JP2005501566A - 一試料中の異なる個体を起源とするdnaの検出方法 - Google Patents
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Abstract
第1の態様において、本発明は生物試料中の異なる個体を起源とするDNA種を識別するための方法を特徴とする。これらの方法は、母体試料中の胎児DNAを識別または検出するため、あるいは臓器提供者のDNAを臓器被提供者のDNAから識別するために用いることができる。好ましい実施形態において、DNA種は、DNAメチル化の差異などDNA種における後成的差異を観察することによって識別される。第2の態様において、本発明は、母親から得た生物試料中の胎児DNAを検出することにより、胎児における遺伝的異常を検出する方法を特徴とする。第3の態様において、本発明は臓器提供者を起源とするDNA種を臓器被提供者を起源とするDNA種から識別するための方法を特徴とする。第4の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNA種を識別するためのキットを特徴とする。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、一試料中の異なる個体を起源とするDNAの検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
体液中に異なる個体を起源とするDNAが存在していることは、多くの臨床上および生物学上の状況において周知の生物学的現象である。例えば、骨髄移植後、移植の被提供者の造血系は、種々の割合の提供者(ドナー)の細胞と被提供者(レシピエント)の細胞から構成されることになる。提供者の細胞または被提供者の細胞の量の確認は、性別(マンギオーニ(Mangioni)ら、Bone Marrow Transplant 第20巻:969〜73頁(1997))やDNA多型(ロークス(Roux)ら、Blood 第79巻:2775〜83頁(1992))を含む、提供者と被提供者との間の遺伝的差異を検出することによって行われてきた。この手法には、解析する領域が提供者と被提供者との間の遺伝的差異を保持していない場合に、現手法による分析が不可能となるという必然の結果を伴う。
【0003】
他の例として、妊娠中に母体の血漿および血清中の胎児DNAを検出することがすでに実証されている(ロー(Lo)ら、Lancet 第350巻:第9076号:485〜7頁(1997))。この技術は、母体の血漿および血清から単離した胎児DNAを、非侵襲的な出生前診断に使用できることを実証している(ロー(Lo)ら、N Eng J Med、第339巻(24):1734〜8頁(1998);ファース(Faas)ら、Lancet 第352巻(9135):1196頁(1998);アミカッチ(Amicucci)ら、Clin Chem 第46巻(2):301頁(2000);チェン(Chen)ら、Prenat Diagn 第20巻(4):355〜7頁(2000);サイトウ(Saito)ら、Lancet 第356巻:1170頁(2000))。この現象の臨床への応用は、母体の血漿および血清中に上記の胎児DNAが比較的高い絶対濃度および相対濃度で循環していることに助けられてきた(ロー(Lo)ら、Am J. Hum Genet 第62巻:768〜775頁(1998))。この手法を用いて、胎児のRh因子(D)の状態(ロー(Lo)ら、New Eng J Med 第339巻:1734〜1738頁(1998))、筋緊張性ジストロフィー(アミカッチ(Amicucci)ら、Clin Chem 第46巻:301〜302頁(2000))、軟骨無形成症(サイトウ(Saito)ら、Lancet 第356巻:1170頁(2000))およびある種の染色体転座(チェン(Chen)ら、Prenat Diag 第20巻:335〜357(2000);チェン(Chen)ら、Clin Chem 第47巻:937〜939頁(2001))を含む多くの状態の非侵襲的出生前検出が達成されてきている。これらの現行の手法のいずれも、母親のDNA配列とは遺伝的に識別可能な父親から受け継いだDNA配列の検出を利用している(ビアンチ(Bianchi)、Am J Hum Genet 第62巻(4):763頁(1998))。具体的には、母体の血漿または血清中において、母親から受け継がれた胎児DNAを検出することは不可能であると考えられていた。同様の限界が、母体の血液の細胞画分から単離した胎児有核細胞の検出についても記載されている(ロー(Lo)ら、Ann NY Acad Sci,第731巻:204頁(1994))。
【0004】
その他に、癌患者から異常にメチル化されたDNAを検出した事例もある。そうした事例は、肺(エステラー(Esteller)ら、Cancer Res 第59巻(1):67頁(1999))や肝臓の癌(ウォン(Wong)ら、Cancer Res 第59巻(1):71頁(1999))を含む様々な癌を有した患者について報告されている。
【0005】
最近では、後成的現象、すなわちDNA配列の変化を伴わずに表現型を変えるプロセスの生物学に大きな関心が寄せられている(ウォルフェ(Wolffe)、Science 第286巻:481〜486頁(1999))。最も特徴づけの進んでいる後成的プロセスの1つとしてDNAメチル化がある(ウォルフェ(Wolffe)ら、Curr Biol.第10巻:R463〜R465頁(1999))。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
DNA種の間の遺伝的ではなく後成的(エピジェネティックな)差異を用いて、生物の体液中の異なる個体を起源とするDNA種を識別する方法の価値は非常に高いと考えられる。例えば、母体試料中の胎児DNAを後成的に検出することにより、さらに別のスクリーニングや診断方法が可能になるという顕著な利点が提供されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0007】
第1の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNA種を識別するための方法を特徴とする。好ましい実施形態において、本発明の方法は、母体試料中の胎児DNAを識別または検出するために、あるいは臓器被提供者のDNAから臓器提供者のDNAを識別するために用いられる。
【0008】
当業者であれば、個体から得られた生物試料は任意の体液または細胞試料から採取しうることを認識しているであろうが、好ましい実施形態において、体液は血漿または血清である。好ましい実施形態において、DNA種は、DNAメチル化の違いなど、DNA種における後成的差異を観察することによって識別される。例えば、1つのDNA種が男性からものであり、1つのDNA種が女性からのものであるような状況において、後成的マーカーは、女性個体の不活性化されたX染色体とすることができる。そのような実施形態では、不活性化X染色体上のメチル化されたDNA配列を用いて、女性個体を起源とするDNAを検出することができる。いくつかの実施形態では、後成的差異を細胞内部で解析することができる。さらに、いくつかの実施形態において、後成的差異を、in situメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて解析することもできる。さらに、後成的差異を、それぞれの個体由来の細胞を選別または単離するために、あるいはそれぞれの個体からDNAを精製するために用いることもできる。本発明に従う方法は、DNA種の濃度を測定しながら実施しても、測定せずに実施してもよいが、好ましい実施形態においては、それぞれの後成的差異をもつDNA種の濃度が測定される。DNAメチル化の差異を後成的マーカーとするような実施形態において、このような濃度測定には、それぞれのDNAメチル化の差異を測定することが伴う。特に好ましい実施形態において、亜硫酸水素ナトリウムを生物試料かDNA種に直接加えて、DNAメチル化の差異を検出する。しかしながら、他の実施形態において、当業者によって周知のように、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を、DNAメチル化差異を検出するために用いることもできる。さらに別の実施形態において、DNAシーケンシングまたはプライマー伸長法を用いてメチル化の差異を検出することもできる。
【0009】
第2の態様において、本発明は、母親から得た生物試料中の胎児DNAを検出することにより、胎児における異常を検出する方法を特徴とする。本発明に従う方法は、DNAメチル化の差異などの後成的マーカーに基づいて母体DNAから胎児DNAを識別することにより、母体試料中の胎児DNAを検出することを図る。このような方法を用いると、遺伝的異常もしくは遺伝性の疾病を予示する胎児DNAを同定することができ、これにより出生前診断のための方法が提供される。これらの方法は、疾病状態にメチル化の変化が伴うと同定されている任意かつ全ての妊娠関連症状に適用することができる。診断可能な疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが21トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【0010】
本発明の第1の態様の広義の識別方法と同様に、母親から得る生物試料は好ましくは血漿または血清である。母体と胎児のDNA間の識別は、母体の血漿または血清中の胎児DNAの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。胎児DNAを定量する実施形態において、測定された濃度は、妊娠関連疾患を予測、監視または診断もしくは予後判定するために用いることができる。好ましい実施形態では、胎児由来の個々の後成的指標(マーク)が胎児疾患に関連づけられ、いくつかの実施形態では、胎盤中の胎児細胞内の後成的特徴が母体の血漿または血清における胎児特異的指標(マーカー)として用いられる。
【0011】
第3の態様において、本発明は、臓器提供者を起源とするDNA種を、臓器被提供者のDNA種から識別するための方法を特徴とする。本発明の第1の態様の広義の識別方法と同様に、得られる生物試料は好ましくは血漿または血清である。臓器提供者からのDNAと臓器被提供者からのDNAとの間の識別、または潜在的臓器提供者からのDNAと潜在的臓器被提供者からのDNAとの間の識別は、生物試料中のDNAの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。本実施形態は、移植が骨髄移植である事例において特に有用である。このような測定は、特に臓器拒絶反応に関して移植の被提供者の臨床経過を予測するために用いることができる。
【0012】
第4の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNAを識別するためのキットを特徴とする。そのようなキットは、例えば、母体生物試料中の胎児DNAの有無を識別または検出するために、あるいは、臓器提供者または潜在的臓器提供者由来のDNAを、臓器被提供者または潜在的臓器被提供者由来のDNAから識別するために有用である。本発明のキットは、母体DNAのメチル化状態を確認するための亜硫酸水素ナトリウムなど1つ以上の試薬と、DNAの有無を検出するためのゲルなど1つ以上の試薬とを含む。さらに、上記キットは、試料中に存在するDNAの量を増幅するための1つ以上の試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するための1つ以上の試薬などを含んでいてもよい。そのような試薬は当業者によって周知である。さらに、上記キットは、母体DNA試料を得るための1つ以上の装置を含んでいてもよい。そのような装置は当業者によって周知である。特に本発明のキットは、遺伝的異常、例えば胎児中に存在するDNA配列の全部または一部における変異、置換または欠失などに全体的または部分的に起因する疾病を診断するために用いることができる。診断しうる疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが21トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0013】
第1の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNA種を識別するための方法を特徴とする。好ましい実施形態において、本発明の方法は、母体試料中の胎児DNAを識別または検出するために、あるいは臓器被提供者のDNAから臓器提供者のDNAを識別するために用いられる。
【0014】
当業者であれば、個体由来の生物試料は任意の体液または細胞試料から採取しうることを認識しているであろうが、好ましい実施形態において、体液は血漿または血清である。好ましい実施形態において、DNA種は、DNAメチル化の違いなど、DNA種における後成的差異を観察することによって識別される。例えば、1つのDNA種が男性からものであり、1つのDNA種が女性からのものであるような状況において、後成的マーカーは、女性個体の不活性化されたX染色体とすることができる。そのような実施形態では、不活性化X染色体上のメチル化されたDNA配列を用いて、女性個体を起源とするDNAを検出することができる。いくつかの実施形態では、後成的差異を細胞内部で解析することができる。さらに、いくつかの実施形態において、後成的差異は、in situメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて解析することもできる。さらに、後成的差異は、それぞれの個体由来の細胞を選別または単離するために、あるいはそれぞれの個体からDNAを精製するために用いることもできる。本発明に従う方法は、DNA種の濃度を測定しながら実施しても、測定せずに実施してもよいが、好ましい実施形態においては、それぞれの後成的差異をもつDNA種の濃度が測定される。DNAメチル化の差異を後成的マーカーとするような実施形態において、このような濃度測定には、それぞれのDNAメチル化の差異を測定することが伴う。特に好ましい実施形態において、亜硫酸水素ナトリウムを生物試料かDNA種に直接加えて、DNAメチル化の差異を検出する。しかしながら、他の実施形態において、当業者によって周知のように、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を、DNAメチル化差異を検出するために用いることもできる。さらに別の実施形態において、DNAシーケンシングまたはプライマー伸長法を用いてメチル化の差異を検出することもできる。
【0015】
本明細書中で用いる「生物試料」という用語は、生きた生物から得たあらゆる体液もしくは細胞試料またはそれらの混合物を包含するものとする。具体的には、上記用語は組織バイオプシー、血清、血漿または羊水試料を含む。
【0016】
本明細書中で用いる「後成的差異」という用語は、一次ヌクレオチド配列以外の任意の分子上または構造上の差異を包含するものとする。例えば、上記用語はメチル化の差異を含みうる。
【0017】
本明細書中で用いる「DNA」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子断片、および完全な遺伝子配列などの、2つ以上のヌクレオチドからなる任意の配列を包含するものとする。
