallendem
Licht in enger Nachbarschaft zu den Nanoteilchen auf, was die Raman-Streuung
von den Analytmolekülen
verstärkt.
Dieses Verfahren kann den Nachweis von biologischen Systemen immerhin
um den Faktor 1014 verstärken.
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Das
Multiplexing ist wegen seiner großen Potentiale bei wachsender
Ineffektivität
der chemischen und biochemischen Analysen ein anspruchsvoller Ansatz
für Tests
mit hohem Durchsatz in verschiedenen Bereichen, wie zum Beispiel
in biologischer Forschung, klinischer Diagnose und Medikamenten-Screening.
In einem Multiplexassay werden mehrere Sonden verwendet, die Spezifitäten gegenüber den
entsprechenden Analyten in einer Probenmischung aufweisen. Eine
der kritischen Herausforderungen bei der Aufstellung einer Multiplexplattform
ist die Entwicklung eines Sondenidentifizierungssystems, das für jede einzelne
Sonde in einem großen
Sondensatz unterscheidbare Komponenten besitzt.
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Bei
früheren
Verfahren wurde SERS in Kombination mit der Multiplexanalyse verwendet.
Solche Verfahren nutzen targetbeschichtete Goldteilchen und DNA-Sonden,
die sowohl mit einem Raman-Farbstoff als auch einer Thiolgruppe
modifiziert sind (Cao et al., Science 297:1536).
Solche Reagenzien sind jedoch im allgemeinen mit hohen Kosten herzustellen
und arbeitsintensiv bei der Verwendung. Außerdem sorgt die Kopplung des
Raman-Farbstoffs
und der Thiolgruppe an den Analyten nicht für Flexibilität bei der
Anwendung und/oder beim Entfernen des Farbstoffs oder SERS-Substrats.
Es besteht daher ein Bedarf an Zusammensetzungen und Verfahren,
die für
niedrigere Kosten und erhöhte
Flexibilität
bei der Markierung von Analyten und Einfangreagenzien während der
Multiplexanalyse sorgen.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1A ist
ein schematisches Flußdiagramm,
das ein verbessertes Verfahren zum Nachweis eines Analyten illustriert.
Einfangreagenzien, die an einen festen Träger (z.B. Antikörper) gebunden
sind, enthalten eine Raman-Markierung. Die Bindung eines Zielanalyten
wird anschließend
durch Raman-Nachweis festgestellt.
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1B ist
ein schematisches Flußdiagramm,
das vorherige Verfahren zum Nachweis eines Analyten illustriert,
dem austauschbare Bindungselemente und Raman-markierte Einfangreagenzien
fehlen.
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2 ist
ein schematisches Diagramm, das ein verbessertes Verfahren zum Nachweis
eines Analyten illustriert. Das als Beispiel dienende Diagramm illustriert
Proteintargets, die sich an Antikörper binden, welche auf einer
festen Oberfläche
immobilisiert und mit Raman-Markierungen
markiert sind.
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3A ist
ein schematisches Flußdiagramm,
das ein verbessertes Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäuresequenz
(z.B. SNP) illustriert. Einfang-Nukleinsäuren, die an einen festen Träger gebunden
sind, schließen
das Hybridisieren einer Target-Nukleinsäure ein, die mit einem ersten
Bindungselement verknüpft ist.
Die Hybridisierung der Target-Nukleinsäure wird anschließend durch
Raman-Nachweis festgestellt.
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3B ist
ein schematisches Flußdiagramm,
das vorherige Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäuresequenz
ohne austauschbare Bindungselemente illustriert.
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4 ist
ein schematisches Diagramm, das ein verbessertes Verfahren zum Nachweis
einer Nukleinsäuresequenz
illustriert. Das als Beispiel dienende Diagramm illustriert Target-Nukleinsäuren, die
mit immobilisierten Einfang-Nukleinsäuremolekülen hybridisieren.
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Die
folgende detaillierte Beschreibung enthält zahlreiche spezifische Details,
um für
ein gründlicheres Verständnis der
offenbarten Ausführungsformen
der Erfindung zu sorgen. Für
Fachleute auf dem Gebiet ist jedoch erkennbar, daß die Ausführungsformen
ohne diese speziellen Details ausgeführt werden können. In
anderen Fällen
sind Geräte,
Verfahren, Prozeduren und individuelle Komponenten, die im Fachgebiet
bekannt sind, nicht im Detail hierin beschrieben worden.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung betreffen Signalverstärkungsverfahren für biologische
Multiplexassays. Biologische Target-Komplexe werden im allgemeinen
durch eine Seed-Substanz markiert (tagged), die die Bildung eines
oberflächenverstärkten Raman-Streuungssubstrats
(SERS-Substrats) katalysieren kann. Die Target-Komplexe können sich
dann an Einfangreagenzien binden, die eine Raman-Markierung umfassen.
Das SERS-Substrat wird dann auf der Seed-Substanz durch Reduktion
von Metall-Kationen
erzeugt. Die Targetsignale werden durch SERS-Messung der Raman-Markierungen
festgestellt. Genauer gesagt, stellen die Ausführungsformen der Erfindung
Target-Analyte bereit, die mit spezifischen Bindungselementen, die
Seed-Teilchen umfassen, funktionalisiert sind. Ausführungsformen
der Erfindung betreffen ferner Target-Komplexe, die zwischen derartigen
Target-Analyten und einem Einfangreagenz gebildet sind, welches an
ein festes Substrat gebunden ist. Das Einfangreagenz umfaßt optional
eine Raman-Markierung. Andere Ausführungsformen der Erfindung
betreffen Verfahren des Nachweises der Bindung eines Target-Analyten
an ein Einfangreagenz, das mit der obenflächenverstärkten Raman- Streuungsspektroskopie (SERS-Spektroskopie)
verbunden wird, um einen gemultiplexten Nachweis von Analyten auszuführen. Dies
wird als Beispiel für Polypeptid-Targets
in den 1A, 1B und 2 und
für Nukleinsäure-Targets
in den 3A, 3B und 4 dargestellt.
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Dementsprechend
wird in einer Ausführungsform
ein biologischer Target-Komplex,
der einen Target-Analyten umfaßt,
welcher mit einem ersten spezifischen Bindungselement verknüpft ist,
bereitgestellt. Der Target-Komplex umfaßt ferner ein zweites spezifisches
Bindungselement, das sich an das erste spezifische Bindungselement
bindet, dabei einen Zielkomplex bildend. Das zweite spezifische
Bindungselement umfaßt ein
Seed-Teilchen, das sich zum Katalysieren der Bildung eines oberflächenverstärkten Raman-Streuungssubstrats
(SERS-Substrats) eignet. Anschließend kann das SERS-Substrat
aktiviert werden, damit es für
einen SERS-Effekt sorgt. Der Komplex umfaßt ferner ein Einfangreagenz,
das an einen festen Träger
gebunden ist. Das Einfangreagenz kann eine Raman-Markierung umfassen.
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"Target-Analyt", wie hierin verwendet,
ist die Substanz, die in der Testprobe unter Verwendung der vorliegenden
Erfindung nachgewiesen werden soll. Der Analyt kann jede Substanz
sein, für
die ein natürlich
vorkommendes Einfangreagenz existiert (z.B. ein Antikörper, Polypeptid,
DNA, RNA, Zelle, Virus usw.) oder für die ein Einfangreagenz hergestellt
werden kann, und der Target-Analyt kann sich in einem Assay an ein
oder mehrere Einfangreagenzien binden. "Target-Analyt" umfaßt auch alle antigenen Substanzen,
Haptene, Antikörper
und Kombinationen derselben. Der Target-Analyt kann ein Protein,
ein Peptid, eine Aminosäure,
ein Kohlenhydrat, ein Hormon, ein Asteroid, ein Vitamin, ein Medikament,
einschließlich
der für
therapeutische Zwecke sowie der für unerlaubte Zwecke verabreichten
Medikamente, ein Bakterium, ein Virus und Stoffwechselprodukte der
obigen Substanzen oder Antikörper
gegen dieselben sein.
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"Target-Analytenanologon", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf eine Substanz, die mit einem Analyteneinfangreagenz
kreuzreagiert, obwohl sie dies in einem größeren oder geringeren Umfang
als der Target-Analyt selbst tun kann. Das Target-Analytenanologon
kann einen modifizierten Target-Analyten sowie einen fragmentierten
oder synthetischen Anteil des Target-Analytenmoleküls umfassen,
solange das Target-Analytenanologon mindestens einen epitopischen
Ort mit dem interessierenden Target-Analyten gemeinsam hat.
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"Spezifisches Bindungselement", wie hierin verwendet,
ist ein Element eines spezifischen Bindungspaares, d.h. von zwei
unterschiedlichen Molekülen,
wo eines der Moleküle
(z.B. ein erstes spezifisches Bindungselement) sich durch chemische
oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül (z.B.
ein zweites spezifisches Bindungselement) bindet. Zusätzlich zu
antigen- und antikörper-spezifischen
Bindungspaaren umfassen andere spezifische Bindungspaare Biotin
und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nucleotidsequenzen
(einschließlich
Sonden- und eingefangene Nukleinsäuresequenzen, die in DNA-Hybridisierungsassays
zur Feststellung einer Target-Nukleinsäuresequenz
verwendet werden), komplementäre
Peptidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Enzym-Cofaktoren und Enzyme,
Enzyminhibitoren a und Enzyme, Zellen, Viren und dergleichen. Ferner
können
spezifische Bindungspaare Elemente umfassen, die Analoga des ursprünglichen
spezifischen Bindungselementes sind. Zum Beispiel kann ein Derivat
oder Fragment des Analyts, d.h. ein Analytenanalogon, verwendet
werden, solange es mindestens ein Epitop mit dem Analyten gemeinsam
hat. Immunreaktive spezifische Bindungselemente umfassen Antigene,
Haptene, Antikörper und
Komplexe derselben, einschließlich
derjenigen, die durch rekombinante DNA-Verfahren oder Peptidsynthese
gebildet werden.
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"Spezifisches Hilfsbindungselement", wie hierin verwendet,
ist ein spezifisches Bindungselement, das zusätzlich zu den spezifischen
Bindungselementen des Target-Analyten und des Einfangreagenzes verwendet wird
und zu einem Teil des endgültigen
Komplexes wird. Es können
ein oder mehrere spezifische Hilfsbindungselemente bei einem Assay
verwendet werden. "Bindung", wie hierin verwendet,
ist jeder Prozeß,
der zur Bildung von gekoppelten Komponenten führt. Der Prozeß des "Bindens" betrifft das direkte
oder indirekte Befestigen von einer Komponente an einer anderen
durch die Bildung von mindestens einer molekularen Bindung, wozu
kovalente, Ionen-, koordinative, Wasserstoff- oder van der Waals-Bindungen
oder nicht-chemische Wechselwirkungen, zum Beispiel hydrophobe Wechselwirkungen,
gehören
können.
