JP2001269198A - 多型遺伝子の型を決定する方法 - Google Patents
多型遺伝子の型を決定する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、ポリヌクレオチド中に含まれる多型
部位の多型配列を迅速且つ簡便に決定する方法を提供す
ることを目的とする。 【解決手段】前記課題を解決するために、本発明は、ポ
リヌクレオチド中に含まれる多型部位の型を決定する方
法であって、前記ポリヌクレオチド中に含まれ得る多型
配列に結合し得る１種類以上のプローブと前記ポリヌク
レオチドとを混合する工程と、共焦点顕微鏡を用いて、
微小空間内に存在する前記ポリヌクレオチドを検出する
工程と、蛍光相関分析法を用いて検出結果を解析して、
前記ポリヌクレオチドに結合したプローブの種類を決定
することにより、前記多型部位の型を決定する工程とを
具備する方法を提供する。
部位の多型配列を迅速且つ簡便に決定する方法を提供す
ることを目的とする。 【解決手段】前記課題を解決するために、本発明は、ポ
リヌクレオチド中に含まれる多型部位の型を決定する方
法であって、前記ポリヌクレオチド中に含まれ得る多型
配列に結合し得る１種類以上のプローブと前記ポリヌク
レオチドとを混合する工程と、共焦点顕微鏡を用いて、
微小空間内に存在する前記ポリヌクレオチドを検出する
工程と、蛍光相関分析法を用いて検出結果を解析して、
前記ポリヌクレオチドに結合したプローブの種類を決定
することにより、前記多型部位の型を決定する工程とを
具備する方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリヌクレオチド
中の多型配列を決定するための方法に関する。
中の多型配列を決定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年のゲノムサイエンスの進展により、
特定の疾病と遺伝子の多型との関連が急速に明らかにな
りつつあるため、遺伝子の多型分析は、遺伝的疾患を診
断する上で極めて有用となるものと期待されている。ヒ
トの場合、各個体のゲノムDNAの同一性は99%を超え、ヒ
トの多型遺伝子には、ごく僅かな塩基配列の相違が存在
するにすぎないため、ヒトの多型分析としては、単ヌク
レオチド多型（SNP；Single Nucleotide Polymorphis
m）の分析が特に注目されている。
特定の疾病と遺伝子の多型との関連が急速に明らかにな
りつつあるため、遺伝子の多型分析は、遺伝的疾患を診
断する上で極めて有用となるものと期待されている。ヒ
トの場合、各個体のゲノムDNAの同一性は99%を超え、ヒ
トの多型遺伝子には、ごく僅かな塩基配列の相違が存在
するにすぎないため、ヒトの多型分析としては、単ヌク
レオチド多型（SNP；Single Nucleotide Polymorphis
m）の分析が特に注目されている。
【０００３】現在、遺伝子の多型分析法としては、血清
学的な方法とDNAを用いた方法が主に使用されている
が、後者は前者に比べて判定に試験者の熟練を要さず、
検査工程の自動化が可能であるという利点を有してい
る。
学的な方法とDNAを用いた方法が主に使用されている
が、後者は前者に比べて判定に試験者の熟練を要さず、
検査工程の自動化が可能であるという利点を有してい
る。
【０００４】DNAを用いた方法にも種々の変法がある
が、その多くは、PCRによる増幅、標識されたプローブ
と増幅産物とのハイブリダイゼーション、標識物質の検
出等の周知技術を組み合わせたものである。
が、その多くは、PCRによる増幅、標識されたプローブ
と増幅産物とのハイブリダイゼーション、標識物質の検
出等の周知技術を組み合わせたものである。
【０００５】これらの方法は、血清学的方法と比べれ
ば、操作が比較的容易であるが、なお、 (1)PCRによる増幅操作、洗浄操作、及び電気泳動等の複
数の複雑な操作が必要であるため分析に長時間を要す
る； (2)マイクロタイタープレート等に固相したプローブを
用いて多型分析を行う場合、分析すべき遺伝子の多型性
が高度であれば、多量の検体及び試薬が必要となるのみ
ならず、同時測定可能な項目の数が限られる； (3)残存標識物質によるバックグラウンドの上昇や非特
異的反応のため精度が十分でない； (4)検査コストが高い； 等の欠点を有している。
ば、操作が比較的容易であるが、なお、 (1)PCRによる増幅操作、洗浄操作、及び電気泳動等の複
数の複雑な操作が必要であるため分析に長時間を要す
る； (2)マイクロタイタープレート等に固相したプローブを
用いて多型分析を行う場合、分析すべき遺伝子の多型性
が高度であれば、多量の検体及び試薬が必要となるのみ
ならず、同時測定可能な項目の数が限られる； (3)残存標識物質によるバックグラウンドの上昇や非特
異的反応のため精度が十分でない； (4)検査コストが高い； 等の欠点を有している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来技術に
存する上記課題を解決するためになされたものであっ
て、極めて多数の多型配列を迅速且つ簡便に決定する方
