KR20240082845A - 금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단키트 및 이의 검출방법 - Google Patents

금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단키트 및 이의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 올리고펩타이드로 개질된 금 나노갭입자의 나노갭에 의한 플라즈몬 커플링에 의해 매우 높은 라만 신호 증폭 효과 및 재현성을 구현하여 사스 코로나바이러스 2 검출에 있어 높은 감도를 가져 정확한 검출이 가능하다.

Description

금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단키트 및 이의 검출방법{Composition for detecting SARS-CoV-2 comprising gold nanogap particles, a diagnostic kit comprising the same, and a method for detecting the same}
본 발명은 라만 신호를 갖는 프로브가 도입된 금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단키트 및 이의 검출방법에 관한 것이다.
유전체 검출 기술은 대부분 형광 신호 및 형광 이미지의 색상과 신호 세기 분석이 이용되는데, 형광 물질이 일정 수준 이상 존재하지 않을 경우 신호 세기가 강해지는 데 한계가 있고, 시간이 지나면서 형광 세기가 약해지며, 형광 물질의 종류가 다르더라도 발현되는 색상의 가짓수가 제한되어 검출 물질의 구분에 제약이 있다.
이러한 형광 신호의 한계로 인해 나노 크기의 작은 유전체를 형광 신호로 검출하기 위해 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing; NGS), 마이크로어레이 등 물질 증폭 방식이 이용되는데, 이러한 목표 형광을 검출하는 장비는 대부분 매우 정밀하고 고가이며, 운용의 전문성이 요구된다.
또한, 바이러스 검출에 주로 쓰이는 기술인 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)은 비교적 비용은 저렴하나, 미량이라도 오염 시에는 타겟이 아닌 물질이 증폭되어 검사 결과에 오류를 가져오는 등 검출조건이 까다롭고, 검출시간(약 2~3시간)이 오래 소요되며, 분석자의 숙련도가 필요하다.
이러한 문제점들을 해결하기 위해 최근에는 라만 분광학을 이용한 표지물질이 이용되고 있다. 형광 신호에 비해 라만 신호는 각 분자별 지문과 같은 형태로 신호 패턴이 나타나기 때문에 나노 사이즈의 물질을 종류별로 명확하게 검출할 수 있다. 라만 분석법은 빛(레이저)을 이용하기 때문에 충분한 신호가 나올 경우 1회 측정 시간은 약 1~10초 내외로 짧으며, 유전자 증폭 과정 없이 빛을 이용하여 직접 분자를 측정하므로 유전자 증폭을 위한 값 비싼 형광인자, 중합효소, 프라이머 등의 재료가 필요하지 않아 비교적 저렴한 장점이 있다. 또한, 비숙련자도 간단한 분석법 숙지 후 즉시 이용 가능하다. 이러한 라만 신호를 이용한 분자 검출법은 정밀하고 안정되며 간편하고 신속한 측정이 가능하여 비파괴, 미세, 화학 분석, 이미지 처리 등에 널리 사용되며, 특히 액체, 기체, 젤(gel), 현탁액(slurry), 가루(powder) 등 측정 대상의 물성에 상관없이 표본의 화학 조성, 구조 등의 특성을 분석하는데 활용된다.
그러나 라만 분광기술의 경우 신호 세기가 매우 약하고 재현성이 낮은 한계가 있으며, 바이오, 의료 표본의 경우 대부분 수많은 물질이 혼합되어 있고 액체 상태인 경우가 많아 라만 신호의 안정성이 떨어지는 문제가 있다. 이를 개선하기 위해서는 시료의 고순도 정제 과정이 필요한데 그 과정에서 시료의 많은 손실이 발생한다. 또한, 유전체의 경우 단일 염기가 아닌 수많은 염기가 서열을 이루어 (곡)선형 구조를 이루고 있으며, 단백질도 대부분 단일 아미노산이 아닌 수많은 아미노산이 결합된 3차 구조를 이루고 있어 일관되고 안정적인 라만 증폭 신호를 획득하기 매우 어렵다.
이를 극복하기 위해 표면 증강 라만 산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)이 제안되었다. SERS는 금, 은 등의 금속 나노구조의 거친 표면에 분자가 흡착될 때 라만 산란 세기가 106~108배 이상 급격히 증가되는 현상을 이용한 분광법이다. SERS는 라만의 낮은 신호 강도를 극복할 수 있어 이를 이용한 다양한 질병과 관련된 유전자, 단백질(바이오마커)의 조기 진단을 수행하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 바이오, 의료 표본은 SERS 분석 시에도 여러 가지 전처리가 필요하며, 숙련된 기술 없이는 일관된 라만 신호를 획득하기 어려운 문제가 있다.