Es versteht sich, daß zwei Komponenten
auf zahlreiche Weise mit aneinander gekoppelt werden können. Diese
Kopplung kann spezifische nicht-kovalente Affinitätswechselwirkungen
umfassen, ohne darauf beschränkt
zu sein, zum Beispiel Streptavidin: oder Avidin:Biotin-Wechselwirkungen
und Hapten:Antikörper-Wechselwirkungen;
hydrophobe Wechselwirkungen, magnetische Wechselwirkungen, polare
Wechselwirkungen, wie zum Beispiel "benetzende" Verknüpfungen zwischen zwei polaren
Oberflächen
oder zwischen Oligonucleotid und Polyethylenglycol; Bildung einer
kovalenten Bindung, zum Beispiel einer Amidbindung, einer Disulfidbindung,
einer Thioetherbindung, einer Etherbindung, einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung;
oder über
andere Vernetzungsmittel; oder über
einen säurelabilen
Linker. Als Beispiel dienende gekoppelte Komponenten umfassen (ohne
darauf beschränkt
zu sein) Antikörper-Epitop-Komplexe,
Rezeptor-Liganden-Komplexe oder komplementäre Nukleinsäurekomplexe. Als Beispiel dienende
Target-Analyt-Einfangreagenz-Komplexe
umfassen eine Target-Nukleinsäuresequenz
(d.h. einen Target-Analyten),
die mit einer komplementären
Nukleinsäuresequenz
(d.h. einem Einfangreagenz) hybridisiert. Andere als Beispiel dienende
Target-Analyten-Einfangreagenz-Komplexe umfassen ein Target-Polypeptid
(d.h. einen Target-Analyten), der sich an einen Rezeptor oder Antikörper (d.h.
ein Einfangreagenz) bindet und so ein Ligandenbindungspaar bildet.
Das Ausmaß der
Bindung wird durch die Anwesenheit und die vorhandene Menge des
Target-Analyten beeinflußt. "Verknüpft", wie hierin verwendet,
ist der Zustand von zwei oder mehr Molekülen und/oder Teilchen, die
in enger Nähe
zueinander gehalten werden.
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"Einfangreagenzien", wie hierin verwendet,
ist ein Molekül
oder eine Verbindung, die in der Lage ist, den Target-Analyten oder
das Targetreagenz zu binden, welches direkt oder indirekt an einem
im wesentlichen festen Material befestigt ist. Das Einfangreagenz
kann jede Substanz sein, für
die ein natürlich
vorkommender Target-Analyt existiert (z.B. ein Antikörper, Polypeptid,
DNA, RNA, Zelle, Virus usw.) oder für die ein Target-Analyt hergestellt
werden kann, und das Einfangreagenz kann sich in einem Assay an
einen oder mehrere Target-Analyten binden.
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"Seed-Teilchen", wie hierin verwendet,
sind jede Substanz, die die Bildung eines Nanoteilchens aus einer
Metall-Kolloid-Lösung
ausfällen
kann und das Phänomen
einer oberflächenverstärkten Raman-Lichtstreuung
(SERS) oder oberflächenverstärkten Resonanz-Raman-Lichtstreuung (SERRS)
stützen
kann. Beispiele für
Seed-Teilchen umfassen (ohne darauf beschränkt zu sein): Kolloide von
Gold oder Silber, Pt, Cu, Ag/Au, Pt/Au, Cu/Au, Nanoshell- oder Legierungsteilchen;
Teilchen oder Flocken von Gold, Silber, Kupfer oder anderen Substanzen,
die Leitungsbandelektronen aufweisen. Da die Teilchenoberfläche am SERS-
oder SERRS-Effekt beteiligt ist, werden Flocken oder Teilchen von
Substanzen, die keine Leitungsbandelektronen aufweisen, aber mit
einer Substanz beschichtet sind, die Leitungsbandelektronen aufweist,
ebenfalls zu geeigneten Makroteilchen.
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"Raman-Markierung", wie hierin verwendet,
ist jede Substanz, die ein nachweisbares Raman-Spektrum erzeugt,
welches sich von den Raman-Spektren anderer vorhandener Komponenten
unterscheiden läßt, wenn
sie mit einer Strahlung der richtigen Wellenlänge beleuchtet wird. Andere
Begriffe für
eine Raman-Markierung umfassen "Raman-aktive Markierung", "Raman-Farbstoff und "Raman-Reportermolekül". Eine Raman-Markierung umfaßt ein organisches
oder anorganisches Molekül,
Atom, Komplex oder Struktur, einschließlich (ohne darauf beschränkt zu sein)
synthetischer Moleküle,
Farbstoffe, natürlich
vorkommender Pigmente, wie zum Beispiel Phycoerythrin, organischer
Nanostrukturen, wie zum Beispiel C60, Buckyballs oder Kohlenstoff-Nanoröhrchen,
Metall-Nanostrukturen, wie zum Beispiel Nanoprismen und Halbleiter
im Nanomaßstab,
wie zum Beispiel Quantenpunkte. Zahlreiche Beispiele für Raman-Markierungen
werden unten offenbart. Als Beispiel dienende Raman-Markierungen
werden in der Tabelle 1 unten bereitgestellt. Der Fachmann wird
erkennen, daß solche
Beispiele keine Einschränkung
darstellen und daß "Raman-Markierung" jedes organische
oder anorganische Atom, Molekül,
Verbindung oder Struktur einschließt, die im Fachgebiet bekannt
ist und durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen werden kann. Eine
spezielle Art von "Raman-Markierung" umfaßt "Raman-Farbstoffe". Beispiele für Raman-Farbstoffe umfassen
chemische Markierungen, wie zum Beispiel Kresylechtviolett (CFV,
Fluka), Brillantkresylblau (BCB, Allied Chemical and Dye) und Paraaminobenzoesäure (PABA,
Aldrich). Weitere Farbstoffe umfassen Cy3, Cy3.5, Cy5, TAMRA (TMR),
TexasRot (TR) und Rhodamin 6G (RD).
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Raman-Markierungen
bieten den Vorteil, daß sie
scharfe Peaksignale erzeugen, die ermöglichen, daß eine größere Zahl von unterscheidbaren
Markierungen an Sonden angeheftet werden kann. Zusätzliche nicht-einschränkende Beispiele
für verwendbare
Raman-aktive Markierungen
umfassen TRIT (Tetramethylrhodaminisothiol), NBD (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), TexasRot-Farbstoff,
Phthalsäure,
Terephthalsäure, Isophthalsäure, Kresylechtviolett,
Kresylblauviolett, Brillantkresylblau, Paraaminobenzoesäure, Erythrosin,
Biotin, Digoxigenin, 5-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein,
TET (6-Carboxy-2',4,7,7'-tetrachlorfluorescein),
HEX (6-Carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachlorfluorescein),
Joe (6-carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein), 5-Carboxy-2',4',5',7'-tetrachlorfluorescein,
5-Carboxyfluorescein, 5-Carboxyrhodamin,
Tamra (Tetramethylrhodamin), 6-Carboxyrhodamin, Rox (Carboxy-X-rhodamin), R6G (Rhodamin
6G), Phthalocyanine, Azomethine, Cyanine (z.B. Cy3, Cy3.5, Cy5),
Xanthine, Succinylfluoresceine, N,N-Diethyl-4-(5'-azobenzotriazolyl)-phenylamin und Aminoacridin.
Diese und andere Raman-aktive Markierungen sind kommerziell erhältlich (z.B.
Molecular Probes, Eugene, OR).
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Es
wird in Betracht gezogen, daß die
Raman-aktive Markierung eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen
kann, zum Beispiel Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindungen. Es wird
auch in Betracht gezogen, daß die
Raman-aktiven Markierungen eine Ringstruktur mit Seitengruppen umfassen
können,
die an der Ringstruktur befestigt sind, wie zum Beispiel allgemein
polyzyklische aromatische Verbindungen. Verbindungen mit Seitengruppen,
die die Raman-Intensität
erhöhen,
umfassen Verbindungen mit konjugierten Ringstrukturen, wie zum Beispiel
Purine, Acridine, Rhodaminfarbstoffe und Cyaninfarbstoffe. Es wird
in Betracht gezogen, daß die Gesamtpolarität eines
polymeren aktiven molekularen Raman-Codes hydrophil ist, hydrophobe
Seitengruppen können
aber einbezogen sein. Andere Markierungen, die anwendbar sind, umfassen
Cyanid, Thiol, Chlor, Brom, Methyl, Phosphor und Schwefel.
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Richtlinien,
die auf den Entwurf und die Herstellung von Raman-Markierungen anwendbar
sind, sind hierin enthalten. Kurz gesagt, umfassen die als Beispiel
dienenden Raman-Markierungen,
die hierin bereitgestellt werden, solche, die eine Kombination der
folgenden Eigenschaften aufweisen: 1) ein konjugiertes aromatisches
System (im allgemeinen zwei oder mehr Ringe); 2) ein oder mehr Stickstoff-
oder Schwefelatome mit einem einsamen Elektronenpaar (zur Ag-Bindung),
vorzugsweise zwei solcher Atome auf derselben Seite des Moleküls, so daß sie ein
Metallatom chelieren können;
3) möglichst
wenige Sauerstoffatome; 4) wenige oder keine freien OH-Gruppen in
der Nähe
des Ag-Bindungsortes; und 5) wenige konkurrierende Ag-Bindungsmodi.
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Dementsprechend
umfassen Moleküle,
die zur Bereitstellung einer Metalloberflächenadsorption angewendet werden
können,
im allgemeinen mindestens ein N- oder
S-Atom mit einem einsamen Elektronenpaar (zur Ag-Bindung). Bei einigen
Erscheinungsformen ist es nützlich,
zwei solcher Atome auf derselben Seite des Moleküls zu haben, so daß sie Metallatome
chelieren können.
Außerdem
ist in anderen Erscheinungsformen eine positive Ladung im Molekül, wie zum
Beispiel N+, S+ oder
C+ enthalten.