【0018】
本明細書中で用いる「メチル化特異的PCR」という用語は、DNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理してからPCR増幅に供する方法を記述するために用いられる。この技法は、DNAを亜硫酸水素塩で処理することにより、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換されるという原理に基づいている。一方、メチル化されているシトシン残基は変化しない。したがって、亜硫酸水素変換後のメチル化ゲノム領域と非メチル化ゲノム領域のDNA配列は異なり、配列特異的PCRプライマーによって識別可能である。
【0019】
本発明は、従来技術の限界を克服するためにゲノム刷り込みの現象を利用している。ゲノム刷り込みにおいて、DNA配列は、DNA配列を変えることなく生化学的に修飾される。このプロセスによって、胎児と母体のDNAに異なる修飾が生じれば、この違いを母体の血漿および血清中の母体DNAからの胎児DNAの識別に活用することができる。この現象は、母体血液の細胞画分中における母体細胞からの胎児細胞の識別にも用いることができる。さらに、この原理は、胎児/乳児の体内に入った母体の細胞またはDNAを検出するために用いることもできる(ロー(Lo)ら、Blood 第88巻(11):4390〜5頁(1996);ロー(Lo)ら、Clin Chem,第46巻(9):1301〜9頁(2000);マロネイ(Maloney)ら、J Clin Invest 第104巻(1):41〜7頁(1999))。この現象は、骨髄移植後(ロー(Lo)ら、Br J Haematol 第89巻(3):645〜9頁(1995))や固形臓器移植後(スターズル(Starzl)ら、Curr Opin Nephrol Hypertens 第6巻(3):292〜8頁(1997);ロー(Lo)ら、Lancet 第351巻(9112):1329〜30頁(1998);チャン(Zhang)、Clin Chem 第45巻(10):1741〜6頁(1999))など、個人の体内に細胞またはDNA配列が存在することが見いだされる多くの他の臨床上の状況において用いることができる。
【0020】
本発明により、母体血漿/血清中の胎児DNAに対する性別非依存性および多型非依存性マーカーの開発が可能になる。性別非依存性および多型非依存性の胎児マーカーを開発するためには、栄養膜中で選択的かつ特異的にメチル化されるDNA配列を用いればよい(オーゲーン(Ohgane)ら、Dev Genet、第22巻(2):132〜40頁(1998))。これにより、母親の血漿/血清中で容易に検出できるのは男の胎児に由来するDNAの存在だけだという(Y染色体を標的として用いることによる)現行の限界を克服できる(ロー(Lo)ら、Am J Hum Genet、第62巻(4):768頁(1998))。本発明は、胎児と母体のDNAの配列差異に依存することのなくそのような識別を行う検出方法を提供する(タン(Tang)ら、Clin Chem 第45巻(11):2033〜5頁(1999);パートル(Pertl)ら、Hum Genet 第106巻:45〜49頁(2000))。
【0021】
PCRなどの分子検出方法の開発により、骨髄移植(BMT)後のキメラ現象を監視するための多くの強力なツールが提供されてきた。性別が不一致の場合のBMT後キメラ現象の検出に最も広く用いられているPCRに基づいた試験のうちの1つは、Y染色体上の配列に対するPCRである(ロー(Lo)ら、Br J Haematol 第89巻:645〜9頁(1995))。この戦略の限界は、提供者が男性で被提供者が女性である場合にしか使用できないことにある。本発明は、提供者が女性で被提供者が男性である場合にも適用しうるシステムを提供する。X染色体の不活性化(Lyonization)現象は女性のみに存在するという事実を用いて、女性特異的マーカーを開発することができる。この現象では、女性個体中の2つのX染色体のうちの1つが、多数の不活性化遺伝子内に生じるメチル化を伴ってランダムに不活性化される。これにより、過剰な男性DNAの中で女性DNAを検出するアッセイが可能となり、提供者が女性で被提供者が男性であるBMTにも適用することができる。
【0022】
第2の態様において、本発明は、母親から得た生物試料中の胎児DNAを検出することにより、胎児における異常を検出する方法を特徴とする。本発明に従う方法は、DNAメチル化の差異などの後成的マーカーに基づいて母体DNAから胎児DNAを識別することにより、母体試料中の胎児DNAを検出することを図る。このような方法を用いると、異常もしくは疾病を予示する胎児DNAを同定することができ、これにより出生前診断のための方法が提供される。上記の方法は、疾病状態にメチル化の変化が伴うと同定されている任意かつ全ての妊娠関連症状に適用することができる。診断可能な疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが21トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【0023】
本発明の第1の態様の広義の識別方法と同様に、母親から得た生物試料は好ましくは血漿または血清である。母体と胎児のDNA間の識別は、母体の血漿または血清中の胎児DNAの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。胎児DNAを定量する実施形態において、測定された濃度は、妊娠関連疾患を予測、監視または診断するために用いることができる。好ましい実施形態では、胎児由来の個々の後成的指標が胎児疾患に関連づけられ、いくつかの実施形態では、胎盤中の胎児細胞内の後成的特徴が母体の血漿または血清における胎児特異的マーカーとして用いられる。
【0024】
本発明は、DNA配列の点では母体DNAから識別可能でなくてもよい、差異的にメチル化された胎児DNA配列を、非侵襲的出生前診断用マーカーとして利用する。この新規な手法により、従来の手法においては情報性のない胎児と母親とのペアが出生前診断に対して情報性のあるペアに変わりうる。したがって、本発明は、新世代の非侵襲的出生前試験を構築することのできる土台を提供する。
【0025】
本発明の方法は、妊婦の血漿または血清中の、胎児を起源とする差異的にメチル化されたDNAを検出することに基づいている。差異的にメチル化されたDNA配列(単一ヌクレオチド多型を含んでいてもよい)は、好ましくはメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって検出されるが、原理的には差異的にメチル化されたDNAに対する任意の検出方法を用いることができる。この手法によって、従来は情報性のなかった胎児DNAマーカーを出生前診断のために用いることができるようになる。
【0026】
本発明により、DNA配列のメチル化状態の変化を伴う胎児または母親のあらゆる疾患の存在を検出または予測することが可能になる。例としては、例えばプラーダー‐ヴィリ症候群(クボタ(Kubota)ら、Nat Genet 第16巻(1):16〜7頁(1997))などの刷り込み不全が挙げられる。本発明は、刷り込み不全であると示唆されてきた子癇前症(グレーブス(Graves)、Reprod Fertil Dev 第10巻(1):23〜9頁(1998))に対する新しいタイプの試験を提供する。本発明は、メチル化の変化を伴う可能性のあるダウン症候群(21トリソミー)(ユ(Yu)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第94巻(13):6862〜7頁(1997))を含む染色体異数性に対する新しいタイプの試験を提供する。
【0027】
本発明は、母親と胎児の間のDNAメチル化の差異を用いることにより、母体血漿中の胎児DNAの検出における従来技術の限界を克服することを特徴とする。
第3の態様において、本発明は、臓器提供者を起源とするDNA種を、臓器被提供者のDNA種から識別するための方法を特徴とする。本発明の第1の態様の広義の識別方法と同様に、得られる生物試料は好ましくは血漿または血清である。臓器提供者からのDNAと臓器被提供者からのDNAとの間の識別、または潜在的臓器提供者からのDNAと潜在的臓器被提供者からのDNAとの間の識別は、生物試料中のDNAの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。本実施形態は、移植が骨髄移植である事例において特に有用である。このような測定は、特に臓器拒絶反応に適用された場合の被移植者の臨床経過を予測するために用いることができる。
【0028】
第4の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNAを識別するためのキットを特徴とする。そのようなキットは、例えば、母体生物試料中の胎児DNAの有無を識別または検出するために、あるいは、臓器提供者または潜在的臓器提供者由来のDNAを、臓器被提供者または潜在的臓器被提供者由来のDNAから識別するために有用である。本発明のキットは、母体DNAのメチル化状態を確認するための亜硫酸水素ナトリウムなど1つ以上の試薬と、DNAの有無を検出するためのゲルなど1つ以上の試薬とを含む。さらに、上記キットは、試料中に存在するDNAの量を増幅するための1つ以上の試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するための1つ以上の試薬などを含んでいてもよい。そのような試薬は当業者によって周知である。さらに、上記キットは、母体DNA試料を得るための1つ以上の装置を含んでいてもよい。そのような装置は当業者によって周知である。特に本発明のキットは、遺伝的異常、例えば胎児中に存在するDNA配列の全部または一部における変異、置換または欠失または重複などに全体的または部分的に起因する疾病を診断するために用いることができる。診断しうる疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが21トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【実施例1】
【0029】
(新規な後成的手法を用いた骨髄移植後キメラ現象の検出)
(材料と方法)
(被験者と試料)
本研究では、女性の提供者から骨髄移植を受けた4人の男性の被提供者と、17人の健常被験者とを採用した。(ロー(Lo)ら、Am J Hum Genet 第62巻:768〜75頁(1998))に記載されているようにして、すべての採取したEDTA血試料由来の軟膜(BC)を回収し、−20℃で保存した。
【0030】
(DNA単離)
Nucleon(登録商標)DNA抽出キット(スコットラブス(Scotlabs)社)を製造者の推奨に従って使用して、BCからDNAを抽出した。
【0031】
(亜硫酸水素塩による変換)
DNA試料の亜硫酸水素塩による修飾は、製造者の指示に従ってCpGenome(登録商標)DNA修飾キット(インターゲン(Intergen))を用いて実施した。亜硫酸水素塩による変換を行うことにより、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換されるが、メチル化されているシトシン残基は変化しない(ハーマン(Herman)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第93巻:9821〜6頁(1996))。その後、亜硫酸水素塩による変換後のメチル化されたDNAとメチル化されていないDNAの間の配列の差異を、異なるPCRプライマーを用いて識別する。亜硫酸水素塩による変換反応においては1μgのBC DNAを用いた。
【0032】
(メチル化特異的PCR(MSP))
MSPアッセイは、前掲のハーマン(Herman)らによって記載されているプロトコールを改変したものである。メチル化された配列に対しては、プライマーM‐for(5’‐GCGAGCGTAGTATTTTTCGGC‐3’)およびM‐rev(5’‐AACCAAATAACCTATAAAACCTCTACG‐3’)を設計し、メチル化されていない配列に対しては、プライマーU‐for(5’‐GTTGTGAGTGTAGTATTTTTTGGT‐3’)およびU‐rev(5’‐CAAATAACCTATAAAACCTCTACA‐3’)を設計した。5μLの亜硫酸水素塩で処理したDNAを、5μLの10×TaqMan(登録商標)バッファA(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))、2mM MgCl2、10pmol dNTPs、それぞれ20pmolの対応するMSPプライマー、および1.25U AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(PEアプライドバイオシステムズ)を含む50μLのPCR反応系に加えた。最初に95℃で8分間の変性工程を実施した後、反応混合物を45回の熱サイクル(各サイクルは、メチル化された対立遺伝子:95℃45秒間、58℃30秒間、72℃20秒間;メチル化されていない対立遺伝子:95℃45秒間、50℃30秒間、72℃20秒間)に供した。その後、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。
【0033】
(結果)
本実験は、アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化DNA配列および非メチル化DNA配列を検出するためのMSPアッセイを提供する。全体で、6人の男性と11人の女性の健常被験者を採用した。すべての男性対照被験者において、予想通り試料中にはメチル化されていないアンドロゲン受容体遺伝子しか検出されなかった(図1A)。対照的に、女性対照被験者においては非メチル化とメチル化の両方のアンドロゲン受容体遺伝子DNA配列が観察された(図1A)。これらの女性被験者におけるメチル化アンドロゲン受容体遺伝子と非メチル化アンドロゲン受容体遺伝子の検出比率は、それぞれ100%および82%であった。DNA試料をMSPアッセイから除外した場合には、陽性のシグナルは全く観察されなかった(図1A)。興味深いことに、メチル化および非メチル化の両方のDNA配列に対する陽性のシグナルが、性別が不一致な骨髄移植を受けた被提供者の男性全員(100%)において観察されたことから、女性提供者に由来する細胞が男性被提供者の血液循環中に存在していることがわかる。
【0034】
上記結果から、女性個体由来の不活性化X染色体上のメチル化された遺伝子を、キメラ現象研究における女性特異的マーカーとして利用できることが初めて実証された。このアッセイは、男性と女性の細胞またはDNAの混合物を用いる移植後キメラ現象の他のタイプの研究にも適用可能である。例としては、固形臓器移植後の細胞キメラ現象(スターズル(Starzl)ら、Curr Opin Nephrol Hypertens 第6巻:292〜8頁(1997))、移植後の血漿中DNAキメラ現象(ロー(Lo)ら、Lancet 第351巻:1329〜30頁(1998))および尿中DNAキメラ現象(チャン(Zhang)ら、Clin Chem 第45巻:1741〜6頁(1995))が挙げられる。さらに、最近では妊娠中の母親から胎児への細胞およびDNAの受け渡しにも大きな関心が寄せられている(ロー(Lo)ら、Blood 第88巻:4390〜5頁(1996);マロネイ(Maloney)ら、J Clin Invest 第104巻:41〜7頁(1999);ロー(Lo)ら、Clin Chem 第46巻:1301〜9頁(2000))。開発される後成的マーカーは、男性の子孫における母体起源のキメラ現象にも用いることができなければならない。
