JP4589480B2 - 反復配列の多型を分析する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光相関分光法を用いて反復配列の多型を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学・遺伝学の進歩により、多数の遺伝性神経疾患の原因遺伝子が同定されてきた(1)（かっこ内の数字は、本発明の属する分野における現状をより的確に把握し得るように、本明細書に引用した参照文献の番号を示す。これらの参照文献のリストは、図面の簡単な説明の前に記載されている）。その中には、塩基の置換、欠失、挿入、重複等の変異ではなく、トリプレットリピート（3塩基反復配列）の異常な伸長が原因で発症する疾患（トリプレットリピート病）(2,3)が新たに見出されている。
【０００３】
これらの疾患では、同一家系内においても症状が異なる臨床的多様性、世代を経るごとに若年化する表現促進現象、疾患を伝えた親の性によって次世代の重症度が異なる等の現象が観察され、臨床遺伝学的な観点から興味が持たれている。
【０００４】
トリプレットリピートの存在する遺伝子上の領域に基づいて、今日までに見出されたトリプレットリピート病を整理すると、トリプレットリピートの伸長が、(1)5’末端の非翻訳領域に存在する脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞症、(2)翻訳領域に存在する球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症1型、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、マチャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型、(3)3’末端の非翻訳領域に存在する筋緊張性ジストロフィー、(4)イントロン内に存在するフリートライヒ失調症がある。
【０００５】
これらの疾患の原因遺伝子におけるリピート数は、健常者ではおよそ40リピート以下の一定の範囲に分布し、この範囲の中で著しい多型を示すことが多い。一方、患者におけるリピート数の増大の程度は、タンパク質の翻訳領域に存在するトリプレットリピートの場合は、約40〜100リピート程度であるのに対して、非翻訳部位やイントロンに存在するトリプレットリピートの場合は、約200〜1000リピート以上という著しい増大を示す。これら原因遺伝子の生理的機能については、球脊髄性筋萎縮症がアンドロゲン受容体を、脊髄小脳失調症６型が電位依存性Ca2+チャネルのα1Aサブユニットをコードしていることが分かっている以外は不明である。
【０００６】
これらの疾患の原因遺伝子の反復配列の繰り返し数を測定する方法には、以下のような方法がある。
【０００７】
まず、最も古典的な方法は、サザンブロットを利用する方法であり、概略は以下のとおりである。
【０００８】
(1) 既知の制限酵素でゲノムDNA切片を切断して、多くのDNA断片を作製する。
【０００９】
(2) 該DNA断片をゲル電気泳動にかけて分画した後、得られた電気泳動パターンをナイロン膜上にサザンブロットする(4)。
【００１０】
(3) 目的遺伝子と特異的にハイブリダイズできる標識DNAプローブと前記サザンブロットされたDNA断片とのハイブリダイゼーションを行う。
【００１１】
(4) 標識プローブが結合した電気泳動パターン上のバンドを検出することによって、上記の目的遺伝子の反復配列の繰り返し数を決定する(5)。
【００１２】
また、PCRによる多型分析の一態様として、反復配列の繰り返し数を決定する方法も盛んに行われている。該方法では、検出すべき反復配列を増幅し得るプライマーを用いて該配列を増幅した後、増幅産物を電気泳動し、染色又はオートラジオグラフィー等を用いて該産物を検出している(6)。
【００１３】
しかし、両分析方法は何れも、電気泳動法やブロッティング法のように、複雑な実験操作を必要とするので、多大な労力及び時間を要する。また、ブロッティング法、PCR法とも電気泳動を用いるため、多検体・多項目を処理するのが困難であるのみならず、繰り返し数を正確に測定するためには、1塩基の差異を検出し得る極めて精度の高い電気泳動を行わなければならない。さらに、目的の遺伝子を検出するための標識として、32P等の放射性アイソトープを用いる場合には、関係法令によって取扱者が限定されるという問題もある。
【００１４】
一方、これらの分析法とは全く異なる方法として、近年、ジーンチップ（マイクロアレイ）と呼ばれる基板上にオリゴヌクレオチドを合成する方法と(7)、スライドグラス等にPCR産物やプラスミドDNAをスポットする方法(8)が開発された。これらの方法では、約1万個のクローンがアレイ化され、遺伝子の塩基配列決定、単塩基多型、ジーンハンティング、遺伝子発現モニタリング等の遺伝子解析への適用が試みられている。これらの方法は、多種類のDNAプローブによって効率よく測定できるために、多数の検体を同時に検出することが可能であるという利点を有している。
【００１５】
しかしながら、塩基配列に大きな差違がある核酸群から特定の核酸を検出する場合とは異なり、各反復配列の多型は繰り返し数のみが異なるにすぎないので、各反復配列を識別するためには、各反復配列とプローブとの会合・解離状態を微妙に調整するための複雑な手段が必要であるが、上述の方法では、このような精密な制御は不可能である。また測定が、乾燥状態で行われるために、ハイブリダイゼーションの変化をリアルタイムで検出し得ないという欠点も有している。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な操作で反復配列の多型を短時間に分析できる方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、本発明は、
反復配列の多型を分析する方法であって、
（１）反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
（２）前記標的核酸を標識する工程と；
（３）標識した標的核酸を検出する工程と；
（４）蛍光相関分光法を用いて検出結果を解析することにより、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、標的核酸中に含まれる反復配列の多型を分析する方法を提供する。
【００１９】
本明細書において、「反復配列」とは、AGTAGTAGTのごとく、同一、あるいは極めて類似した「反復単位」が反復されてなる塩基配列を意味する。
【００２０】
本明細書において「多型」とは、同一の遺伝子座を占める複数の対立遺伝子の型をいう。従って、「多型を分析する」とは、このような対立遺伝子の型を推定し、必要に応じて決定することを意味する。
【００２１】
反復配列の場合、反復単位の繰り返し数の相違によって対立遺伝子の型が決まるので、「反復配列の多型を分析する」とは、反復配列の繰り返し数を推定し、必要に応じて決定することをいう。ここで、反復単位の「繰り返し数」とは、反復配列中に含まれる反復単位の個数を意味する。上記事例の場合、AGTが「反復単位」であり、「繰り返し数」は3回である。
【００２２】
本発明の方法によれば、同一の反復単位を有するが、繰り返し数が異なる2以上の核酸を簡易な操作で区別することができ、必要であれば、繰り返し数を決定することも可能である。
【００２３】
本発明の方法を実施するためには、まず、反復配列を有する核酸を含む検体を準備する。反復配列の繰り返し数は、トリプレットリピート病等の疾病の診断指標となり得るので、前記検体は、典型的には、疾病の有無を診断すべき被験者から採取する。
【００２４】
ここで、「トリプレットリピート病」とは、３塩基を単位とする縦列反復配列が繰り返し数の増加によって伸長することにより発症する遺伝性疾患をいう。トリプレットリピート病には、脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞症、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症1型、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、マチャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型、筋緊張性ジストロフィー、フリートライヒ失調症が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の方法に供すべき「検体」には、血液、唾液、精液などの体液、血球成分、生検組織、培養細胞等を溶解又は懸濁したものであり得るがこれらに限定されない。
