ES2685893T3 - Método para determinar la composición de ácidos nucleicos de una mezcla de ácidos nucleicos - Google Patents

Método para determinar la composición de ácidos nucleicos de una mezcla de ácidos nucleicos Download PDF

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Abstract

Método para determinar la composición de ácidos nucleicos en una mezcla de ácidos nucleicos totales que comprende un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, en el que dicho primer ácido nucleico y dicho segundo ácido nucleico se derivan de fuentes diferentes, comprendiendo dicho método: 1) tratar dicha mezcla de ácidos nucleicos totales con un bisulfito, para convertir citosina no metilada en dicha mezcla de ácidos nucleicos totales en uracilo, y obtener una mezcla de ácidos nucleicos totales convertidos; 2) someter dicha mezcla de ácidos nucleicos totales convertidos a PCR cuantitativa fluorescente multiplexada usando un primer conjunto de cebadores de amplificación y un segundo conjunto de cebadores de amplificación, para capturar y amplificar un fragmento de ácido nucleico predeterminado, y obtener una razón R de un producto de amplificación metilado con respecto a un producto de amplificación no metilado de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, en el que dicho primer ácido nucleico y dicho segundo ácido nucleico contienen ambos dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, y el fragmento de ácido nucleico predeterminado en dicho primer ácido nucleico difiere del fragmento de ácido nucleico predeterminado en dicho segundo ácido nucleico en cuanto al nivel de metilación; dicho primer conjunto de cebadores de amplificación reconoce específicamente el fragmento de ácido nucleico predeterminado convertido, y dicho segundo conjunto de cebadores de amplificación reconoce específicamente el fragmento de ácido nucleico predeterminado no convertido; y se predeterminan una proporción de metilación M1 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico y una proporción de metilación M2 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico; y 3) basándose en la razón R del producto de amplificación metilado con respecto al producto de amplificación no metilado de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, la proporción de metilación M1 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico y la proporción de metilación M2 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico, determinar la composición de ácidos nucleicos en la mezcla de ácidos nucleicos totales; en el que en la etapa 3), el contenido ε del primer ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales se determina según la fórmula ε>=(M2+RM2-R)/[R(M2-M1)-(M1-M2)].

Description

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DESCRIPCION
Método para determinar la composición de ácidos nucleicos de una mezcla de ácidos nucleicos
Antecedentes
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de las tecnologías biológicas, particularmente a un método para determinar la composición de ácidos nucleicos en una mezcla de ácidos nucleicos, y más específicamente a un método para determinar el contenido de un primer ácido nucleico en una mezcla de ácidos nucleicos totales que comprende el primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
Técnica relacionada
El diagnóstico prenatal es una de las formas más eficaces para reducir las anomalías congénitas mediante el diagnóstico de defectos congénitos o enfermedades genéticas en el feto antes del nacimiento usando diversas herramientas de detección, por ejemplo, tecnologías de obtención de imágenes, bioquímicas, citogenéticas y biomoleculares.
Desde el año 1997, se ha encontrado a través de la investigación que está presente ADN fetal libre circulante en la sangre periférica de una mujer embarazada, y este hallazgo brinda una nueva oportunidad para el cribado fetal no invasivo.
En el método existente para detectar aneuploidía cromosómica fetal mediante secuenciación del plasma materno, el ADN libre total en el plasma materno se secuencia generalmente, sin hacer discriminación entre el ADN fetal y materno, y si el feto tiene una variación aneuploide cromosómica se determina basándose en la prueba de significación. El método es ventajoso en el cribado no invasivo de trisomía. Sin embargo, cuando la concentración de ADN fetal es baja, puede obtenerse potencialmente un resultado de falso negativo debido a una baja significación de la anomalía cromosómica.
Chim SSC et al: “Systematic Search for Placental DNA-Methylation Markers on Chromosome 21: Toward a Maternal Plasma-Based Epigenetic Test for Fetal Trisomy 21”, Clinical Chemistry, vol. 54, n.° 3, 1 de marzo de 2008, describen un método que usa extensión de cebadores de un solo nucleótido sensibles a metilación que implica tratamiento con bisulfito.
Por tanto, existe la necesidad en la actualidad de un método mejorado para cuantificar el ADN fetal en el plasma materno.
Metilación del ADN se refiere a un proceso de modificación química en el que, en presencia de una ADN metiltransferasa, se añade un grupo metilo al carbono C-5 de la citosina, para producir metilcitosina. Una modificación de metilación del ADN de este tipo puede ser específica para el individuo, el tejido o la célula, de modo que el ADN de fuentes diferentes (por ejemplo, ADN fetal y materno, o ADN tumoral y normal) puede discriminarse basándose en la metilación de un gen particular, y entonces se cuantifica el ADN de una fuente.
Para la detección de cánceres en estadio temprano, la metilación de un gen particular está estrechamente vinculada con la aparición y el desarrollo de cánceres, y por tanto puede usarse como posible marcador en diagnóstico temprano. Por ejemplo, el cáncer colorrectal, también denominado cáncer de intestino grueso, incluye la proliferación de tumores en el intestino grueso, recto y apéndice. En el mundo occidental, es el tercer cáncer más prevalente, y la segunda causa de muerte por cáncer. Generalmente, se considera que muchos cánceres de intestino grueso se inducen a partir del pólipo adenomatoso del intestino grueso. Estos tumores en forma de hongo son generalmente benignos, pero algunos de ellos se transformarán en cánceres tras un periodo de tiempo. El cáncer de colon puede tratarse eficazmente en estadio temprano mediante operación quirúrgica antes de la metástasis, para prolongar el tiempo de supervivencia. Por tanto, la detección de cáncer colorrectal en estadio temprano es un factor clave que determina si puede realizarse una cura satisfactoria y completa. Un marcador altamente específico y sensible es crucial para el diagnóstico de cánceres colorrectales. Por ejemplo, la detección cualitativa y cuantitativa de metilación del ADN anómalamente alta en suero y excrementos es un método nuevo, con gran potencial y no invasivo para el cribado de cánceres colorrectales.