이에, L. Brus 등(JACS. 2002)은 금속 입자 이합체(dimer)의 경우 두 개 이상의 나노입자 사이에 매우 강한 전자기장인 핫 스팟(hot spot 또는 interstitial field)이 형성되어 SERS 신호가 증강된다고 보고하였으며, 전자기적인 이론계산에 따르면 상기 핫 스팟(hot spot)에 의해 1012정도의 SERS 증강이 예측된다. 그러나 이러한 구조체를 이용하여 라만 신호를 얻을 경우 여전히 신호의 정량성, 결과의 재현성, 합성의 편이성 및 간편성, 비용, 프로브의 안정성 등이 문제점으로 남아있다. 즉, 두 개 이상의 나노입자가 나노갭에 의하여 결합될 경우 증폭된 광학신호를 검출할 수 있으나 이러한 나노입자의 나노갭의 크기를 조절하는 것이 어렵고, 이에 따라 물질 합성의 용이성, 안정성, 신호의 재현성, 정량성 등이 확보될 수 없다.
이에, 본 발명자는 DNA를 이용하여 코어와 쉘을 포함하고 코어와 쉘 사이에 나노갭이 형성되어 라만 신호를 증폭시킬 수 있는 단일나노입자를 제조한 바 있다(한국등록특허 제10-1352342호).
한편, 코로나바이러스감염증-19(코로나19, COVID-19)의 병원체는 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)이며, 코로나비리데과에 속하는 RNA 바이러스이다. SARS-CoV-2는 실시간 유전자 증폭검사(Real Time PCR; RT-PCR)를 통해 진단 가능하며, 이 검사방법으로는 6시간 이내에 결과 확인이 가능하다. 이에 민감도 및 특이도가 보다 향상된 효과적인 검출방법이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자는 상기 제10-1352342호에 따른 나노입자를 사스 코로나바이러스 2 검출에 적용하였으나, 감도가 낮은 문제가 있어 이를 개선하고자 DNA 대신 펩타이드로 개질시킨 금 나노갭입자를 제조하고, 이를 사스 코로나바이러스 2 검출 또는 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단에 활용가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 단일 나노입자 내부에 나노갭이 형성되어 매우 높은 라만 신호 증폭 효과 및 높은 재현성을 가지고 있는 금 나노갭입자를 이용한 사스 코로나바이러스 2 검출용 또는 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단키트 및 이의 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물에 있어서, 상기 금 나노갭입자는 금 코어 및 상기 금 코어를 둘러싼 금 쉘을 포함하고, 상기 금 코어와 상기 금 쉘 사이에 나노갭이 형성되며, 상기 금 쉘의 표면에 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 제공한다.
상기 코어와 쉘이 나노브릿지로 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 코어의 표면에 올리고펩타이드가 정전기적 인력으로 부착된 것을 특징으로 한다.
상기 올리고펩타이드는 S-S-S-S-S-C, A-A-A-A-A-C, Y-Y-Y-Y-Y-C 및 T-T-T-T-T-C 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 코어의 표면에 상기 올리고펩타이드의 한쪽 말단이 공유결합으로 부착되고, 상기 올리고펩타이드의 일부는 상기 쉘에 삽입된 것을 특징으로 한다.
상기 올리고펩타이드에 라만 활성분자가 정전기적 인력 또는 공유결합으로 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 라만 활성분자는 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein; 6-FAM), Dabcyl, 테트라메틸 로다민 아이소티올(TRIT), 7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸(NBD), 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루바이올렛, 브릴리언트(brilliant) 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소나노튜브, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인, 황, 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5) 및 로다민(Rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 금 나노갭입자의 직경은 1 nm 내지 990 nm일 수 있다.
상기 나노갭은 0.01 nm 내지 100 nm일 수 있다.
상기 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물은 라만 분광법을 이용하여 사스 코로나바이러스 2를 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 라만 분광법은 표면 증강 라만 분광법(SERS), 표면증강 공명 라만 분광법(SERRS), 하이퍼-라만 또는 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS)일 수 있다.
또한, 다른 측면에서 본 발명은 상기 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증(COVID-19) 진단키트를 제공한다.