【００２６】
被験者から検体を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作を行う。核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の慣用法を使用し得る。
【００２７】
検体中の核酸の量が少ないときには、核酸を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(以下PCRと略記する)によって行い得る。しかしながら、本発明の方法は、感度が非常に高いので、従来の方法では必須であった増幅操作を省略し得る。
【００２８】
必要に応じて核酸を抽出し、又は増幅した後、検出可能な標識、好ましくは蛍光標識を用いて、検体中の前記核酸（以下、標的核酸という）を標識する。以下に記載されているように、蛍光相関分析法を用いて標的核酸を検出、測定する場合には、検出可能な標識は蛍光標識でなければならない。
【００２９】
標的核酸を標識するためには、標識核酸中に、検出可能な標識を有するヌクレオチドを直接導入すればよい。あるいは、標的核酸と相補的な標識プローブとハイブリダイズさせてもよい。
【００３０】
ジデオキシヌクレオチド３リン酸とデオキシヌクレオチド３リン酸の混合物を用いて標識を導入すれば、反復配列だけを標識できる。例えば、CGAが反復してなる反復配列の場合、デオキシCTP、デオキシGTP、デオキシATP（３種類のデオキシヌクレオチド３リン酸のうち少なくとも１種類はラベルされている）、及びジデオキシTTPの混合物とプライマーとを混合し、該プライマーを伸長させる。反復配列にはチミンが含まれていないので、プライマーが反復配列の末端に到達するまでは、プライマーの伸長を停止させるジデオキシTTPがプライマーに取り込まれない。プライマーが反復配列の末端に到達すれば、ジデオキシTTPがプライマーに取り込まれるので、プライマーの伸長が停止する。反復配列の繰り返し数を測定する場合、反復配列以外の部分が標識されていると測定精度が低下するので、このような方法によって、反復配列部分のみを標識することが好ましい。
【００３１】
検出可能な標識を用いて標的核酸を標識した後、検体中に存在する標的核酸、好ましくは、測定感度を上げるために検体中の「微小空間」に存在する標的核酸を検出する。
【００３２】
ここで、「微小空間」とは、容積が10-21L（1nm四方の立方体の体積に相当する）〜10-3L、典型的には10-18L〜10-9L、最も典型的には10-15L〜10-12Lの空間をいう。微小空間の形状は、球状、円錐状、立方体状、直方体状等任意の形状であり得る。
【００３３】
標的核酸は、標的核酸中に導入された標識、又はプローブ中の標識を検出することによって検出される。微小空間の容積は極めて小さいので、微小空間に存在する標的核酸を検出する場合、レーザー光を用い、顕微鏡視野下において、蛍光を検出することが好ましい。
【００３４】
このような検出は、典型的には、図1に示すような共焦点顕微鏡によってなし得る。共焦点顕微鏡自体は、本分野で公知である。
【００３５】
共焦点顕微鏡を用いた検出は、
１．レーザー光を励起光として照射する；
２．フィルター(IF)を通過させた後、レーザー光を集光し、ダイクロイックミラー(DM)によって試料中の一点にレーザー光を照射する；
３．試料中の蛍光物質をレーザー光で励起して発光させる；
４．ピンホールを通過させることにより、試料の焦点中の蛍光物質から発せられた蛍光のみを光増倍管(PMT)で増幅する
５．増幅した蛍光を検出する
ことによってなされる。
【００３６】
図では、アルゴンイオンレーザーが例示されているが、蛍光物質の種類に応じて、波長の異なるクリプトンアルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、ヘリウムカドミニウムレーザーも使用できる。また、図１は、典型的な共焦点顕微鏡の模式図にすぎないので、図１に記載の共焦点顕微鏡以外のシステムも当然使用できる。
【００３７】
このような検出方法は、微少な一点から発せられる蛍光のみを検出するので、バックグラウンドがなく、通常の蛍光検出に比べて著しく感度が高い。標的核酸の検出は、一般的にはミリ秒〜分の単位、最も一般的には秒の単位で行われる。
【００３８】
検出結果が得られたら、該結果を解析して、標的核酸の反復単位の種類、繰り返し数等を決定する。
【００３９】
結果の解析は、検出結果の「解析」は、蛍光相関分析法によって行うのが好ましい。ここで、「蛍光相関分析法（以下FCS(fluorescence correlation spectrometry)と称する）」とは、微小空間内に存在する平均数個（ある場合には一個）の蛍光物質が発する蛍光の強度を一定時間測定した後、ブラウン運動に由来する蛍光のゆらぎの自己相関関数をとり、該関数の分析によって、蛍光物質に関する種々のデータを取得する方法をいう。FCS自体は公知であり、その詳細については、特表平11-502608を参照されたい。
【００４０】
FCSを用いて、標的核酸を同定するには、以下の操作を行う。
【００４１】
１．図２ａ)に示されている微小空間にレーザー光を照射する。
【００４２】
２．該微小空間中に存在する蛍光物質から発せられる蛍光の強度を経時的に測定し、図２ｂ）及び図２ｃ）に示されているデータを取得する。
【００４３】
３．異なる２時点の蛍光強度I(t)とI(t+τ)の積の期待値を計算し、自己相関関数G(τ)＝<I(t) I(t+τ)>を得る。
【００４４】
４．下式１：
【００４５】
【式１】
【００４６】
（ここで、Ｎ：蛍光分子の平均数
τsmall＝wo2/4Dsmall：サイズが小さい核酸の並進拡散時間
τlarge＝wo2/4Dlarge ：サイズが大きい核酸の並進拡散時間
y=繰り返し数が多い反復配列の割合
S=wo/zoである
（なお、woは検出領域の径、2zoは領域長、DsmallとDlargeは、それぞれサイズが小さい核酸及びサイズが大きい核酸の並進拡散定数である））
を用いて、３．で得た自己相関関数を解析する。
【００４７】
FCSによるデータ解析には、Evotec BioSystems社から発売されているコンピュータープログラム「FCS」を使用できる。１〜４までの操作時間は、１つの標的核酸当り10秒未満であり得る。
【００４８】
このような分析の概念は、図２ｂ）及び図２ｃ）によって、より明確となろう。すなわち、サイズが小さい場合にはブラウン運動の速度が大きいので、I(t)が大きい。これに対して、サイズが大きい場合にはブラウン運動の速度が小さいので、I(t)の周波数が小さい。
【００４９】
従って、式(1)を用いれば、標識された核酸のサイズ、各核酸の割合を推定し得る。必要であれば、以下に記載した方法を用いて、核酸のサイズを正確に決定することも可能である。
【００５０】
以上のように、本発明の方法の最も基本的な態様は、
(1)反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
(2)前記標的核酸を標識する工程と；
(3)標識した標的核酸を検出する工程と；
(4)検出結果を解析することにより反復配列の多型を分析する工程と
を具備する。
【００５１】
本発明は、標識した標的核酸の一本鎖部分を分解して、前記一本鎖部分が除去された標的核酸と遊離のヌクレオチドとを生成せしめる工程をさらに備えた方法も提供する。
【００５２】
より具体的には、該方法は、
反復配列の多型を分析する方法であって、
（１）反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
（２）前記反復配列を標識する工程と；
（３）前記反復配列と相補的なプローブと前記反復配列とをハイブリダイズさせて、前記プローブと前記標的核酸からなるハイブリッドを形成せしめる工程と；
（４）前記ハイブリッド中の一本鎖部分を消化して、前記標的核酸から標識ヌクレオチドを遊離させ、遊離した標識ヌクレオチドと二本鎖ハイブリッドとを生成せしめる工程と；
（５）前記遊離した標識ヌクレオチドを検出又は定量することによって、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法である。
【００５３】
該方法によれば、反復配列の反復回数を正確に決定できる。
【００５４】
該方法を実施するには、まず反復配列を有する標的核酸を被験者から採取して、反復配列部分のみを標識する。標的核酸の採取法は、上述のとおりである。反復配列部分のみを標識するには、反復配列の相補鎖を鋳型にして、上述のジデオキシ三リン酸を用いた方法で標識ヌクレオチドを導入するのが簡便である。
【００５５】
標的核酸を標識した後、プローブに接触させる。該プローブは、反復配列を構成する反復単位と相補的な塩基配列を有するように調製する。従って、該標識プローブは、標識された反復配列とハイブリダイズし得る。