【0035】
このアッセイは、例えば、リアルタイムPCR技術を用いて定量的な方法に発展させることもできる(ロー(Lo)ら、Cancer Res 第59巻:3899〜903頁(1999))。このような発展によって、我々は特定の人におけるキメラ現象のレベルを監視することができるようになる。臨床的には、そのようなアッセイがBMTにおける移植片受容性を監視する役割を果たすものと思われる。尿中または血漿中のDNAキメラ現象の場合には、そのようなアッセイは移植片の拒絶を監視するために用いることもできるであろう。
【実施例2】
【0036】
(母体血漿中の胎児DNAを検出するための戦略としての、胎児と母親間での差異的なDNAメチル化)
本実験では、ヒトIGF2‐H19遺伝子座内の差異的にメチル化される領域を、母体血漿中の後成的マーカーとして用いることにより、胎児が母親から受け継いだ対立遺伝子を検出可能であることを実証する。これらの結果は、母体血漿中の胎児DNAの出生前診断の可能性を大きく広げ、母体血漿中の性別や多型に依存しない胎児特異的マーカーの開発、ならびに刷り込み不全やある種の染色体異数性の出生前診断に対する新しい戦略を可能にする。
【0037】
(材料と方法)
(被験者と試料)
試料はインフォームドコンセントを行った上で妊婦より採取した。全部で、21人の妊娠第2期(17〜21週)および18人の妊娠第3期(37〜42週)の女性を本研究のために採用した。採用した被験者のいずれも、現妊娠において子癇前症でも早期分娩でもなかった。母体のEDTA血試料および胎児羊水試料を、上述のようにして(ロー(Lo)ら、Am J Hum Genet 第62巻:768〜775頁(1998))妊娠第2期の妊婦から採取した。妊娠第3期の妊婦については、正常な経膣分娩の2〜3時間前に母体のEDTA血試料を採取した。胎児臍帯のEDTA血試料も上述のようにして(ロー(Lo)ら、Clin Chem 第46巻:1903〜1906頁(2000))分娩後直ちに採取した。採取したすべての血液試料由来の血漿および軟膜は、血漿試料を16,000gで再度遠心分離したことを除いては、上述のようにして(ロー(Lo)ら、Am J Hum Genet 第62巻:768〜775頁(1998))採集し、−20℃で保存した。羊水試料は4℃で保存した。
【0038】
(DNA単離)
DNAは血漿および羊水試料より、QIAamp(登録商標)Bloodキット(キアゲン(Qiagen))を用いて抽出した。典型的には、1カラムにつきDNA抽出のために800μLの血漿または羊水を用いた。溶出体積としては50〜110μLを用いた。DNAは、製造者の推奨に従ってNucleon(登録商標)DNA抽出キット(スコットラブス(Scotlabs))を用いて軟膜より抽出した。
【0039】
(DMR多型領域の遺伝子型決定)
ヒトIGF2‐H19遺伝子座中のDMRは、2つの450bp反復単位と7つの400bp反復単位を含む(ナカガワ(Nakagawa)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第98巻:591〜596頁(2001))(図2)。DMR中のA/G SNP(前掲のナカガワ(Nakagawa)ら)を本実験におけるマーカーとして選択した(図2)。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、母体DNA試料および胎児DNA試料中のSNPを増幅した。プライマーは、ヒトH19遺伝子(Genbankアクセス番号AF125183)の配列を用いて設計した。典型的には、母体の軟膜、臍帯軟膜または羊水から精製した2〜5μLの溶出DNAを、2.5μLの10×TaqMan(登録商標)バッファA(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))、3mM MgCl2、6.26pmol dNTPs、5pmol プライマー(順方向:5’‐ggACGGAATTGGTTGTAGTT‐3’;逆方向:5’‐AGGCAATTGTCAGTTCAGTAA‐3’)および0.625U AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))を含む25μLのPCR反応系に加えた(95℃8分間に続いて、95℃1分間、56℃20秒間、72℃20秒間のサイクルを35サイクル)。順方向プライマーについては、上記の場合のヌクレオチドはH19配列(Genbankアクセス番号AF125183)の7927〜7944位に対応させた。逆方向プライマーについては、ヌクレオチドはH19配列の8309〜8329位に相補的なものとした。その後、PCR産物をアガロースゲル電気泳動およびDNAシーケンシングによって解析した。
【0040】
(亜硫酸水素塩による変換)
DNA試料の亜硫酸水素塩による修飾は、製造者の指示に従ってCpGenome(登録商標)DNA修飾キット(インターゲン(Intergen))を用いて実施した。亜硫酸水素塩による変換を行うことにより、メチル化されていないシトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化されているシトシン残基には変化がないはずである(ハーマン(Herman)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第93巻:9821〜9826頁(1996))。その後、亜硫酸水素塩による変換後のメチル化されたDNAとメチル化されていないDNAとの間の配列の差異を、異なるPCRプライマーを用いて識別することができた。一般に、亜硫酸水素塩による変換反応においては、1μgの母体血液もしくは臍帯血由来の軟膜DNA、または母体血漿もしくは羊水から精製した93μLの溶出DNAを用いた。次いで亜硫酸水素塩で処理したDNAを、25〜50μLの1μ Tris‐EDTA中に溶出させた。
【0041】
(メチル化特異的PCR(MSP))
MSPアッセイは、前述(Hermanら 1996)のようなプロトコールを改変したものである。亜硫酸水素塩処理した5μLのDNAを、5μLの10×TaqMan(登録商標)バッファA(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))、2.5mM MgCl2、10pmol dNTPs、それぞれ20pmolの対応するMSPプライマー(図2)、および1.25U AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))を含む50μLのPCR反応系に加えた。メチル化された配列に対しては、プライマーM‐forおよびM‐rev(図2)を設計し、メチル化されていない配列に対しては、プライマーU‐forおよびU‐rev(図2)を設計した。最初に95℃で8分間の変性工程を実施した後、反応混合物を50回(軟膜および羊水DNA)または56回(血漿DNA)の熱サイクル(各サイクルは、メチル化された対立遺伝子:95℃45秒間、55℃20秒間、72℃20秒間;メチル化されていない対立遺伝子:95℃45秒間、49℃20秒間、72℃20秒間)に供した。その後、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。反応産物は、DNAシーケンシングまたはプライマー伸長アッセイのために、Microspin(登録商標)S‐300HRカラム(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))を用いて精製した。
【0042】
(DNAシーケンシング)
精製したPCR産物をABI Prism(登録商標)dRhodamineターミネータ・サイクルシーケンシング・レディ反応キット(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))およびPCR産物の対応する順方向プライマーを用いてシーケンシングした。シーケンシング産物はABI Prism(登録商標)310ジェネティクアナライザー(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))を用いて解析した。
【0043】
(プライマー伸長アッセイ)
2μLの精製MSP産物を、50μM ddATP(2’,3’−ジデオキシアデニン三リン酸)、50μM dGTP、50μM dTTP、0.2pmol Cys‐5‐標識プライマー(5’‐GGGTTATTTGGGAATAGGATATTTA‐3’)、4U ThermoSequenase(登録商標)(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))および1.43μL濃縮バッファを含む25μLの反応系に加えた。反応系を、95℃30秒間、51℃20秒間、72℃20秒間を1サイクルとする40回の熱サイクルに供した。Cys‐5‐標識プライマーは、25ヌクレオチド(nt)の長さを有し、多型部位はプライマーの3’末端から2nt離れたところにあった。A対立遺伝子については、多型部位でのddATPの取り込みによって連鎖の終結が起こり、27nt(すなわち25+2nt)の伸長産物を生じることになる。G対立遺伝子については、プライマーの3’末端から5nt離れた次のA残基まで鎖の伸長が継続するので、30nt(すなわち25+5nt)の伸長産物が生じることになる。反応産物は14%変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ALF(登録商標)Express(登録商標)シーケンサ(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))を用いて分析した。データはAlleleLinks(登録商標)プログラム(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))によって解析した。
【0044】
(結果)
(DMRの遺伝子型決定)
この研究には39人の妊婦を採用した。DMR内のSNPにおける母体の遺伝子型(図2)は、軟膜DNAからのPCR産物の直接シーケンシングによって決定した。考えられる各遺伝子型を有する妊婦の数は、17人(GG,43.6%)、16人(AG,41.0%)および6人(AA,15.4%)であった。
【0045】
(二多型性(biallelic)多型に対してヘテロ接合の女性由来の血漿中胎児DNAの検出)
SNPに対してヘテロ接合(すなわちAG)の16人の女性を選んでさらなる実験を行った。これは二多型性の多型であるので、以前の基準に基づけば、これらの女性は、母体血漿中の胎児DNAの検出に関して、この多型遺伝子座に情報性を有するとは考えられないであろう(ロー(Lo)ら、Ann N Y Acad Sci 第731巻:204〜213頁(1994);ビアンチ(Bianchi) Am J Hum Genet 第62巻:763〜764頁(1998))。この遺伝領域の差異的なメチル化により上記限界を克服できることを実証するために、母体DNAを亜硫酸水素塩で処理し、図2に示したプライマーを用いてMSPにより増幅した。同様に、羊水(妊娠第2期試料)または臍帯血の軟膜(妊娠第3期試料)から単離した胎児DNAをPCRおよびMSPに供して、胎児の対立遺伝子の刷り込み状態を判定した。
【0046】
選択した16例のうち、4例の妊娠第3期胎児試料および7例の妊娠第2期胎児試料からのメチル化された(すなわち父親から受け継いだ)対立遺伝子が、それぞれの母親のメチル化された対立遺伝子とは異なっていた(図3a,b;パネル1と2を比較のこと)。この胎児と母親の間でのメチル化の差異によって、母体血漿から胎児の対立遺伝子を検出することができるかどうかを調べるために、これらの例から得た母体血漿DNAを亜硫酸水素塩で変換してからMSPに供した。興味深いことに、父親から受け継いだメチル化された胎児対立遺伝子は、2例の第3期および4例の第2期母体血漿試料中でも検出された(図3a,b;パネル3)。これらの観察結果が単に母体血漿中の異常にメチル化されたDNAの存在によるものである可能性を排除するために、陽性例のうち1例から出生後の母体血漿試料(分娩後〜3.5年)をさらなる試験のために採取した。この出生後試料からは追加のメチル化された対立遺伝子は認められなかったことから(図3a、パネル4)、妊娠中の母体試料中の追加のメチル化対立遺伝子は、胎児起源のものであることがわかる。さらに、非情報性の例(n=4、データ示さず)の血漿中に陽性のシグナルは全く観察されなかったことから、このMSPアッセイの特異性が実証された。まとめると、上記のデータは、母親と胎児の間でのメチル化の差異を用いることにより、既存の基準では情報性が有ると考えられていないケースにおいてさえ、母体血漿中の胎児DNAを検出できるようになることを示している。
【0047】
(母親から受け継がれた胎児DNAの、母体血漿からの検出)
次に我々は、母親と胎児の間のメチル化の差異を用いて、胎児が母親から受け継いだ対立遺伝子を検出することができるようになるかどうかについて調べた。このタイプの分析は、以前は不可能であると考えられていた(ロー(Lo)ら、Ann N Y Acad Sci 第731巻:204〜213頁(1994);ビアンチ(Bianchi)、Am J Hum Genet 第62巻:763〜764頁(1998))。母親から受け継いだ対立遺伝子はメチル化されていないので、亜硫酸水素塩処理に続いて、プライマーU‐forおよびU‐rev(図2)を用いてメチル化されていない対立遺伝子を増幅した。分析した16例のうち、3例の妊娠第3期および5例の妊娠第2期の母体試料が情報性を有していた。これらの例において、胎児は、母親のメチル化されていない対立遺伝子とは異なるメチル化されていない対立遺伝子を有していた。これらの結果は、上記の例において、母親が該胎児対立遺伝子を元々彼女の父親から受け継ぎ、その後胎児に受け渡したことを含意する。情報性を有する8例のうち、直接シーケンシングにおいて妊娠第3期試料のうち1例にごく弱い陽性のシグナルが観察された(図4a、パネル1とパネル2で比較)。
【0048】
そこで我々は、上記の1つの陽性例に見られたシグナルが弱いこと、および母体血漿由来のメチル化されていない胎児対立遺伝子の検出率が低いことは、直接シーケンシング法の感度が低いことによるものであろうと考えた。検出の感度を高めるために、我々はより感度の高いプライマー伸長アッセイを用いて、MSP反応産物からメチル化されていない胎児対立遺伝子を検出した。SNPはA/G多型であったので、ddATPをプライマー伸長アッセイにおける反応基質として用いた。A対立遺伝子およびG対立遺伝子から伸長した反応産物は、それぞれ27および30ヌクレオチド長であった。対応する母体軟膜試料中には、胎児特異的な反応産物は全く存在しなかった(図4b、c;母体BC)。驚くべきことに、胎児特異的な伸長産物は、2例の妊娠第3期母体血漿試料(図4b、矢印)および1例の妊娠第2期母体血漿試料(図4c、矢印)において観察されたことから、母体血漿中にメチル化されていない胎児DNAが存在することが分かった。対照として、情報性のないどの被験例もこのアッセイにおいては陽性を示さなかった(n=5、データ示さず)。これらの結果から、母親から受け継がれた胎児DNA配列を母体血漿から検出するために後成的マーカーを使用するということの実行可能性が初めて実証された。