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Allgemein
sind Silberkolloide stabil bei einem relativ großen Oberflächenpotential (–60 mV oder
darunter); wenn Moleküle
von organischen Verbindungen auf Silberkolloidflächen adsorbiert werden, reduziert sich
das Potential (Zeta-Potential) und so wird eine Kolloidagglutination
mit organischen Verbindungen als "Klebstoff" bewirkt. Die vorliegende Untersuchung
hat Verbindungen mit einem konjugierten aromatischen System identifiziert,
die die Aggregation von Ag-Teilchen effizienter induzieren können. N-
oder S-Atome sind für die stabile
Bindung an der Ag-Oberfläche
geeignet, und ein einzelner Bindungsmodus, der durch zwei chelierende
Elektronendonatoratome verankert ist, hilft bei der Erzeugung von
starken Raman-Signalen mit einfacher Signatur. O-Atome, besonders
die von freien Hydroxylgruppen, konkurrieren im allgemeinen mit
N und S um die Ag-Oberflächenbindung.
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Moleküle, die
sich dafür
eignen, ein starkes Raman-Signal bereitzustellen, umfassen diejenigen,
die eine starke Absorption von UV/sichtbarem Licht besitzen (konjugierte
Doppelbindungen und aromatisches System). Moleküle mit starker Absorption in
der Nähe
der Raman-Anregungswellenlänge
gehören
wegen ihres Resonanzeffektes dazu. Auch dazu gehören die Moleküle mit Schwingungsmoden,
wie zum Beispiel C-N-Bindungsdehnung, C-C-Bindungsdehnung und Pulsationsmoden
von 6-gliedrigen Ringen in einem aromatischen System. Ebenfalls
dazu gehören
die Moleküle
mit wenigen O-Atomen, weil im allgemeinen C-O-, O-H- und C=O-Bindungen
keine starken Raman-Signale liefern.
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Es
werden auch chemische Strukturen bereitgestellt, die eine eindeutige
Raman-Signatur für eine Raman-Markierung
aufweisen. Die Raman-Verschiebung einer bestimmten Mode kann auf
der Basis seiner chemischen Strukturumgebung entweder zu einer längeren Wellenlänge oder
einer kürzeren
Wellenlänge "bewegt" werden. Eine benachbarte
elektronenziehende Gruppe (konjugierter aromatischer Ring, CN usw.)
kann zum Beispiel den Raman-Peak zu einer höheren Wellenzahl bewegen, und
elektronenabgebende Gruppen (Amin, Thiol usw.) bewirken das Gegenteil.
Außerdem
können
einem Molekül
durch Vermeiden derselben Schwingungsmoden, die an verschiedenen
Teilen des Moleküls
auftreten, eindeutige Raman-Signaturen verliehen werden, wenn sie
nicht symmetrisch sind. Solche Strukturen ergeben Doppelpeaks oder
einen verbreiterten einzelnen Peak, was im allgemeinen die Raman-Signatur
komplizierter macht.
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In
bestimmten Ausführungsformen
können
die Raman-aktiven Markierungen, die in den Verfahren und Komplexen
der Erfindung verwendet werden, unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden,
die aus Nukleinsäuren,
Nucleotiden, Nucleotidanaloga, Basenanaloga, Fluoreszenzfarbstoffen,
Peptiden, Aminosäuren, modifizierten
Aminosäuren,
organischen Komponenten, Quantenpunkten, Kohlenstoff-Nanoröhrchen,
Fullerenen, Metall-Nanopartikeln, elektronendichten Teilchen und
kristallinen Teilchen oder einer Kombination von zwei oder mehr
derselben besteht.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung geeigneter Teilchen,
die Raman-Markierungen aufweisen, und von spezifischen Bindungssubstanzen,
die daran angeheftet sind und sich für die Verwendung in Nachweistests
eignen, in Betracht gezogen. Bei der Ausführung dieser Erfindung werden
jedoch Nanoteilchen bevorzugt. Die Größe, Form und chemische Zusammensetzung
der Teilchen trägt
zu den Eigenschaften der sich ergebenden Sonde, einschließlich des
DNA-Strichcodes, bei. Diese Eigenschaften umfassen optische Eigenschaften,
optoelektronische Eigenschaften, elektrochemische Eigenschaften,
elektronische Eigenschaften, Stabilität in verschiedenen Lösungen,
Poren- und Kanalgrößenvariation,
Fähigkeit,
bioaktive Moleküle
abzutrennen, wenn sie als Filter fungieren usw. Die Verwendung von
Mischungen von Teilchen, die unterschiedliche Größen, Formen und/oder chemische
Zusammensetzungen haben, sowie die Verwendung von Nanoteilchen,
die gleiche Größen, Formen
und chemische Zusammensetzung haben, wird in Betracht gezogen. Beispiele
für geeignete
Teilchen umfassen ohne Einschränkung
nano- und mikrometergroße
Kernteilchen, Aggregatteilchen, isotrope (wie zum Beispiel kugelförmige) und
anisotrope Teilchen (wie zum Beispiel nicht-kugelige Stäbe, tetraedrische
Prismen) und Nanoshell-Teilchen, wie zum Beispiel die in der
US-Patentanmeldung Ser. Nr. 10/034,451 ,
eingereicht am 28. Dezember 2002, und der Internationalen Anmeldung
Nr.
PCT/US01/50825 , eingereicht
am 28. Dezember 2002, beschriebenen, die durch Verweis in Gänze einbezogen
werden.
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Nanoteilchen,
die in der Praxis der Erfindung anwendbar sind, umfassen Metall
(z.B. Gold, Silber, Kupfer und Platin), Halbleiter (z.B. CdSe, CdS
und CdS oder CdSe, mit ZnS beschichtet) und magnetische (z.B. Ferromagnetit)
kolloidale Materialien. Andere Nanoteilchen, die bei der Ausführung der
Erfindung anwendbar sind, umfassen ZnS, ZnO, Tio.sub.2, AgI, AgBr,
HgI.sub2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In.sub.2S.sub.3, In.sub.2Se.sub.3,
Cd.sub.3P.sub.2, Cd.sub.3As.sub.2, InAs und GaAs. Die Größe der Nanoteilchen
beträgt vorzugsweise
etwa 1,4 nm bis etwa 150 nm (mittlerer Durchmesser), besser von
etwa 5 bis etwa 50 nm, am besten von etwa 10 bis etwa 30 nm. Die
Nanoteilchen können
Stäbchen,
Prismen, Würfel,
Tetraeder oder Nanoshell-Teilchen sein.
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"SERS" (Oberflächenverstärkte Raman-Streuung)" bedeutet die Erhöhung der
Streuung, die von bestimmten Molekülen in der Nähe bestimmter
Metalloberflächen
auftritt. "SERRS
(Oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Streuung)" ergibt sich, wenn
das Adsorbat auf einer SERS-aktiven Oberfläche sich in Resonanz mit der
Laser-Anregungswellenlänge
befindet. Die sich ergebende Verstärkung ist das Produkt der Resonanz und
Oberflächenverstärkung.
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"SERS-Substrat", wie hierin verwendet,
umfaßt
ein Färbemittel,
wie zum Beispiel ein Silber- oder Goldfärbemittel, das für ein Aktivieren
von Raman-Markierungen auf Teilchen sorgt, um einen SERS-Effekt
zu erzeugen. "Färbemittel", wie hierin verwendet,
umfaßt
ein Material, z.B. Gold, Silber usw., das zum Erzeugen oder Verstärken einer
nachweisbaren Änderung
bei einem beliebigen Assay verwendet werden kann, das hierin beschrieben
wird. Eine Silberfärbung
kann zum Beispiel bei jeder Art von Nanoteilchen eingesetzt werden, die
die Reduktion von Silber katalysieren. Daher kann Goldkolloid, das
einer Färbelösung ausgesetzt
wird, die AgNO3 enthält, als Kristallisationszentrum
für die
Abscheidung von Ag dienen.
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"Zwischenmolekül", wie hierin verwendet,
ist jede Substanz, die ein spezifisches Bindungselement umfaßt und sich
an einen Target-Analyten bindet. Als Beispiel dienende Zwischenmoleküle umfassen
Antikörper,
die an ein spezifisches Bindungselement angeheftet sind. Wie in 2 gezeigt,
umfaßt
ein als Beispiel dienendes Zwischenmolekül einen zweiten Antikörper, der
Nanogold-Seeds aufweist. Solche Moleküle binden sich im allgemeinen
an den Target-Analyten nach der Bindung des Target-Analyten an das
immobilisierte Einfangreagenz.
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"Strahlung", wie hierin verwendet,
ist eine Energie in Form von elektromagnetischer Strahlung, die
bei Anwendung auf eine Testmischung die Erzeugung eines Raman-Spektrums
bewirkt, das von der Raman-aktiven Markierung hierin erzeugt wird.
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Die
Komplexe und Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, sind von
vorherigen Berichten unterscheidbar, die den SERS-Nachweis mit Raman-Markierungsanwendungen
kombinieren. Zum Beispiel sind Gold-Nanoteilchen, kombiniert mit
der oberflächenverstärkten Raman-Streuungsspektroskopie
zum Nachweis und zur Identifizierung von einzelnen Farbstoffmolekülen von Cao
et al. (Science 297:1536) beschrieben worden. Cao et al.
haben eine Sonde entwickelt, die um ein 13 nm großes Gold-Nanoteilchen gelegt
ist. Die Nanoteilchen sind mit hydrophilen Oligonucleotiden beschichtet,
die einen Raman-Farbstoff an einem Ende enthalten und zum Schluß mit einem
kleinen Molekülerkennungselement
(z.B. Biotin) abgedeckt sind. Dieses Molekül ist katalytisch aktiv und
wird mit Silber in der Lösung
von AG(I) und Hydrochinon beschichtet. Nachdem die Sonde an ein
kleines Molekül
oder ein Antigen angeheftet wurde, das es nachweisen soll, wird
das Substrat einer Silber- und Hydrochinonlösung ausgesetzt. Die Silberplattierung
tritt in enger Nähe
zum Raman-Farbstoff auf, was die Feststellung der Farbstoffsignatur
mit einem Standard-Raman-Mikroskop
ermöglicht.
Im Gegensatz dazu bestehen die Komplexe, die hierin offenbart werden,
aus einem Raman-Farbstoff, der zum Beispiel von einem Gold-Nanoteilchen
verschieden ist, das sich zum Stützen
eines SERS-Substrats eignet. Die biologischen Target-Komplexe umfassen
ein Seed-Teilchen, das die Bildung eines SERS-Substrats katalysieren kann.