【００５６】
該方法によって反復配列の繰り返し数を決定するためには、該反復配列より短いプローブを使用する。このようなプローブと標識された反復配列とをハイブリダイズさせれば、標識された反復配列の末端が一本鎖として延出したハイブリッドが形成される。
【００５７】
該ハイブリッドを一本鎖特異的ヌクレアーゼによって消化すれば、前記ハイブリッドの一本鎖部分、すなわち一本鎖として延出している標識された反復配列の末端部分のみが消化される。標識された反復配列には標識ヌクレオチドが導入されているので、標識された反復配列を消化すれば、標識ヌクレオチドが遊離する。一本鎖特異的ヌクレアーゼとしては、S1ヌクレアーゼ又はExoIヌクレアーゼを使用し得る。
【００５８】
標識ヌクレオチドが遊離すれば、標的配列中の反復配列がプローブよりも長いことを意味している。反対に、標識されたヌクレオチドが遊離されなかった場合、標的核酸中の反復配列がプローブよりも長くないことを意味している。それ故、標識されたヌクレオチドが遊離されるか否かを調べることにより、反復配列の繰り返し数が、所定の回数を超えるか否かを知ることができる。多くの疾病では、正常者に比べて、繰り返し数は増加する。それ故、正常者の反復配列より長く、患者の反復配列より短いプローブを用いれば、被験者が疾病に罹患しているか否かを診断し得る。
【００５９】
さらに、プローブの繰り返し数は既知なので、遊離したヌクレオチドの濃度と消化されたハイブリッドの濃度を測定すれば、一つのハイブリッドから遊離したヌクレオチド個数を算出することができる。これによって、標的核酸中に含まれる反復配列の繰り返し数を正確に決定できる。
【００６０】
上述した蛍光相関分光法を用いれば、遊離したヌクレオチドの濃度及び消化されたハイブリッドの濃度をリアルタイムに測定し得る。
【００６１】
本方法によれば、２種類又はそれ以上の標的核酸の反復配列を同時に分析することも可能である。
【００６２】
反復単位が異なる２種類の標的核酸を同時に分析するには、両核酸の反復配列をそれぞれ異なる標識でラベルするのが簡便であり、１種類の標的核酸を分析する場合と同様の操作で反復配列の長さを決定できる。
【００６３】
蛍光相関分光法を用いれば、ハイブリッドのサイズ及び存在比率、遊離したヌクレオチドの量を容易に測定できる。従って、蛍光相関分光法を用いる場合には、両反復配列の長さ又は各プローブの長さが異なれば、標識が同じでも、2種類のハイブリッドを容易に区別することができる。
【００６４】
なお、上記の方法では、標的核酸の反復配列を標識したが、これに代えて、標識したプローブを用いてもよい。この場合には、プローブが反復配列より長いときに、標識ヌクレオチドが遊離する。その他の操作は、反復配列を標識した場合と同じである。
【００６５】
以下、実施例により、本発明の方法をさらに詳細に説明する。
【００６６】
［実施例１］
本実施例では、球脊椎性筋萎縮症(以下SBMAと略記する)患者のアンドロゲン受容体遺伝子中の反復配列の繰り返し数を測定することにより、被験者がSBMAに罹患しているか否かを診断する方法について説明する。
【００６７】
アンドロゲン受容体遺伝子には、該受容体のN末端近傍をコードする部分にCAG反復配列が存在する。正常人では、該反復配列の繰り返し数は約20であるのに対して、SBMA患者では40〜60に増加することが報告されている(7)。
【００６８】
従って、アンドロゲン受容体遺伝子中に含まれる該反復配列の繰り返し数を測定することにより、被験者がSBMAに罹患しているか否かを診断することができる。
【００６９】
以下、本実施例の方法について説明する。
【００７０】
まず、正常な繰り返し数（本実施例の場合20回）をするプローブを作成した。
【００７１】
次に、被験者から採取したDNA検体を図１のように蛍光標識した。検体には、蛍光標識したdATP、未標識のdCTP、dGTP、ddTTP（ジデオキシTTP）とプライマーを用いた伸長反応によって、蛍光標識を導入した。ddTTPを用いることにより、T（チミン）の位置で伸長反応が停止するので、反復配列のみを蛍光標識し得る。
【００７２】
続いて、正常者又はSBMA患者由来のDNA検体と該プローブを反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００７３】
図３に示されているように、正常者から採取した検体DNAは、プローブより長くないので、プローブの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる。一方、SBMA患者から採取した検体DNAは、プローブより長いので、検体DNAの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる（図３参照）。
【００７４】
ハイブリダイゼーション反応に続いて、プローブと検体DNAからなるハイブリッドに、二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、一本鎖部分を消化した。
【００７５】
図３に示されているように、該反応によって、一本鎖部分は分解されてヌクレオチドになり、二本鎖部分のみからなるハイブリッドが生成される。
【００７６】
前述のように、正常者由来のハイブリッドの一本鎖部分はプローブの一部によって構成されるので、正常者由来のハイブリッドを消化すると、プローブの一部が分解される。これに対して、SBMA患者由来のハイブリッドの一本鎖部分は検体DNAの一部によって構成されるので、SBMA患者由来のハイブリッドを消化すると、検体DNAの一部が分解される。
【００７７】
検体DNAは標識ヌクレオチドを含むので、SBMA患者由来のハイブリッドの分解産物には標識ヌクレオチドが遊離する。これに対して、プローブは標識ヌクレオチドを含まないので、正常者由来のハイブリッドの分解産物には標識ヌクレオチドが遊離しない。
【００７８】
蛍光分子の挙動すなわち蛍光強度とゆらぎの関係は、分子が小さい場合は速く、分子が大きいと遅い。このため、正常者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が短くなるのに対して、SBMA患者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が長くなり、相関時間の長短によって両者を判別できる。
【００７９】
さらに、SBMA患者由来のハイブリッドの分解産物からは、標識ヌクレオチドが観察されるのに対して、正常者のそれからは、殆ど標識ヌクレオチドが観察されないことを指標として、反復配列の長さを判定することもできる。
【００８０】
また、SBMA患者の場合、標識ヌクレオチドと二本鎖部分の両者が標識されているので、二本鎖部分と標識ヌクレオチドの濃度を計算することができる。具体的には、ヌクレオチドの数を二本鎖の分子数で割り、プローブの繰り返し数20を加算すれば、SBMA患者の反復配列の繰り返し数が得られる。
【００８１】
なお、本実施例では、一本鎖特異的ヌクレアーゼ処理を行い、反復配列の繰り返し数を正確に決定する方法を説明したが、一本鎖特異的ヌクレアーゼ処理を行わずに、反復配列の繰り返し数の概数を推定してもよい。
【００８２】
［実施例２］
本実施例では、実施例１とは反対に、プローブを蛍光標識した場合の検査方法について説明する。
【００８３】
まず、正常な繰り返し数（本実施例の場合20回）を有し、全てのA（アデニン）が蛍光標識されたプローブを作成した。続いて、正常者又はSBMA患者由来のDNA検体と該プローブを反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００８４】
図４に示されているように、正常者から採取した検体DNAは、プローブより長くないので、プローブの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる。一方、SBMA患者から採取した検体DNAは、プローブより長いので、検体DNAの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる（図４参照）。
【００８５】
ハイブリダイゼーション反応に続いて、プローブと検体DNAからなるハイブリッドに、二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、一本鎖部分を消化した。
【００８６】
図４に示されているように、該反応によって、一本鎖部分は分解されてヌクレオチドになり、二本鎖部分のみからなるハイブリッドが生成される。
【００８７】