Sumario
La presente invención pretende solucionar al menos uno de los problemas técnicos anteriores hasta cierto punto o proporcionar al menos una opción comercial útil. Con este propósito, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para determinar eficazmente la composición de ácidos nucleicos en una mezcla de ácidos nucleicos que comprende ácidos nucleicos de una variedad de fuentes.
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La presente invención proporciona un método para determinar la composición de ácidos nucleicos en una mezcla de ácidos nucleicos totales que comprende un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, en el que dicho primer ácido nucleico y dicho segundo ácido nucleico se derivan de fuentes diferentes, tal como se define mediante las reivindicaciones adjuntas, incluyendo, pero sin limitarse a, fuentes de individuos diferentes, fuentes de tejido diferentes y fuentes de células diferentes. El método comprende: 1) tratar dicha mezcla de ácidos nucleicos totales con un bisulfito, para convertir la citosina no metilada en dicha mezcla de ácidos nucleicos totales en uracilo, y obtener una mezcla de ácidos nucleicos totales convertidos; 2) someter dicha mezcla de ácidos nucleicos totales convertidos a PCR cuantitativa fluorescente multiplexada usando un primer conjunto de cebadores de amplificación y un segundo conjunto de cebadores de amplificación, para capturar y amplificar un fragmento de ácido nucleico predeterminado, y obtener una razón R de un producto de amplificación metilado con respecto a un producto de amplificación no metilado de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, en el que dicho primer ácido nucleico y dicho segundo ácido nucleico contienen ambos dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, y dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico difiere de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico en cuanto al nivel de metilación; dicho primer conjunto de cebadores de amplificación reconoce específicamente el fragmento de ácido nucleico predeterminado convertido, y dicho segundo conjunto de cebadores de amplificación reconoce específicamente el fragmento de ácido nucleico predeterminado no convertido; y se predeterminan una proporción de metilación M1 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico y una proporción de metilación M2 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico; y 3) basándose en la razón R del producto de amplificación metilado con respecto al producto de amplificación no metilado de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, la proporción de metilación M1 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico y la proporción de metilación M2 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico, determinar la composición de ácidos nucleicos en la mezcla de ácidos nucleicos totales; en el que en la etapa 3), el contenido e del primer ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales se determina según la fórmula 8=(M2+RM2-R)/[R(M2-M1)-(M1-M2)].
Según una realización de la presente invención, el tratamiento del ADN con un bisulfito puede permitir que la citosina no metilada se convierta en uracilo mediante desaminación, mientras que la citosina protegida con un grupo metilo permanece inalterada, de modo que puede discriminarse un sitio de citosina metilada de un sitio de citosina no metilada. Además, tras la PCR, la citosina metilada original permanece inalterada, y el uracilo obtenido tras tratamiento con un bisulfito se convierte completamente en timina. Por tanto, un fragmento metilado o un fragmento no metilado en el ADN obtenido tras tratamiento con un bisulfito puede amplificarse específicamente diseñando un cebador de PCR específico de metilación o específico de no metilación. Dado que el número del fragmento metilado y fragmento no metilado se correlaciona con la razón de composición de moléculas de ácido nucleico de fuentes diferentes, la composición de moléculas de ácido nucleico de fuentes diferentes, por ejemplo, el contenido de un primer ácido nucleico o un segundo ácido nucleico, en la mezcla de ácidos nucleicos, puede determinarse eficazmente usando el método según la presente invención.
Según una realización de la presente invención, el método puede tener además las siguientes características técnicas adicionales.
En una realización según la presente invención, dicho primer ácido nucleico es un ADN fetal, y dicho segundo ácido nucleico es un ADN materno. Opcionalmente, dicha mezcla de ácidos nucleicos totales es un ADN plasmático materno. Por consiguiente, la concentración de ADN fetal en la mezcla de ADN materno y fetal puede determinarse eficazmente. En algunas otras realizaciones de la presente invención, dicho primer ácido nucleico es un ADN de células cancerosas, y dicho segundo ácido nucleico es un ADN de células no cancerosas. Opcionalmente, dicha mezcla de ácidos nucleicos totales es un ADN tisular, plasmático o fecal de un paciente con tumor. Por tanto, puede analizarse el nivel de metilación en tejidos cancerosos de pacientes con tumores.
Según la presente invención, el contenido e del primer ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales se determina en la etapa 3) según la fórmula e=(M2+RM2-R)/[R(M2-M1)-(M1-M2)]. Por tanto, puede determinarse eficazmente la composición y el contenido de moléculas de ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales.
En una realización según la presente invención, M1 es al menos 10 veces, preferiblemente al menos 50 veces, más preferiblemente al menos 90 veces y lo más preferiblemente al menos 100 veces M2. Como tal, puede mejorarse adicionalmente la eficacia con la que se determinan la composición y el contenido de las moléculas de ácido nucleico.
En una realización según la presente invención, el contenido e del primer ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales se determina en la etapa 3) según la fórmula e=R/[M1R+M1]. Como tal, puede simplificarse adicionalmente el método para determinar la composición y el contenido de moléculas de ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales, y puede mejorarse adicionalmente la eficacia con la que se determinan la composición y el contenido de las moléculas de ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales.