法を提供することを目的とする。
存する上記課題を解決するためになされたものであっ
て、極めて多数の多型配列を迅速且つ簡便に決定する方
法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明は、ポリヌクレオチド中に含まれる多型部位
の塩基配列が多型配列PS１〜PSｎ（nは2以上の整数）の
何れであるかを決定する方法であって、前記ポリヌクレ
オチドを含む検体を準備する工程と、検出可能な標識が
ラベルされた核酸プローブPR1〜PRnであって、前記多型
配列PS１〜PSnと特異的に結合し得る核酸プローブPR１
〜PRｎと前記検体とを混合することにより、前記核酸プ
ローブPR１〜PRｎを前記ポリヌクレオチドに結合せしめ
る工程と、微小空間内に存在する前記核酸プローブPR１
〜PRｎを検出する工程と、検出結果を解析して、PR１〜
PRｎのうちの何れが前記ポリヌクレオチドに結合したか
を決定することにより、前記多型部位の塩基配列が多型
配列PS１〜PSｎの何れであるかを決定する工程とを具備
する方法を提供する。
に、本発明は、ポリヌクレオチド中に含まれる多型部位
の塩基配列が多型配列PS１〜PSｎ（nは2以上の整数）の
何れであるかを決定する方法であって、前記ポリヌクレ
オチドを含む検体を準備する工程と、検出可能な標識が
ラベルされた核酸プローブPR1〜PRnであって、前記多型
配列PS１〜PSnと特異的に結合し得る核酸プローブPR１
〜PRｎと前記検体とを混合することにより、前記核酸プ
ローブPR１〜PRｎを前記ポリヌクレオチドに結合せしめ
る工程と、微小空間内に存在する前記核酸プローブPR１
〜PRｎを検出する工程と、検出結果を解析して、PR１〜
PRｎのうちの何れが前記ポリヌクレオチドに結合したか
を決定することにより、前記多型部位の塩基配列が多型
配列PS１〜PSｎの何れであるかを決定する工程とを具備
する方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明は、所定のポリヌクレオチ
ド、最も典型的には多型遺伝子中に含まれる多型部位の
塩基配列を迅速且つ簡便に決定する方法を提供する。
ド、最も典型的には多型遺伝子中に含まれる多型部位の
塩基配列を迅速且つ簡便に決定する方法を提供する。
【０００９】本明細書において、「多型遺伝子」とは、
一つの遺伝子座を占める複数種の対立遺伝子群、又はこ
のような対立遺伝子群に属する個々の対立遺伝子を指称
するものとする。
一つの遺伝子座を占める複数種の対立遺伝子群、又はこ
のような対立遺伝子群に属する個々の対立遺伝子を指称
するものとする。
【００１０】「多型部位」とは、各多型遺伝子間で塩基
配列が異なる部位をいう。例えば、多型遺伝子A1の塩基
配列がAAA TTT CCC GGGであり、多型遺伝子A2の塩基配
列がAAA TTT AGT GGGである場合には、斜字体で示され
ている部位が多型部位に該当する。多型部位の中で、１
塩基のみが異なるものは、特に「単ヌクレオチド多型」
と指称するものとする。
配列が異なる部位をいう。例えば、多型遺伝子A1の塩基
配列がAAA TTT CCC GGGであり、多型遺伝子A2の塩基配
列がAAA TTT AGT GGGである場合には、斜字体で示され
ている部位が多型部位に該当する。多型部位の中で、１
塩基のみが異なるものは、特に「単ヌクレオチド多型」
と指称するものとする。
【００１１】また、「多型配列」とは、多型部位に含ま
れる塩基配列を意味する（上記事例では、斜字体で示さ
れている塩基配列）。
れる塩基配列を意味する（上記事例では、斜字体で示さ
れている塩基配列）。
【００１２】本発明の方法は、任意の多型遺伝子の多型
部位に含まれる塩基配列を明らかにするために、すなわ
ち多型遺伝子の型を決定するために用いることができ
る。
部位に含まれる塩基配列を明らかにするために、すなわ
ち多型遺伝子の型を決定するために用いることができ
る。
【００１３】なお、以下では、本発明の方法を適用すべ
き多型遺伝子（以下標的多型遺伝子と称する）の多型部
位中に含まれることが知られている多型配列をPS１〜PS
ｎ（nは２以上の整数）と表記するものとする。例え
ば、上記事例においては、PS1はCCCであり、PS2はAGTで
ある。
き多型遺伝子（以下標的多型遺伝子と称する）の多型部
位中に含まれることが知られている多型配列をPS１〜PS
ｎ（nは２以上の整数）と表記するものとする。例え
ば、上記事例においては、PS1はCCCであり、PS2はAGTで
ある。
【００１４】本発明の方法を用いれば、極めて迅速に多
型部位の型を決定できるので、本発明の方法は、多数の
多型部位を含有する多型遺伝子や多種類の多型からなる
多型部位を含む多型遺伝子に適用できる。このような遺
伝子としては、ヒト白血球抗原（以下HLAと称する）を
含む主要組織適合抗原を挙げることができるが、これに
限定されない。
型部位の型を決定できるので、本発明の方法は、多数の
多型部位を含有する多型遺伝子や多種類の多型からなる
多型部位を含む多型遺伝子に適用できる。このような遺
伝子としては、ヒト白血球抗原（以下HLAと称する）を
含む主要組織適合抗原を挙げることができるが、これに