正常者由来のハイブリッドの一本鎖部分はプローブの一部によって構成されるので、正常者由来のハイブリッドを消化すると、プローブの一部が分解される。これに対して、SBMA患者由来のハイブリッドの一本鎖部分は検体DNAの一部によって構成されるので、SBMA患者由来のハイブリッドを消化すると、検体DNAの一部が分解される。
【００８８】
検体DNAは標識ヌクレオチドを含まないので、SBMA患者由来のハイブリッドからは標識ヌクレオチドが遊離しない。これに対して、プローブは標識ヌクレオチドを含むので、正常者由来のハイブリッドからは標識ヌクレオチドがする。
【００８９】
蛍光分子の挙動すなわち蛍光強度とゆらぎの関係は、分子が小さい場合は速く、分子が大きいと遅い。このため、正常者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が短くなるのに対して、SBMA患者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が長くなり、相関時間の長短によって両者を判別できる。
【００９０】
［実施例３］
本実施例では、２種類のトリプレットリピート病を同時に検査する方法について説明する。
【００９１】
第一のトリプレットリピート病としては、正常者における反復配列の繰り返し数が20以下である疾病を選択し、CAGが20回反復してなるプローブ５を作成した。
【００９２】
第ニのトリプレットリピート病としては、正常者における反復配列の繰り返し数が50以下である疾病を選択し、CCGが50回反復してなるプローブ６を作成した。
【００９３】
プローブ５とプローブ６には、蛍光標識を施してある。
【００９４】
まず、診断すべき被験者から両トリプレット病の指標となる検体DNAを含む検体を採取した。
【００９５】
該検体中には、反復配列１(CAGが20回以下反復されてなる反復配列)又は反復配列２(CAGが21回以上反復されてなる反復配列)が含まれており(図５参照)、反復配列１と反復配列２は第一のトリプレットリピート病の有無を診断するための指標となる。前記検体中には、反復配列３(CCGが50回以下反復されてなる反復配列)又は反復配列４(CCGが51回以上反復されてなる反復配列)も含まれており(図５参照)、反復配列３と反復配列４は第二のトリプレットリピート病の有無を診断するための指標となる。
【００９６】
プローブ５とプローブ６及び前記検体を反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００９７】
該反応によって、反復配列１は、プローブ５とハイブリダイズして、ハイブリッド７(図５)を形成する。反復配列１は、プローブ５より長くないので、ハイブリッド７に一本鎖部分が生じる場合には、該一本鎖部分はプローブ５の一部によって構成される。一方、反復配列２もプローブ５とハイブリダイズして、ハイブリッド８を形成するが、反復配列２は、プローブ５より長いので、ハイブリッド８の一本鎖部分は、反復配列２の一部によって構成される。
【００９８】
ハイブリダイゼーション反応によって、反復配列３は、プローブ６とハイブリダイズして、ハイブリッド９を形成する。反復配列３は、プローブ６より長くないので、ハイブリッド９に一本鎖部分が生じる場合には、該一本鎖部分はプローブ６の一部によって構成される。一方、反復配列４もプローブ６とハイブリダイズして、ハイブリッド１０を形成するが、反復配列４は、プローブ６より長いので、ハイブリッド１０の一本鎖部分は、反復配列４の一部によって構成される。
【００９９】
ハイブリダイゼーション反応に続いて二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、前記各ハイブリッド中の一本鎖部分を消化した。
【０１００】
検体が第一のトリプレットリピート病に罹患していない正常者から採取された場合、前記検体には、反復配列１が含まれるので、ハイブリッド７が形成される。図５のように、ハイブリッド７の一本鎖部分は、プローブ５の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が20未満の二本鎖ハイブリッド１２が得られるとともに、蛍光標識されたヌクレオチドが遊離する。これに対して、検体が第一のトリプレットリピート病に罹患した患者から採取された場合、前記検体には、反復配列２が含まれるので、ハイブリッド８が形成される。図５のように、ハイブリッド８の一本鎖部分は、反復配列２の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が20の二本鎖ハイブリッド１１が得られるが、蛍光標識されたヌクレオチドは遊離しない。
【０１０１】
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第一のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０２】
さらに、検体が第二のトリプレットリピート病に罹患していない正常者から採取された場合、前記検体には、反復配列３が含まれるので、ハイブリッド９が形成される。図５のように、ハイブリッド９の一本鎖部分は、プローブ６の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が50以下の二本鎖ハイブリッド１４が得られるとともに、蛍光標識されたヌクレオチドが遊離する。これに対して、検体が第二のトリプレットリピート病に罹患した患者から採取された場合、前記検体には、反復配列４が含まれるので、ハイブリッド１０が形成される。図５のように、ハイブリッド１０の一本鎖部分は、反復配列４の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が50の二本鎖ハイブリッド１３が得られるが、蛍光標識されたヌクレオチドは遊離しない。
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第二のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０３】
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第二のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０４】
以上の結果を下表にまとめる。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
以上、本実施例によれば、２種類のトリプレットリピート病を同時に検査することが可能となる。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、簡便な操作で反復配列の多型を短時間に分析できる。
【０１０８】
［参考文献］
(1) Martin, J.B.:Ann. Neurol., 34, 757-773 (1993)
(2) La Spada, A.R.:Ann. Neurol., 36, 814-822 (1994)
(3) Ross, C.A.:Neurol., 36, 814-822 (1994)
(4) Southern E.M.:J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)
(5) Verkerk, A.J.M.H.:Cell, 65, 905-914 (1991)
(6) Fu, T.:Cell, 67, 1047-1058 (1991)
(7) Fordor, S.P.A.:Science, 251, 767-773 (1991)
(8) Schena, M.:Science, 270, 460-470 (1995)
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に使用し得る検出システムの模式図。
【図２】蛍光相関分光法による反復配列の分析の概念を表す図。
【図３】実施例１の方法を示す図。
【図４】実施例２の方法を示す図。
【図５】実施例３の方法を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光相関分光法を用いて反復配列の多型を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学・遺伝学の進歩により、多数の遺伝性神経疾患の原因遺伝子が同定されてきた(1)（かっこ内の数字は、本発明の属する分野における現状をより的確に把握し得るように、本明細書に引用した参照文献の番号を示す。これらの参照文献のリストは、図面の簡単な説明の前に記載されている）。その中には、塩基の置換、欠失、挿入、重複等の変異ではなく、トリプレットリピート（3塩基反復配列）の異常な伸長が原因で発症する疾患（トリプレットリピート病）(2,3)が新たに見出されている。