En una realización según la presente invención, dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado incluye uno o
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más fragmentos de ácido nucleico ubicados en cromosomas diferentes.
En una realización según la presente invención, dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado incluye uno o más fragmentos de ácido nucleico ubicados en genes diferentes. En una realización según la presente invención, dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado puede seleccionarse de al menos una porción de RASSF1A, SERPINB5, C21orf63, OLIG2, CBR1, SIM2, DSCAM, TRPM2, C21orf29, COL18A1, AIRE, ERG, CD48, FAIM3, ARHGAP25, BMP3, VIM, NDRG4, TFPI2, SFRP2, SEPT9 y SELPLG. Por tanto, el método puede usarse eficazmente en el cribado prenatal y tumoral. Según una realización de la presente invención, para diversos genes, dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado incluye al menos uno seleccionado de las secuencias de ácido nucleico mostradas a continuación:
Gen
Secuencia de ácido nucleico
RASSF1A
chr3:50378097-50378226
AIRE
chr21:45703903-45704111
SIM2
chr21:38078780-38079213
ERG
chr21:39878777-39879107
CD48
chr1:160681560-160681732
FAIM3
chr1:207096473-207096654
ARHGAP25
chr2:69001823-69002052
SELPLG
chr12:109028663-109028901
BMP3
chr4:81951942-81952808
VIM
chr10:17270431-17272617
NDRG4
chr16:58497034-58498595
TFPI2
chr7:93519367-93520184
SFRP2
chr4:154709513-154710827
SEPT9
chr17:75368689-75370506
Por consiguiente, la concentración de ADN fetal en la mezcla de ADN materno y fetal, o la concentración del ADN de células cancerosas en la mezcla de ADN de células cancerosas y no cancerosas derivadas de un tejido tumoral de un paciente con tumor puede determinarse eficazmente. En una realización según la presente invención, para el gen RASSF1A, dicho primer conjunto de cebadores de amplificación incluye moléculas de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 7 y 8. Por consiguiente, la concentración de aDn fetal en la mezcla de ADN materno y fetal, o la concentración del ADN de células cancerosas en la mezcla de ADN de células cancerosas y no cancerosas derivadas de un tejido tumoral puede determinarse eficazmente.
En una realización según la presente invención, para el gen RASSF1A, dicho segundo conjunto de cebadores de amplificación incluye moléculas de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 4 y 5. Por consiguiente, la concentración de ADN fetal en la mezcla de ADN materno y fetal, o la concentración del ADN de células cancerosas en la mezcla de ADN de células cancerosas y no cancerosas derivadas de un tejido tumoral puede determinarse eficazmente.
En una realización según la presente invención, se usan adicionalmente una sonda específica de metilación y una sonda específica de no metilación en dicha PCR cuantitativa fluorescente multiplexada. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente.
En una realización según la presente invención, dicha sonda específica de metilación y dicha sonda no específica de metilación portan respectivamente un marcador seleccionado de al menos uno de FAM, JOE y TAMRA. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente.
En una realización según la presente invención, dicha sonda específica de metilación tiene una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO: 6, y dicha sonda no específica de metilación tiene una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO: 9. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente.
En una realización según la presente invención, dicha sonda específica de metilación está marcada con FAM y TAMRA. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente. En una realización según la presente invención, dicha sonda no específica de metilación está marcada con JOE y TAMRA. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente.
Por consiguiente, el método según la presente invención tiene al menos las siguientes ventajas.
1. El contenido de ADN específico en una muestra de ADN de un sujeto puede analizarse mediante el método según la realización de la presente invención usando QPCR multiplexada específica de metilación.
2. El método según la realización de la presente invención es rápido y conveniente. El método según la realización de la presente invención incluye menos etapas, y las operaciones implicadas en la práctica incluyen meramente
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extracción de ADN, tratamiento con bisulfito y PCR cuantitativa (QPCR). La conveniencia en la operación hace que el método según la realización de la presente invención sea aplicable a diversas detecciones clínicas (por ejemplo, detección del ADN fetal en plasma materno, o el contenido de ADN en células tumorales en muestras de pacientes con tumores). La rapidez de la operación permite que el método según la realización de la presente invención sea potencialmente aplicable al control de calidad de diversas detecciones clínicas (por ejemplo, diagnóstico prenatal no invasivo).
3. El método según la realización de la presente invención tiene un alto rendimiento. La presente invención implica un método para la cuantificación mediante (sin limitación) QPCR, que tiene la ventaja de un alto rendimiento. Por ejemplo, usando sistemas de PCR en tiempo real Applied Biosystems® StepOne™ o StepOnePlus™, pueden procesarse hasta 96 muestras en un procedimiento de QPCR.
4. El método según la realización de la presente invención tiene extensibilidad. El método según la presente invención implica analizar el contenido de ADN específico en una muestra de ADN de un sujeto mediante QPCR multiplexada específica de metilación. Por ejemplo, cuando se usan múltiples marcadores de metilación (en cromosomas diferentes), en la presente invención, puede detectarse la variación en el número de copias de un ADN específico (por ejemplo, T21) en algunos cromosomas en la muestra de ADN de un sujeto, mientras que se analiza el contenido de ADN específico en la muestra de ADN del sujeto. Debe indicarse que el término “marcador de metilación” tal como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de ácido nucleico que difiere significativamente en el nivel de metilación en ácidos nucleicos de fuentes diferentes. La al menos una porción de los genes RASSF1A, SERPINB5, C21orf63, OLIG2, CBR1, SIM2, DSCAM, TRPM2, C21orf29, COL18A1, AIRE, ERG, CD48, FAIM3, ARHGAP25, BMP3, VIM, NDRG4, TFPI2, SFRP2, SEPT9 y SELPLG mencionados anteriormente, y los fragmentos de ácido nucleico proporcionados en la tabla a continuación pueden usarse como “marcador de metilación”.