限定されない。
【００１５】本発明の方法によって、多型遺伝子の多型
部位の型を決定するためには、まず、標的多型遺伝子を
含む検体を準備する。本発明の方法をヒトに適用する場
合、典型的には、検体は血液、骨髄液、脳脊髄液等を含
む体液であり得るが、これらに限定されない。
部位の型を決定するためには、まず、標的多型遺伝子を
含む検体を準備する。本発明の方法をヒトに適用する場
合、典型的には、検体は血液、骨髄液、脳脊髄液等を含
む体液であり得るが、これらに限定されない。
【００１６】本発明の方法は感度が高いので、従来法の
ように、検体を準備した後にPCR増幅する操作は省略す
ることができるが、標的多型遺伝子が特に少量であれ
ば、PCR増幅を行ってもよい。標的多型遺伝子をPCR増幅
する場合には、型を決定すべき多型部位を挟むようにプ
ライマー対を選択しなければならない。
ように、検体を準備した後にPCR増幅する操作は省略す
ることができるが、標的多型遺伝子が特に少量であれ
ば、PCR増幅を行ってもよい。標的多型遺伝子をPCR増幅
する場合には、型を決定すべき多型部位を挟むようにプ
ライマー対を選択しなければならない。
【００１７】続いて、多型配列PS１〜PSｎと相補的な塩
基配列を含む核酸プローブPR１〜PR ｎ（nは２以上の整
数）を、前記検体と混合する。核酸プローブPR1は、多
型配列PS１と相補的な塩基配列を含むので、標的多型遺
伝子の型がPS1の場合には、核酸プローブPR1のみが標的
多型遺伝子と結合し得る。同様に、標的多型遺伝子の型
がPS2〜PSnの場合には、それぞれ核酸プローブPR2〜PR
ｎが標的多型遺伝子と結合し得る。
基配列を含む核酸プローブPR１〜PR ｎ（nは２以上の整
数）を、前記検体と混合する。核酸プローブPR1は、多
型配列PS１と相補的な塩基配列を含むので、標的多型遺
伝子の型がPS1の場合には、核酸プローブPR1のみが標的
多型遺伝子と結合し得る。同様に、標的多型遺伝子の型
がPS2〜PSnの場合には、それぞれ核酸プローブPR2〜PR
ｎが標的多型遺伝子と結合し得る。
【００１８】標的多型遺伝子に未知の多型配列が存在し
ない限り、該多型遺伝子には、多型配列PS１〜PSｎのう
ちの何れかが含まれるので、該多型遺伝子と核酸プロー
ブPR １〜PRｎとを混合すれば、核酸プローブPR１〜PRｎ
の何れかが該多型遺伝子の多型部位に結合する。
ない限り、該多型遺伝子には、多型配列PS１〜PSｎのう
ちの何れかが含まれるので、該多型遺伝子と核酸プロー
ブPR １〜PRｎとを混合すれば、核酸プローブPR１〜PRｎ
の何れかが該多型遺伝子の多型部位に結合する。
【００１９】核酸プローブPR１〜PRｎには、検出可能な
標識物質、好ましくは蛍光物質又は発光物質が標識され
ているので、核酸プローブが結合した多型遺伝子は、以
下で詳述する検出操作で検出することが可能となる。
標識物質、好ましくは蛍光物質又は発光物質が標識され
ているので、核酸プローブが結合した多型遺伝子は、以
下で詳述する検出操作で検出することが可能となる。
【００２０】各核酸プローブに標識すべき標識物質は、
全て同種であってもよい。しかし、何れの核酸プローブ
が標的多型遺伝子に結合したかを識別できるように、少
なくとも２種類の標識物質を用いることが好ましい。１
種類の標識物質のみを使用する場合には、例えば、各核
酸プローブの長さを変えることによって、何れの核酸プ
ローブが標的多型遺伝子に結合したか識別することがで
きる。
全て同種であってもよい。しかし、何れの核酸プローブ
が標的多型遺伝子に結合したかを識別できるように、少
なくとも２種類の標識物質を用いることが好ましい。１
種類の標識物質のみを使用する場合には、例えば、各核
酸プローブの長さを変えることによって、何れの核酸プ
ローブが標的多型遺伝子に結合したか識別することがで
きる。
【００２１】核酸プローブPR１〜PRｎの何れかを標的多
型遺伝子に結合させた後に、「微小空間」内に存在する
核酸プローブPR１〜PRｎを検出する。
型遺伝子に結合させた後に、「微小空間」内に存在する
核酸プローブPR１〜PRｎを検出する。
【００２２】本明細書において、「微小空間」とは、容
積が10-21L（1nm四方の立方体の体積に相当する）〜10
-3L、典型的には10-18L〜10-9L、最も典型的には10-15L
〜10 -12Lの空間をいう。微小空間の形状は、球状、円錐
状、立方体状、直方体状等任意の形状であり得る。
積が10-21L（1nm四方の立方体の体積に相当する）〜10
-3L、典型的には10-18L〜10-9L、最も典型的には10-15L
〜10 -12Lの空間をいう。微小空間の形状は、球状、円錐
状、立方体状、直方体状等任意の形状であり得る。
【００２３】微小空間内の標的多型遺伝子は、該遺伝子
に結合した核酸プローブの標識を検出することによって
検出される。前述のように、微小空間の容積は極めて小
さいので、該検出は、レーザー光を用いて、顕微鏡視野
下で微小領域内の蛍光発光を検出することが好ましい。
に結合した核酸プローブの標識を検出することによって
検出される。前述のように、微小空間の容積は極めて小
さいので、該検出は、レーザー光を用いて、顕微鏡視野