Das Seed-Teilchen ist mit einem zweiten Bindungselement verknüpft, welches
sich an ein erstes Bindungselement bindet, das mit einem Target-Analyten
verknüpft
ist. Sobald der Target-Analyt sich an ein Einfangreagenz bindet,
das mit einer Raman-Markierung verknüpft ist, wird das SERS-Substrat
durch Reduktion von Metall-Kationen erzeugt. Wenn alternativ eine
Nukleinsäure
der Target-Analyt ist, wird die Raman-Markierung zum SERS-Substrat
nach der Bildung hinzugefügt
(siehe z.B. die 3A, 3B und 4).
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Dementsprechend
wird in einer weiteren Ausführungsform
ein Verfahren zum Nachweis eines Analyt-Einfangreagenz-Komplexes
durch Raman-Spektroskopie bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Bereitstellung
eines Target-Analyten, der mit einem ersten spezifischen Bindungselement
verknüpft
ist, und die Bereitstellung eines Einfangreagenzes, das an ein festes
Substrat gebunden ist. Das Einfangreagenz umfaßt eine Raman-Markierung. Das
Verfahren umfaßt
ferner das Zusammenbringen des Target-Analyten mit dem Einfangreagenz
unter Bedingungen, die sich zur Bildung eines Target-Analyt-Einfangreagenz-Komplexes
eignen. Der erste spezifische Bindungspartner wird mit einem zweiten
spezifischen Bindungspartner, der funktionell mit einem Seed-Teilchen
verknüpft
ist, das sich zum Verknüpfen
mit einem SERS-Substrat eignet, zusammengebracht. Der Target-Analyt-Einfangreagenz-Komplex wird dann
mit elektromagnetischer Strahlung zusammengebracht, die sich zum
Nachweisen einer speziellen Eigenschaft, welche mit dem Target-Analyt-Einfangreagenz-Komplex verknüpft ist,
durch Raman-Spektroskopie eignet.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung Verfahren zum mehrfachen Nachweis von Analyten
in einer Probe durch Zusammenbringen von Target- Analyten in einer Probe unter Bedingungen,
die sich zur Bildung von Komplexen eignen, mit einem Satz von Einfangreagenzien
bereit. Im Fall eines Target-Analyten, der keine Nukleinsäure ist,
wird das Einfangreagenz mit einer Raman-Markierung konjugiert. Jedes
Einfangreagenz kann mit einer eindeutigen Raman-Markierung, wie
zum Beispiel einem Raman-Farbstoff, der mit einer eindeutigen optischen
Signatur verknüpft
ist, konjugiert werden. Nach der Komplexbildung und SERS-Aktivierung
des SERS-Substrats werden die eindeutigen optischen Signaturen in
einer Multiplexart mit einem geeigneten Nachweisgerät nachgewiesen.
Da jeder sich spezifisch bindende Target-Analyt an ein spezifisches
Einfangreagenz gebunden ist, das mit einem bekannten Raman-Farbstoff,
der eine unterscheidbare optische Signatur emittiert, wie zum Beispiel
einem SERS-Signal, konjugiert ist, sind individuelle optische Signaturen,
die aus den Konstrukten nachgewiesen werden, also mit der Identität eines
Target-Analyten in der Probe verknüpft.
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"Testprobe", wie hierin verwendet,
bedeutet die Probe, die den Target-Analyten enthält, der unter Verwendung der
vorliegenden Erfindung nachgewiesen und ge-assayed werden soll.
Die Testprobe kann andere Komponenten neben dem Target-Analyten
enthalten, kann die physikalischen Eigenschaften einer Flüssigkeit oder
eines Feststoffs haben und kann eine beliebige Größe oder
Volumen haben, einschließlich
zum Beispiel eines sich bewegenden Flüssigkeitsstroms. Die Testprobe
kann beliebige Substanzen enthalten, die kein Target-Analyt sind,
solange die anderen Substanzen die Bindung des Target-Analyten mit
dem Einfangreagenz oder die spezifische Bindung des ersten Bindungselementes
an das zweite Bindungselement nicht stören. Beispiele für Testproben
umfassen (ohne darauf beschränkt
zu sein): Serum, Plasma, Speichel, Samenflüssigkeit, Urin, andere Körperflüssigkeiten
und Umgebungsproben, wie zum Beispiel Grundwasser oder Abwasser,
Bodenextrakte, Luft und Pestizidrückstände.
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Die
optische Nachweisprozedur oder Kombination von optischen Nachweisprozeduren,
die angewendet werden sollen, hängt
von der Art der Analyten, dem Trenngerät oder der -matrix sowie der
Struktur und den Eigenschaften der Einfangreagenzien ab. Die getrennten
Komplexe können
durch ein oder eine Kombination von optischen Verfahren nachgewiesen
werden, die unter Adsorption, Reflektion, Polarisation, Brechung,
Fluoreszenz, Raman-Spektren, SERS, Resonanzlichtstreuung, gittergekoppelter
Oberflächen-Plasmon-Resonanz gewählt werden,
wobei Verfahren, die hierin beschrieben und im Fachgebiet bekannt
sind, verwendet werden.
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Die
Raman-aktiven Markierungen werden aus einem Raman-aktiven Farbstoff,
Aminosäure,
Nucleotid oder einer Kombination derselben ausgewählt. Beispiele
für Raman-aktive Aminosäuren, die
sich zur Integration in die Raman-aktive Markierung eignen, umfassen
Arginin, Methionin, Cystein und Kombinationen derselben. Beispiele
für Raman-aktive
Nucleotide, die sich zur Integration in die Raman-aktive Markierung
eignen, umfassen Adenin, Guanin und Derivate derselben. Die Raman-aktiven
Markierungen sind kleine Moleküle,
die bei der Erzeugung eines Raman-Signals sehr aktiv sind und normalerweise
ein Molekulargewicht von unter 1 kDa haben. Raman-aktive Markierungen,
die diese Anforderungen erfüllen,
umfassen Farbstoffe (z.B. R6G, Tamra, Rox) Aminosäuren (z.B.
Arginin, Methionin, Cystein), Nukleinsäurebasen (z.B. Adenin oder
Guanin) oder eine Kombination derselben. Natürlich vorkommende oder synthetische
Verbindungen, die die oben beschriebenen Merkmale besitzen, wie
zum Beispiel ein geeignetes Molekulargewicht und Raman-Charakteristika,
können
ebenfalls verwendet werden. Die Raman-aktiven Markierungen können in
einer beliebigen Lage entlang der molekularen Hauptkette angeordnet
werden, und eine einzelne Hauptkette kann mehr als eine solche Markierung
haben. Raman-Signaturen der Elemente des Satzes können während der
Synthese der molekularen Raman-Codes durch Ändern der Art, Zahl und relativen
Positionen der Raman-aktiven Markierungen entlang der Hauptkette
eingestellt werden.
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Die
gebundenen Komplexe, die die Raman-aktive Markierung umfassen, werden
mit einer dünnen Schicht
aus Metall überzogen,
wie hierin beschrieben wird, um die Raman-Signale aus dem Komplex zu verstärken. Die
Metallschicht, die in enger Nähe
zum Analyten liegt, erzeugt SERS-Signale, und der ganze feste Träger kann
mit einer einzigen Lichtquelle bestrahlt werden, während SERS-Signale
von den gebundenen Komplexen gesammelt werden, zum Beispiel durch
SERS-Scanning. Ein oder mehrere SERS-Spektren, die von einer diskreten
Stelle erhalten wurden, verknüpfen
das Einfangreagenz mit dem Vorhandensein eines bestimmten Target-Analyten
in der Probe oder identifizieren das Einfangreagenz als eins mit
(bisher unbekannter) Affinität
zu einem Molekül
oder Komplex in der Probe.
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Antikörper und
Rezeptoren sind nicht-einschränkende
Beispiele für
Einfangreagenzien, die an diskreten Orten auf dem festen Träger befestigt
sind. Nukleinsäuren,
Phagendisplay-Peptide, Nukleinsäuren,
Aptamere, Liganden, Lectine und Kombinationen derselben können ebenfalls
als Einfangreagenzien in den Verfahren der Erfindung verwendet werden.
Die Probe ist nicht notwendigerweise ein Körperfluid, obwohl sie das sein kann,
sondern kann jeder gemischte Pool von Analyten sein, einschließlich Proteinen,
Glykoproteinen, Lipoproteine, Nukleinsäure, Viruspartikeln, Polysacchariden,
Steroiden, und Kombinationen derselben umfassen. In einer Erscheinungsform
umfaßt
die Probe einen Pool aus Körperfluid
von Patienten, bei denen bekannt ist oder vermutet wird, daß sie eine
bestimmte Krankheit haben.
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Der
Begriff "Nukleinsäure" wird hierin in einem
weiten Sinn verwendet und soll eine Folge von Desoxyribonucleotiden
oder Ribonucleotiden bedeuten, die durch eine Phosphodiesterbindung
verbunden sind. Der Bequemlichkeit halber wird der Begriff "Oligonucleotid" hierin verwendet,
um auf ein Polynucleotid zu verweisen, das als Startermolekül (Primer)
oder als Sonde verwendet wird. Ein Oligonucleotid, das als Sonde
oder Primer verwendet werden kann, welcher selektiv mit einer ausgewählten Nucleotidsequenz
hybridisiert, hat im allgemeinen eine Mindestlänge von etwa 10 Nucleotiden, üblicherweise
von etwa 15 Nucleotiden, zum Beispiel zwischen etwa 15 und etwa
50 Nucleotiden.
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Eine
Nukleinsäure
kann RNA oder kann DNA sein, welche ein Gen oder ein Teil desselben
sein kann, eine cDNA, eine synthetische Polydesoxyribonukleinsäuresequenz
oder dergleichen und kann einzelsträngig oder doppelsträngig sowie
ein DNA/RNA-Hybrid sein. In verschiedenen Ausführungsformen kann ein Polynucleotid,
einschließlich
eines Oligonucleotids (z.B. eine Sonde oder ein Primer), Nucleosid-
oder Nucleotidanaloga oder eine Hauptkettenbindung, die keine Phosphodiesterbindung
ist, enthalten. Nucleotide, die ein Polynucleotid umfassen, sind
im allgemeinen natürlich
vorkommende Desoxyribonucleotide, wie zum Beispiel Adenin, Cytosin,
Guanin oder Thymin, die mit 2'-Desoxyribose
verbunden sind, oder Ribonucleotide, wie zum Beispiel Adenin, Cytosin,
Guanin oder Uracil, die mit Ribose verbunden sind. Ein Polynucleotid
oder Oligonucleotid kann jedoch auch Nucleotidanaloga enthalten,
einschließlich
der nicht natürlich
vorkommenden synthetischen Nucleotide oder modifizierte natürlich vorkommende
Nucleotide. Solche Nucleotidanaloga sind im Fachgebiet bekannt und
handelsüblich,
wie zum Beispiel Polynucleotide, die solche Nucleotidanaloga enthalten (Lin
et al., Nucl. Acids Res. 22:5220-5234 (1994); Jellinek
et al., Biochemistry 34:11363-11372 (1995); Pagratis et
al., Nature Biotechnol. 15:68-73 (1997).