또한, 다른 측면에서 본 발명은 생체 시료와, 상기 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 반응시킨 후 라만 분광법을 이용하여 사스 코로나바이러스 2를 검출하는 단계를 포함하는 사스 코로나바이러스 2의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물은 두께가 균일한 나노갭 및 라만 활성분자에 대해 넓은 표면적을 갖는 금 나노갭입자를 포함하여, 매우 증폭된 라만 신호를 획득할 수 있으며, 이중 프로브를 사용하므로 목표(바이러스) 유전체와의 결합 특이도가 높고, 재현성이 높아 사스 코로나바이러스 2를 효과적으로 검출하고, 사스 코로나바이러스 2 감염증을 진단할 수 있다.
또한, 유전체 증폭기술을 사용하지 않고, 고감염성 신·변종 바이러스를 핵산 분리된 유전체 상태에서 고민감도·고신뢰도로 정성·정량 측정할 수 있어 라만 광학 기반 현장진단용 체외진단기기에 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노갭입자의 제조방법(A) 및 투과전자현미경(TEM) 사진(B)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노갭입자의 나노갭과 쉘 두께 측정 그래프(A) 및 SERS 스펙트럼(B)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 고정된 금 나노갭입자와 농도별 SARS-CoV-2 바이러스 spike 단백질을 반응시킨 SERS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은, 금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 제공하며, 상기 금 나노갭입자는 금 코어 및 상기 금 코어를 둘러싼 금 쉘을 포함하고, 상기 금 코어와 상기 금 쉘 사이에 나노갭이 형성되며, 상기 금 쉘의 표면에 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어 “코어”란, 그 표면에 올리고펩타이드가 직접 결합되어 있는 금 입자로서, 지름이 1 nm 내지 900 nm인 구형 또는 구형과 유사한 형태의 입자를 의미한다.
또한, 본 발명에서 용어 “쉘”이란 상기 코어를 둘러싸고 있는 금 코팅층으로서, 코어 표면에 결합되어 있는 올리고펩타이드의 일부가 쉘의 내부에 위치한다. 상기 쉘의 두께는 0.1 내지 900 nm이며, 바람직하게는 1 nm 내지 100 nm일 수 있다. 상기 코어와 쉘 사이에는 나노갭이 형성되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “나노갭”은, 상기 코어와 쉘 사이에 형성되어 있는 공간을 의미한다. 나노갭의 두께는 0.01 nm 내지 100 nm인 것이 바람직하다. 상기 나노갭에 의하여 코어와 쉘이 구분될 수 있고, 상기 나노갭에 의하여 코어와 쉘이 완전히 접촉되지 않을 수도 있으며, 일부 영역에서는 코어와 쉘이 나노브릿지에 의하여 접촉되어 있을 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 “나노갭”이 반드시 코어와 쉘 사이를 완전하게 분리하는 공간을 의미하는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “나노브릿지”는, 직경이 0.5 nm 내지 20 nm인 상기 코어와 쉘을 연결하는 나노갭에 존재하는 브릿지를 의미한다. 본 발명의 금 나노갭입자는 코어와 쉘 사이에 “나노브릿지 된 나노갭” 또는 “나노브릿지가 없는 나노갭”을 포함할 수 있다.
특히, 상기 코어와 쉘이 일부 영역에서 접촉되어 있는 경우에는, 나노브릿지를 통하여 접촉된다. 즉, 코어 상에 쉘이 형성될 경우 코어 표면 전체로부터 쉘 사이에 나노갭이 형성되나, 일부 영역에서 쉘을 형성하는 물질 일부가 내부로 나노브릿지를 형성하여 코어와 접촉되는 구조를 가질 수 있다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 쉘이 형성되는 과정에서 일부가 코어 쪽으로 형성될 수 있으며, 이에 의하여 나노브릿지가 형성될 수 있다. 나노브릿지의 갯수는 하나 이상부터 나노갭을 형성할 수 있는 한도 내에서 제한되지 않는다. 나노브릿지는 코어와 쉘의 구조를 더욱 안정적으로 유지할 수 있도록 하며, SERS의 신호를 더욱 증가시키는 한 요소가 될 수 있다.
상기 나노갭에 의하여 코어와 쉘 사이에 공간이 형성되어 있고, 이러한 나노갭에 의하여 라만 신호의 증폭이 가능하며, 이에 따라 본 발명에 따른 금 나노갭입자를 이용하여 증폭된 라만 신호의 검출이 가능하다. 특히, 나노갭의 재현성이 매우 높을 뿐만 아니라 라만 신호(surface-enhanced Raman scattering, SERS)를 얻을 경우 신호의 정량성, 결과의 재현성, 합성의 편이성 및 간편성, 비용, 프로브의 안정성 등이 획기적으로 개선될 수 있다.