【0049】
(考察)
上記の結果から、後成的マーカーを使用することにより、母体血漿中の胎児DNAを検出する際の従来の限界が克服されることが実証される。母親と胎児の間の後成的な差異を用いることにより、母体の対立遺伝子とは遺伝子としては区別のつかない、父親から受け継いだ胎児対立遺伝子を、母親の血漿から検出することができる。同様に、母親から受け継いだ胎児対立遺伝子を、母親の血漿から検出することができる。従って、この新規な後成的手法は、母体血漿中の胎児DNAを用いることのできる疾患のレパートリーを広げることであろう。
【0050】
比較的感受性の低い方法、例えば直接シーケンシングやプライマー伸長法を用いた場合でも、本結果は、差異的にメチル化された胎児DNA配列を母体血漿から検出できることを実証している。メチル化された対立遺伝子に対する同様のアッセイと比較して(図3)、母体血漿中のメチル化されていない胎児DNAの検出の感度は低かった(図4)。より感受性の高い検出システム、例えば対立遺伝子特異的PCR(ニュートン(Newton)ら、Nucleic Acids Res 第17巻:2503〜2516頁(1989))やリアルタイムメチル化特異的PCR(ロー(Lo)ら、Cancer Res 第59巻:3899〜3903頁(1999);イーズ(Eads)ら、Nucleic Acids Res 第28巻:E32頁(2000))などを用いることにより、血漿を用いる後成的分析の感度を高めることができるかもしれない。リアルタイムメチル化特異的PCRの開発は、循環中の腫瘍DNAの検出に対してはすでに達成されているように(カワカミ(Kawakami)ら、J Natl Cancer Inst 第92巻:1805〜1811頁(2000))、母体血漿中の胎児特異的メチル化を定量する可能性を切り開くことから特に興味深い。
【0051】
母体血漿中の胎児DNAを常套的出生前診断ツールとして導入する可能性から、循環する胎児DNAに対する汎用マーカーの必要性についての問題が持ち上がってきた(ロー(Lo)ら、Am J hum Gnet 第62巻:768〜775頁(1998);アベント(Avent)ら、Vox Sang 第78巻:155〜162頁(2000))。そのようなマーカーに対する提案の大半は、これまでは母親と胎児との間の遺伝的多型現象を使用することに焦点を当ててきた(タン(Tang)ら、Clin Chem 第45巻:2033〜2035頁(1999);パートル(Pertl)ら、Hum Genet 第106巻:45〜49頁(2000))。今回母体血漿中の胎児DNA検出のために後成的マーカーを使用できる可能性が実証されたことから、母体血漿中における性別非依存性かつ多型非依存性の胎児マーカーを開発するための新しい手法が開拓される。これを実現できる1つの方法としては、組織特異的メチル化現象を利用することである(グルナウ(Grunau)ら、Hum Mol Genet 第9巻:2651〜2663頁(2000))。栄養膜は、母体血漿中への胎児DNAの放出に関する有力な細胞集団であると示唆されてきたので、栄養膜特異的メチル化パターンを解明することにより、母体血漿中における汎用性の胎児後成的マーカーの開発が可能になる。生物学的には、組織特異的メチル化マーカーを使用すると、どのタイプの胎児細胞が母体血漿中への胎児DNAの放出に関与しているかに関する疑問に直接取り組むことができる。
【0052】
母体血漿の後成的分析が、プラーダー‐ヴィリ症候群などのゲノム刷り込みに関連する疾患に適用できることは自明である(ファイファー(Pfeifer)、Lancet 第356巻:1819〜1820頁(2000))。この戦略は、刷り込まれた遺伝子が役目を果たしていると仮定されている子癇前症などの疾患診断の可能性も有しているかもしれない(グレーブス(Graves)、Reprod Fertil Dev 第10巻:23〜29頁(1998))。
【0053】
胎児の染色体異数性の出生前検出のために、母体血漿中の胎児DNAを応用できるかどうかは、この現象が発見されて以来激しく議論されてきた問題である(ロー(Lo)ら、Lancet 第350巻:485〜487頁(1997);ビアンチ(Bianchi)、Am J Hum Genet 第62巻:763〜764頁(1998))。異数性の妊娠中に循環する胎児DNAのレベルは正数性の妊娠の場合と比較して量的に異なることが発見され(ロー(Lo)ら、Clin Chem 第45巻:1747〜1751頁(1999);チョン(Zhong)ら、Prenat Diagn 第20巻:795〜798頁(2000))、この発見により、母体血漿から胎児が染色体異数性である危険性を評価するための方法が提案されている。最近になって母体血漿中(「血漿から取り出した細胞」)にアポトーシスを起こした胎児細胞が見つかり(バン・ウェイク(Van Wijk)ら、Clin Chem 第46巻:729〜731頁(2000))、母体血漿から異数性を検出するためのさらに別の手法が提案されている(プーン(Poon)ら、Lancet 第356巻:1819〜1820頁(2000))。興味深いことに、本発明のデータは胎児の染色体異数性を検出するためのさらに別の潜在的手法を開拓するものでもある。これは異常なDNAメチル化パターンは染色体異数性に関連する可能性があるという観察結果に基づいている(クロミツ(Kuromitsu)ら、Mol Cell Biol 第17巻:707〜712頁(1997);ユ(Yu)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第94巻:6862〜6867頁(1997))。したがって、母体血漿からこのような異常にメチル化された胎児DNA配列を検出するための後成的マーカーを開発することができる。そのようなマーカーは、母体血漿中の胎児DNAの単純な定量(ロー(Lo)ら、Clin Chem 第45巻:1747〜1751頁(1999);チョン(Zhong)ら、Prenat Diagn 第20巻:795〜798頁(2000))に比べて高い特異性を有するとともに、「血漿から取り出した細胞」に基づく方法(プーン(Poon)ら、Lancet 第356巻:1819〜1820頁(2000))と比べて大規模な用途により適している。
【0054】
胎児後成的マーカーは、母体血液の細胞画分から単離した胎児細胞の分析においても用いることができる。これには、メチル化分析をin situ様式で実施できることを示した最近のデータを活用する(ヌオボ(Nuovo)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第96巻:12754〜12759頁(1999))。
【0055】
母子輸送は双方向プロセスであるという最近の理解をもってすれば(ロー(Lo)ら、Blood 第88巻:4390〜4395頁(1996);マロネイ(Maloney)ら、J Clin Invest 第104巻:41〜47頁(1999))、後成的マーカーは、母親から胎児への細胞およびDNAの移動を調べるためにも用いることができる。このような手法は、他のタイプのキメラ現象、例えば移植後の造血のキメラ現象(スターズル(Starzl)ら、Curr Opin Nephrol Hypertens 第6巻:292〜298頁(1997))および尿中DNAのキメラ現象(チャン(Zhang)ら、Clin Chem 第45巻:1741〜1746頁(1999))などを調べるためにも応用できる。
【0056】
ヒトゲノムについての理解の深まりやメチル化分析に対するハイスループットのアレイを用いる技術の開発に伴って(ヤン(Yan)ら、Clin Cancer Res 第6巻:1432〜1438頁(2000))、有用な胎児後成的マーカーの数は今後数年のうちに急速に増加することが期待される。そうした開発によって、従来の母体血漿における遺伝的マーカーとともに、相乗的に用いることのできる臨床的に関連した胎児後成的マーカー群が提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1A】アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化DNA配列および非メチル化DNA配列を検出するアッセイの結果を示す図。全体として、6人の男性と11人の女性の健常被験者を採用した。全男性対照被験者のなかでは、予想通りメチル化されていないアンドロゲン受容体遺伝子のみが試料中に検出された(図1A)。対照的に、女性対照被験者においては非メチル化とメチル化の両方のアンドロゲン受容体遺伝子DNA配列が観察された(図1A)。これらの女性被験者におけるメチル化アンドロゲン受容体遺伝子と非メチル化アンドロゲン受容体遺伝子の検出比率は、それぞれ100%および82%であった。DNA試料をアッセイから除外した場合には、陽性のシグナルは全く観察されなかった(図1A)。
【図1B】アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化DNA配列および非メチル化DNA配列を検出するアッセイの結果を示す図。興味深いことに、メチル化および非メチル化の両方のDNA配列に対する陽性のシグナルが、女性を提供者とするすべての男性の骨髄移植の被提供者において観察されたことから、女性提供者に由来する細胞が男性被提供者の血液循環中に存在していることがわかる。
【図2】ヒトIGF2‐H19領域の差異的にメチル化される領域(DMR)の模式図。2つの450bp反復単位(A1およびA2)および7つの400bp反復単位(B1〜B7)が示されている。調べた領域の上側のDNA鎖上の潜在的メチル化領域は、白丸で示されている。調べた単一ヌクレオチド多型(SNP)部位(A/G)は、白四角で示されている。白抜き矢印は、それぞれメチル化された対立遺伝子(M)とメチル化されていない対立遺伝子(U)に特異的なPCR反応における順方向プライマー(for)および逆方向プライマー(rev)の位置を示している。これらのMSPプライマーの配列が示されている。亜硫酸水素処理したDNAと未処理のDNAとの間の配列の違いを太字イタリックで示し、メチル化(父親から受け継いだ)DNAおよび非メチル化(母親から受け継いだ)DNAとの間の配列の違いを太字下線で示す。
【図3A】妊娠第3期の母体血漿中のメチル化された(父親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。母体軟膜(パネル1)、胎児軟膜または羊水(パネル2)、出生前母体血漿(パネル3)および出生後母体血漿(パネル4)試料中のメチル化された対立遺伝子のDNA配列が示されている。出生前母体血漿試料中にメチル化された胎児DNAが存在することが「*」で示されている。多型(SNP)部位は赤字で示されている。
【図3B】妊娠第2期の母体血漿中のメチル化された(父親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。母体軟膜(パネル1)、胎児軟膜または羊水(パネル2)、出生前母体血漿(パネル3)および出生後母体血漿(パネル4)試料中のメチル化された対立遺伝子のDNA配列が示されている。出生前母体血漿試料中にメチル化された胎児DNAが存在することが「*」で示されている。多型(SNP)部位は赤字で示されている。
【図4A】母体血漿中のメチル化されていない(母親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。(a)直接シーケンシング法を用いて、母体軟膜(パネル1)および妊娠第3期母体試料(パネル2)中のメチル化されていないDNA配列を検出した。母体血漿中にメチル化されていない胎児DNAが存在する場合を「*」で示す。
【図4B】母体血漿中のメチル化されていない(母親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。(b)プライマー伸長アッセイを用いて2つの妊娠第3期母体血漿試料中のメチル化されていない胎児DNA(矢印)を検出した。反応産物のサイズ(nt)が下に示されており、●は未使用プライマーを示し、□は検出された対立遺伝子を示す。
【図4C】母体血漿中のメチル化されていない(母親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。(c)プライマー伸長アッセイを用いて妊娠第2期母体血漿試料中のメチル化されていない胎児DNA(矢印)を検出した。プライマーのみ、非メチル化G対立遺伝子または非メチル化A対立遺伝子を含む対照反応からの産物が示されている。反応産物のサイズ(nt)が下に示されており、●は未使用プライマーを示し、□は検出された対立遺伝子を示す。
【0001】
本発明は、一試料中の異なる個体を起源とするDNAの検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
体液中に異なる個体を起源とするDNAが存在していることは、多くの臨床上および生物学上の状況において周知の生物学的現象である。例えば、骨髄移植後、移植の被提供者の造血系は、種々の割合の提供者(ドナー)の細胞と被提供者(レシピエント)の細胞から構成されることになる。提供者の細胞または被提供者の細胞の量の確認は、性別(マンギオーニ(Mangioni)ら、Bone Marrow Transplant 第20巻:969〜73頁(1997))やDNA多型(ロークス(Roux)ら、Blood 第79巻:2775〜83頁(1992))を含む、提供者と被提供者との間の遺伝的差異を検出することによって行われてきた。この手法には、解析する領域が提供者と被提供者との間の遺伝的差異を保持していない場合に、現手法による分析が不可能となるという必然の結果を伴う。
【0003】
他の例として、妊娠中に母体の血漿および血清中の胎児DNAを検出することがすでに実証されている(ロー(Lo)ら、Lancet 第350巻:第9076号:485〜7頁(1997))。この技術は、母体の血漿および血清から単離した胎児DNAを、非侵襲的な出生前診断に使用できることを実証している(ロー(Lo)ら、N Eng J Med、第339巻(24):1734〜8頁(1998);ファース(Faas)ら、Lancet 第352巻(9135):1196頁(1998);アミカッチ(Amicucci)ら、Clin Chem 第46巻(2):301頁(2000);チェン(Chen)ら、Prenat Diagn 第20巻(4):355〜7頁(2000);サイトウ(Saito)ら、Lancet 第356巻:1170頁(2000))。この現象の臨床への応用は、母体の血漿および血清中に上記の胎児DNAが比較的高い絶対濃度および相対濃度で循環していることに助けられてきた(ロー(Lo)ら、Am J. Hum Genet 第62巻:768〜775頁(1998))。この手法を用いて、胎児のRh因子(D)の状態(ロー(Lo)ら、New Eng J Med 第339巻:1734〜1738頁(1998))、筋緊張性ジストロフィー(アミカッチ(Amicucci)ら、Clin Chem 第46巻:301〜302頁(2000))、軟骨無形成症(サイトウ(Saito)ら、Lancet 第356巻:1170頁(2000))およびある種の染色体転座(チェン(Chen)ら、Prenat Diag 第20巻:335〜357(2000);チェン(Chen)ら、Clin Chem 第47巻:937〜939頁(2001))を含む多くの状態の非侵襲的出生前検出が達成されてきている。これらの現行の手法のいずれも、母親のDNA配列とは遺伝的に識別可能な父親から受け継いだDNA配列の検出を利用している(ビアンチ(Bianchi)、Am J Hum Genet 第62巻(4):763頁(1998))。具体的には、母体の血漿または血清中において、母親から受け継がれた胎児DNAを検出することは不可能であると考えられていた。同様の限界が、母体の血液の細胞画分から単離した胎児有核細胞の検出についても記載されている(ロー(Lo)ら、Ann NY Acad Sci,第731巻:204頁(1994))。