下で微小領域内の蛍光発光を検出することが好ましい。
【００２４】このような検出は、図1に示すような共焦
点顕微鏡によってなし得る。共焦点顕微鏡自体は、本分
野で公知である。共焦点顕微鏡を用いた検出は、 (1)レーザー光を励起光として照射する； (2)フィルター(IF)を通過させた後、レーザー光を集光
し、ダイクロイックミラー(DM)によって試料中の一点に
レーザー光を照射する； (3)試料中の蛍光物質をレーザー光で励起して蛍光発光
させる； (4)ピンホールを通過させることにより、試料の焦点中
の蛍光物質から発せられた蛍光のみを光増倍管(PMT)で
増幅する (5)増幅した蛍光を検出する ことによってなされる。
点顕微鏡によってなし得る。共焦点顕微鏡自体は、本分
野で公知である。共焦点顕微鏡を用いた検出は、 (1)レーザー光を励起光として照射する； (2)フィルター(IF)を通過させた後、レーザー光を集光
し、ダイクロイックミラー(DM)によって試料中の一点に
レーザー光を照射する； (3)試料中の蛍光物質をレーザー光で励起して蛍光発光
させる； (4)ピンホールを通過させることにより、試料の焦点中
の蛍光物質から発せられた蛍光のみを光増倍管(PMT)で
増幅する (5)増幅した蛍光を検出する ことによってなされる。
【００２５】図では、アルゴンイオンレーザーが例示さ
れているが、蛍光物質の種類に応じて、波長の異なるク
リプトンアルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオンレー
ザー、ヘリウムカドミニウムレーザーも使用できる。ま
た、図１は、典型的な共焦点顕微鏡の模式図にすぎない
ので、図１に記載の共焦点顕微鏡以外のシステムも当然
使用できる。
れているが、蛍光物質の種類に応じて、波長の異なるク
リプトンアルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオンレー
ザー、ヘリウムカドミニウムレーザーも使用できる。ま
た、図１は、典型的な共焦点顕微鏡の模式図にすぎない
ので、図１に記載の共焦点顕微鏡以外のシステムも当然
使用できる。
【００２６】このような検出方法は、微少な一点から発
せられる蛍光のみを検出するので、バックグラウンドが
なく、通常の蛍光検出に比べて、感度が著しく高い。
せられる蛍光のみを検出するので、バックグラウンドが
なく、通常の蛍光検出に比べて、感度が著しく高い。
【００２７】標的多型遺伝子の検出は、一般的にはミリ
秒〜分の単位、最も一般的には秒の単位で行われる。
秒〜分の単位、最も一般的には秒の単位で行われる。
【００２８】検出結果が得られたら、該結果を解析し
て、核酸プローブのうちの何れが標的多型遺伝子に結合
したかを決定する。標的多型遺伝子に結合した核酸プロ
ーブの種類が決定されれば、標的多型遺伝子の型が明ら
かになる。
て、核酸プローブのうちの何れが標的多型遺伝子に結合
したかを決定する。標的多型遺伝子に結合した核酸プロ
ーブの種類が決定されれば、標的多型遺伝子の型が明ら
かになる。
【００２９】検出結果の「解析」は、蛍光相関分析法に
よって行うのが好ましい。ここで、「蛍光相関分析法
（以下FCS）」とは、平均数個、ある場合には１個の蛍
光物質が発する蛍光の強度を一定時間測定した後、ブラ
ウン運動に由来する蛍光のゆらぎの自己相関関数をと
り、該関数の分析によって、蛍光物質に関する種々のデ
ータを取得する方法をいう。FCS自体は公知であり、そ
の詳細は、特願平32017に記載されている。
よって行うのが好ましい。ここで、「蛍光相関分析法
（以下FCS）」とは、平均数個、ある場合には１個の蛍
光物質が発する蛍光の強度を一定時間測定した後、ブラ
ウン運動に由来する蛍光のゆらぎの自己相関関数をと
り、該関数の分析によって、蛍光物質に関する種々のデ
ータを取得する方法をいう。FCS自体は公知であり、そ
の詳細は、特願平32017に記載されている。
【００３０】本発明の方法では、核酸プローブのうち何
れが標的対立遺伝子に結合したかを明らかにするため
に、以下のようにFCSを行う。
れが標的対立遺伝子に結合したかを明らかにするため
に、以下のようにFCSを行う。
【００３１】(1)図２ａ)に示されている微小領域にレー
ザー光を照射する。
ザー光を照射する。
【００３２】(2)該微小領域中に存在する蛍光物質から
発せられる蛍光の蛍光強度を経時的に測定し、図２ｂ）
及び図２ｃ）に示されているようなデータを取得する。
発せられる蛍光の蛍光強度を経時的に測定し、図２ｂ）
及び図２ｃ）に示されているようなデータを取得する。
【００３３】(3)異なる２時点の蛍光強度I(t)とI(t+τ)
の積の期待値を計算し、自己相関関数G(τ)＝<I(t) I(t
+τ)>を得る。
の積の期待値を計算し、自己相関関数G(τ)＝<I(t) I(t
+τ)>を得る。
【００３４】(4)下式１：
【式１】
【００３５】（ここで、Ｎ：蛍光分子の平均数 τfree＝wo2/4Dfree：遊離の核酸プローブの並進拡散時
間 τbound＝wo2/4Dbound：結合した核酸プローブの並進拡
散時間 y=結合した核酸プローブの割合 S=wo/zoである（なお、woは検出領域の径、2zoは領域