본 발명에 따른 나노브릿지된 금 나노갭입자는 넓은 표면적을 갖는 고정적이고 균일한 갭을 제공한다(도 1a). 이러한 단일 내부-갭 구조에서, 코어의 표면 전체가 SERS 강화를 위해 사용될 수 있으며, 라만 활성분자의 위치 또한 정확하게 구조 내부에 위치시킬 수 있다. 나아가 실제 사용에 있어서도, 합성 수율이 높을 뿐만 아니라 간단한 방법으로 합성할 수 있다. 또한, 일부 영역에서는 나노브릿지가 형성되어 코어와 쉘이 연결되어 있는바, 전체 금 나노갭입자의 구조를 더욱 안정적으로 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 나노갭은, 코어 상에 올리고펩타이드가 결합되고, 올리고펩타이드가 결합된 코어 상에 쉘이 형성됨으로써 형성될 수 있다. 즉, 코어와 쉘 사이에 올리고펩타이드가 존재하여 코어와 쉘의 완전한 접촉을 차단할 수 있고, 이에 따라 차단된 공간이 나노갭으로 형성될 수 있다.
상기 금 나노갭입자 코어의 표면에는, 올리고펩타이드가 정전기적 인력 또는 공유결합으로 부착될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 금 나노갭입자 코어의 표면에는 올리고펩타이드의 한쪽 말단이 개질되고, 상기 올리고펩타이드의 일부는 상기 쉘에 삽입된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “올리고펩타이드”는, 적은 수의 펩타이드로 구성된 중합체로, 일반적으로 화학적 합성이 가능한 짧은 펩타이드 사슬을 의미하며, 본 발명에 따른 금 나노갭입자를 합성하는데 중요한 역할을 한다. 구체적으로, 코어 주위에 쉘을 형성할 경우, 올리고펩타이드로 인하여 쉘이 완전히 코어와 접촉하지 못하여 나노갭을 형성할 수 있다.
또한, 코어의 표면에 개질된 올리고펩타이드는 라만 활성분자가 위치하는 라만 활성분자-개질 플랫폼 역할을 할 수 있다. 즉, 라만 활성분자를 올리고펩타이드에 결합시킴으로써, 코어의 표면, 나노갭, 또는 쉘 내부에 위치하도록 할 수 있으며, 그 위치 및 갯수 또한 정확하게 조절할 수 있다.
본 발명에서는, 상기 올리고펩타이드의 예로서, Alanine5(A5)-cystein, Serine5(S5)-cytein, Threonine5(Y5)-cystein, Tyrosine5(T5)-cystein을 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 금 나노갭입자는 나노갭 내부에 라만 신호를 측정하기 위한 라만 활성분자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “라만 활성분자”는, 본 발명의 금 나노갭입자가 하나 이상의 분석물에 부착되었을 때 라만 검출 장치에 의한 분석물의 검출 및 측정을 용이하게 하는 물질을 의미한다. 라만 분광법에 사용될 수 있는 라만 활성분자는 유기 원자, 분자 또는 무기 원자, 분자 등을 포함한다. 구체적으로, 라만 활성분자의 예로서, 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein; 6-FAM), Dabcyl, 테트라메틸 로다민 아이소티올(TRIT), 7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸(NBD), 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루바이올렛, 브릴리언트(brilliant) 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소나노튜브, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인, 황, 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5) 및 로다민(Rhodamine) 등이 있으나 이에 제한되지 않으며, 사용된 라만 활성분자가 뚜렷한 라만 스펙트럼을 나타내어야 하고, 서로 다른 유형의 분석물과 특히 결합하거나 연관될 수 있어야 한다. 바람직하게는 라만 분석 시 사용하는 여기 레이저 파장과 공명하여 더욱 높은 라만 신호 세기를 나타내는 분자들이다.
상기 라만 활성분자는 나노갭에 포함될 수 있는데, 올리고펩타이드에 공유결합 또는 정전기적 인력으로 개질되어 내부-나노갭에 위치하거나, 또는 올리고펩타이드와는 별개로 코어 입자의 표면에 라만 활성분자를 공유결합 또는 정전기적 인력으로 결합시킬 수 있다. 올리고펩타이드에 라만 활성분자를 개질시킬 경우, 라만 활성분자의 위치를 조절할 수 있다. 즉, 코어에 개질되는 올리고펩타이드 말단에 가까운 위치에 라만 활성분자를 개질할 경우, 나노입자에서 라만 활성분자는 코어에 가깝게 위치할 수 있으며, 이를 조절하여 라만 활성분자를 나노갭에 위치시키는 것이 가능하다. 예컨대, 라만 활성분자의 위치에 따라 라만 신호가 달라질 수 있으며, 내부-갭에 위치할 경우, 라만 신호가 가장 강하게 검출될 수 있고, 높은 균일성과 재현성 있는 신호를 발생시킬 수 있다.