【０００３】
これらの疾患では、同一家系内においても症状が異なる臨床的多様性、世代を経るごとに若年化する表現促進現象、疾患を伝えた親の性によって次世代の重症度が異なる等の現象が観察され、臨床遺伝学的な観点から興味が持たれている。
【０００４】
トリプレットリピートの存在する遺伝子上の領域に基づいて、今日までに見出されたトリプレットリピート病を整理すると、トリプレットリピートの伸長が、(1)5’末端の非翻訳領域に存在する脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞症、(2)翻訳領域に存在する球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症1型、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、マチャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型、(3)3’末端の非翻訳領域に存在する筋緊張性ジストロフィー、(4)イントロン内に存在するフリートライヒ失調症がある。
【０００５】
これらの疾患の原因遺伝子におけるリピート数は、健常者ではおよそ40リピート以下の一定の範囲に分布し、この範囲の中で著しい多型を示すことが多い。一方、患者におけるリピート数の増大の程度は、タンパク質の翻訳領域に存在するトリプレットリピートの場合は、約40〜100リピート程度であるのに対して、非翻訳部位やイントロンに存在するトリプレットリピートの場合は、約200〜1000リピート以上という著しい増大を示す。これら原因遺伝子の生理的機能については、球脊髄性筋萎縮症がアンドロゲン受容体を、脊髄小脳失調症６型が電位依存性Ca2+チャネルのα1Aサブユニットをコードしていることが分かっている以外は不明である。
【０００６】
これらの疾患の原因遺伝子の反復配列の繰り返し数を測定する方法には、以下のような方法がある。
【０００７】
まず、最も古典的な方法は、サザンブロットを利用する方法であり、概略は以下のとおりである。
【０００８】
(1) 既知の制限酵素でゲノムDNA切片を切断して、多くのDNA断片を作製する。
【０００９】
(2) 該DNA断片をゲル電気泳動にかけて分画した後、得られた電気泳動パターンをナイロン膜上にサザンブロットする(4)。
【００１０】
(3) 目的遺伝子と特異的にハイブリダイズできる標識DNAプローブと前記サザンブロットされたDNA断片とのハイブリダイゼーションを行う。
【００１１】
(4) 標識プローブが結合した電気泳動パターン上のバンドを検出することによって、上記の目的遺伝子の反復配列の繰り返し数を決定する(5)。
【００１２】
また、PCRによる多型分析の一態様として、反復配列の繰り返し数を決定する方法も盛んに行われている。該方法では、検出すべき反復配列を増幅し得るプライマーを用いて該配列を増幅した後、増幅産物を電気泳動し、染色又はオートラジオグラフィー等を用いて該産物を検出している(6)。
【００１３】
しかし、両分析方法は何れも、電気泳動法やブロッティング法のように、複雑な実験操作を必要とするので、多大な労力及び時間を要する。また、ブロッティング法、PCR法とも電気泳動を用いるため、多検体・多項目を処理するのが困難であるのみならず、繰り返し数を正確に測定するためには、1塩基の差異を検出し得る極めて精度の高い電気泳動を行わなければならない。さらに、目的の遺伝子を検出するための標識として、32P等の放射性アイソトープを用いる場合には、関係法令によって取扱者が限定されるという問題もある。
【００１４】
一方、これらの分析法とは全く異なる方法として、近年、ジーンチップ（マイクロアレイ）と呼ばれる基板上にオリゴヌクレオチドを合成する方法と(7)、スライドグラス等にPCR産物やプラスミドDNAをスポットする方法(8)が開発された。これらの方法では、約1万個のクローンがアレイ化され、遺伝子の塩基配列決定、単塩基多型、ジーンハンティング、遺伝子発現モニタリング等の遺伝子解析への適用が試みられている。これらの方法は、多種類のDNAプローブによって効率よく測定できるために、多数の検体を同時に検出することが可能であるという利点を有している。
【００１５】
しかしながら、塩基配列に大きな差違がある核酸群から特定の核酸を検出する場合とは異なり、各反復配列の多型は繰り返し数のみが異なるにすぎないので、各反復配列を識別するためには、各反復配列とプローブとの会合・解離状態を微妙に調整するための複雑な手段が必要であるが、上述の方法では、このような精密な制御は不可能である。また測定が、乾燥状態で行われるために、ハイブリダイゼーションの変化をリアルタイムで検出し得ないという欠点も有している。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な操作で反復配列の多型を短時間に分析できる方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、本発明は、
反復配列の多型を分析する方法であって、
（１）反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
（２）前記標的核酸を標識する工程と；
（３）標識した標的核酸を検出する工程と；
（４）蛍光相関分光法を用いて検出結果を解析することにより、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、標的核酸中に含まれる反復配列の多型を分析する方法を提供する。
【００１９】
本明細書において、「反復配列」とは、AGTAGTAGTのごとく、同一、あるいは極めて類似した「反復単位」が反復されてなる塩基配列を意味する。
【００２０】
本明細書において「多型」とは、同一の遺伝子座を占める複数の対立遺伝子の型をいう。従って、「多型を分析する」とは、このような対立遺伝子の型を推定し、必要に応じて決定することを意味する。
【００２１】
反復配列の場合、反復単位の繰り返し数の相違によって対立遺伝子の型が決まるので、「反復配列の多型を分析する」とは、反復配列の繰り返し数を推定し、必要に応じて決定することをいう。ここで、反復単位の「繰り返し数」とは、反復配列中に含まれる反復単位の個数を意味する。上記事例の場合、AGTが「反復単位」であり、「繰り返し数」は3回である。
【００２２】
本発明の方法によれば、同一の反復単位を有するが、繰り返し数が異なる2以上の核酸を簡易な操作で区別することができ、必要であれば、繰り返し数を決定することも可能である。
【００２３】
本発明の方法を実施するためには、まず、反復配列を有する核酸を含む検体を準備する。反復配列の繰り返し数は、トリプレットリピート病等の疾病の診断指標となり得るので、前記検体は、典型的には、疾病の有無を診断すべき被験者から採取する。
【００２４】
ここで、「トリプレットリピート病」とは、３塩基を単位とする縦列反復配列が繰り返し数の増加によって伸長することにより発症する遺伝性疾患をいう。トリプレットリピート病には、脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞症、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症1型、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、マチャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型、筋緊張性ジストロフィー、フリートライヒ失調症が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の方法に供すべき「検体」には、血液、唾液、精液などの体液、血球成分、生検組織、培養細胞等を溶解又は懸濁したものであり得るがこれらに限定されない。
【００２６】
被験者から検体を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作を行う。核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の慣用法を使用し得る。
【００２７】
検体中の核酸の量が少ないときには、核酸を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(以下PCRと略記する)によって行い得る。しかしながら、本発明の方法は、感度が非常に高いので、従来の方法では必須であった増幅操作を省略し得る。
【００２８】