長、DfreeとDboundは、それぞれ遊離の核酸プローブ及
び結合した核酸プローブの並進拡散定数である））を用
いて、(3)で得た自己相関関数を解析する。
間 τbound＝wo2/4Dbound：結合した核酸プローブの並進拡
散時間 y=結合した核酸プローブの割合 S=wo/zoである（なお、woは検出領域の径、2zoは領域
長、DfreeとDboundは、それぞれ遊離の核酸プローブ及
び結合した核酸プローブの並進拡散定数である））を用
いて、(3)で得た自己相関関数を解析する。
【００３６】(5)各核酸プローブについて、添加前と添
加後の自己相関関数を比較する。
加後の自己相関関数を比較する。
【００３７】FCSによるデータ解析には、Evotec BioSys
tems社から発売されているコンピュータープログラム
「FCS」を使用できる。
tems社から発売されているコンピュータープログラム
「FCS」を使用できる。
【００３８】このような分析の概念は、図２ｂ）及び図
２ｃ）によって、より明確となろう。すなわち、蛍光強
度の関数I(t)は、核酸プローブが標的対立遺伝子に結合
していない場合には、分子のサイズが小さいのでブラウ
ン運動の速度が大きく、I(t)の周波数が大きい。これに
対して、核酸プローブが標的対立遺伝子に結合すると、
図２ｂ）のように、周波数の大きいデータが得られる。
それ故、上述のごとく、蛍光強度を基にして得られた自
己相関関数を解析すれば、プローブが結合したか否かが
明らかとなるわけである。
２ｃ）によって、より明確となろう。すなわち、蛍光強
度の関数I(t)は、核酸プローブが標的対立遺伝子に結合
していない場合には、分子のサイズが小さいのでブラウ
ン運動の速度が大きく、I(t)の周波数が大きい。これに
対して、核酸プローブが標的対立遺伝子に結合すると、
図２ｂ）のように、周波数の大きいデータが得られる。
それ故、上述のごとく、蛍光強度を基にして得られた自
己相関関数を解析すれば、プローブが結合したか否かが
明らかとなるわけである。
【００３９】FCSによって、何れの核酸プローブが結合
したのかを決定するためには、例えば、各核酸プローブ
を励起波長及び／又は蛍光波長の異なる蛍光標識で区別
すればよい。
したのかを決定するためには、例えば、各核酸プローブ
を励起波長及び／又は蛍光波長の異なる蛍光標識で区別
すればよい。
【００４０】また、各核酸プローブのサイズが異なれ
ば、ブラウン運動の変化及び自己相関関数も異なるの
で、サイズの異なる核酸プローブを用いることによって
何れの核酸プローブが結合したかを決定することもでき
る。もちろん、サイズと蛍光標識の両者を組み合わせる
ことによって、標的対立遺伝子に結合した核酸プローブ
の種類を決定してもよい。
ば、ブラウン運動の変化及び自己相関関数も異なるの
で、サイズの異なる核酸プローブを用いることによって
何れの核酸プローブが結合したかを決定することもでき
る。もちろん、サイズと蛍光標識の両者を組み合わせる
ことによって、標的対立遺伝子に結合した核酸プローブ
の種類を決定してもよい。
【００４１】上記のようなハイブリダイゼーション反応
を指標とした検出のみならず、プローブとして用いた標
識配列をプライマーとして用いてPCR反応を行い、増幅
産物の標識種類の判別によっても標的対立遺伝子を決定
することが可能である。また、こうしたPCR反応を指標
とする可能である。また、こうしたPCR反応を指標とす
る場合、多型によって増幅産物のサイズが異なるように
プライマーの設計をすることにより、増幅産物のサイズ
の差異に基づく自己相関関数の差によって標的対立遺伝
子の型を決定することができる。
を指標とした検出のみならず、プローブとして用いた標
識配列をプライマーとして用いてPCR反応を行い、増幅
産物の標識種類の判別によっても標的対立遺伝子を決定
することが可能である。また、こうしたPCR反応を指標
とする可能である。また、こうしたPCR反応を指標とす
る場合、多型によって増幅産物のサイズが異なるように
プライマーの設計をすることにより、増幅産物のサイズ
の差異に基づく自己相関関数の差によって標的対立遺伝
子の型を決定することができる。
【００４２】このように、本発明の方法を用いれば、極
めて迅速且つ簡便に標的対立遺伝子の多型部位の型を決
定できる。
めて迅速且つ簡便に標的対立遺伝子の多型部位の型を決
定できる。
【００４３】以下、本発明の実施例として、HLAの型を
決定する方法について説明する。 ［実施例１］（図３参照） 本実施例では、HLAクラスII領域DRB1のアロ抗原性を示
す多型配列の型を決定する。DR2のサブタイプであるDRB
1*15（配列番号１）とDRB1*16（配列番号２）は、141番
目のヌクレオチド（T→C）と180番目のヌクレオチド(G
→C)のみが異なっている。
決定する方法について説明する。 ［実施例１］（図３参照） 本実施例では、HLAクラスII領域DRB1のアロ抗原性を示
す多型配列の型を決定する。DR2のサブタイプであるDRB
1*15（配列番号１）とDRB1*16（配列番号２）は、141番
目のヌクレオチド（T→C）と180番目のヌクレオチド(G