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Die
kovalente Bindung, die die Nucleotide einer Nukleinsäure verbindet,
ist im allgemeinen eine Phosphodiesterbindung. Die kovalente Bindung
kann jedoch auch eine der zahlreichen anderen Bindungen sein, einschließlich einer
Thiodiesterbindung, einer Phosphorthioatbindung, einer peptidähnlichen
Bindung oder einer anderen Bindung, die den Fachleuten als für die Verbindung
von Nucleotiden anwendbar bekannt ist, um synthetische Polynucleotide
zu erzeugen (siehe zum Beispiel Tam et al., Nucl. Acids
Res. 22:977-986 (1994); Ecker und Crooke, BioTechnology
13:351-360 (1995)). Die Aufnahme von nicht natürlich vorkommenden
Nucleotidanaloga oder Bindungen, die die Nucleotide oder Analoga
verbinden, kann besonders nützlich
sein, wenn das Polynucleotid einer Umgebung ausgesetzt werden soll,
die eine nucleolytische Aktivität
besitzt, einschließlich
zum Beispiel eines Gewebskulturmediums, oder bei Verabreichung an
ein Lebewesen, da die modifizierten Polynucleotide weniger anfällig für eine Degradation
sein können.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "selektive Hybridisierung" oder "selektiv hybridisieren" auf die Hybridisierung
unter mäßig stringenten
oder hoch stringenten Bedingungen, so daß eine Nucleotidsequenz sich
vorzugsweise mit einer ausgewählten
Nucleotidsequenz gegenüber
nicht verwandten Nucleotidsequenzen in einem ausreichend großen Umfang
verknüpft,
so daß dies
bei der Identifizierung der ausgewählten Nucleotidsequenz anwendbar
ist. Es ist zu erkennen, daß ein
gewisser Betrag an unspezifischer Hybridisierung unvermeidbar ist,
der aber akzeptabel ist, vorausgesetzt, daß die Hybridisierung mit einer
Target-Nucleotidsequenz
ausreichend selektiv ist, so daß sie
von der unspezifischen Kreuzhybridisierung unterschieden werden
kann, zum Beispiel mindestens etwa zweifach selektiver, im allgemeinen
mindestens etwa dreifach selektiver, normalerweise mindestens etwa
fünffach
selektiver und insbesondere mindestens etwa zehnfach selektiver,
wie zum Beispiel durch eine Menge an markiertem Oligonucleotid bestimmt,
die sich an das Target-Nukleinsäuremolekül bindet,
im Vergleich mit einem Nukleinsäuremolekül, das kein
Target-Molekül ist, insbesondere
ein im wesentlichen ähnliches
(d.h. homologes) Nukleinsäuremolekül, das sich
vom Target-Nukleinsäuremolekül unterscheidet.
Bedingungen, die eine selektive Hybridisierung ermöglichen,
können
empirisch bestimmt werden oder können
zum Beispiel auf der Basis des relativen GC:AT-Gehalts des hybridisierenden
Oligonucleotids und der Sequenz, mit der es hybridisiert, der Länge des
hybridisierenden Oligonucleotids und der Zahl, falls zutreffend,
von Fehlpaarungen zwischen dem Oligonucleotid und der Sequenz, mit
der es hybridisieren soll, abgeschätzt werden (siehe zum Beispiel Sambrook
et al., "Molecular
Cloning: A laboratory manual" (Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989)).
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Ein
Beispiel für
Bedingungen mit zunehmend höherer
Stringenz ist folgendes: 2 × SSC/0,1
% SDS etwa bei Raumtemperatur (Hybridisierungsbedingungen); 0,2 × SSC/0,1
% SIDS etwa bei Raumtemperatur (Bedingungen mit niedriger Stringenz);
0,2 × SSC/0,1
% SDS bei ungefähr
42EC (mäßig stringente
Bedingungen) und 0,1 × SSC
bei etwa 68EC (hoch stringente Bedingungen). Das Waschen kann unter
Verwendung von nur einer dieser Bedingungen ausgeführt werden,
z.B. hoch stringente Bedingungen, oder jede dieser Bedingungen kann,
z.B. für
jeweils 10-15 Minuten, in der oben angeführten Reihenfolge verwendet
werden, wobei jeder der aufgeführten
Schritte oder alle wiederholt werden. Wie jedoch oben erwähnt, variieren
die optimalen Bedingungen je nach der speziellen Hybridisierungsreaktion,
die beteiligt ist, und kann empirisch bestimmt werden.
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Wie
hierin verwendet, wird der Begriff "Antikörper" in seinem weitesten Sinne gebraucht,
so daß er
polyklonale und monoklonale Antikörper sowie Antigenbindungsfragmente
solcher Antikörper
umfaßt.
Ein Antikörper,
der bei einem Verfahren der Erfindung anwendbar ist, oder ein Antigenbindungsfragment
desselben wird zum Beispiel dadurch gekennzeichnet, daß er/es
eine spezifische Bindungsaktivität
für ein
Epitop eines Analyten besitzt. Wie unten erläutert, kann der Analyt alternativ
der Sondenantikörper
sein, insbesondere in Ausführungsformen
der Erfindungsverfahren, bei denen Antikörper, die als Sonden verwendet
werden (z.B. Wirkstoffe), Körperflüssigkeiten
ausgesetzt werden, um einen Satz von Antikörpern auf den Nutzen als Medikamentenkandidaten
zu überprüfen.
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Der
Antikörper
umfaßt
zum Beispiel natürlich
vorkommende Antikörper
sowie nicht natürlich
vorkommende Antikörper,
einschließlich
zum Beispiel einkettige Antikörper,
chimärische,
bifunktionelle und humanisierte Antikörper sowie Antigenbindungsfragmente
derselben. Solche nicht natürlich
vorkommenden Antikörper
können
unter Verwendung der Festphasen-Peptidsynthese konstruiert, können rekombinant
erzeugt oder können
zum Beispiel durch Überprüfen von
kombinatorischen Bibliotheken erhalten werden, die aus variablen schweren
Ketten und variablen leichten Ketten bestehen (siehe Huse
et al., Science 246:1275-1281
(1989). Diese und andere Verfahren zur Herstellung von
zum Beispiel chimärischen,
humanisierten, CDR-transplantierten, einkettigen und bifunktionellen
Antikörpern
sind den Fachleuten bekannt (Winter und Harris, Immunol. Today
14:243-246, 1993; Ward et al., Nature 341:544-546,
1989; Harlow und Lane, Antibodies: A laboratory manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hilyard
et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck,
Antibody Engineering, 2nd ed. (Oxford University Press 1995)).
Monoklonale Antikörper,
die sich zur Verwendung als Sonden eignen, kann man auch von einer
Reihe von kommerziellen Quellen beziehen. Solche kommerziellen Antikörper stehen
für eine
breite Palette von Zielen zur Verfügung. Antikörpersonden können mit
molekularen Hauptketten unter Verwendung von chemischen Standardzusammensetzungen
konjugiert werden, wie unten diskutiert.
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Der
Ausdruck "bindet
spezifisch" oder "spezifische Bindungsaktivität" bedeutet bei Verwendung
in Bezug auf einen Antikörper,
daß eine
Wechselwirkung des Antikörpers
und eines bestimmten Epitops eine Dissoziationskonstante von mindestens
ca. 1 × 10–6,
im allgemeinen mindestens ca. 1 × 10–7,
normalerweise mindestens ca. 1 × 10–8 und
insbesondere mindestens ca. 1 × 10–9 oder
1 × 10–10 oder
darunter hat. Als solche sind Fab-, F(ab)2-, Fd- und Fv-Fragmente
eines Antikörpers,
die die spezifische Bindungsaktivität für ein Epitop eines Antigens
beibehalten, in die Definition eines Antikörpers einbezogen.
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Im
Kontext der Erfindung bezeichnet der Begriff "Ligand" einen natürlich vorkommenden spezifischen Bindungspartner
eines Rezeptors, einen synthetischen spezifischen Bindungspartner
eines Rezeptors oder ein geeignetes Derivat der natürlichen
oder synthetischen Liganden. Die Bestimmung und Isolierung von Liganden
ist im Fachgebiet bekannt (Lerner, Trends Neurosci. 17:142-146,
1994). Der Fachmann wird erkennen, daß ein Molekül (oder makromolekularer Komplex)
sowohl Rezeptor als auch Ligand sein kann. Der Bindungspartner,
der ein kleineres Molekulargewicht hat, wird im allgemeinen als
Ligand bezeichnet, und der Bindungspartner, der das größere Molekulargewicht
hat, wird als Rezeptor bezeichnet.
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In
bestimmten Erscheinungsformen betrifft die Erfindung Verfahren zum
Nachweis eines Analyten in einer Probe. Mit "Analyt" wird jedes Molekül oder Verbindung bezeichnet,
für welches
eine Sonde gefunden werden kann. Ein Analyt kann sich in der festen,
flüssigen,
gasförmigen
oder Dampfphase befinden. Mit "Gas- oder
Dampfphasenanalyt" wird
ein Molekül
oder eine Verbindung bezeichnet, die sich zum Beispiel im Gasraum
einer Flüssigkeit,
in der Umgebungsluft, in einer Atemprobe, in einem Gas oder als
Verunreinigung in einem der Vorhergehenden befindet. Es ist zu erkennen,
daß der
physikalische Zustand der Gas- oder Dampfphase durch Druck, Temperatur
sowie durch Beeinflussung der Oberflächenspannung einer Flüssigkeit
durch die Anwesenheit oder das Hinzufügen von Salzen usw. geändert werden
kann.
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Der
Analyt kann ein Molekül
sein, das direkt in einer Probe gefunden wird, wie zum Beispiel
in einem Körperfluid
von einem Wirtsorganismus. Die Probe kann direkt untersucht werden
oder kann vorbehandelt werden, um den Analyten besser nachweisbar
zu machen. Ferner kann der interessierende Analyt durch Nachweis
eines Mittels bestimmt werden, das als Beweis für den interessierenden Analyten
dient, wie zum Beispiel ein spezifisches Bindungspaarelement, das
komplementär
zum interessierenden Analyten ist und dessen Vorkommen nur festgestellt
wird, wenn der interessierende Analyt in der Probe vorhanden ist.