Gen
Secuencia de ácido nucleico
RASSF1A
chr3:50378097-50378226
AIRE
chr21:45703903-45704111
SIM2
chr21:38078780-38079213
ERG
chr21:39878777-39879107
CD48
chr1:160681560-160681732
FAIM3
chr1:207096473-207096654
ARHGAP25
chr2:69001823-69002052
SELPLG
chr12:109028663-109028901
BMP3
chr4:81951942-81952808
VIM
chr10:17270431-17272617
NDRG4
chr16:58497034-58498595
TFPI2
chr7:93519367-93520184
SFRP2
chr4:154709513-154710827
SEPT9
chr17:75368689-75370506
Aspectos y ventajas adicionales de la presente invención se proporcionarán parcialmente y serán parcialmente evidentes a partir de la descripción a continuación, o se entenderán a través de la práctica de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
Los aspectos y ventajas anteriores y/u otros adicionales de la presente invención resultan evidentes y comprensibles a partir de la descripción de realizaciones en relación con el dibujo adjunto, en el que:
la figura 1 es un diagrama de flujo esquemático de un método para analizar una mezcla de ácidos nucleicos totales según una realización de la presente invención.
Descripción detallada
Se describirán a modo de ejemplo en detalle realizaciones de la presente invención a continuación en el presente documento con referencia al dibujo adjunto en el que los mismos o similares caracteres de referencia se refieren a los mismos o similares elementos o elementos que tienen las mismas o similares funciones en todas partes. Las realizaciones descritas a continuación con referencia al dibujo adjunto son a modo de ejemplo, y se pretende que expliquen, y no que limiten, la presente invención.
Los términos “primero” y “segundo” se usan en el presente documento con propósitos de descripción, y no se pretende que indiquen o impliquen una importancia relativa o que apunten implícitamente el número de la característica técnica indicada. Por tanto, las características definidas por “primero” y “segundo” pueden incluir explícita o implícitamente una o más características. En la descripción de la presente invención, “plural” significa dos o más, a menos que se defina de otro modo específicamente.
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En referencia a la figura 1, se describe en detalle un método para analizar una mezcla de ácidos nucleicos según la presente invención.
Tal como se muestra en la figura 1, la presente invención proporciona un método para determinar la composición de ácidos nucleicos en una mezcla de ácidos nucleicos totales. La mezcla de ácidos nucleicos totales comprende un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico. Específicamente, el método comprende las siguientes etapas.
S100: Tratamiento con bisulfito
En esta etapa, la mezcla de ácidos nucleicos totales se trata con un bisulfito, para convertir citosina no metilada en la mezcla de ácidos nucleicos totales en uracilo, y obtener una mezcla de ácidos nucleicos totales convertidos. Durante la etapa, la región/fragmento diana en la mezcla de ácidos nucleicos totales puede capturarse de antemano si es necesario, y luego se trata con un bisulfito.
Según una realización de la presente invención, el tipo de la mezcla de ácidos nucleicos totales que puede tratarse y analizarse mediante el método según la presente invención no está particularmente limitado, siempre que las moléculas de ácido nucleico de diversas fuentes contenidas en la mezcla de ácidos nucleicos totales tengan niveles de metilación diferentes, y existan niveles de metilación particularmente diferentes para la misma secuencia. Por ejemplo, según una realización de la presente invención, la mezcla de ácidos nucleicos totales puede ser una mezcla de ADN fetal y materno, o una mezcla de ADN de células cancerosas y no cancerosas. Por tanto, la mezcla de ácidos nucleicos totales puede ser un ADN plasmático materno, y un ADN tisular, plasmático o fecal de un paciente con tumor. Específicamente, en una realización según la presente invención, dicho primer ácido nucleico es un ADN fetal, y dicho segundo ácido nucleico es un ADN materno. Opcionalmente, dicha mezcla de ácidos nucleicos totales es un ADN plasmático materno. Por consiguiente, la concentración de ADN fetal en la mezcla de ADN materno y fetal puede determinarse eficazmente. En algunas otras realizaciones de la presente invención, dicho primer ácido nucleico es un ADN de células cancerosas, y dicho segundo ácido nucleico es un ADN de células no cancerosas. Dicha mezcla de ácidos nucleicos totales es un ADN tisular, plasmático o fecal de un paciente con tumor. Por tanto, puede analizarse el nivel de metilación en tejidos cancerosos de pacientes con tumores.
Según una realización de la presente invención, el método para extraer la mezcla de ADN de muestras biológicas relevantes no está particularmente limitado. Por ejemplo, la mezcla de ADN puede extraerse mediante un método de extracción de ADN convencional tal como método de precipitación con sales, cromatografía en columna, método de perlas magnéticas y método de SDS. Entre ellos, se prefiere el método de perlas magnéticas. En resumen, el método comprende las siguientes etapas. Se obtienen moléculas de ADN desnudo después de que se traten la sangre, los tejidos o las células con proteinasa K en un tampón de lisis celular. Las moléculas de ADN se someten a adsorción por afinidad reversible usando perlas magnéticas específicas. Las proteínas, los lípidos y otras impurezas se retiran mediante lavado con un detergente. Entonces, las moléculas de aDn se eluyen de las perlas magnéticas usando un eluyente.