【0004】
その他に、癌患者から異常にメチル化されたDNAを検出した事例もある。そうした事例は、肺(エステラー(Esteller)ら、Cancer Res 第59巻(1):67頁(1999))や肝臓の癌(ウォン(Wong)ら、Cancer Res 第59巻(1):71頁(1999))を含む様々な癌を有した患者について報告されている。
【0005】
最近では、後成的現象、すなわちDNA配列の変化を伴わずに表現型を変えるプロセスの生物学に大きな関心が寄せられている(ウォルフェ(Wolffe)、Science 第286巻:481〜486頁(1999))。最も特徴づけの進んでいる後成的プロセスの1つとしてDNAメチル化がある(ウォルフェ(Wolffe)ら、Curr Biol.第10巻:R463〜R465頁(1999))。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
DNA種の間の遺伝的ではなく後成的(エピジェネティックな)差異を用いて、生物の体液中の異なる個体を起源とするDNA種を識別する方法の価値は非常に高いと考えられる。例えば、母体試料中の胎児DNAを後成的に検出することにより、さらに別のスクリーニングや診断方法が可能になるという顕著な利点が提供されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0007】
第1の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNA種を識別するための方法を特徴とする。好ましい実施形態において、本発明の方法は、母体試料中の胎児DNAを識別または検出するために、あるいは臓器被提供者のDNAから臓器提供者のDNAを識別するために用いられる。
【0008】
当業者であれば、個体から得られた生物試料は任意の体液または細胞試料から採取しうることを認識しているであろうが、好ましい実施形態において、体液は血漿または血清である。好ましい実施形態において、DNA種は、DNAメチル化の違いなど、DNA種における後成的差異を観察することによって識別される。例えば、1つのDNA種が男性からものであり、1つのDNA種が女性からのものであるような状況において、後成的マーカーは、女性個体の不活性化されたX染色体とすることができる。そのような実施形態では、不活性化X染色体上のメチル化されたDNA配列を用いて、女性個体を起源とするDNAを検出することができる。いくつかの実施形態では、後成的差異を細胞内部で解析することができる。さらに、いくつかの実施形態において、後成的差異を、in situメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて解析することもできる。さらに、後成的差異を、それぞれの個体由来の細胞を選別または単離するために、あるいはそれぞれの個体からDNAを精製するために用いることもできる。本発明に従う方法は、DNA種の濃度を測定しながら実施しても、測定せずに実施してもよいが、好ましい実施形態においては、それぞれの後成的差異をもつDNA種の濃度が測定される。DNAメチル化の差異を後成的マーカーとするような実施形態において、このような濃度測定には、それぞれのDNAメチル化の差異を測定することが伴う。特に好ましい実施形態において、亜硫酸水素ナトリウムを生物試料かDNA種に直接加えて、DNAメチル化の差異を検出する。しかしながら、他の実施形態において、当業者によって周知のように、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を、DNAメチル化差異を検出するために用いることもできる。さらに別の実施形態において、DNAシーケンシングまたはプライマー伸長法を用いてメチル化の差異を検出することもできる。
【0009】
第2の態様において、本発明は、母親から得た生物試料中の胎児DNAを検出することにより、胎児における異常を検出する方法を特徴とする。本発明に従う方法は、DNAメチル化の差異などの後成的マーカーに基づいて母体DNAから胎児DNAを識別することにより、母体試料中の胎児DNAを検出することを図る。このような方法を用いると、遺伝的異常もしくは遺伝性の疾病を予示する胎児DNAを同定することができ、これにより出生前診断のための方法が提供される。これらの方法は、疾病状態にメチル化の変化が伴うと同定されている任意かつ全ての妊娠関連症状に適用することができる。診断可能な疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが21トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【0010】
本発明の第1の態様の広義の識別方法と同様に、母親から得る生物試料は好ましくは血漿または血清である。母体と胎児のDNA間の識別は、母体の血漿または血清中の胎児DNAの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。胎児DNAを定量する実施形態において、測定された濃度は、妊娠関連疾患を予測、監視または診断もしくは予後判定するために用いることができる。好ましい実施形態では、胎児由来の個々の後成的指標(マーク)が胎児疾患に関連づけられ、いくつかの実施形態では、胎盤中の胎児細胞内の後成的特徴が母体の血漿または血清における胎児特異的指標(マーカー)として用いられる。
【0011】
第3の態様において、本発明は、臓器提供者を起源とするDNA種を、臓器被提供者のDNA種から識別するための方法を特徴とする。本発明の第1の態様の広義の識別方法と同様に、得られる生物試料は好ましくは血漿または血清である。臓器提供者からのDNAと臓器被提供者からのDNAとの間の識別、または潜在的臓器提供者からのDNAと潜在的臓器被提供者からのDNAとの間の識別は、生物試料中のDNAの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。本実施形態は、移植が骨髄移植である事例において特に有用である。このような測定は、特に臓器拒絶反応に関して移植の被提供者の臨床経過を予測するために用いることができる。
【0012】
第4の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNAを識別するためのキットを特徴とする。そのようなキットは、例えば、母体生物試料中の胎児DNAの有無を識別または検出するために、あるいは、臓器提供者または潜在的臓器提供者由来のDNAを、臓器被提供者または潜在的臓器被提供者由来のDNAから識別するために有用である。本発明のキットは、母体DNAのメチル化状態を確認するための亜硫酸水素ナトリウムなど1つ以上の試薬と、DNAの有無を検出するためのゲルなど1つ以上の試薬とを含む。さらに、上記キットは、試料中に存在するDNAの量を増幅するための1つ以上の試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するための1つ以上の試薬などを含んでいてもよい。そのような試薬は当業者によって周知である。さらに、上記キットは、母体DNA試料を得るための1つ以上の装置を含んでいてもよい。そのような装置は当業者によって周知である。特に本発明のキットは、遺伝的異常、例えば胎児中に存在するDNA配列の全部または一部における変異、置換または欠失などに全体的または部分的に起因する疾病を診断するために用いることができる。診断しうる疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが21トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0013】
第1の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNA種を識別するための方法を特徴とする。好ましい実施形態において、本発明の方法は、母体試料中の胎児DNAを識別または検出するために、あるいは臓器被提供者のDNAから臓器提供者のDNAを識別するために用いられる。
【0014】
当業者であれば、個体由来の生物試料は任意の体液または細胞試料から採取しうることを認識しているであろうが、好ましい実施形態において、体液は血漿または血清である。好ましい実施形態において、DNA種は、DNAメチル化の違いなど、DNA種における後成的差異を観察することによって識別される。例えば、1つのDNA種が男性からものであり、1つのDNA種が女性からのものであるような状況において、後成的マーカーは、女性個体の不活性化されたX染色体とすることができる。そのような実施形態では、不活性化X染色体上のメチル化されたDNA配列を用いて、女性個体を起源とするDNAを検出することができる。いくつかの実施形態では、後成的差異を細胞内部で解析することができる。さらに、いくつかの実施形態において、後成的差異は、in situメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて解析することもできる。さらに、後成的差異は、それぞれの個体由来の細胞を選別または単離するために、あるいはそれぞれの個体からDNAを精製するために用いることもできる。本発明に従う方法は、DNA種の濃度を測定しながら実施しても、測定せずに実施してもよいが、好ましい実施形態においては、それぞれの後成的差異をもつDNA種の濃度が測定される。DNAメチル化の差異を後成的マーカーとするような実施形態において、このような濃度測定には、それぞれのDNAメチル化の差異を測定することが伴う。特に好ましい実施形態において、亜硫酸水素ナトリウムを生物試料かDNA種に直接加えて、DNAメチル化の差異を検出する。しかしながら、他の実施形態において、当業者によって周知のように、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を、DNAメチル化差異を検出するために用いることもできる。さらに別の実施形態において、DNAシーケンシングまたはプライマー伸長法を用いてメチル化の差異を検出することもできる。
【0015】
本明細書中で用いる「生物試料」という用語は、生きた生物から得たあらゆる体液もしくは細胞試料またはそれらの混合物を包含するものとする。具体的には、上記用語は組織バイオプシー、血清、血漿または羊水試料を含む。
【0016】
本明細書中で用いる「後成的差異」という用語は、一次ヌクレオチド配列以外の任意の分子上または構造上の差異を包含するものとする。例えば、上記用語はメチル化の差異を含みうる。
【0017】
本明細書中で用いる「DNA」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子断片、および完全な遺伝子配列などの、2つ以上のヌクレオチドからなる任意の配列を包含するものとする。
【0018】
本明細書中で用いる「メチル化特異的PCR」という用語は、DNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理してからPCR増幅に供する方法を記述するために用いられる。この技法は、DNAを亜硫酸水素塩で処理することにより、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換されるという原理に基づいている。一方、メチル化されているシトシン残基は変化しない。したがって、亜硫酸水素変換後のメチル化ゲノム領域と非メチル化ゲノム領域のDNA配列は異なり、配列特異的PCRプライマーによって識別可能である。
【0019】
本発明は、従来技術の限界を克服するためにゲノム刷り込みの現象を利用している。ゲノム刷り込みにおいて、DNA配列は、DNA配列を変えることなく生化学的に修飾される。このプロセスによって、胎児と母体のDNAに異なる修飾が生じれば、この違いを母体の血漿および血清中の母体DNAからの胎児DNAの識別に活用することができる。この現象は、母体血液の細胞画分中における母体細胞からの胎児細胞の識別にも用いることができる。さらに、この原理は、胎児/乳児の体内に入った母体の細胞またはDNAを検出するために用いることもできる(ロー(Lo)ら、Blood 第88巻(11):4390〜5頁(1996);ロー(Lo)ら、Clin Chem,第46巻(9):1301〜9頁(2000);マロネイ(Maloney)ら、J Clin Invest 第104巻(1):41〜7頁(1999))。この現象は、骨髄移植後(ロー(Lo)ら、Br J Haematol 第89巻(3):645〜9頁(1995))や固形臓器移植後(スターズル(Starzl)ら、Curr Opin Nephrol Hypertens 第6巻(3):292〜8頁(1997);ロー(Lo)ら、Lancet 第351巻(9112):1329〜30頁(1998);チャン(Zhang)、Clin Chem 第45巻(10):1741〜6頁(1999))など、個人の体内に細胞またはDNA配列が存在することが見いだされる多くの他の臨床上の状況において用いることができる。
【0020】
本発明により、母体血漿/血清中の胎児DNAに対する性別非依存性および多型非依存性マーカーの開発が可能になる。性別非依存性および多型非依存性の胎児マーカーを開発するためには、栄養膜中で選択的かつ特異的にメチル化されるDNA配列を用いればよい(オーゲーン(Ohgane)ら、Dev Genet、第22巻(2):132〜40頁(1998))。これにより、母親の血漿/血清中で容易に検出できるのは男の胎児に由来するDNAの存在だけだという(Y染色体を標的として用いることによる)現行の限界を克服できる(ロー(Lo)ら、Am J Hum Genet、第62巻(4):768頁(1998))。本発明は、胎児と母体のDNAの配列差異に依存することのなくそのような識別を行う検出方法を提供する(タン(Tang)ら、Clin Chem 第45巻(11):2033〜5頁(1999);パートル(Pertl)ら、Hum Genet 第106巻:45〜49頁(2000))。
【0021】