Das Mittel, das als Beweis für
den Analyten dient, wird somit zum Analyten, der bei einem Assay
nachgewiesen wird. Die Körperflüssigkeit
kann zum Beispiel Urin, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Samen, Stuhl,
Auswurf, Hirn-Rückenmarksflüssigkeit,
Tränen,
Schleim und dergleichen sein.
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Der
Begriff "Kolloid", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf Metallionen, die in einer Flüssigkeit, normalerweise Wasser,
suspendiert sind. Typische Metalle, die zur Verwendung in erfindungsgemäßen Metallkolloiden
und für
Nanopartikel erwogen werden, umfassen die transparenten Metalle,
zum Beispiel Silber, Gold, Platin, Aluminium und dergleichen.
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Zum
Verstärken
der Raman-Spektren, die durch Raman-aktive Substrate erzeugt werden,
wird eine dünne
Schicht eines transparenten Metalls, wobei die Schicht eine aufgerauhte
Oberfläche
besitzt, auf der oberen Schicht des Substrats und/oder den daran
gebundenen Komplexen abgeschieden. Die Rauhigkeitsmerkmale liegen
in der Größenordnung
von mehreren zehn Nanometern; sie sind klein im Vergleich zur Wellenlänge der
einfallenden Anregungsstrahlung. Die geringe Größe der Teilchen ermöglicht,
daß die
Anregung des Oberflächenplasmons
des Metallteilchens auf dem Teilchen lokalisiert wird. Merkmale
der Metallrauheit an der Metalloberfläche können in einer Reihe von Weisen
entwickelt werden; zum Beispiel Gasphasenabscheidung von Metallteilchen
oder Auftrag von Metallkolloiden auf die obere Schicht des Biosensors.
Da die Oberflächenelektronen
des Metalls auf das Teilchen beschränkt sind, dessen Größe klein
ist, ist die Plasmon-Anregung ebenfalls auf das Rauheitsmerkmal
beschränkt.
Das sich ergebende elektromagnetische Feld des Plasmons ist sehr
stark, was das SERS-Signal im Vergleich zu einem Raman-Signal sehr
verstärkt.
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Es
wurde geschätzt,
daß nur
1 von 10 Analytmolekülen
bei der Raman-Spektroskopie
unelastisch streut. Bei Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Verfahren,
bei denen die Intensität
des Raman-Signals von einem streuenden Molekül unter SERS-Bedingungen sehr
verstärkt
wird, können
niedrige Konzentrationen eines Raman-aktiven Analyten bei Konzentrationen
im Bereich von pico- und femto-molar nachgewiesen werden. In einigen
Fällen
können
die erfindungsgemäßen Verfahren
dazu verwendet werden, das Vorhandensein eines einzelnen Analytenmoleküls in einer
komplexen biologischen Probe, wie zum Beispiel Blutserum, durch
Abscheiden einer dünnen
Schicht eines transparenten Metalls, so daß es in Kontakt mit den gebundenen
Komplexen ist, die eine Raman-Markierung enthalten, nachzuweisen.
Gold, Silber, Kupfer und Aluminium sind die transparenten Metalle,
die am besten für
dieses Verfahren einsetzbar sind.
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Eine
aufgerauhte Metalloberfläche
kann mit einer von mehreren Verfahren hergestellt werden. Der Ausdruck "eine dünne Metallschicht", wie hierin verwendet,
bezeichnet eine Metallschicht, die durch chemische Gasphasenabscheidung über den
gebundenen Komplexen, welche eine Raman-Markierung enthalten, abgeschieden
wird. Alternativ bedeutet eine dünne
Metallschicht eine Schicht von Nanopartikeln, die durch Einwirken
von reduzierenden Bedingungen auf eine kolloidale Lösung von
Metallionen gebildet wird, um Metall-Nanopartikel an Ort und Stelle
zu bilden. In einigen Ausführungsformen
enthalten die Nanopartikel die gebundenen Komplexe. Alternativ können Seed-Teilchen,
die zum Beispiel an die Raman-Codes angeheftet sind, die Bildung
der Nanopartikel aus einer Metallkolloidlösung verursachen. In diesem
Zusammenhang bedeutet "dünn" eine Dicke von etwa
einer halben Wellenlänge
der Bestrahlungslichtquelle (normalerweise ein Laser), um Nutzen
aus SERS zu ziehen, zum Beispiel von etwa 15 nm bis etwa 500 nm,
wie zum Beispiel etwa 100 nm bis etwa 200 nm.
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Der
Begriff "Analyte", wie hierin verwendet,
umfaßt
Nukleinsäuren,
Proteine, Peptide, Lipide, Kohlenhydrate, Glycolipide, Glycoproteine
oder ein anderes potentielles Ziel, für welches eine spezifische
Sonde hergestellt werden kann. Wie oben diskutiert, können Antikörper- oder
Aptamersonden in die erfindungsgemäßen aktiven molekularen Raman-Codes
eingebaut werden und zur Identifizierung eines Targets verwendet
werden, für
welches ein Aptamer oder Antikörper
hergestellt werden kann. Das Vorhandensein mehrerer Analyte in einer
Probe kann gleichzeitig ge-assayed werden, da ja jedes Element eines
Satzes unterscheidbar markiert und nachgewiesen werden kann. Die
quantitative Angabe des Analyten ist mit Standardverfahren möglich, die
in der spektroskopischen Analyse bekannt sind. Die Menge an Analyt,
die an ein erfindungsgemäßes Raman-Sondenkonstrukt
gebunden ist, kann zum Beispiel durch Messen der erzeugten Signalstärke und
durch Vergleich mit einer Kalibrierkurve bestimmt werden, die aus
bekannten Mengen ähnlicher
Standards von Raman-Sondenkonstrukten erstellt wurde. Solche Quantisierungsverfahren
gehören
zu den Routinefähigkeiten im
Fachgebiet.
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Ein "Substrat" als hierin verwendeter
Begriff umfaßt
solche bekannten Vorrichtungen wie Chips oder Mikrotiterplatten
und kann eine gemusterte Oberfläche
aufweisen, die individuelle diskrete Stellen enthält, welche
so wie behandelt werden können,
wie hierin beschrieben, daß sie
sich an einzelne Analyte oder Arten von Analyten binden. In Ausführungsformen,
bei denen das Raman-Sondenkonstrukt alternativ am Substrat befestigt
ist, kann eine Korrelation zwischen dem Ort einer individuellen
Stelle in der Anordnung mit dem Raman-Code und der Sonde, die sich
an dieser bestimmten Stelle befindet, aufgestellt werden.
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Array-Zusammensetzungen
können
mindestens eine Fläche
mit mehreren diskreten Substratstellen umfassen. Die Größe des Arrays
hängt vom
Endzweck des Arrays ab. Es können
Arrays, die etwa 2 bis viele Millionen verschiedener diskreter Substratstellen
enthalten, erstellt werden. Das Array umfaßt im allgemeinen zwei bis
immerhin eine Milliarde oder mehr solcher Stellen, je nach der Größe der Fläche. Daher
können
Arrays mit sehr hoher Dichte, hoher Dichte, mäßiger Dichte, niedriger Dichte
oder sehr niedriger Dichte erstellt werden. Bereiche für Arrays
mit sehr hoher Dichte reichen von etwa 10.000.000 bis etwa 2.000.000.000
Stellen pro Array. Arrays hoher Dichte reichen von etwa 100.000
bis etwa 10.000.000 Stellen. Arrays mit mäßiger Dichte reichen von etwa
10.000 bis etwa 50.000 Stellen. Arrays mit niedriger Dichte haben
im allgemeinen weniger als 10.000 Stellen. Arrays mit sehr niedriger
Dichte haben im allgemeinen weniger als 1.000 Stellen.
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Die
Stellen weisen ein Muster auf, d.h. eine regelmäßige Anordnung oder Konfiguration,
oder können zufällig verteilt
sein. Ein regelmäßiges Muster
von Stellen kann so verwendet werden, daß die Stellen in einer x-y-Koordinatenebene
adressiert werden können.
Die Oberfläche
des Substrats kann so modifiziert werden, daß das Anhaften von Analyten
an individuellen Stellen ermöglicht
wird. Die Oberfläche
des Substrats kann für
die Bildung solcher diskreter Stellen modifiziert werden. In einer
Ausführungsform
kann die Oberfläche
so modifiziert werden, daß sie
Wells, d.h. Vertiefungen in der Oberfläche des Substrats, umfaßt. Dies
kann unter Verwendung einer Reihe bekannter Verfahren erfolgen,
einschließlich
(ohne darauf beschränkt
zu sein) der Fotolithographie, Prägeverfahren, Formungsverfahren
und Mikroätzverfahren.
Wie Fachleute erkennen werden, hängt
das Verfahren, das verwendet wird, von der Zusammensetzung und der
Form des Substrats ab. Alternativ kann die Oberfläche des
Substrats durch Modifizierung chemisch abgeleitete Stellen enthalten,
die für
ein Anhaften von Analyten oder Sonden an diskreten Orten auf dem
Substrat verwendet werden können. Das Hinzufügen eines
Musters von chemischen funktionellen Gruppen, wie zum Beispiel Aminogruppen,
Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, kann für ein kovalentes
Anhaften von Molekülen
verwendet werden, die entsprechende reaktive funktionelle Gruppen
oder Linkermoleküle
umfassen.
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Biologische "Analyte" können natürlich vorkommende
Proteine oder Fragmente von natürlich
vorkommenden Proteinen umfassen. Zum Beispiel können also zelluläre Extrakte,
die Proteine oder zufällige
oder gezielte Aufschließungen
von proteinhaltigen zellulären
Extrakten enthalten, verwendet werden. Auf diese Weise können Banken
von prokaryotischen und eukaryotischen Proteinen zur Überprüfung der
Systeme, die hierin beschrieben werden, erstellt werden. Zum Beispiel
können
Banken von bakteriellen, Pilz-, Viren- und Säugetierproteinen für Screening-Zwecke
erzeugt werden.
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Verfahren
für die
Oligonucleotidsynthese sind im Fachgebiet bekannt, und es kann jedes
solche Verfahren verwendet werden. Oligonucleotide können zum
Beispiel unter Verwendung handelsüblicher Oligonucleotid-Synthesizer
(z.B. von Applied Biosystems, Foster City, CA) hergestellt werden.