Después de obtener la mezcla de ácidos nucleicos totales, la mezcla obtenida puede tratarse directamente con un bisulfito, o la región/fragmento diana en la mezcla de ácidos nucleicos totales puede capturarse de antemano si es necesario, y luego tratarse con un bisulfito. Según una realización de la presente invención, el tratamiento de ADN con un bisulfito puede permitir que la citosina no metilada se convierta en uracilo mediante desaminación, mientras que la citosina protegida con un grupo metilo permanece inalterada, de modo que puede discriminarse un sitio de citosina metilada de un sitio de citosina no metilada. Por tanto, puede llevarse a cabo eficazmente el posterior análisis de una región que comprende un sitio metilado o un sitio no metilado. Según una realización de la presente invención, el tratamiento con bisulfito puede lograrse mediante cualquier método conocido, siempre que la citosina no metilada pueda convertirse en uracilo mediante desaminación, mientras que la citosina protegida con un grupo metilo permanece inalterada.
S200: PCR cuantitativa multiplexada
Después de que la mezcla de ácidos nucleicos se convierta mediante tratamiento con un bisulfito, las proporciones relativas del fragmento metilado y fragmento no metilado en la mezcla de ácidos nucleicos totales convertido se analizan mediante PCR multiplexada. Específicamente, la mezcla de ácidos nucleicos totales convertido se somete a PCR cuantitativa fluorescente multiplexada usando un primer conjunto de cebadores de amplificación y un segundo conjunto de cebadores de amplificación, para determinar una razón R de un producto de amplificación metilado y un producto de amplificación no metilado del fragmento de ácido nucleico predeterminado.
El término “fragmento de ácido nucleico predeterminado” tal como se usa en el presente documento es un fragmento de ácido nucleico tal que difiere entre niveles de metilación en un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico. Según una realización de la presente invención, el primer conjunto de cebadores de amplificación reconoce específicamente el fragmento de ácido nucleico predeterminado convertido, y el segundo conjunto de cebadores de amplificación reconoce específicamente el fragmento de ácido nucleico predeterminado no convertido.
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En una realización según la presente invención, dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado incluye una o más moléculas de ácido nucleico ubicadas en cromosomas diferentes.
En una realización según la presente invención, dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado incluye uno o más fragmentos de ácido nucleico ubicados en genes diferentes. Según una realización de la presente invención, el fragmento de ácido nucleico predeterminado puede seleccionarse de al menos una porción de RASSF1A, SERPINB5, C21orf63, OLIG2, CBR1, SIM2, DSCAM, TRPM2, C21orf29, COL18A1, AIRE, ERG, CD48, FAIM3, ARHGAP25, BMP3, VIM, NDRG4, TFPI2, SFRP2, SEPT9 y SELPLG. Por consiguiente, la concentración de ADN fetal en la mezcla de ADN materno y fetal, o la concentración del ADN de células cancerosas en la mezcla de ADN de células cancerosas y no cancerosas derivadas de un tejido tumoral puede determinarse eficazmente. Según una realización de la presente invención, para diversos genes, dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado incluye al menos uno seleccionado de las secuencias de ácido nucleico mostradas a continuación:
Gen
Secuencia de ácido nucleico
RASSF1A
chr3:50378097-50378226
AIRE
chr21:45703903-45704111
SIM2
chr21:38078780-38079213
ERG
chr21:39878777-39879107
CD48
chr1:160681560-160681732
FAIM3
chr1:207096473-207096654
ARHGAP25
chr2:69001823-69002052
SELPLG
chr12:109028663-109028901
BMP3
chr4:81951942-81952808
VIM
chr10:17270431-17272617
NDRG4
chr16:58497034-58498595
TFPI2
chr7:93519367-93520184
SFRP2
chr4:154709513-154710827
SEPT9
chr17:75368689-75370506
Los expertos en la técnica deben entender que las secuencias de ácido nucleico en la tabla anterior se describen mediante las posiciones de las secuencias en cada cromosoma del genoma. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico chr3:50378097-50378226 del primer gen RASSF1A se refiere a la secuencia de ácido nucleico en las posiciones 50378097 a 50378226 en el cromosoma 3 del genoma humano, es decir, la secuencia de ácido nucleico: accagctgccgtgtggggttgcacgcggtgccccgcgcgatgcgcagcgcgttggcacgctccagccgggtgcggcccttccc agcgcgcccagcgggtgccagctcccgcagctcaatgagctcaggct (SEQ ID NO: 1).