올리고펩타이드와 별개로 라만 활성분자를 코어 표면에 결합시킬 경우, 라만 활성분자의 부착량을 극대화할 수 있는 특징이 있다.
본 발명에 따른 금 나노갭입자의 직경은 1 nm 내지 990 nm인 것이 바람직하며, 20 nm 내지 500 nm인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 금 나노갭입자의 쉘 상에 다시금 나노입자 및 쉘을 형성할 수 있으며, 이에 따라 금 나노갭입자 내부에 나노갭이 복수의 층으로 존재하는 금 나노갭입자의 형성이 가능하며, 이의 형성방법은 상기 나노갭 및 쉘의 형성 방법을 반복하는 것으로 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 금 나노갭입자는 바이오분자를 결합시켜 금 나노갭입자의 특성을 향상시킬 수 있다. 예컨대, 목표(바이러스) 유전체 서열의 상보적 프로브를 두 개로 제작한 후 한쪽 프로브를 금 나노갭입자의 쉘 코딩 표면에 부착시켜 내부 나노갭(intra-nanogap)을 형성하고, 프로브 중 다른 한 부분을 마그네틱 비드(magnetic bead) 표면에 붙여서 목표(바이러스) 유전체 서열과 교합시켜 유전체 나노브리지(nano bridge)를 형성한다. 강력한 마그네틱 바로 마그네틱 비드를 걸러내어 라만 신호를 측정할 수 있으며, 목표 유전체와 교합이 이루어지면 금 나노갭입자의 나노갭에서 라만 활성분자의 강력한 라만 신호 발생을 감지할 수 있으므로 목표(바이러스) 유전체의 유무 판정에 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물은 금 나노갭입자의 나노갭으로 증폭된 라만 신호를 획득할 수 있으며, 마그네틱 비드 방식으로 액체 시료 내 여러 가지 혼합물 속에서 목표(바이러스) 유전체만 걸러내므로 시료에 대한 고순도 정제 또는 농축 전처리 과정이 결과에 크게 영향을 주지 않는다. 또한, 이중 프로브를 사용하므로 목표(바이러스) 유전체와의 결합 특이도가 높다.
본 발명에 따른 금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물은 라만 분광법을 이용하여 사스 코로나바이러스 2를 검출할 수 있다.
상기 라만 분광법은 표면 증강 라만 분광법(SERS), 표면증강 공명 라만 분광법(SERRS), 하이퍼-라만 또는 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS)일 수 있다.
본 발명에서, 용어 “표면 증강 라만 산란법(SERS)”이란, 거칠게 처리된 특정금속 표면에 흡착되어 있거나 수백 나노미터 이내의 거리에 위치해 있을 때 발생되는 라만 산란의 일종으로 이때 라만 산란의 세기는 일반 라만의 세기와 비교하여 106~108배 이상 증가되는 현상을 이용한 분광법을 말한다.
본 발명에서, 용어 “표면 증강 공명라만 분광법(SERRS)”이란, SERS 활성 표면에서의 흡착물에 대한 레이저 여기 파장의 공명 현상을 이용한 분광법을 말한다.
본 발명에서, 용어 “비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS)”이란, 라만 활성 매질에 고정가변의 두 레이저 광을 입사시키고, 이들의 결합에 의해 얻어지는 반(反) 스토크스 방사의 스펙트럼을 측정하는 분광법을 말한다.
이러한 실시양태에서, 라만 활성 기판은 하나 이상의 라만 검출 단위장치와 작동가능하게 결합될 수 있다. 라만 분광법에 의한 분석물의 검출을 위한 여러 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, 미국특허 제6,002,471호, 제6,040,191호, 제6,149,868호, 제6,174,677호, 제6,313,914호). SERS 및 SERRS에서, 라만 검출의 감도는 거친 금속 표면, 예컨대 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 표면 상에 흡수된 분자에 대해 106 이상으로 증강된다.