→C)のみが異なっている。
【００４４】DRB1*15の141〜180番目の塩基配列と相補
的な塩基配列を有するプローブ１と、DRB1*16の141〜18
0番目の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ
２を調製し、プローブ１はフルオレセインイソチオシア
ネート(FITC)、プローブ２はローダミンで標識する。プ
ローブ１及びプローブ２が、各々10-8M程度の濃度にな
るように溶液に加える。
的な塩基配列を有するプローブ１と、DRB1*16の141〜18
0番目の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ
２を調製し、プローブ１はフルオレセインイソチオシア
ネート(FITC)、プローブ２はローダミンで標識する。プ
ローブ１及びプローブ２が、各々10-8M程度の濃度にな
るように溶液に加える。
【００４５】コンセンサス領域に特異的に結合し得るプ
ライマー対を用いたPCR反応により、60〜200番目の塩基
配列を増幅し、10-8程度の濃度になるように溶液を加え
て、DNA検体を調製する。
ライマー対を用いたPCR反応により、60〜200番目の塩基
配列を増幅し、10-8程度の濃度になるように溶液を加え
て、DNA検体を調製する。
【００４６】カバーグラスの面に該DNA検体を１滴載置
し、プローブ１とプローブ２を添加した後、58〜60℃前
後のハイブリダイゼーション反応を行う。
し、プローブ１とプローブ２を添加した後、58〜60℃前
後のハイブリダイゼーション反応を行う。
【００４７】ハイブリダイゼーション反応の前後におけ
る、蛍光発光の自己相関関数の変化を測定する。
る、蛍光発光の自己相関関数の変化を測定する。
【００４８】例えば、検体DNAの型がDRB1*15のホモであ
る場合には、プローブ１のみが結合するので、FITCから
発せられる黄緑色の蛍光の自己相関関数のみが変化す
る。他方、検体DNAの型がDRB1*16のホモである場合に
は、プローブ２のみが結合するので、ローダミンから発
せられる黄緑色の蛍光の自己相関関数のみが変化する。
また、検体DNAの型がDRB1*15とDRB1*16のヘテロである
場合には、プローブ１とプローブ２が共に結合するの
で、FITCから発せられる蛍光とローダミンから発せられ
る蛍光の自己相関関数が共に変化する。もし、検体DNA
の型がDRB1*15とDRB1*16の何れでもなければ、自己相関
関数は全く変化しない。
る場合には、プローブ１のみが結合するので、FITCから
発せられる黄緑色の蛍光の自己相関関数のみが変化す
る。他方、検体DNAの型がDRB1*16のホモである場合に
は、プローブ２のみが結合するので、ローダミンから発
せられる黄緑色の蛍光の自己相関関数のみが変化する。
また、検体DNAの型がDRB1*15とDRB1*16のヘテロである
場合には、プローブ１とプローブ２が共に結合するの
で、FITCから発せられる蛍光とローダミンから発せられ
る蛍光の自己相関関数が共に変化する。もし、検体DNA
の型がDRB1*15とDRB1*16の何れでもなければ、自己相関
関数は全く変化しない。
【００４９】このように、プローブ１とプローブ２は異
なる標識物質でラベルされているので、同一の容器中に
添加しても、何れのプローブが検体DNAと結合したかを
決定できる。近年、HLAには多くの多型部位が存在する
ので、多種類のプローブを同時に同じ容器に添加して分
析できることは、本発明の方法の大きな利点である。
なる標識物質でラベルされているので、同一の容器中に
添加しても、何れのプローブが検体DNAと結合したかを
決定できる。近年、HLAには多くの多型部位が存在する
ので、多種類のプローブを同時に同じ容器に添加して分
析できることは、本発明の方法の大きな利点である。
【００５０】本実施例では、異なる標識物質でラベルさ
れたプローブを用いる方法を記載したが、長さが異なる
プローブを用いてもよい。この場合、各プローブの長さ
は、FCSによってゆらぎの差異を判別できるように選択
しなければならない。例えば、DRB1*15とDRB1*16を判別
する上記事例においては、プローブ１とプローブ３（配
列番号３；プローブ１より20塩基長い）を使用すること
ができる。
れたプローブを用いる方法を記載したが、長さが異なる
プローブを用いてもよい。この場合、各プローブの長さ
は、FCSによってゆらぎの差異を判別できるように選択
しなければならない。例えば、DRB1*15とDRB1*16を判別
する上記事例においては、プローブ１とプローブ３（配
列番号３；プローブ１より20塩基長い）を使用すること
ができる。
【００５１】図４には、本実施例の方法の臨床検査への
応用を示した。該応用によれば、多数の多型配列のサブ
クラスの型を迅速に決定できるので、多数の多型部位が
存在し、多型部位毎に多くのサブクラスが同定されてい
るHLAの型を決定するのに有用である。
応用を示した。該応用によれば、多数の多型配列のサブ
クラスの型を迅速に決定できるので、多数の多型部位が
存在し、多型部位毎に多くのサブクラスが同定されてい
るHLAの型を決定するのに有用である。