Nucleotidvorläufer,
die an eine Reihe von Markierungen angeheftet sind, können kommerziell
erhalten (z.B. Molecular Probes, Eugene, OR) und in Oligonucleotide
oder Polynucleotide eingebaut werden. Alternativ können Nucleotidvorläufer erworben
werden, die verschiedene reaktive Gruppen enthalten, wie zum Beispiel
Biotin, Diogoxigenin, Sulfhydryl-, Amino- oder Carboxylgruppen.
Nach der Oligonucleotidsynthese können Markierungen unter Verwendung
von Standardchemikalien angeheftet werden. Oligonucleotide einer
beliebigen gewünschten
Sequenz, mit oder ohne reaktive Gruppen zum Anheften von Markierungen,
können
ebenfalls von einer breiten Palette von Quellen gekauft werden (z.B.
Midland Certified Reagents, Midland, TX).
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Das
Metall, das zum Erreichen eines geeigneten SERS-Signals benötigt wird,
ist von Natur aus im COIN vorhanden, und eine breite Palette von
Raman-aktiven organischen Verbindungen kann in das Teilchen integriert
werden. Tatsächlich
kann eine große
Zahl von eindeutigen Raman-Signaturen durch den Einsatz von Nanoteilchen
erzeugt werden, die Raman-aktive
organische Verbindungen verschiedener Struktur, Mischungen und Verhältnisse
enthalten. Die Verfahren, die hierin beschrieben werden und COINS
verwenden, sind daher für
den gleichzeitigen Nachweis vieler Analyse in einer Probe anwendbar,
was zu einer schnellen qualitativen Analyse der Inhaltsstoffe des "Profils" eines Körperfluids
führt.
Da außerdem
viele COINS in ein einzelnes Nanopartikel integriert werden können, ist
das SERS-Signal von einem einzelnen COIN-Teilchen im Vergleich zu
SERS-Signalen stark, die aus Raman-aktiven Materialien erhalten
wurden, welche keine Nanoteilchen enthalten, die hierin als COINS
beschrieben werden. Diese Situation führt zu einer erhöhten Empfindlichkeit
im Vergleich zu Raman-Verfahren, die keine COINS verwenden.
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COINS
werden unter Verwendung von Standard-Metallkolloidchemikalien leicht
zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren vorbereitet.
Die Herstellung von COINS nutzt auch die Fähigkeit von Metallen, organische
Verbindungen zu adsorbieren. Da Raman-aktive organische Verbindungen auf dem
Metall während
der Bildung der Metallischen Kolloide adsorbiert werden, können viele
Raman-aktive organische Verbindungen in das COIN integriert werden,
ohne spezielle Chemikalien zum Anheften zu erfordern.
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Die
COINs, die bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, werden
im allgemeinen folgendermaßen
hergestellt. Eine wäßrige Lösung wird
hergestellt, die geeignete Metallkationen, ein Reduzierungsmittel und
mindestens eine geeignete Raman-aktive organische Verbindung enthält. Die
Komponenten der Lösung werden
dann Bedingungen ausgesetzt, die die metallischen Kationen reduzieren,
so daß sich
neutrale, kolloidale Metallteilchen bilden. Da die Bildung der metallischen
Kolloide in Gegenwart einer geeigneten Raman-aktiven organischen
Verbindung erfolgt, wird die Raman-aktive organische Verbindung
schnell während
der Kolloidbildung auf dem Metall adsorbiert. Diese einfache Art
von COIN wird als Typ I-COIN bezeichnet. Typ I-COINS können normalerweise
durch Membranfiltration isoliert werden. Außerdem können COINS verschiedener Größen durch
Zentrifugieren angereichert werden.
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In
alternativen Ausführungsformen
können
die COINS ein zweites Metall umfassen, das vom ersten Metall verschieden
ist, wobei das zweite Metall eine Schicht bildet, die auf der Oberfläche des
Nanopartikels liegt. Um diese Art von SERS-aktiven Nanopartikeln
herzustellen, werden Typ I-COINS in eine wäßrige Lösung gebracht, die geeignete
Kationen eines zweiten Metalls und ein Reduzierungsmittel enthält. Die
Komponenten der Lösung
werden dann Bedingungen ausgesetzt, die die zweiten metallischen
Kationen reduzieren, so daß sich
eine metallische Schicht bildet, die auf der Oberfläche des
Nanopartikels liegt. In bestimmten Ausführungsformen umfaßt die zweite
Metallschicht Metalle, wie zum Beispiel Silber, Gold, Platin, Aluminium
und dergleichen. Diese Art von COIN wird als Typ II-COIN bezeichnet.
Type II-COINS können
auf die gleiche Weise wie Typ I-COINS isoliert und angereichert werden.
Typ I- und Typ II-COINS sind im wesentlichen kugelförmig und
besitzen eine Größe im Bereich
von etwa 20 nm bis 60 nm. Die Größe des Nanopartikels
wird so gewählt, daß sie etwa
eine halbe Wellenlänge
des Lichtes beträgt,
das zum Bestrahlen der COINS während
des Nachweises verwendet wird.
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Organische
Verbindungen werden normalerweise an eine Schicht eines zweiten
Metalls in Typ II-COINS durch kovalente Bindung von organischen
Verbindungen an die Oberfläche
der Metallschicht angeheftet. Die kovalente Bindung einer organischen
Schicht an die metallische Schicht kann in einer Reihe von Weisen
erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie zum Beispiel
durch Thiol-Metall-Bindungen. In alternativen Ausführungsformen
können
die organischen Moleküle,
die an die Metallschicht angeheftet sind, vernetzt werden, so daß sie ein
molekulares Netz bilden.
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Die
COIN(s), die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden,
können
Kerne umfassen, die magnetische Materialien, wie zum Beispiel Eisenoxide,
und dergleichen enthalten. Magnetische COINs können ohne Zentrifugieren unter
Verwendung handelsüblicher
Handhabungssysteme für
Magnetteilchen verarbeitet werden. Magnetismus kann tatsächlich als
Mechanismus zum Abtrennen biologischer Targets verwendet werden,
die an magnetischen COIN-Partikeln befestigt sind, welche mit bestimmten
biologischen Sonden markiert sind.
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"Raman-aktive organische
Verbindung", wie
hierin verwendet, bezieht sich auf ein organisches Molekül, das eine
eindeutige SERS-Signatur als Reaktion auf Anregung durch einen Laser
erzeugt. Eine Reihe von Raman-aktiven organischen Verbindungen wird
zur Verwendung als Komponenten in COINS erwogen. In bestimmten Ausführungsformen
sind Raman-aktive organische Verbindungen polyzyklische aromatische
oder heteroaromatische Verbindungen. Die Raman-aktive organische
Verbindung hat normalerweise ein Molekulargewicht von unter etwa
300 Dalton.
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Zusätzliche
nicht-einschränkende
Beispiele für
Raman-aktive organische Verbindungen zur Verwendung in COINS umfassen
TRIT (Tetramethylrhodaminisothiol), NBD (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol),
TexasRot-Farbstoff, Phthalsäure,
Terephthalsäure,
Isophthalsäure,
Kresylechtviolett, Kresylblauviolett, Brillantkresylblau, Paraaminobenzoesäure, Erythrosin,
Biotin, Digoxigenin, 5-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein,
5-Carboxy- 2',4',5',7'-tetrachlorfluorescein,
5-Carboxyfluorescein, 5-Carboxyrhodamin, 6-Carboxyrhodamin, 6-Carboxytetramethylaminophthalocyanine,
Azomethine, Cyanine, Xanthine, Succinylfluoresceine, Aminoacridin
und dergleichen. Diese und andere Raman-aktive organische Verbindungen
sind kommerziell erhältlich
(z.B. Molecular Probes, Eugene, OR, USA).
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In
bestimmten Ausführungsformen
ist die Raman-aktive Verbindung Adenin, Adenin, 4-Aminopyrazol(3,4-d)pyrimidin,
2-Fluoradenin, N6-Benzoyladenin, Kinetin, Dimethylallylaminoadenin,
Zeatin, Bromadenin, 8-Azaadenin, 8-Azaguanin, 6-Mercaptopurin, 4-Amino-6-mercaptopyrazol(3,4-d)pyrimidin,
8-Mercaptoadenine oder 9-Amino-acridin-4-amino-pyrazol(3,4-d)pyrimidin oder 2-Fluoradenin.
In einer Ausführungsform ist
die Raman-aktive
Verbindung Adenin.
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Wenn "fluoreszierende Verbindungen" in COINs integriert
werden, können
die fluoreszierenden Verbindungen Farbstoffe, intrinsisch fluoreszierende
Proteine, Lanthanid-Phosphor
und dergleichen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Farbstoffe,
die für
die Integration in COINs verwendet werden können, umfassen zum Beispiel
Rhodamin und Derivate, wie zum Beispiel TexasRot, ROX (6-Carboxy-X-rhodamin),
Rhodamin-NHS und TAMRA (5/6-Carboxytetramethylrhodamin-NHS); Fluorescein
und Derivate, wie zum Beispiel 5-Brommethylfluorescein und FAM (5'-Carboxyfluorescein-NHS),
Lucifer Gelb, IAEDANS, 7-Met,
N-Coumarin-4-acetat, 7-OH-4-CH3-Coumarin-3-acetat, 7-NHZ-4CH3-Coumarin-3-acetat
(AMCA), Monobrombiman, Pyrentrisulfonate, wie zum Beispiel Cascade
Blau und Monobromtrimethylammoniobiman.
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Eine
als Beispiel dienende Verwendung für die Verfahren, die hierin
beschrieben werden, ist der Nachweis einer Target-Nukleinsäure. Solch
ein Verfahren ist zum Beispiel für
den Nachweis eines Einzel-Nucleotid-Polymorphismus (SNP), zum Nachweis
von infektiösen
Stoffen in einer klinischen Probe, Nachweis eines Amplifikationsproduktes,
das von genomischer DNA oder RNA oder Messenger-RNA oder Nachweis
eines Gens (cDNA), das in einen Klon eingeführt wird, anwendbar. Für bestimmte
Verfahren, die sich auf den Nachweis eines Target-Polynucleotids
richten, wird eine Oligonucleotidsonde unter Verwendung von Verfahren
synthetisiert, die im Fachgebiet bekannt sind.
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Bei
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung kann das Raman-Spektrometer Teil einer
Nachweiseinheit sein, die zum Nachweisen und Quantisieren der Raman-Signale
der vorliegenden Erfindung durch Raman-Spektroskopie ausgelegt ist.