라만 검출 장치의 비제한적인 예는 미국특허 제6,002,471호에 개시되어 있다. 여기 빔은 532 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Nd:YAG 레이저 또는 365 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Ti:사파이어 레이저에 의해 생성된다. 펄스 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔이 사용될 수 있다. 여기 빔은 공초점의 광학기 및 현미경 렌즈를 통과하여 하나 이상의 분석물을 함유하는 라만 활성 기판 상으로 초점이 모아진다. 분석물로부터의 라만 방출 광은 현미경 렌즈 및 공초점 광학기에 의해 모아지고 스펙트럼 분리를 위해 단색광장치와 결합된다. 공초점 광학기로는 배경신호를 감소시키기 위한 다이크로익 필터(dichroic filter), 차단 필터, 공초점 핀홀, 대물렌즈 및 거울의 조합을 포함한다. 공초점 광학기 뿐만 아니라 표준 풀 필드(full field) 광학기도 사용될 수 있다. 라만 방출 신호는 신호를 카운팅하고 디지털화하는 컴퓨터와 인터페이스로 연결된 사태형 광다이오드를 포함하는 라만 검출기에 의해 검출된다.
검출 장치의 또다른 예는 미국특허 제5,306,403호에 개시되어 있으며, 이로는 단광자 카운팅 방식으로 작동하는 갈륨-비소 광전자증배관(RCA Model C31034 또는 Burle Industries Model C3103402)이 구비된 스펙스 모델(Spex Model) 1403 이중 격자 분광계를 들 수 있다. 여기화 공급원은 스펙트라피직스(SpectraPhysics), 모델 166으로부터의 514.5 nm 선 아르곤-이온 레이저 및 크립턴(krypton)-이온 레이저(Innova 70, 비간섭성)의 647.1 nm 선을 포함한다.
다른 여기화 공급원으로는 337 nm에서의 질소 레이저(레이저 사이언스 인코포레이티드(Laser Science Inc.) 및 325 nm에서의 헬륨-카드뮴 레이저(라이코녹스(Liconox)(미국특허 제6,174,677호), 발광 다이오드, Nd:YLF 레이저, 및/또는 다양한 이온 레이저 및/또는 염료 레이저를 포함한다. 여기 빔은 밴드패스 필터(Corion)에 의해 스펙트럼으로 정제되어 6× 대물 렌즈(Newport, Model L6X)를 이용하는 라만 활성 기판 상에 초점화될 수 있다. 대물 렌즈는 홀로그래피 빔 스플리터(Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18)를 이용하여 분석물을 여기시키고 라만 신호를 수집하여 여기 빔 및 방출된 라만 신호에 대한 직각 형태를 만드는데 모두 사용될 수 있다. 홀로그래피 노치 필터(Kaiser Optical Systems, Inc.)는 레이라이(Rayleigh) 산란 방사선을 감소시키는데 사용될 수 있다. 다른 라만 검출기로는 적색 증강된 고감도 전하 결합 소자(RE-ICCD) 검출 시스템(Princeton Instruments)이 장착된 ISA HR-320 분광기를 포함한다. 푸리에 변환 분광기(마이컬슨 간섭계에 기초함), 하전된 주입 장치, 광다이오드 어레이, InCaAs 검출기, 전자증배 CCD, 고감도 CCD 및/또는 광트랜지스터 어레이 등 다른 유형의 검출기가 사용될 수 있다.
당해 분야에 공지된 임의의 적절한 형태 또는 구성의 라만 분광법 또는 관련기법이 분석물 검출에 사용될 수 있으며, 이로는 노말 라만 스캐터링, 공명 라만 스캐터링, 표면 증강 라만 스캐터링, 표면 증강 공명 라만 스캐터링, 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS), 자극 라만 스캐터링, 역 라만 분광법, 자극 게인 라만 분광법, 하이퍼-라만 스캐터링, 분자 광학 레이저 시험기(molecular optical laser examiner, MOLE) 또는 라만 마이크로탐침 또는 라만 현미경법 또는 공초점 라만 마이크로분광기, 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광법, 시간 분해 공명 라만, 라만 해리 분광법 또는 UV-라만 현미경법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 라만 검출 장치는 컴퓨터와 작동가능하게 결합될 수 있다. 검출 장치로부터의 데이터는 프로세서에 의해 처리되고 데이터는 주 기억장치에 저장될 수 있다. 표준 분석물에 대한 방출 프로파일 상의 데이터는 또한 주기억 장치 또는 ROM에 저장될 수 있다. 프로세서는 라만 활성 기판에서의 분석물로부터의 방출 스펙트럼을 비교하여 샘플의 분석물 유형을 확인할 수 있다. 프로세서는 검출 장치로부터의 데이터를 분석하여 여러 분석물의 정체 및/또는 농도를 측정할 수 있다. 서로 다르게 구비된 컴퓨터는 특정 이행에 사용될 수 있다. 따라서, 시스템의 구조는 본 발명의 상이한 실시양태에서 다를 수 있다. 데이터 수집작업 이후, 전형적으로 데이터는 데이터 분석 작업으로 보내질 것이다. 분석 작업을 용이하게 하기 위해, 검출 장치에 의해 수득된 데이터는 상기한 바와 같이 디지털 컴퓨터를 사용하여 전형적으로 분석할 것이다. 전형적으로, 컴퓨터는 검출장치로부터의 데이터 수용 및 저장 뿐만 아니라 수집된 데이터의 분석 및 보고를 위해적절히 프로그래밍될 것이다.