【００５２】図４から明らかのように、該方法では、ガ
ラス平板上の各窪みの中には、HLAの多型配列（A2、A2
6、B40…等）がそれぞれ各別に添加した後、各多型配列
のサブクラスと特異的に結合し得るプローブ群を加え
る。続いて、本実施例で詳述したように、各窪み毎に何
れのプローブが結合したかを決定すれば、多数の多型配
列のサブタイプを決定することができる。勿論、前記窪
みの中に添加すべき多型配列はHLAのみに限らない。ま
た、各窪みには、全く種類の異なる多型遺伝子を添加し
てもよい。
ラス平板上の各窪みの中には、HLAの多型配列（A2、A2
6、B40…等）がそれぞれ各別に添加した後、各多型配列
のサブクラスと特異的に結合し得るプローブ群を加え
る。続いて、本実施例で詳述したように、各窪み毎に何
れのプローブが結合したかを決定すれば、多数の多型配
列のサブタイプを決定することができる。勿論、前記窪
みの中に添加すべき多型配列はHLAのみに限らない。ま
た、各窪みには、全く種類の異なる多型遺伝子を添加し
てもよい。
【００５３】
【発明の効果】本発明の方法によれば、多種類のポリヌ
クレオチド中の多型部位を迅速且つ簡便に決定できる。
クレオチド中の多型部位を迅速且つ簡便に決定できる。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Olympus Optical Co., Ltd. <120> Method for determining a polymorphic sequence <130> <140> <141> <160> 3 <170> PatenIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agaaacccca cctccgaggg tcctcctccg ccgcgcccga cg 42 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggaaacccca cctccgaggg tcctcctccg ccgcgcccga cg 42 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tcgtctctca cagaaacccc acctccgagg gtcctcctcc gccgcgcccg cgccacga 59
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に使用し得る検出システムの模式
図。
図。
【図２】本発明の方法による多型配列の決定方法の概念
を表す図。
を表す図。
【図３】実施例１で用いたプローブを示す図。
【図４】本発明の方法の臨床医学への応用例を示す図。
Claims (3)
- 【請求項１】 ポリヌクレオチド中に含まれる多型部位
の塩基配列が多型配列PS１〜PSｎ（nは2以上の整数）の
何れであるかを決定する方法であって、 前記ポリヌクレオチドを含む検体を準備する工程と、 検出可能な標識がラベルされた核酸プローブPR1〜PRnで
あって、前記多型配列PS１〜PSnと特異的に結合し得る
核酸プローブPR１〜PRｎと前記検体とを混合することに
より、前記核酸プローブPR１〜PRｎを前記ポリヌクレオ
チドに結合せしめる工程と、 微小空間内に存在する前記核酸プローブPR１〜PRｎを検
出する工程と、 検出結果を解析して、PR１〜PRｎのうちの何れが前記ポ
リヌクレオチドに結合したかを決定することにより、前
記多型部位の塩基配列が多型配列PS１〜PSｎの何れであ
るかを決定する工程とを具備する方法。 - 【請求項２】 前記検出が共焦点顕微鏡によって行わ
れ、且つ前記解析が蛍光相関分光法によって行われるこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドがヒト組織適合性
抗原の遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の
方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000087500A JP2001269198A (ja) | 2000-03-27 | 2000-03-27 | 多型遺伝子の型を決定する方法 |
| EP01915852A EP1180549B1 (en) | 2000-03-27 | 2001-03-27 | Method of measuring polymorphism |
| PCT/JP2001/002495 WO2001073120A1 (fr) | 2000-03-27 | 2001-03-27 | Procede de mesure de polymorphisme |
| DE60126711T DE60126711T2 (de) | 2000-03-27 | 2001-03-27 | Verfahren zum messen von polymorphismen |
| US09/995,100 US20030008296A1 (en) | 2000-03-27 | 2001-11-27 | Method for determining polymorphism |