必要に応じて核酸を抽出し、又は増幅した後、検出可能な標識、好ましくは蛍光標識を用いて、検体中の前記核酸（以下、標的核酸という）を標識する。以下に記載されているように、蛍光相関分析法を用いて標的核酸を検出、測定する場合には、検出可能な標識は蛍光標識でなければならない。
【００２９】
標的核酸を標識するためには、標識核酸中に、検出可能な標識を有するヌクレオチドを直接導入すればよい。あるいは、標的核酸と相補的な標識プローブとハイブリダイズさせてもよい。
【００３０】
ジデオキシヌクレオチド３リン酸とデオキシヌクレオチド３リン酸の混合物を用いて標識を導入すれば、反復配列だけを標識できる。例えば、CGAが反復してなる反復配列の場合、デオキシCTP、デオキシGTP、デオキシATP（３種類のデオキシヌクレオチド３リン酸のうち少なくとも１種類はラベルされている）、及びジデオキシTTPの混合物とプライマーとを混合し、該プライマーを伸長させる。反復配列にはチミンが含まれていないので、プライマーが反復配列の末端に到達するまでは、プライマーの伸長を停止させるジデオキシTTPがプライマーに取り込まれない。プライマーが反復配列の末端に到達すれば、ジデオキシTTPがプライマーに取り込まれるので、プライマーの伸長が停止する。反復配列の繰り返し数を測定する場合、反復配列以外の部分が標識されていると測定精度が低下するので、このような方法によって、反復配列部分のみを標識することが好ましい。
【００３１】
検出可能な標識を用いて標的核酸を標識した後、検体中に存在する標的核酸、好ましくは、測定感度を上げるために検体中の「微小空間」に存在する標的核酸を検出する。
【００３２】
ここで、「微小空間」とは、容積が10-21L（1nm四方の立方体の体積に相当する）〜10-3L、典型的には10-18L〜10-9L、最も典型的には10-15L〜10-12Lの空間をいう。微小空間の形状は、球状、円錐状、立方体状、直方体状等任意の形状であり得る。
【００３３】
標的核酸は、標的核酸中に導入された標識、又はプローブ中の標識を検出することによって検出される。微小空間の容積は極めて小さいので、微小空間に存在する標的核酸を検出する場合、レーザー光を用い、顕微鏡視野下において、蛍光を検出することが好ましい。
【００３４】
このような検出は、典型的には、図1に示すような共焦点顕微鏡によってなし得る。共焦点顕微鏡自体は、本分野で公知である。
【００３５】
共焦点顕微鏡を用いた検出は、
１．レーザー光を励起光として照射する；
２．フィルター(IF)を通過させた後、レーザー光を集光し、ダイクロイックミラー(DM)によって試料中の一点にレーザー光を照射する；
３．試料中の蛍光物質をレーザー光で励起して発光させる；
４．ピンホールを通過させることにより、試料の焦点中の蛍光物質から発せられた蛍光のみを光増倍管(PMT)で増幅する
５．増幅した蛍光を検出する
ことによってなされる。
【００３６】
図では、アルゴンイオンレーザーが例示されているが、蛍光物質の種類に応じて、波長の異なるクリプトンアルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、ヘリウムカドミニウムレーザーも使用できる。また、図１は、典型的な共焦点顕微鏡の模式図にすぎないので、図１に記載の共焦点顕微鏡以外のシステムも当然使用できる。
【００３７】
このような検出方法は、微少な一点から発せられる蛍光のみを検出するので、バックグラウンドがなく、通常の蛍光検出に比べて著しく感度が高い。標的核酸の検出は、一般的にはミリ秒〜分の単位、最も一般的には秒の単位で行われる。
【００３８】
検出結果が得られたら、該結果を解析して、標的核酸の反復単位の種類、繰り返し数等を決定する。
【００３９】
結果の解析は、検出結果の「解析」は、蛍光相関分析法によって行うのが好ましい。ここで、「蛍光相関分析法（以下FCS(fluorescence correlation spectrometry)と称する）」とは、微小空間内に存在する平均数個（ある場合には一個）の蛍光物質が発する蛍光の強度を一定時間測定した後、ブラウン運動に由来する蛍光のゆらぎの自己相関関数をとり、該関数の分析によって、蛍光物質に関する種々のデータを取得する方法をいう。FCS自体は公知であり、その詳細については、特表平11-502608を参照されたい。
【００４０】
FCSを用いて、標的核酸を同定するには、以下の操作を行う。
【００４１】
１．図２ａ)に示されている微小空間にレーザー光を照射する。
【００４２】
２．該微小空間中に存在する蛍光物質から発せられる蛍光の強度を経時的に測定し、図２ｂ）及び図２ｃ）に示されているデータを取得する。
【００４３】
３．異なる２時点の蛍光強度I(t)とI(t+τ)の積の期待値を計算し、自己相関関数G(τ)＝<I(t) I(t+τ)>を得る。
【００４４】
４．下式１：
【００４５】
【式１】
（ここで、Ｎ：蛍光分子の平均数
τsmall＝wo2/4Dsmall：サイズが小さい核酸の並進拡散時間
τlarge＝wo2/4Dlarge ：サイズが大きい核酸の並進拡散時間
y=繰り返し数が多い反復配列の割合
S=wo/zoである
（なお、woは検出領域の径、2zoは領域長、DsmallとDlargeは、それぞれサイズが小さい核酸及びサイズが大きい核酸の並進拡散定数である））
を用いて、３．で得た自己相関関数を解析する。
【００４７】
FCSによるデータ解析には、Evotec BioSystems社から発売されているコンピュータープログラム「FCS」を使用できる。１〜４までの操作時間は、１つの標的核酸当り10秒未満であり得る。
【００４８】
このような分析の概念は、図２ｂ）及び図２ｃ）によって、より明確となろう。すなわち、サイズが小さい場合にはブラウン運動の速度が大きいので、I(t)が大きい。これに対して、サイズが大きい場合にはブラウン運動の速度が小さいので、I(t)の周波数が小さい。
【００４９】
従って、式(1)を用いれば、標識された核酸のサイズ、各核酸の割合を推定し得る。必要であれば、以下に記載した方法を用いて、核酸のサイズを正確に決定することも可能である。
【００５０】
以上のように、本発明の方法の最も基本的な態様は、
(1)反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
(2)前記標的核酸を標識する工程と；
(3)標識した標的核酸を検出する工程と；
(4)検出結果を解析することにより反復配列の多型を分析する工程と
を具備する。
【００５１】
本発明は、標識した標的核酸の一本鎖部分を分解して、前記一本鎖部分が除去された標的核酸と遊離のヌクレオチドとを生成せしめる工程をさらに備えた方法も提供する。
【００５２】
より具体的には、該方法は、
反復配列の多型を分析する方法であって、
（１）反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
（２）前記反復配列を標識する工程と；
（３）前記反復配列と相補的なプローブと前記反復配列とをハイブリダイズさせて、前記プローブと前記標的核酸からなるハイブリッドを形成せしめる工程と；
（４）前記ハイブリッド中の一本鎖部分を消化して、前記標的核酸から標識ヌクレオチドを遊離させ、遊離した標識ヌクレオチドと二本鎖ハイブリッドとを生成せしめる工程と；
（５）前記遊離した標識ヌクレオチドを検出又は定量することによって、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法である。
【００５３】
該方法によれば、反復配列の反復回数を正確に決定できる。
【００５４】
該方法を実施するには、まず反復配列を有する標的核酸を被験者から採取して、反復配列部分のみを標識する。標的核酸の採取法は、上述のとおりである。反復配列部分のみを標識するには、反復配列の相補鎖を鋳型にして、上述のジデオキシ三リン酸を用いた方法で標識ヌクレオチドを導入するのが簡便である。
【００５５】
標的核酸を標識した後、プローブに接触させる。該プローブは、反復配列を構成する反復単位と相補的な塩基配列を有するように調製する。従って、該標識プローブは、標識された反復配列とハイブリダイズし得る。
【００５６】
該方法によって反復配列の繰り返し数を決定するためには、該反復配列より短いプローブを使用する。このようなプローブと標識された反復配列とをハイブリダイズさせれば、標識された反復配列の末端が一本鎖として延出したハイブリッドが形成される。
【００５７】
該ハイブリッドを一本鎖特異的ヌクレアーゼによって消化すれば、前記ハイブリッドの一本鎖部分、すなわち一本鎖として延出している標識された反復配列の末端部分のみが消化される。標識された反復配列には標識ヌクレオチドが導入されているので、標識された反復配列を消化すれば、標識ヌクレオチドが遊離する。一本鎖特異的ヌクレアーゼとしては、S1ヌクレアーゼ又はExoIヌクレアーゼを使用し得る。
【００５８】