El término “PCR cuantitativa fluorescente multiplexada” tal como se usa en el presente documento puede denominarse QPCR multiplexada específica de metilación, que es un método experimental con el que puede amplificarse un fragmento de ADN metilado y no metilado en un marcador de metilación, y cuantificarse de manera fluorescente. Durante la QPCR, el principio subyacente a la cuantificación fluorescente en tiempo real es un método de sonda, en el que la sonda es una sonda de oligonucleótido que se etiqueta con un indicador fluorescente y un extintor fluorescente en los dos extremos respectivamente. Durante la amplificación por PCR, se añade una sonda fluorescente específica al mismo tiempo que se añade un par de cebadores. Cuando la sonda está intacta, la señal fluorescente emitida a partir del indicador la absorbe el extintor. Durante la amplificación por PCR, la sonda se escinde enzimáticamente mediante la actividad exonucleasa 5'-3' de la enzima Taq, de modo que el indicador fluorescente se disocia del extintor fluorescente, mediante lo cual un sistema de detección de fluorescencia puede recibir una señal fluorescente. Tras la PCR, se forma una molécula fluorescente para cada cadena de ADN amplificada, y por tanto la intensidad de la señal fluorescente es proporcional al número de moléculas de ADN que se unen a la sonda. Tal como se describió anteriormente, en la QPCR multiplexada según la presente invención, los dos conjuntos de cebadores se diseñan de modo que los fragmentos de ADN metilado y no metilado en el marcador de metilación se amplifican ambos, y los dos tipos de ADN se cuantifican relativamente usando la sonda de metilación que se une específicamente al fragmento metilado, y la sonda de no metilación que se une específicamente al fragmento no metilado. Por tanto, en una realización según la presente invención, se usan adicionalmente una sonda específica de metilación y una sonda específica de no metilación en la PCR cuantitativa fluorescente multiplexada. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente. En una realización según la presente invención, dicha sonda específica de metilación y dicha sonda específica de no metilación portan respectivamente un marcador seleccionado de al menos uno de FAM, JOE y TAMRA. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente. En una realización según la presente invención, dicha sonda específica de metilación tiene una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO: 6, y dicha sonda específica de no metilación tiene una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO: 9. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente. En una realización según la presente invención, dicha sonda específica de metilación está marcada con FAM y TAMRA. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente. En una realización según la presente invención, dicha sonda no específica de metilación está marcada con JOE y TAMRA. Por tanto, la eficacia de la PCR cuantitativa fluorescente puede mejorarse adicionalmente.
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En una realización según la presente invención, para el gen RASSF1A, el primer conjunto de cebadores de amplificación incluye preferiblemente moléculas de ácido nucleico tal como se muestra en sEq ID NO: 7 y 8. Para el gen RASSF1A, el segundo conjunto de cebadores de amplificación incluye preferiblemente moléculas de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 4 y 5. Por consiguiente, la concentración de ADN fetal en la mezcla de ADN materno y fetal puede determinarse eficazmente.
El análisis del contenido relativo de fragmentos diferentes usando PCR multiplexada cuantitativa puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido. Por ejemplo, puede usarse el método de 2-ññCt y el método de curva de patrones relativos. En la presente invención, se usa preferiblemente el método de 2-ññCt para calcular la razón del fragmento metilado con respecto al fragmento no metilado, que entonces se calibra mediante una curva de patrones.
Según una realización de la presente invención, las dos etapas anteriores pueden llevarse a cabo en paralelo o de antemano para ácidos nucleicos particulares, por ejemplo, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, para predeterminar una proporción de metilación Mi del fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico, y una proporción de metilación M2 del fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico.
S300: Análisis de la composición de moléculas de ácido nucleico
El número del fragmento metilado y fragmento no metilado se correlaciona con la razón de composición de moléculas de ácido nucleico de fuentes diferentes. Tras determinar la proporción de metilación Mi del fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico y la proporción de metilación M2 del fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico, y determinar la razón R del producto de amplificación metilado con respecto al producto de amplificación no metilado de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado mediante PCR cuantitativa fluorescente multiplexada, la composición de las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, el contenido del primer ácido nucleico o el segundo ácido nucleico, puede determinarse eficazmente a través de análisis de datos.
Según la presente invención, el contenido e del primer ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales se determina en esta etapa según la fórmula g=(M2+RM2-R)/[R(M2-Mi)-(Mi-M2)]. Por tanto, la composición y el contenido de moléculas de ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales pueden determinarse eficazmente.
En una realización según la presente invención, puede usarse un fragmento de ácido nucleico predeterminado que difiere significativamente en el nivel de metilación en el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, Mi es al menos 10 veces, preferiblemente al menos 50 veces, más preferiblemente al menos 90 veces y lo más preferiblemente al menos 100 veces M2. Por tanto, la eficacia con la que la composición y el contenido de las moléculas de ácido nucleico se determinan puede mejorarse adicionalmente puesto que el valor de M2 es pequeño, y puede ignorarse sin influir en el resultado final. Por consiguiente, en una realización según la presente invención, el contenido e del primer ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales puede determinarse según la fórmula e=R/[MiR+Mi] en esta etapa. Como tal, el método para determinar la composición y el contenido de moléculas de ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales puede simplificarse adicionalmente, y la eficacia con la que la composición y el contenido de las moléculas de ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales se determinan puede mejorarse adicionalmente.
A continuación en el presente documento, las realizaciones de la presente invención se describen en detalle a modo de ejemplos. Sin embargo, los expertos en la técnica deben entender que los siguientes ejemplos son con fines ilustrativos. Cuando no se proporcionan condiciones específicas en los ejemplos, se siguen condiciones convencionales o condiciones recomendadas por el fabricante. Los reactivos o instrumentos para los que no se indican fabricantes son todos productos comunes comercialmente disponibles en el mercado.
Ejemplo 1: Secuenciación de marcador de metilación fetal
En primer lugar, debe indicarse que el marcador de metilación fetal es una o más regiones genómicas metiladas de manera diferencial, cuyos niveles de metilación difieren significativamente en el ADN fetal y el ADN materno, ligeramente entre las poblaciones.
En este ejemplo, se seleccionaron 9 pares de muestras de ADN placentario-ADN de leucocitos materno y se usaron para determinar el nivel de metilación de un marcador de metilación fetal candidato, es decir una región (chr3:50378097-50378226, SEQ ID NO: 1) en el gen RASSF1A, y se evaluaron las diferencias individuales. El método fue específicamente tal como sigue.