또한 본 발명은, 본 발명에 따른 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증(COVID-19) 진단키트를 제공한다. 상기 사스 코로나바이러스 2 감염증은 독감, 감기, 인후염, 기관지염 또는 폐렴을 포함하는 것일 수 있으나, 사스 코로나바이러스 2 감염으로 인해 발생하는 질환이라면 이에 한정되는 것은 아니다.
이러한 진단키트에는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구, 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 금 나노갭입자의 표면에는 다른 신호를 나타낼 수 있는 물질을 금 나노갭입자의 내부 또는 외부에 포함할 수 있으며, 예컨대 CT 조영제, MRI 조영제, 광학 조영제, 초음파 조영제 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 이에 따라 금 나노갭입자에 의한 라만 분석과 함께 CT, MRI, 광학 또는 초음파 분석을 동시에 할 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명에 따른 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 생체시료와 반응시킨 후 라만 분광법을 이용하여 사스 코로나바이러스 2를 검출하는 단계를 포함하는 사스 코로나바이러스 2의 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드-금 나노갭입자(peptide-AuNNP) 제조
20 nm citrate-AuNP 표면에 각각 Alanine5(A5)-cystein, Serine5(S5)-cytein, Threonine5(Y5)-cystein, Tyrosine5(T5)-cystein의 반복서열을 갖는 올리고펩타이드를 첨가하여 하루 동안 상온에서 반응시킨 후, 라만 신호전달 분자인 4,4'-디피리딜(4,4'-dipyridyl; 4,4'-DP)을 일주일간 첨가하여 라만 염료로 개질된 올리고펩타이드-AuNP를 합성하였다. 올리고펩타이드-AuNP (100 μL, 1 nM)에 100 mM 포스페이트-버퍼 용액(phosphate-buffered solution; PB; pH 7.4), 2 M NaCl, 1% 폴리-N-비닐-2-피롤리돈(poly-N-vinyl-2-pyrrolidone; PVP; MW 40,000)을 첨가하여 적절한 금 쉘 형성 환경을 만들었다(최종 농도; 10 mM PB; 0.3 M NaCl; pH 7.4; 0.5% PVP). 환원제로 30.4 μL의 10 mM NH2OH·HCl을 첨가 및 30.4 μL의 5 mM 금 전구체(gold precursor; HAuCl4)를 첨가하고 상온에서 30분간 gentle vortexing하여 Au 쉘을 성장시켜 펩타이드-금 나노갭입자(peptide-AuNNP)를 제조하였다(도 1A). 상세하게는, 반응물이 첨가될수록 더 작은 돌기(budding sphere)가 나타나기 시작하여 올리고펩타이드가 개질된 금 표면에 옆으로 형성되었다. 점진적으로 쉘과 같은 구조가 형성되었으며, 이러한 과정에서 나노갭이 관찰되었다(도 1B).
형성된 펩타이드-금 나노갭입자(peptide-AuNNP) 표면에 Abcamⓡ 사의 ‘Gold conjugation kit’ 의 버퍼용액을 이용하여 항체를 고정시켰다.
비교예 1. DNA-금 나노갭입자 제조(DNA-AuNNP)
DNA가 개질된 금 나노입자(20 nm; DNA 서열: 3′-HS-(CH2)3-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5′)를 'S. J. Hurst, A. K. R. Lytton-Jean, C. A. Mirkin, Anal. Chem. 78, 8313 (2006)'의 문헌에 따라 제조하였고, 라만 신호전달 분자인 4,4'-디피리딜(4,4'-dipyridyl; 4,4'-DP)을 일주일간 첨가하여 라만 염료로 개질된 DNA-AuNP를 합성하였다. 상기 DNA가 개질된 금 나노입자의 코어를 둘러싼 쉘(Au)을 형성하기 위하여, 상기 DNA가 개질된 금 나노입자를 금 전구체(gold precursor; HAuCl4), 환원제(NH2OH-HCl) 및 1% 폴리-N-비닐-2-피롤리돈(poly-N-vinyl-2-pyrrolidone; PVP; MW 40,000)과 포스페이트-버퍼 용액(phosphate-buffered solution; 0.3 M NaCl; 10 mM PB; pH 7.4)에서 반응시키고, 상온에서 30분간 gentle vortexing하였다. 쉘의 형성과정에 따른 나노입자의 형태변화를 확인하기 위하여, 시드(seeds; DNA가 개질된 금 나노입자, 1 nM)의 양을 기준으로 하여, 금 전구체(gold precursor; HAuCl4), 환원제(NH2OH-HCl)의 양을 조절하였다.