| US11/900,192 US20080076133A1 (en) | 2000-03-27 | 2007-09-10 | Method for determining polymorphism |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000087500A JP2001269198A (ja) | 2000-03-27 | 2000-03-27 | 多型遺伝子の型を決定する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001269198A true JP2001269198A (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=18603503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000087500A Pending JP2001269198A (ja) | 2000-03-27 | 2000-03-27 | 多型遺伝子の型を決定する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001269198A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001275699A (ja) * | 2000-03-30 | 2001-10-09 | Olympus Optical Co Ltd | 反復配列の多型を分析する方法 |
| JP2007530073A (ja) * | 2004-04-01 | 2007-11-01 | シュティヒティング サンクイン ブロエドフォールツィーニング | 血球抗原を遺伝子型特定する方法及び血球抗原を遺伝子型特定するために適したキット |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08242858A (ja) * | 1995-03-10 | 1996-09-24 | Max Planck Ges Foerderung Wissenschaft Ev | 少数のヌクレイン酸鎖を直接証明する方法 |
| JPH11502608A (ja) * | 1993-01-18 | 1999-03-02 | エボテック・バイオシステムズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 |
| JP2000125900A (ja) * | 1998-10-22 | 2000-05-09 | Olympus Optical Co Ltd | 標的核酸の定量分析方法 |
| WO2000049180A1 (en) * | 1999-02-18 | 2000-08-24 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
-
2000
- 2000-03-27 JP JP2000087500A patent/JP2001269198A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11502608A (ja) * | 1993-01-18 | 1999-03-02 | エボテック・バイオシステムズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KINJO, M., BIOTECHNIQUES, vol. 25, no. 4, JPN4006015405, 1998, pages 706 - 715, ISSN: 0000766166 * |
| RIGLER, R., J. BIOTECHNOLOGY, vol. 41, JPN4006015406, 1995, pages 177 - 186, ISSN: 0000766167 * |
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| JP2001275699A (ja) * | 2000-03-30 | 2001-10-09 | Olympus Optical Co Ltd | 反復配列の多型を分析する方法 |
| JP4589480B2 (ja) * | 2000-03-30 | 2010-12-01 | オリンパス株式会社 | 反復配列の多型を分析する方法 |
| JP2007530073A (ja) * | 2004-04-01 | 2007-11-01 | シュティヒティング サンクイン ブロエドフォールツィーニング | 血球抗原を遺伝子型特定する方法及び血球抗原を遺伝子型特定するために適したキット |
| JP4881850B2 (ja) * | 2004-04-01 | 2012-02-22 | シュティヒティング サンクイン ブロエドフォールツィーニング | 血球抗原を遺伝子型特定する方法及び血球抗原を遺伝子型特定するために適したキット |
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