Se adoptó la PCR de secuenciación con bisulfito (BSP) para determinar el nivel de metilación del marcador candidato. Específicamente, las secuencias de cebador de BSP fueron el cebador directo GTTGTTTTTTGGTTGTTTTTTT (SEQ ID NO: 2); y el cebador inverso CCTACACCCAAATTTCCATTAC (SEQ ID
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NO: 3). Entonces se empleó secuenciación y clonación de TA para determinar el nivel de mutilación del producto de la BSP. Específicamente, se recogieron 30 clones de cada muestra para secuenciación por Sanger 3730. Entonces, se calculó el nivel de metilación del marcador candidato en el ADN placentario y el ADN de leucocitos maternos, según m=número de citosina metilada (mC)/número total de citosina (C). Los resultados experimentales se muestran en la tabla 1 a continuación, en donde ith denota el nivel de metilación del marcador candidato en el ADN placentario; y m2 denota el nivel de metilación del marcador candidato en el ADN de leucocitos materno.
Tabla 1. Nivel de metilación del marcador candidato
Muestra
m1 m2
1
82,60 % 0,90 %
2
87,50 % 0,20 %
3
92,80 % 0,40 %
4
92,90 % 0,20 %
5
91,60 % 0,00 %
6
95,20 % 0,40 %
7
94,40 % 0,80 %
8
93,50 % 0,20 %
9
84,80 % 0,20 %
Promedio
90,59 % 0,37 %
Ejemplo 2: Cuantificación de la concentración de ADN fetal
Se extrajeron 6 muestras de plasma materno usando un QlAamp DNA Mini Kit, y se determinó la concentración de ADN fetal basándose en los valores de mi y m2 determinados en el ejemplo 1. Las etapas específicas fueron tal como siguen.
(1) Tratamiento con bisulfito
Se trataron las muestras de ADN plasmático de los sujetos con un bisulfito usando el kit EZ DNA Methylation - Direct™.
(2) Diseño de cebadores específicos de metilación
Se diseñaron dos pares de cebadores para el marcador mencionado en el ejemplo 1 y se usaron en QPCR multiplexada, que incluía un par de cebadores específicos de metilación y un par de cebadores específicos de no metilación, para amplificar específicamente el fragmento de ADN metilado y no metilado respectivamente. Se muestran las secuencias de cebador y sonda en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2. Secuencia de cebador y sonda
Tipo de cebador o sonda
Secuencia
Cebador directo específico de metilación
GATTAGTTGTCGTGTGGGGTTGTAC (SEQ ID NO: 4)
Cebador inverso específico de metilación
ATCGAAAAAACCTAAACTCATTAAACTACG (SEQ ID NO: 5)
Sitio específico de metilación
TGGTACGTTTTAGTCGGGTGCGGTT (SEQ ID NO: 6)
Cebador directo específico de no metilación
GGATTAGTTGTTGTGTGGGGTTGTAT (SEQ ID NO: 7)
Cebador inverso específico de no metilación
AAAAAAACCTAAACTCATTAAACTACAAA (SEQ ID NO: 8)
Sitio específico de no metilación
TGGTGTTTTGTGTGATGTGTAGTGTGTTGG (SEQ ID NO: 9)
(3) QPCR multiplexada específica de metilación
Se usó Taq ADN polimerasa JumpStart™ de Sigma para la QPCR multiplexada, en la que la cuantificación por QPCR se efectuó mediante un método de sonda, la sonda usada en la PCR específica de metilación se marcó con FAM y TAMRA, y la sonda usada en la PCR específica de no metilación se marcó con JOE y TAMRA. Específicamente, el sistema de QPCR fue tal como sigue.
Reactivo
Volumen (|il)
Tampón de PCR 10X (que contiene MgCh 15 mM)
2,5
*MgSO4 (50 mM)
1
dNTP (2,5 mM)
3
Sonda específica de metilación (10 |iM)
0,625
Sonda específica de no metilación (10 |iM)
0,625
Tinte de referencia ROX
0,5
Mezcla de cebadores específicos de metilación (ambos fueron 10 |iM)
2
5
10
15
20
25
30
Mezcla de cebadores específicos de no metilación (ambos fueron 10 |iM)
2
Polimerasa JumpStart (2,5 U/|il)
1
Molde
11,75
En total
25
Nota: * indica que el componente puede añadirse o no El procedimiento de PCR se estableció tal como sigue.
Temperatura
Tiempo Ciclo Comentario
94°C
1 min 1 Inicio de la desnaturalización
94°C
30 s 45 Desnaturalización
60°C
30 s Apareamiento
72°C
30 s Extensión
72°C
10 min 1 Derivación final
4°C
Siempre 1 Retención
(4) Cuantificación de la concentración de ADN fetal
Se calculó la razón del producto de amplificación metilado con respecto al producto de amplificación no metilado usando el método de 2-ññCt, y luego se calibró mediante una curva de patrones. Se usó la razón calibrada (representada mediante R en la fórmula) en el cálculo del contenido de ADN fetal en la muestra de plasma materno, donde N se define como el número total de moléculas de ADN en la muestra de plasma parental; s es el contenido de ADN fetal; mi es el nivel de metilación del ADN fetal, y mi=90,59 %; y m2 es el nivel de metilación del ADN de leucocitos maternos, y iri2=0,37%. Entonces
Número de ADN metilado _ N£mi + N(l-s)m>
R = -
Número de ADN no metilado N£(l-m,)+N(l-£)(l-mi)
entonces
imagen1
(fórmula 1). Particularmente, dado que m2“0, s puede calcularse simplemente
mi + Rmi
mediante 1 + AV1111 (fórmula 2). Los resultados del cálculo se muestran en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3. Concentración de ADN fetal en la muestra de plasma materno
N.° de muestra
Concentración fetal estimada (usando la fórmula 1) Concentración fetal estimada (usando la fórmula 2)
1
0,1554 0,1557
2
0,1917 0,1918
3
0,1325 0,1328
4
0,1230 0,1231
5
0,1299 0,1300
6
0,0663 0,0667
Por tanto, la concentración de ADN fetal en la muestra de plasma materno puede cuantificarse eficazmente usando el método según la presente invención. Además, los resultados de cuantificación obtenidos de la concentración de ADN fetal en la muestra de plasma parental pueden usarse además en la detección de la anomalía en el número de cromosomas. Cuando se usa la concentración de ADN fetal calculada con la diferencia de metilación entre el gen RASSF1A en el cromosoma 3 materno y fetal para detectar la anomalía en el número de cromosoma 3, se calculó el 8chr3 de las muestras de prueba y de control normales, se determina que la muestra de prueba contiene una trisomía del cromosoma 3 fetal si el 8chr3 de la muestra de prueba: el echr3 de la muestra de control = aproximadamente 1,5; y de manera similar, se determina que la muestra de prueba contiene una tetrasomía del cromosoma 3 fetal si el echr3 de la muestra de prueba: el echr3 de la muestra de control = aproximadamente 2.