標識ヌクレオチドが遊離すれば、標的配列中の反復配列がプローブよりも長いことを意味している。反対に、標識されたヌクレオチドが遊離されなかった場合、標的核酸中の反復配列がプローブよりも長くないことを意味している。それ故、標識されたヌクレオチドが遊離されるか否かを調べることにより、反復配列の繰り返し数が、所定の回数を超えるか否かを知ることができる。多くの疾病では、正常者に比べて、繰り返し数は増加する。それ故、正常者の反復配列より長く、患者の反復配列より短いプローブを用いれば、被験者が疾病に罹患しているか否かを診断し得る。
【００５９】
さらに、プローブの繰り返し数は既知なので、遊離したヌクレオチドの濃度と消化されたハイブリッドの濃度を測定すれば、一つのハイブリッドから遊離したヌクレオチド個数を算出することができる。これによって、標的核酸中に含まれる反復配列の繰り返し数を正確に決定できる。
【００６０】
上述した蛍光相関分光法を用いれば、遊離したヌクレオチドの濃度及び消化されたハイブリッドの濃度をリアルタイムに測定し得る。
【００６１】
本方法によれば、２種類又はそれ以上の標的核酸の反復配列を同時に分析することも可能である。
【００６２】
反復単位が異なる２種類の標的核酸を同時に分析するには、両核酸の反復配列をそれぞれ異なる標識でラベルするのが簡便であり、１種類の標的核酸を分析する場合と同様の操作で反復配列の長さを決定できる。
【００６３】
蛍光相関分光法を用いれば、ハイブリッドのサイズ及び存在比率、遊離したヌクレオチドの量を容易に測定できる。従って、蛍光相関分光法を用いる場合には、両反復配列の長さ又は各プローブの長さが異なれば、標識が同じでも、2種類のハイブリッドを容易に区別することができる。
【００６４】
なお、上記の方法では、標的核酸の反復配列を標識したが、これに代えて、標識したプローブを用いてもよい。この場合には、プローブが反復配列より長いときに、標識ヌクレオチドが遊離する。その他の操作は、反復配列を標識した場合と同じである。
【００６５】
以下、実施例により、本発明の方法をさらに詳細に説明する。
【００６６】
［実施例１］
本実施例では、球脊椎性筋萎縮症(以下SBMAと略記する)患者のアンドロゲン受容体遺伝子中の反復配列の繰り返し数を測定することにより、被験者がSBMAに罹患しているか否かを診断する方法について説明する。
【００６７】
アンドロゲン受容体遺伝子には、該受容体のN末端近傍をコードする部分にCAG反復配列が存在する。正常人では、該反復配列の繰り返し数は約20であるのに対して、SBMA患者では40〜60に増加することが報告されている(7)。
【００６８】
従って、アンドロゲン受容体遺伝子中に含まれる該反復配列の繰り返し数を測定することにより、被験者がSBMAに罹患しているか否かを診断することができる。
【００６９】
以下、本実施例の方法について説明する。
【００７０】
まず、正常な繰り返し数（本実施例の場合20回）をするプローブを作成した。
【００７１】
次に、被験者から採取したDNA検体を図１のように蛍光標識した。検体には、蛍光標識したdATP、未標識のdCTP、dGTP、ddTTP（ジデオキシTTP）とプライマーを用いた伸長反応によって、蛍光標識を導入した。ddTTPを用いることにより、T（チミン）の位置で伸長反応が停止するので、反復配列のみを蛍光標識し得る。
【００７２】
続いて、正常者又はSBMA患者由来のDNA検体と該プローブを反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００７３】
図３に示されているように、正常者から採取した検体DNAは、プローブより長くないので、プローブの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる。一方、SBMA患者から採取した検体DNAは、プローブより長いので、検体DNAの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる（図３参照）。
【００７４】
ハイブリダイゼーション反応に続いて、プローブと検体DNAからなるハイブリッドに、二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、一本鎖部分を消化した。
【００７５】
図３に示されているように、該反応によって、一本鎖部分は分解されてヌクレオチドになり、二本鎖部分のみからなるハイブリッドが生成される。
【００７６】
前述のように、正常者由来のハイブリッドの一本鎖部分はプローブの一部によって構成されるので、正常者由来のハイブリッドを消化すると、プローブの一部が分解される。これに対して、SBMA患者由来のハイブリッドの一本鎖部分は検体DNAの一部によって構成されるので、SBMA患者由来のハイブリッドを消化すると、検体DNAの一部が分解される。
【００７７】
検体DNAは標識ヌクレオチドを含むので、SBMA患者由来のハイブリッドの分解産物には標識ヌクレオチドが遊離する。これに対して、プローブは標識ヌクレオチドを含まないので、正常者由来のハイブリッドの分解産物には標識ヌクレオチドが遊離しない。
【００７８】
蛍光分子の挙動すなわち蛍光強度とゆらぎの関係は、分子が小さい場合は速く、分子が大きいと遅い。このため、正常者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が短くなるのに対して、SBMA患者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が長くなり、相関時間の長短によって両者を判別できる。
【００７９】
さらに、SBMA患者由来のハイブリッドの分解産物からは、標識ヌクレオチドが観察されるのに対して、正常者のそれからは、殆ど標識ヌクレオチドが観察されないことを指標として、反復配列の長さを判定することもできる。
【００８０】
また、SBMA患者の場合、標識ヌクレオチドと二本鎖部分の両者が標識されているので、二本鎖部分と標識ヌクレオチドの濃度を計算することができる。具体的には、ヌクレオチドの数を二本鎖の分子数で割り、プローブの繰り返し数20を加算すれば、SBMA患者の反復配列の繰り返し数が得られる。
【００８１】
なお、本実施例では、一本鎖特異的ヌクレアーゼ処理を行い、反復配列の繰り返し数を正確に決定する方法を説明したが、一本鎖特異的ヌクレアーゼ処理を行わずに、反復配列の繰り返し数の概数を推定してもよい。
【００８２】
［実施例２］
本実施例では、実施例１とは反対に、プローブを蛍光標識した場合の検査方法について説明する。
【００８３】
まず、正常な繰り返し数（本実施例の場合20回）を有し、全てのA（アデニン）が蛍光標識されたプローブを作成した。続いて、正常者又はSBMA患者由来のDNA検体と該プローブを反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００８４】
図４に示されているように、正常者から採取した検体DNAは、プローブより長くないので、プローブの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる。一方、SBMA患者から採取した検体DNAは、プローブより長いので、検体DNAの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる（図４参照）。
【００８５】
ハイブリダイゼーション反応に続いて、プローブと検体DNAからなるハイブリッドに、二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、一本鎖部分を消化した。
【００８６】
図４に示されているように、該反応によって、一本鎖部分は分解されてヌクレオチドになり、二本鎖部分のみからなるハイブリッドが生成される。
【００８７】
正常者由来のハイブリッドの一本鎖部分はプローブの一部によって構成されるので、正常者由来のハイブリッドを消化すると、プローブの一部が分解される。これに対して、SBMA患者由来のハイブリッドの一本鎖部分は検体DNAの一部によって構成されるので、SBMA患者由来のハイブリッドを消化すると、検体DNAの一部が分解される。
【００８８】
検体DNAは標識ヌクレオチドを含まないので、SBMA患者由来のハイブリッドからは標識ヌクレオチドが遊離しない。これに対して、プローブは標識ヌクレオチドを含むので、正常者由来のハイブリッドからは標識ヌクレオチドがする。
【００８９】
蛍光分子の挙動すなわち蛍光強度とゆらぎの関係は、分子が小さい場合は速く、分子が大きいと遅い。このため、正常者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が短くなるのに対して、SBMA患者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が長くなり、相関時間の長短によって両者を判別できる。