Verfahren zum Nachweis von Raman-markierten Analyten, zum Beispiel
Nucleotiden, unter Verwendung der Raman-Spektroskopie sind im Fachgebiet bekannt
(siehe z.B. die
US-Patente Nr.
5,306,403 ;
6,002,471 und
6,174,677 ). Es sind Variationen
an der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie
(SERS), oberflächenverstärkten Resonanz-Raman-Spektroskopie
(SERRS) und kohärenten
Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie
(CARS) offenbart worden.
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Ein
nicht einschränkendes
Beispiel für
eine Raman-Nachweiseinheit wird im
US-Patent Nr. 6,002,471 offenbart.
Ein Anregungsstrahl wird entweder von einem frequenzverdoppelten
Nd:YAG-Laser mit einer Wellenlänge
von 532 nm oder einem frequenzverdoppelten Ti-Saphir-Laser mit einer
Wellenlänge
von 365 nm erzeugt. Es können
gepulste Laserstrahlen oder kontinuierliche Laserstrahlen verwendet
werden. Der Anregungsstrahl läuft
durch konfokale Optik und ein Mikroskopobjektiv und wird auf den
Fließweg
und/oder die Durchflußmeßzelle fokussiert.
Das Raman-Emissionslicht wird vom Mikroskopobjektiv und der konfokalen
Optik gesammelt und in einen Monochromator zur spektralen Zerlegung
eingekoppelt. Die konfokale Optik umfaßt eine Kombination von dichroitischen
Filtern, Sperrfiltern, konfokalen Lochblenden und Spiegeln zur Verringerung
des Hintergrundsignals. Neben der konfokalen Optik kann auch Standard-Gesamtfeldoptik
verwendet werden. Das Raman-Emissionssignal wird mit einem Raman-Detektor
nachgewiesen, der eine Avalanche-Fotodiode umfaßt, die mit einem Computer
zum Zählen
und zum Digitalisieren des Signals verbunden ist.
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Ein
weiteres Beispiel für
eine Raman-Nachweiseinheit wird im
US-Patent
Nr. 5,306,403 offenbart, die ein Spex-Modell 1403 Doppelgitter-Spektrofotometer
mit einem Galliumarsenid-Fotovervielfacher (RCA-Modell C31034 oder
Burle Industries Modell C3103402) umfaßt, welcher im Einzelphotonzählmodus
betrieben wird. Die Anregungsquelle umfaßt einen 514,5 nm-Linien-Argonionenlaser
von SpectraPhysics, Modell 166, und eine 647,1 nm-Linie von einem
Kryptonionenlaser (Innova 70, Coherent).
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Alternative
Anregungsquellen umfassen einen Stickstofflaser (Laser Science Inc.)
bei 337 nm und einen Helium-Cadmium-Laser (Liconox) bei 325 nm (
US-Patent Nr. 6,174,677 ),
eine lichtemittierende Diode, einen Nd:YLF-Laser und/oder verschiedene
Ionenlaser und/oder Farbstofflaser. Der Anregungsstrahl kann mit einem
Bandpaßfilter
(Corion) spektral gereinigt werden und kann auf den Fließweg und/oder
die Durchflußmeßzelle unter
Verwendung eines Objektivs 6x (Newport, Modell L6X) fokussiert werden.
Mit dem Objektiv kann man unter Verwendung eines holographischen
Strahlenteilers (Kaiser Optical Systems, Inc., Modell HB 647-26N18),
um eine rechtwinklige Geometrie für den Anregungsstrahl und das
emittierte Raman-Signal zu erzeugen, sowohl die Raman-aktiven Sondenkonstrukte
anregen als auch das Raman-Signal sammeln. Ein holographisches Bandsperrfilter
(Kaiser Optical Systems, Inc.) kann zum Reduzieren der Strahlung
mit Rayleigh-Streuung verwendet werden. Alternative Raman-Detektoren
umfassen einen ISA HR-320 Spektrographen, der mit Nachweissystem
(Princeton Instruments) mit einem rotverstärkten intensivierten ladungsgekoppelten
Gerät (RE-ICCD) ausgestattet
ist. Es können
auch andere Arten von Detektoren verwendet werden, wie zum Beispiel
Fourier-Transform-Spektrographen (auf der Basis von Michelson-Interferometern),
Ladungsinjektionsbauelemente, Photodiodenarrays, InGaAs-Detektoren,
Elektronenvervielfacher-CCD, verstärkte CCD und/oder Phototransistor-Arrays.
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Jede
geeignete Form oder Konfiguration von Raman-Spektroskopie oder verwandten
Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, kann zum Nachweisen des
Target-Komplexes
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich (ohne
darauf beschränkt
zu sein) die normale Raman-Streuung, Resonanz-Raman-Streuung, der
oberflächenverstärkten Raman-Streuung,
oberflächenverstärkten Resonanz-Raman-Streuung,
kohärenten
Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS), stimulierten Raman-Streuung,
inversen Raman-Spektroskopie, stimulierten Gain-Raman-Spektroskopie,
Hyper-Raman-Streuung, molekularen optischen Laser-Examiner (MOLE)
oder Raman-Mikrosonde oder Raman-Mikroskopie
oder konfokalen Raman-Mikrospektrometrie, dreidimensionalen oder
Scanning-Raman,
Raman-Sättigungsspektroskopie,
zeitaufgelösten
Resonanz-Raman, Raman-Entkopplungsspektroskopie
oder UV-Raman-Mikroskopie.
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In
bestimmten Erscheinungsformen der Erfindung umfaßt ein System zum Nachweisen
des Target-Komplexes ein Informationsverarbeitungssystem. Ein als
Beispiel dienendes Informationsverarbeitungssystem kann einen Computer
enthalten, der einen Bus zum Kommunizieren von Informationen und
einen Prozessor zum Verarbeiten von Informationen umfaßt. In einer
Ausführungsform
der Erfindung wird der Prozessor aus der Pentium®-Familie
von Prozessoren ausgewählt,
die die Pentium® II-Familie,
die Pentium® III-Familie und
die Pentium® 4-Familie
von Prozessoren umfaßt,
welche von der Intel Corp. (Santa Clara, CA, USA) erhältlich sind.
In alternativen Ausführungsformen
der Erfindung kann der Prozessor ein Celeron®, ein
Itanium® oder
ein Pentium Xeon®-Prozessor (Santa Clara,
CA, USA) sein. In verschiedenen anderen Ausführungsformen der Erfindung
kann der Prozessor auf der Intel-Architektur
beruhen, wie zum Beispiel der Intel® IA-32- oder
Intel® IA-64-Architektur.
Alternativ können
andere Prozessoren verwendet werden. Das Informationsverarbeitungs- und -kontrollsystem
kann ferner alle peripheren Geräte
umfassen, die im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel Speicher-,
Anzeige-, Tastatur- und/oder andere Geräte.
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In
bestimmten Beispielen kann die Nachweiseinheit betriebsfähig mit
dem Informationsverarbeitungssystem verbunden sein. Daten aus der
Nachweiseinheit können
durch den Prozessor verarbeitet und Daten im Speicher gespeichert
werden. Daten zu Emissionsprofilen für verschiedene Raman-Markierungen
können ebenfalls
im Speicher gespeichert werden. Der Prozessor kann die Emissionsspektren
von den Target-Komplexen im Fließweg und/oder der Durchflußmeßzelle vergleichen,
um die Raman-aktive Komponente im Komplex mit dem Target-Analyten
oder dem Einfangreagenz zu identifizieren. Das Informationsverarbeitungssystem
kann Standardprozeduren ausführen,
wie zum Beispiel das Subtrahieren von Hintergrundsignalen oder den
Vergleich von Signalen verschiedener Proben.
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Obwohl
bestimmte Verfahren der vorliegenden Erfindung unter der Steuerung
eines programmierten Prozessors ausgeführt werden können, können die
Verfahren in alternativen Ausführungsformen
der Erfindung vollständig
oder teilweise durch eine programmierbare oder hartverdrahtete Logik
implementiert werden, wie zum Beispiel programmierbare Verknüpfungsfelder
(FPGAs), TTL-Logik oder anwendungsspezifische integrierte Schaltungen
(ASICs). Weiterhin können
die offenbarten Verfahren durch eine beliebige Kombination von programmierten
Allzweck-Computerkomponenten und/oder nutzerspezifischen Hardwarekomponenten ausgeführt werden.
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Nach
der Datenerfassungsoperation werden die Daten normalerweise einer
Datenanalyseoperation zugeführt.
Zur Erleichterung der Analyseoperation werden die Daten, die durch
die Nachweiseinheit gewonnen wurden, normalerweise unter Verwendung
eines digitalen Computers, wie zum Beispiel des oben beschriebenen,
analysiert. Der Computer wird normalerweise für den Empfang und die Speicherung
der Daten aus der Nachweiseinheit sowie für die Analyse und Berichterstellung über die
Daten, die gesammelt wurden, geeignet programmiert.
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In
bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung können
nutzerspezifisch ausgelegte Softwarepakete zum Analysieren der Daten
verwendet werden, die von der Nachweiseinheit gewonnen wurden. In
alternativen Ausführungsformen
der Erfindung kann die Datenanalyse unter Verwendung eines Informationsverarbeitungssystems
und handelsüblicher
Softwarepakete ausgeführt
werden.
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Als
Beispiel dienende Raman-Markierungen werden unten in der Tabelle
1 bereitgestellt.
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Tabelle
1: Auswahl von Raman-Markierungen
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Obwohl
die Erfindung mit Verweis auf die obigen Beispiele beschrieben wurde,
versteht es sich, daß Modifizierungen
und Abwandlungen innerhalb des Geistes und des Umfangs der Erfindung
liegen. Dementsprechend wird die Erfindung nur durch die folgenden
Ansprüche
begrenzt.
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Zusammenfassung:
Verfahren; umfassend a) einen Zielanalyten, der mit einem ersten
spezifischen Bindungselement verknüpft ist; b) ein zweites spezifisches
Bindungselement, das sich an das erste spezifische Bindungselement
bindet und so einen Zielkomplex bildet, wobei das zweite spezifische
Bindungselement s Seed-Teilchen umfaßt, die sich zum Katalysieren
der Bildung eines oberflächenverstärkten Raman-Streuungssubstrats
(SERS-Substrats) eignen, wobei das SERS-Substrat aktiviert werden
kann, so daß es
einen SERS-Effekt bereitstellt; und c) ein Einfangreagenz, das an
ein festes Substrat gebunden ist, wobei das Einfangreagenz eine
Raman-Markierung umfaßt,
wobei der Target-Analyt sich an das Einfangreagenz bindet und einen
Targetkomplex bildet.