구체적으로, DNA가 개질된 금 나노입자 용액(100 μL; 0.3 M PBS에서 1 nM 농도)은, 50 μL의 1% PVP 용액과 혼합하였다. 상기 용액을 30.4 μL의 하이드록시아민 하이드로클로라이드 용액(hydroxylamine hydrochloride solution; 10 mM)과 혼합시킨 후, 30.4 μL의 클로로아우릭 산 용액(chloroauric acid solution; 5 mM)과 혼합시켰다. 반응 결과, DNA-금 나노갭입자(DNA-AuNNP)가 형성되었다.
실시예 2. 금 나노갭입자의 농도에 따른 라만 신호 분석
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 금 나노갭입자 용액을 나이트로셀룰로스(NC membrane) 표면에 dotting하여 라만(spectrometer, CCD, 660 nm laser) 신호를 측정하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 올리고펩타이드로 Serine5(S5)-cytein 및 Alanine5(A5)-cystein을 사용한 금 나노갭입자의 라만 신호 세기가 가장 강하게 보임을확인할 수 있으며, 올리고뉴클레오티드로 개질된 금 나노갭입자에 비해 더 우수한 라만 신호 세기를 나타냄을 알 수 있다.
실시예 3. 펩타이드-금 나노갭입자를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 검출
상기 실시예 1에서 제조된 항체 고정된 금 나노갭입자(Serine5-peptide AuNNP)에 SARS-CoV-2 바이러스 spike 단백질을 농도별로 혼합하여 반응시킨 결과, 도 3을 참조하면, control dot은 희미하게 보이는 반면, test dot은 높은 라만 신호를 가짐에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 농도 7.9 ng에서부터 농도의존적으로 선명하게 보이는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드로 개질된 금 나노갭입자가 안정적인 SERS 신호를 나타내고, 매우 높은 감도 및 정량적인 SERS 스펙트럼을 나타냄을 확인할 수 있으며, 이를 SARS-CoV-2 바이러스 검출에 활용한 결과, 우수한 검출 결과를 나타냄을 알 수 있었다.
이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 금 나노갭입자를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물에 있어서,
    상기 금 나노갭입자는 금 코어 및 상기 금 코어를 둘러싼 금 쉘을 포함하고,
    상기 금 코어와 상기 금 쉘 사이에 나노갭이 형성되며,
    상기 금 쉘의 표면에 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  2. 제1항에 있어서, 상기 코어와 쉘이 나노브릿지로 연결된 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  3. 제1항에 있어서, 상기 코어의 표면에 올리고펩타이드가 정전기적 인력으로 부착된 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  4. 제3항에 있어서, 상기 코어의 표면에 상기 올리고펩타이드의 한쪽 말단이 공유결합으로 부착되고, 상기 올리고펩타이드의 일부는 상기 쉘에 삽입된 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  5. 제3항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 S-S-S-S-S-C, A-A-A-A-A-C, Y-Y-Y-Y-Y-C 및 T-T-T-T-T-C 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  6. 제3항에 있어서, 상기 올리고펩타이드에 라만 활성분자가 정전기적 인력 또는 공유결합으로 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  7. 제6항에 있어서, 상기 라만 활성분자는 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein; 6-FAM), Dabcyl, 테트라메틸 로다민 아이소티올(TRIT), 7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸(NBD), 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루바이올렛, 브릴리언트(brilliant) 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소나노튜브, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인, 황, 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5) 및 로다민(Rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  8. 제1항에 있어서, 상기 금 나노갭입자의 직경은 1 nm 내지 990 nm인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노갭은 0.01 nm 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 라만 분광법을 이용하여 사스 코로나바이러스 2를 검출하는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  11. 제10항에 있어서, 상기 라만 분광법은 표면 증강 라만 분광법(SERS), 표면증강 공명 라만 분광법(SERRS), 하이퍼-라만 또는 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS)인 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증(COVID-19) 진단키트
  13. 생체 시료와, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 반응시킨 후 라만 분광법을 이용하여 사스 코로나바이러스 2를 검출하는 단계를 포함하는 사스 코로나바이러스 2의 검출방법
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