PCRなどの分子検出方法の開発により、骨髄移植(BMT)後のキメラ現象を監視するための多くの強力なツールが提供されてきた。性別が不一致の場合のBMT後キメラ現象の検出に最も広く用いられているPCRに基づいた試験のうちの1つは、Y染色体上の配列に対するPCRである(ロー(Lo)ら、Br J Haematol 第89巻:645〜9頁(1995))。この戦略の限界は、提供者が男性で被提供者が女性である場合にしか使用できないことにある。本発明は、提供者が女性で被提供者が男性である場合にも適用しうるシステムを提供する。X染色体の不活性化(Lyonization)現象は女性のみに存在するという事実を用いて、女性特異的マーカーを開発することができる。この現象では、女性個体中の2つのX染色体のうちの1つが、多数の不活性化遺伝子内に生じるメチル化を伴ってランダムに不活性化される。これにより、過剰な男性DNAの中で女性DNAを検出するアッセイが可能となり、提供者が女性で被提供者が男性であるBMTにも適用することができる。
【0022】
第2の態様において、本発明は、母親から得た生物試料中の胎児DNAを検出することにより、胎児における異常を検出する方法を特徴とする。本発明に従う方法は、DNAメチル化の差異などの後成的マーカーに基づいて母体DNAから胎児DNAを識別することにより、母体試料中の胎児DNAを検出することを図る。このような方法を用いると、異常もしくは疾病を予示する胎児DNAを同定することができ、これにより出生前診断のための方法が提供される。上記の方法は、疾病状態にメチル化の変化が伴うと同定されている任意かつ全ての妊娠関連症状に適用することができる。診断可能な疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが21トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【0023】
本発明の第1の態様の広義の識別方法と同様に、母親から得た生物試料は好ましくは血漿または血清である。母体と胎児のDNA間の識別は、母体の血漿または血清中の胎児DNAの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。胎児DNAを定量する実施形態において、測定された濃度は、妊娠関連疾患を予測、監視または診断するために用いることができる。好ましい実施形態では、胎児由来の個々の後成的指標が胎児疾患に関連づけられ、いくつかの実施形態では、胎盤中の胎児細胞内の後成的特徴が母体の血漿または血清における胎児特異的マーカーとして用いられる。
【0024】
本発明は、DNA配列の点では母体DNAから識別可能でなくてもよい、差異的にメチル化された胎児DNA配列を、非侵襲的出生前診断用マーカーとして利用する。この新規な手法により、従来の手法においては情報性のない胎児と母親とのペアが出生前診断に対して情報性のあるペアに変わりうる。したがって、本発明は、新世代の非侵襲的出生前試験を構築することのできる土台を提供する。
【0025】
本発明の方法は、妊婦の血漿または血清中の、胎児を起源とする差異的にメチル化されたDNAを検出することに基づいている。差異的にメチル化されたDNA配列(単一ヌクレオチド多型を含んでいてもよい)は、好ましくはメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって検出されるが、原理的には差異的にメチル化されたDNAに対する任意の検出方法を用いることができる。この手法によって、従来は情報性のなかった胎児DNAマーカーを出生前診断のために用いることができるようになる。
【0026】
本発明により、DNA配列のメチル化状態の変化を伴う胎児または母親のあらゆる疾患の存在を検出または予測することが可能になる。例としては、例えばプラーダー‐ヴィリ症候群(クボタ(Kubota)ら、Nat Genet 第16巻(1):16〜7頁(1997))などの刷り込み不全が挙げられる。本発明は、刷り込み不全であると示唆されてきた子癇前症(グレーブス(Graves)、Reprod Fertil Dev 第10巻(1):23〜9頁(1998))に対する新しいタイプの試験を提供する。本発明は、メチル化の変化を伴う可能性のあるダウン症候群(21トリソミー)(ユ(Yu)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第94巻(13):6862〜7頁(1997))を含む染色体異数性に対する新しいタイプの試験を提供する。
【0027】
本発明は、母親と胎児の間のDNAメチル化の差異を用いることにより、母体血漿中の胎児DNAの検出における従来技術の限界を克服することを特徴とする。
第3の態様において、本発明は、臓器提供者を起源とするDNA種を、臓器被提供者のDNA種から識別するための方法を特徴とする。本発明の第1の態様の広義の識別方法と同様に、得られる生物試料は好ましくは血漿または血清である。臓器提供者からのDNAと臓器被提供者からのDNAとの間の識別、または潜在的臓器提供者からのDNAと潜在的臓器被提供者からのDNAとの間の識別は、生物試料中のDNAの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。本実施形態は、移植が骨髄移植である事例において特に有用である。このような測定は、特に臓器拒絶反応に適用された場合の被移植者の臨床経過を予測するために用いることができる。
【0028】
第4の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするDNAを識別するためのキットを特徴とする。そのようなキットは、例えば、母体生物試料中の胎児DNAの有無を識別または検出するために、あるいは、臓器提供者または潜在的臓器提供者由来のDNAを、臓器被提供者または潜在的臓器被提供者由来のDNAから識別するために有用である。本発明のキットは、母体DNAのメチル化状態を確認するための亜硫酸水素ナトリウムなど1つ以上の試薬と、DNAの有無を検出するためのゲルなど1つ以上の試薬とを含む。さらに、上記キットは、試料中に存在するDNAの量を増幅するための1つ以上の試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するための1つ以上の試薬などを含んでいてもよい。そのような試薬は当業者によって周知である。さらに、上記キットは、母体DNA試料を得るための1つ以上の装置を含んでいてもよい。そのような装置は当業者によって周知である。特に本発明のキットは、遺伝的異常、例えば胎児中に存在するDNA配列の全部または一部における変異、置換または欠失または重複などに全体的または部分的に起因する疾病を診断するために用いることができる。診断しうる疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが21トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【実施例1】
【0029】
(新規な後成的手法を用いた骨髄移植後キメラ現象の検出)
(材料と方法)
(被験者と試料)
本研究では、女性の提供者から骨髄移植を受けた4人の男性の被提供者と、17人の健常被験者とを採用した。(ロー(Lo)ら、Am J Hum Genet 第62巻:768〜75頁(1998))に記載されているようにして、すべての採取したEDTA血試料由来の軟膜(BC)を回収し、−20℃で保存した。
【0030】
(DNA単離)
Nucleon(登録商標)DNA抽出キット(スコットラブス(Scotlabs)社)を製造者の推奨に従って使用して、BCからDNAを抽出した。
【0031】
(亜硫酸水素塩による変換)
DNA試料の亜硫酸水素塩による修飾は、製造者の指示に従ってCpGenome(登録商標)DNA修飾キット(インターゲン(Intergen))を用いて実施した。亜硫酸水素塩による変換を行うことにより、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換されるが、メチル化されているシトシン残基は変化しない(ハーマン(Herman)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第93巻:9821〜6頁(1996))。その後、亜硫酸水素塩による変換後のメチル化されたDNAとメチル化されていないDNAの間の配列の差異を、異なるPCRプライマーを用いて識別する。亜硫酸水素塩による変換反応においては1μgのBC DNAを用いた。
【0032】
(メチル化特異的PCR(MSP))
MSPアッセイは、前掲のハーマン(Herman)らによって記載されているプロトコールを改変したものである。メチル化された配列に対しては、プライマーM‐for(5’‐GCGAGCGTAGTATTTTTCGGC‐3’)およびM‐rev(5’‐AACCAAATAACCTATAAAACCTCTACG‐3’)を設計し、メチル化されていない配列に対しては、プライマーU‐for(5’‐GTTGTGAGTGTAGTATTTTTTGGT‐3’)およびU‐rev(5’‐CAAATAACCTATAAAACCTCTACA‐3’)を設計した。5μLの亜硫酸水素塩で処理したDNAを、5μLの10×TaqMan(登録商標)バッファA(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))、2mM MgCl2、10pmol dNTPs、それぞれ20pmolの対応するMSPプライマー、および1.25U AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(PEアプライドバイオシステムズ)を含む50μLのPCR反応系に加えた。最初に95℃で8分間の変性工程を実施した後、反応混合物を45回の熱サイクル(各サイクルは、メチル化された対立遺伝子:95℃45秒間、58℃30秒間、72℃20秒間;メチル化されていない対立遺伝子:95℃45秒間、50℃30秒間、72℃20秒間)に供した。その後、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。
【0033】
(結果)
本実験は、アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化DNA配列および非メチル化DNA配列を検出するためのMSPアッセイを提供する。全体で、6人の男性と11人の女性の健常被験者を採用した。すべての男性対照被験者において、予想通り試料中にはメチル化されていないアンドロゲン受容体遺伝子しか検出されなかった(図1A)。対照的に、女性対照被験者においては非メチル化とメチル化の両方のアンドロゲン受容体遺伝子DNA配列が観察された(図1A)。これらの女性被験者におけるメチル化アンドロゲン受容体遺伝子と非メチル化アンドロゲン受容体遺伝子の検出比率は、それぞれ100%および82%であった。DNA試料をMSPアッセイから除外した場合には、陽性のシグナルは全く観察されなかった(図1A)。興味深いことに、メチル化および非メチル化の両方のDNA配列に対する陽性のシグナルが、性別が不一致な骨髄移植を受けた被提供者の男性全員(100%)において観察されたことから、女性提供者に由来する細胞が男性被提供者の血液循環中に存在していることがわかる。
【0034】
上記結果から、女性個体由来の不活性化X染色体上のメチル化された遺伝子を、キメラ現象研究における女性特異的マーカーとして利用できることが初めて実証された。このアッセイは、男性と女性の細胞またはDNAの混合物を用いる移植後キメラ現象の他のタイプの研究にも適用可能である。例としては、固形臓器移植後の細胞キメラ現象(スターズル(Starzl)ら、Curr Opin Nephrol Hypertens 第6巻:292〜8頁(1997))、移植後の血漿中DNAキメラ現象(ロー(Lo)ら、Lancet 第351巻:1329〜30頁(1998))および尿中DNAキメラ現象(チャン(Zhang)ら、Clin Chem 第45巻:1741〜6頁(1995))が挙げられる。さらに、最近では妊娠中の母親から胎児への細胞およびDNAの受け渡しにも大きな関心が寄せられている(ロー(Lo)ら、Blood 第88巻:4390〜5頁(1996);マロネイ(Maloney)ら、J Clin Invest 第104巻:41〜7頁(1999);ロー(Lo)ら、Clin Chem 第46巻:1301〜9頁(2000))。開発される後成的マーカーは、男性の子孫における母体起源のキメラ現象にも用いることができなければならない。
【0035】
このアッセイは、例えば、リアルタイムPCR技術を用いて定量的な方法に発展させることもできる(ロー(Lo)ら、Cancer Res 第59巻:3899〜903頁(1999))。このような発展によって、我々は特定の人におけるキメラ現象のレベルを監視することができるようになる。臨床的には、そのようなアッセイがBMTにおける移植片受容性を監視する役割を果たすものと思われる。尿中または血漿中のDNAキメラ現象の場合には、そのようなアッセイは移植片の拒絶を監視するために用いることもできるであろう。
【実施例2】
【0036】
(母体血漿中の胎児DNAを検出するための戦略としての、胎児と母親間での差異的なDNAメチル化)
本実験では、ヒトIGF2‐H19遺伝子座内の差異的にメチル化される領域を、母体血漿中の後成的マーカーとして用いることにより、胎児が母親から受け継いだ対立遺伝子を検出可能であることを実証する。これらの結果は、母体血漿中の胎児DNAの出生前診断の可能性を大きく広げ、母体血漿中の性別や多型に依存しない胎児特異的マーカーの開発、ならびに刷り込み不全やある種の染色体異数性の出生前診断に対する新しい戦略を可能にする。
【0037】
(材料と方法)
(被験者と試料)
試料はインフォームドコンセントを行った上で妊婦より採取した。全部で、21人の妊娠第2期(17〜21週)および18人の妊娠第3期(37〜42週)の女性を本研究のために採用した。採用した被験者のいずれも、現妊娠において子癇前症でも早期分娩でもなかった。母体のEDTA血試料および胎児羊水試料を、上述のようにして(ロー(Lo)ら、Am J Hum Genet 第62巻:768〜775頁(1998))妊娠第2期の妊婦から採取した。妊娠第3期の妊婦については、正常な経膣分娩の2〜3時間前に母体のEDTA血試料を採取した。胎児臍帯のEDTA血試料も上述のようにして(ロー(Lo)ら、Clin Chem 第46巻:1903〜1906頁(2000))分娩後直ちに採取した。採取したすべての血液試料由来の血漿および軟膜は、血漿試料を16,000gで再度遠心分離したことを除いては、上述のようにして(ロー(Lo)ら、Am J Hum Genet 第62巻:768〜775頁(1998))採集し、−20℃で保存した。羊水試料は4℃で保存した。
【0038】
(DNA単離)
DNAは血漿および羊水試料より、QIAamp(登録商標)Bloodキット(キアゲン(Qiagen))を用いて抽出した。典型的には、1カラムにつきDNA抽出のために800μLの血漿または羊水を用いた。溶出体積としては50〜110μLを用いた。DNAは、製造者の推奨に従ってNucleon(登録商標)DNA抽出キット(スコットラブス(Scotlabs))を用いて軟膜より抽出した。
【0039】
(DMR多型領域の遺伝子型決定)