【００９０】
［実施例３］
本実施例では、２種類のトリプレットリピート病を同時に検査する方法について説明する。
【００９１】
第一のトリプレットリピート病としては、正常者における反復配列の繰り返し数が20以下である疾病を選択し、CAGが20回反復してなるプローブ５を作成した。
【００９２】
第ニのトリプレットリピート病としては、正常者における反復配列の繰り返し数が50以下である疾病を選択し、CCGが50回反復してなるプローブ６を作成した。
【００９３】
プローブ５とプローブ６には、蛍光標識を施してある。
【００９４】
まず、診断すべき被験者から両トリプレット病の指標となる検体DNAを含む検体を採取した。
【００９５】
該検体中には、反復配列１(CAGが20回以下反復されてなる反復配列)又は反復配列２(CAGが21回以上反復されてなる反復配列)が含まれており(図５参照)、反復配列１と反復配列２は第一のトリプレットリピート病の有無を診断するための指標となる。前記検体中には、反復配列３(CCGが50回以下反復されてなる反復配列)又は反復配列４(CCGが51回以上反復されてなる反復配列)も含まれており(図５参照)、反復配列３と反復配列４は第二のトリプレットリピート病の有無を診断するための指標となる。
【００９６】
プローブ５とプローブ６及び前記検体を反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００９７】
該反応によって、反復配列１は、プローブ５とハイブリダイズして、ハイブリッド７(図５)を形成する。反復配列１は、プローブ５より長くないので、ハイブリッド７に一本鎖部分が生じる場合には、該一本鎖部分はプローブ５の一部によって構成される。一方、反復配列２もプローブ５とハイブリダイズして、ハイブリッド８を形成するが、反復配列２は、プローブ５より長いので、ハイブリッド８の一本鎖部分は、反復配列２の一部によって構成される。
【００９８】
ハイブリダイゼーション反応によって、反復配列３は、プローブ６とハイブリダイズして、ハイブリッド９を形成する。反復配列３は、プローブ６より長くないので、ハイブリッド９に一本鎖部分が生じる場合には、該一本鎖部分はプローブ６の一部によって構成される。一方、反復配列４もプローブ６とハイブリダイズして、ハイブリッド１０を形成するが、反復配列４は、プローブ６より長いので、ハイブリッド１０の一本鎖部分は、反復配列４の一部によって構成される。
【００９９】
ハイブリダイゼーション反応に続いて二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、前記各ハイブリッド中の一本鎖部分を消化した。
【０１００】
検体が第一のトリプレットリピート病に罹患していない正常者から採取された場合、前記検体には、反復配列１が含まれるので、ハイブリッド７が形成される。図５のように、ハイブリッド７の一本鎖部分は、プローブ５の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が20未満の二本鎖ハイブリッド１２が得られるとともに、蛍光標識されたヌクレオチドが遊離する。これに対して、検体が第一のトリプレットリピート病に罹患した患者から採取された場合、前記検体には、反復配列２が含まれるので、ハイブリッド８が形成される。図５のように、ハイブリッド８の一本鎖部分は、反復配列２の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が20の二本鎖ハイブリッド１１が得られるが、蛍光標識されたヌクレオチドは遊離しない。
【０１０１】
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第一のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０２】
さらに、検体が第二のトリプレットリピート病に罹患していない正常者から採取された場合、前記検体には、反復配列３が含まれるので、ハイブリッド９が形成される。図５のように、ハイブリッド９の一本鎖部分は、プローブ６の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が50以下の二本鎖ハイブリッド１４が得られるとともに、蛍光標識されたヌクレオチドが遊離する。これに対して、検体が第二のトリプレットリピート病に罹患した患者から採取された場合、前記検体には、反復配列４が含まれるので、ハイブリッド１０が形成される。図５のように、ハイブリッド１０の一本鎖部分は、反復配列４の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が50の二本鎖ハイブリッド１３が得られるが、蛍光標識されたヌクレオチドは遊離しない。
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第二のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０３】
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第二のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０４】
以上の結果を下表にまとめる。
【０１０５】
【表１】
以上、本実施例によれば、２種類のトリプレットリピート病を同時に検査することが可能となる。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、簡便な操作で反復配列の多型を短時間に分析できる。
【０１０８】
［参考文献］
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(8) Schena, M.:Science, 270, 460-470 (1995)
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に使用し得る検出システムの模式図。
【図２】蛍光相関分光法による反復配列の分析の概念を表す図。
【図３】実施例１の方法を示す図。
【図４】実施例２の方法を示す図。
【図５】実施例３の方法を示す図。
Claims (4)
- 反復配列の多型を分析する方法であって、
（１）被験者から採取された反復配列を有する標的核酸について、前記反復配列をジデオキシヌクレオチド３リン酸とデオキシヌクレオチド３リン酸とを用いて蛍光標識する工程と；
（２）前記反復配列と相補的な塩基配列を有するプローブと前記反復配列とをハイブリダイズさせて、前記プローブと前記蛍光標識された標的核酸からなるハイブリッドを形成せしめる工程と；
（３）前記ハイブリッドの一本鎖部分を消化して、前記蛍光標識された標的核酸から蛍光標識ヌクレオチドを遊離させ、遊離した蛍光標識ヌクレオチドと蛍光標識二本鎖ハイブリッドとを生成せしめる工程と；
（４）前記遊離した蛍光標識ヌクレオチド及び前記蛍光標識二本鎖ハイブリッドを、蛍光相関分光法を用いて検出又は定量することによって、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法。 - 反復配列の多型を分析する方法であって、
（１）被験者から採取された反復配列を有する標的核酸における前記反復配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブについて、ジデオキシヌクレオチド３リン酸とデオキシヌクレオチド３リン酸とを用いて蛍光標識する工程と、
（２）前記標的核酸の反復配列と前記蛍光標識プローブとをハイブリダイズさせて、前記蛍光標識プローブと前記標的核酸からなるハイブリッドを形成せしめる工程と；
（３）前記ハイブリッド中の一本鎖部分を消化して、前記蛍光標識プローブから蛍光標識ヌクレオチドを遊離させ、遊離した蛍光標識ヌクレオチドと蛍光標識二本鎖ハイブリッドとを生成せしめる工程と；
（４）前記遊離した蛍光標識ヌクレオチド及び前記蛍光標識二本鎖ハイブリッドを蛍光相関分光法を用いて検出又は定量することによって、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法。 - 第一のトリプレットリピート病の指標となる第一の反復配列および第二のトリプレットリピート病の指標となる第二の反復配列とを用いる請求項１に記載の方法。
- 第一および第二の反復配列をそれぞれ異なる蛍光標識で標識されてなる請求項３記載の方法。
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