ヒトIGF2‐H19遺伝子座中のDMRは、2つの450bp反復単位と7つの400bp反復単位を含む(ナカガワ(Nakagawa)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第98巻:591〜596頁(2001))(図2)。DMR中のA/G SNP(前掲のナカガワ(Nakagawa)ら)を本実験におけるマーカーとして選択した(図2)。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、母体DNA試料および胎児DNA試料中のSNPを増幅した。プライマーは、ヒトH19遺伝子(Genbankアクセス番号AF125183)の配列を用いて設計した。典型的には、母体の軟膜、臍帯軟膜または羊水から精製した2〜5μLの溶出DNAを、2.5μLの10×TaqMan(登録商標)バッファA(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))、3mM MgCl2、6.26pmol dNTPs、5pmol プライマー(順方向:5’‐ggACGGAATTGGTTGTAGTT‐3’;逆方向:5’‐AGGCAATTGTCAGTTCAGTAA‐3’)および0.625U AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))を含む25μLのPCR反応系に加えた(95℃8分間に続いて、95℃1分間、56℃20秒間、72℃20秒間のサイクルを35サイクル)。順方向プライマーについては、上記の場合のヌクレオチドはH19配列(Genbankアクセス番号AF125183)の7927〜7944位に対応させた。逆方向プライマーについては、ヌクレオチドはH19配列の8309〜8329位に相補的なものとした。その後、PCR産物をアガロースゲル電気泳動およびDNAシーケンシングによって解析した。
【0040】
(亜硫酸水素塩による変換)
DNA試料の亜硫酸水素塩による修飾は、製造者の指示に従ってCpGenome(登録商標)DNA修飾キット(インターゲン(Intergen))を用いて実施した。亜硫酸水素塩による変換を行うことにより、メチル化されていないシトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化されているシトシン残基には変化がないはずである(ハーマン(Herman)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第93巻:9821〜9826頁(1996))。その後、亜硫酸水素塩による変換後のメチル化されたDNAとメチル化されていないDNAとの間の配列の差異を、異なるPCRプライマーを用いて識別することができた。一般に、亜硫酸水素塩による変換反応においては、1μgの母体血液もしくは臍帯血由来の軟膜DNA、または母体血漿もしくは羊水から精製した93μLの溶出DNAを用いた。次いで亜硫酸水素塩で処理したDNAを、25〜50μLの1μ Tris‐EDTA中に溶出させた。
【0041】
(メチル化特異的PCR(MSP))
MSPアッセイは、前述(Hermanら 1996)のようなプロトコールを改変したものである。亜硫酸水素塩処理した5μLのDNAを、5μLの10×TaqMan(登録商標)バッファA(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))、2.5mM MgCl2、10pmol dNTPs、それぞれ20pmolの対応するMSPプライマー(図2)、および1.25U AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))を含む50μLのPCR反応系に加えた。メチル化された配列に対しては、プライマーM‐forおよびM‐rev(図2)を設計し、メチル化されていない配列に対しては、プライマーU‐forおよびU‐rev(図2)を設計した。最初に95℃で8分間の変性工程を実施した後、反応混合物を50回(軟膜および羊水DNA)または56回(血漿DNA)の熱サイクル(各サイクルは、メチル化された対立遺伝子:95℃45秒間、55℃20秒間、72℃20秒間;メチル化されていない対立遺伝子:95℃45秒間、49℃20秒間、72℃20秒間)に供した。その後、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。反応産物は、DNAシーケンシングまたはプライマー伸長アッセイのために、Microspin(登録商標)S‐300HRカラム(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))を用いて精製した。
【0042】
(DNAシーケンシング)
精製したPCR産物をABI Prism(登録商標)dRhodamineターミネータ・サイクルシーケンシング・レディ反応キット(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))およびPCR産物の対応する順方向プライマーを用いてシーケンシングした。シーケンシング産物はABI Prism(登録商標)310ジェネティクアナライザー(PEアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems))を用いて解析した。
【0043】
(プライマー伸長アッセイ)
2μLの精製MSP産物を、50μM ddATP(2’,3’−ジデオキシアデニン三リン酸)、50μM dGTP、50μM dTTP、0.2pmol Cys‐5‐標識プライマー(5’‐GGGTTATTTGGGAATAGGATATTTA‐3’)、4U ThermoSequenase(登録商標)(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))および1.43μL濃縮バッファを含む25μLの反応系に加えた。反応系を、95℃30秒間、51℃20秒間、72℃20秒間を1サイクルとする40回の熱サイクルに供した。Cys‐5‐標識プライマーは、25ヌクレオチド(nt)の長さを有し、多型部位はプライマーの3’末端から2nt離れたところにあった。A対立遺伝子については、多型部位でのddATPの取り込みによって連鎖の終結が起こり、27nt(すなわち25+2nt)の伸長産物を生じることになる。G対立遺伝子については、プライマーの3’末端から5nt離れた次のA残基まで鎖の伸長が継続するので、30nt(すなわち25+5nt)の伸長産物が生じることになる。反応産物は14%変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ALF(登録商標)Express(登録商標)シーケンサ(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))を用いて分析した。データはAlleleLinks(登録商標)プログラム(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))によって解析した。
【0044】
(結果)
(DMRの遺伝子型決定)
この研究には39人の妊婦を採用した。DMR内のSNPにおける母体の遺伝子型(図2)は、軟膜DNAからのPCR産物の直接シーケンシングによって決定した。考えられる各遺伝子型を有する妊婦の数は、17人(GG,43.6%)、16人(AG,41.0%)および6人(AA,15.4%)であった。
【0045】
(二多型性(biallelic)多型に対してヘテロ接合の女性由来の血漿中胎児DNAの検出)
SNPに対してヘテロ接合(すなわちAG)の16人の女性を選んでさらなる実験を行った。これは二多型性の多型であるので、以前の基準に基づけば、これらの女性は、母体血漿中の胎児DNAの検出に関して、この多型遺伝子座に情報性を有するとは考えられないであろう(ロー(Lo)ら、Ann N Y Acad Sci 第731巻:204〜213頁(1994);ビアンチ(Bianchi) Am J Hum Genet 第62巻:763〜764頁(1998))。この遺伝領域の差異的なメチル化により上記限界を克服できることを実証するために、母体DNAを亜硫酸水素塩で処理し、図2に示したプライマーを用いてMSPにより増幅した。同様に、羊水(妊娠第2期試料)または臍帯血の軟膜(妊娠第3期試料)から単離した胎児DNAをPCRおよびMSPに供して、胎児の対立遺伝子の刷り込み状態を判定した。
【0046】
選択した16例のうち、4例の妊娠第3期胎児試料および7例の妊娠第2期胎児試料からのメチル化された(すなわち父親から受け継いだ)対立遺伝子が、それぞれの母親のメチル化された対立遺伝子とは異なっていた(図3a,b;パネル1と2を比較のこと)。この胎児と母親の間でのメチル化の差異によって、母体血漿から胎児の対立遺伝子を検出することができるかどうかを調べるために、これらの例から得た母体血漿DNAを亜硫酸水素塩で変換してからMSPに供した。興味深いことに、父親から受け継いだメチル化された胎児対立遺伝子は、2例の第3期および4例の第2期母体血漿試料中でも検出された(図3a,b;パネル3)。これらの観察結果が単に母体血漿中の異常にメチル化されたDNAの存在によるものである可能性を排除するために、陽性例のうち1例から出生後の母体血漿試料(分娩後〜3.5年)をさらなる試験のために採取した。この出生後試料からは追加のメチル化された対立遺伝子は認められなかったことから(図3a、パネル4)、妊娠中の母体試料中の追加のメチル化対立遺伝子は、胎児起源のものであることがわかる。さらに、非情報性の例(n=4、データ示さず)の血漿中に陽性のシグナルは全く観察されなかったことから、このMSPアッセイの特異性が実証された。まとめると、上記のデータは、母親と胎児の間でのメチル化の差異を用いることにより、既存の基準では情報性が有ると考えられていないケースにおいてさえ、母体血漿中の胎児DNAを検出できるようになることを示している。
【0047】
(母親から受け継がれた胎児DNAの、母体血漿からの検出)
次に我々は、母親と胎児の間のメチル化の差異を用いて、胎児が母親から受け継いだ対立遺伝子を検出することができるようになるかどうかについて調べた。このタイプの分析は、以前は不可能であると考えられていた(ロー(Lo)ら、Ann N Y Acad Sci 第731巻:204〜213頁(1994);ビアンチ(Bianchi)、Am J Hum Genet 第62巻:763〜764頁(1998))。母親から受け継いだ対立遺伝子はメチル化されていないので、亜硫酸水素塩処理に続いて、プライマーU‐forおよびU‐rev(図2)を用いてメチル化されていない対立遺伝子を増幅した。分析した16例のうち、3例の妊娠第3期および5例の妊娠第2期の母体試料が情報性を有していた。これらの例において、胎児は、母親のメチル化されていない対立遺伝子とは異なるメチル化されていない対立遺伝子を有していた。これらの結果は、上記の例において、母親が該胎児対立遺伝子を元々彼女の父親から受け継ぎ、その後胎児に受け渡したことを含意する。情報性を有する8例のうち、直接シーケンシングにおいて妊娠第3期試料のうち1例にごく弱い陽性のシグナルが観察された(図4a、パネル1とパネル2で比較)。
【0048】
そこで我々は、上記の1つの陽性例に見られたシグナルが弱いこと、および母体血漿由来のメチル化されていない胎児対立遺伝子の検出率が低いことは、直接シーケンシング法の感度が低いことによるものであろうと考えた。検出の感度を高めるために、我々はより感度の高いプライマー伸長アッセイを用いて、MSP反応産物からメチル化されていない胎児対立遺伝子を検出した。SNPはA/G多型であったので、ddATPをプライマー伸長アッセイにおける反応基質として用いた。A対立遺伝子およびG対立遺伝子から伸長した反応産物は、それぞれ27および30ヌクレオチド長であった。対応する母体軟膜試料中には、胎児特異的な反応産物は全く存在しなかった(図4b、c;母体BC)。驚くべきことに、胎児特異的な伸長産物は、2例の妊娠第3期母体血漿試料(図4b、矢印)および1例の妊娠第2期母体血漿試料(図4c、矢印)において観察されたことから、母体血漿中にメチル化されていない胎児DNAが存在することが分かった。対照として、情報性のないどの被験例もこのアッセイにおいては陽性を示さなかった(n=5、データ示さず)。これらの結果から、母親から受け継がれた胎児DNA配列を母体血漿から検出するために後成的マーカーを使用するということの実行可能性が初めて実証された。
【0049】
(考察)
上記の結果から、後成的マーカーを使用することにより、母体血漿中の胎児DNAを検出する際の従来の限界が克服されることが実証される。母親と胎児の間の後成的な差異を用いることにより、母体の対立遺伝子とは遺伝子としては区別のつかない、父親から受け継いだ胎児対立遺伝子を、母親の血漿から検出することができる。同様に、母親から受け継いだ胎児対立遺伝子を、母親の血漿から検出することができる。従って、この新規な後成的手法は、母体血漿中の胎児DNAを用いることのできる疾患のレパートリーを広げることであろう。
【0050】
比較的感受性の低い方法、例えば直接シーケンシングやプライマー伸長法を用いた場合でも、本結果は、差異的にメチル化された胎児DNA配列を母体血漿から検出できることを実証している。メチル化された対立遺伝子に対する同様のアッセイと比較して(図3)、母体血漿中のメチル化されていない胎児DNAの検出の感度は低かった(図4)。より感受性の高い検出システム、例えば対立遺伝子特異的PCR(ニュートン(Newton)ら、Nucleic Acids Res 第17巻:2503〜2516頁(1989))やリアルタイムメチル化特異的PCR(ロー(Lo)ら、Cancer Res 第59巻:3899〜3903頁(1999);イーズ(Eads)ら、Nucleic Acids Res 第28巻:E32頁(2000))などを用いることにより、血漿を用いる後成的分析の感度を高めることができるかもしれない。リアルタイムメチル化特異的PCRの開発は、循環中の腫瘍DNAの検出に対してはすでに達成されているように(カワカミ(Kawakami)ら、J Natl Cancer Inst 第92巻:1805〜1811頁(2000))、母体血漿中の胎児特異的メチル化を定量する可能性を切り開くことから特に興味深い。
【0051】
母体血漿中の胎児DNAを常套的出生前診断ツールとして導入する可能性から、循環する胎児DNAに対する汎用マーカーの必要性についての問題が持ち上がってきた(ロー(Lo)ら、Am J hum Gnet 第62巻:768〜775頁(1998);アベント(Avent)ら、Vox Sang 第78巻:155〜162頁(2000))。そのようなマーカーに対する提案の大半は、これまでは母親と胎児との間の遺伝的多型現象を使用することに焦点を当ててきた(タン(Tang)ら、Clin Chem 第45巻:2033〜2035頁(1999);パートル(Pertl)ら、Hum Genet 第106巻:45〜49頁(2000))。今回母体血漿中の胎児DNA検出のために後成的マーカーを使用できる可能性が実証されたことから、母体血漿中における性別非依存性かつ多型非依存性の胎児マーカーを開発するための新しい手法が開拓される。これを実現できる1つの方法としては、組織特異的メチル化現象を利用することである(グルナウ(Grunau)ら、Hum Mol Genet 第9巻:2651〜2663頁(2000))。栄養膜は、母体血漿中への胎児DNAの放出に関する有力な細胞集団であると示唆されてきたので、栄養膜特異的メチル化パターンを解明することにより、母体血漿中における汎用性の胎児後成的マーカーの開発が可能になる。生物学的には、組織特異的メチル化マーカーを使用すると、どのタイプの胎児細胞が母体血漿中への胎児DNAの放出に関与しているかに関する疑問に直接取り組むことができる。
【0052】
母体血漿の後成的分析が、プラーダー‐ヴィリ症候群などのゲノム刷り込みに関連する疾患に適用できることは自明である(ファイファー(Pfeifer)、Lancet 第356巻:1819〜1820頁(2000))。この戦略は、刷り込まれた遺伝子が役目を果たしていると仮定されている子癇前症などの疾患診断の可能性も有しているかもしれない(グレーブス(Graves)、Reprod Fertil Dev 第10巻:23〜29頁(1998))。
【0053】
胎児の染色体異数性の出生前検出のために、母体血漿中の胎児DNAを応用できるかどうかは、この現象が発見されて以来激しく議論されてきた問題である(ロー(Lo)ら、Lancet 第350巻:485〜487頁(1997);ビアンチ(Bianchi)、Am J Hum Genet 第62巻:763〜764頁(1998))。異数性の妊娠中に循環する胎児DNAのレベルは正数性の妊娠の場合と比較して量的に異なることが発見され(ロー(Lo)ら、Clin Chem 第45巻:1747〜1751頁(1999);チョン(Zhong)ら、Prenat Diagn 第20巻:795〜798頁(2000))、この発見により、母体血漿から胎児が染色体異数性である危険性を評価するための方法が提案されている。最近になって母体血漿中(「血漿から取り出した細胞」)にアポトーシスを起こした胎児細胞が見つかり(バン・ウェイク(Van Wijk)ら、Clin Chem 第46巻:729〜731頁(2000))、母体血漿から異数性を検出するためのさらに別の手法が提案されている(プーン(Poon)ら、Lancet 第356巻:1819〜1820頁(2000))。興味深いことに、本発明のデータは胎児の染色体異数性を検出するためのさらに別の潜在的手法を開拓するものでもある。これは異常なDNAメチル化パターンは染色体異数性に関連する可能性があるという観察結果に基づいている(クロミツ(Kuromitsu)ら、Mol Cell Biol 第17巻:707〜712頁(1997);ユ(Yu)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第94巻:6862〜6867頁(1997))。したがって、母体血漿からこのような異常にメチル化された胎児DNA配列を検出するための後成的マーカーを開発することができる。そのようなマーカーは、母体血漿中の胎児DNAの単純な定量(ロー(Lo)ら、Clin Chem 第45巻:1747〜1751頁(1999);チョン(Zhong)ら、Prenat Diagn 第20巻:795〜798頁(2000))に比べて高い特異性を有するとともに、「血漿から取り出した細胞」に基づく方法(プーン(Poon)ら、Lancet 第356巻:1819〜1820頁(2000))と比べて大規模な用途により適している。
【0054】
胎児後成的マーカーは、母体血液の細胞画分から単離した胎児細胞の分析においても用いることができる。これには、メチル化分析をin situ様式で実施できることを示した最近のデータを活用する(ヌオボ(Nuovo)ら、Proc Natl Acad Sci USA 第96巻:12754〜12759頁(1999))。
【0055】
母子輸送は双方向プロセスであるという最近の理解をもってすれば(ロー(Lo)ら、Blood 第88巻:4390〜4395頁(1996);マロネイ(Maloney)ら、J Clin Invest 第104巻:41〜47頁(1999))、後成的マーカーは、母親から胎児への細胞およびDNAの移動を調べるためにも用いることができる。このような手法は、他のタイプのキメラ現象、例えば移植後の造血のキメラ現象(スターズル(Starzl)ら、Curr Opin Nephrol Hypertens 第6巻:292〜298頁(1997))および尿中DNAのキメラ現象(チャン(Zhang)ら、Clin Chem 第45巻:1741〜1746頁(1999))などを調べるためにも応用できる。
【0056】
ヒトゲノムについての理解の深まりやメチル化分析に対するハイスループットのアレイを用いる技術の開発に伴って(ヤン(Yan)ら、Clin Cancer Res 第6巻:1432〜1438頁(2000))、有用な胎児後成的マーカーの数は今後数年のうちに急速に増加することが期待される。そうした開発によって、従来の母体血漿における遺伝的マーカーとともに、相乗的に用いることのできる臨床的に関連した胎児後成的マーカー群が提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1A】アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化DNA配列および非メチル化DNA配列を検出するアッセイの結果を示す図。全体として、6人の男性と11人の女性の健常被験者を採用した。全男性対照被験者のなかでは、予想通りメチル化されていないアンドロゲン受容体遺伝子のみが試料中に検出された(図1A)。対照的に、女性対照被験者においては非メチル化とメチル化の両方のアンドロゲン受容体遺伝子DNA配列が観察された(図1A)。これらの女性被験者におけるメチル化アンドロゲン受容体遺伝子と非メチル化アンドロゲン受容体遺伝子の検出比率は、それぞれ100%および82%であった。DNA試料をアッセイから除外した場合には、陽性のシグナルは全く観察されなかった(図1A)。
【図1B】アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化DNA配列および非メチル化DNA配列を検出するアッセイの結果を示す図。興味深いことに、メチル化および非メチル化の両方のDNA配列に対する陽性のシグナルが、女性を提供者とするすべての男性の骨髄移植の被提供者において観察されたことから、女性提供者に由来する細胞が男性被提供者の血液循環中に存在していることがわかる。
【図2】ヒトIGF2‐H19領域の差異的にメチル化される領域(DMR)の模式図。2つの450bp反復単位(A1およびA2)および7つの400bp反復単位(B1〜B7)が示されている。調べた領域の上側のDNA鎖上の潜在的メチル化領域は、白丸で示されている。調べた単一ヌクレオチド多型(SNP)部位(A/G)は、白四角で示されている。白抜き矢印は、それぞれメチル化された対立遺伝子(M)とメチル化されていない対立遺伝子(U)に特異的なPCR反応における順方向プライマー(for)および逆方向プライマー(rev)の位置を示している。これらのMSPプライマーの配列が示されている。亜硫酸水素処理したDNAと未処理のDNAとの間の配列の違いを太字イタリックで示し、メチル化(父親から受け継いだ)DNAおよび非メチル化(母親から受け継いだ)DNAとの間の配列の違いを太字下線で示す。
【図3A】妊娠第3期の母体血漿中のメチル化された(父親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。母体軟膜(パネル1)、胎児軟膜または羊水(パネル2)、出生前母体血漿(パネル3)および出生後母体血漿(パネル4)試料中のメチル化された対立遺伝子のDNA配列が示されている。出生前母体血漿試料中にメチル化された胎児DNAが存在することが「*」で示されている。多型(SNP)部位は赤字で示されている。
【図3B】妊娠第2期の母体血漿中のメチル化された(父親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。母体軟膜(パネル1)、胎児軟膜または羊水(パネル2)、出生前母体血漿(パネル3)および出生後母体血漿(パネル4)試料中のメチル化された対立遺伝子のDNA配列が示されている。出生前母体血漿試料中にメチル化された胎児DNAが存在することが「*」で示されている。多型(SNP)部位は赤字で示されている。
【図4A】母体血漿中のメチル化されていない(母親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。(a)直接シーケンシング法を用いて、母体軟膜(パネル1)および妊娠第3期母体試料(パネル2)中のメチル化されていないDNA配列を検出した。母体血漿中にメチル化されていない胎児DNAが存在する場合を「*」で示す。
【図4B】母体血漿中のメチル化されていない(母親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。(b)プライマー伸長アッセイを用いて2つの妊娠第3期母体血漿試料中のメチル化されていない胎児DNA(矢印)を検出した。反応産物のサイズ(nt)が下に示されており、●は未使用プライマーを示し、□は検出された対立遺伝子を示す。
【図4C】母体血漿中のメチル化されていない(母親から受け継いだ)胎児DNAの検出を示す図。(c)プライマー伸長アッセイを用いて妊娠第2期母体血漿試料中のメチル化されていない胎児DNA(矢印)を検出した。プライマーのみ、非メチル化G対立遺伝子または非メチル化A対立遺伝子を含む対照反応からの産物が示されている。反応産物のサイズ(nt)が下に示されており、●は未使用プライマーを示し、□は検出された対立遺伝子を示す。
Claims (38)
- 生物試料中の異なる個体を起源とするDNA種を識別するための方法であって、前記DNA種間の後成的差異を決定する工程を含む方法。
- 後成的差異は、DNAメチル化の差異であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 生物試料は血漿または血清であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 生物試料は血液であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 一方の個体が妊婦であり、他方の個体が未出生の胎児であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 一方の個体が移植の被提供者であり、他方の個体が臓器提供者であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 移植は骨髄移植であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 後成的差異を有するDNA種の濃度を測定する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 後成的差異は、DNAメチル化の差異であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- DNAメチル化の差異を検出するために、生物試料またはDNA種に亜硫酸水素ナトリウムを加える工程をさらに含む請求項2に記載の方法。
- DNAメチル化の差異を検出するために、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程をさらに含む請求項2に記載の方法。
- DNAメチル化の差異を検出するために、DNAのシーケンシングを行う工程をさらに含む請求項10に記載の方法。
- DNAメチル化の差異を検出するために、プライマー伸長法を実施する工程をさらに含む請求項10に記載の方法。
- 生物試料は母体の血漿または血清であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 母体の血漿または血清中の胎児DNAの濃度を測定する工程をさらに含む請求項14に記載の方法。
- 測定された胎児DNAの濃度は、疾患を予測、監視または診断もしくは予後判定するために用いられることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 後成的指標は、胎児または母体の疾患に関連づけられていることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 疾患は染色体異数性であることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 染色体異数性は21トリソミー(ダウン症候群)であることを特徴とする請求項18に
記載の方法。 - 疾患は子癇前症であることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 疾患は刷り込み不全であることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 疾患はプラーダー‐ヴィリ症候群であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 疾患はエンジェルマン症候群であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 胎盤中の胎児細胞における後成的差異を、母体血漿または血清中の胎児特異的マーカーとして用いることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 提供者と被提供者のDNAの濃度を測定する工程をさらに含む請求項6に記載の方法。
- 移植の被提供者の臨床経過を予測するために前記測定を用いることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 一方の個体が男性で、他方の個体が女性であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 後成的マーカーは、女性個体の不活性化されたX染色体であることを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 不活性化されたX染色体上のメチル化されたDNA配列が、女性個体を起源とするDNAを検出するために用いられることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 後成的差異は、細胞内部で解析されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 後成的差異は、in situメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて解析されることを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 後成的差異は、細胞を個体から選別または単離するために用いられることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 後成的差異は、個体からDNAを精製するために用いられることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 生物試料中の異なる個体を起源とするDNA種を識別するためのキットであって、DNA種のメチル化状態を確認するための1つ以上の試薬を含むキット。
- 母親由来DNAのメチル化状態を確認するための1つ以上の試薬は、亜硫酸水素ナトリウムであることを特徴とする請求項34に記載のキット。
- DNAの存在を検出するための1つ以上の試薬をさらに含む請求項34に記載のキット。
- 生物試料中に存在するDNAの量を増幅するための1つ以上の試薬をさらに含む請求項34に記載のキット。
- DNA試料を得るための1つ以上の装置をさらに含む請求項34に記載のキット。
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