Asimismo, con la detección de la anomalía en el número del cromosoma 21 como ejemplo, se selecciona un marcador (por ejemplo AIRE, SIM2, ERG, etc.) en el cromosoma 21 y se cuantifica la concentración de ADN fetal en las muestras de prueba y de control normales mediante el método anterior, para calcular el echr21 de las mismas respectivamente. Se determina que la muestra de prueba contiene una trisomía del cromosoma 21 fetal si el echr21 de la muestra de prueba: el echr21 de la muestra de control = aproximadamente 1,5. De manera similar, se determina que la muestra de prueba contiene una tetrasomía del cromosoma 21 fetal si el Schr21 de la muestra de prueba: el Schr21 de la muestra de control = aproximadamente 2. Debe indicarse que el término “aproximadamente” tal como se usa en el
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presente documento está dentro de ±10 %.
Ejemplo 3:
Se determinó la concentración de ADN de células cancerosas en una muestra de ADN plasmático de un paciente con cáncer colorrectal mediante el método según la presente invención siguiendo las etapas a continuación. Las etapas específicas fueron tal como sigue.
(1) Secuenciación del fragmento de ácido nucleico predeterminado: se usaron un ADN de células de cáncer colorrectal y una muestra de ADN de células normales. Para un fragmento de ácido nucleico predeterminado en los genes de metilación SEPT9, NDRG4 y TFPI2 específicos para cáncer colorrectal, se obtuvo un producto de BSP mediante PCR de secuenciación con bisulfito (BSP), y después se determinó el nivel de metilación del producto de BSP mediante clonación y secuenciación de TA. Específicamente, se recogieron 30 clones de cada muestra para secuenciación por Sanger 3730. Entonces, se calculó el nivel de metilación del fragmento de ácido nucleico predeterminado en el ADN de células de cáncer colorrectal y ADN de células normales, según m=número de citosina metilada (mC)/número total de citosina (C) o m=número de clones metilados/número total de clones. m1 es el nivel de metilación en el ADN de células cancerosas y m2 es el nivel de metilación en el ADN de células normales.
(2) Extracción de muestras: se extrajo una muestra de ADN plasmático de un paciente con cáncer colorrectal usando el QIAamp DNA Mini Kit.
(3) Tratamiento con bisulfito: se trató la muestra de ADN plasmático del sujeto con un bisulfito usando el kit EZ DNA Methylation-Direct™.
(4) Diseño de cebadores específicos de metilación: para cada uno de los 3 genes de metilación SEPT9, NDRG4 y TFPI2 específicos para cáncer colorrectal, se diseñaron dos pares de cebadores y se usaron en QPCR multiplexada, que incluía un par de cebadores específicos de metilación y un par de cebadores específicos de no metilación, para amplificar específicamente el fragmento de ADN metilado y no metilado respectivamente. Las secuencias de cebador y sonda correspondientes a los 3 genes se muestran en la tabla 4 a continuación.
Tabla 4. Secuencias de cebador y sonda
Tipo de cebador o sonda
Nombre Secuencia
Cebador directo específico de metilación
SEPT9-M-F TATTAGTTATTATGTCGGATTTCGC (SEQ ID NO: 10)
Cebador inverso específico de metilación
SEPT9-M-R GCCTAAATTAAAAATCCCGTC (SEQ ID NO: 11)
Sitio específico de metilación
M-SEPT9-Probe TGGAGAGGATTTTGCGGGTGGGTTT (SEQ ID NO: 12)
Cebador directo específico de no metilación
SEPT9-U-F ATTAGTTATTATGTTGGATTTTGTGG (SEQ ID NO: 13)
Cebador inverso específico de no metilación
SEPT9-U-R AAAACACCTAAATTAAAAATCCCATC (SEQ ID NO: 14)
Sitio específico de no metilación
U-SEPT9-Probe TGTGGTTGTGGATGTGTTGGAGAGG (SEQ ID NO: 15)
Cebador directo específico de metilación
NDRG4-M-F TTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCG (SEQ ID NO: 16)
Cebador inverso específico de metilación
NDRG4-M-R CGAACTAAAAACGATACGCCG (SEQ ID NO: 17)
Sitio específico de metilación
M-NDRG4-Probe TCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACG CGGGTA (SEQ ID NO: 18)
Cebador directo específico de no metilación
NDRG4-U-F GATTAGTTTTAGGTTTGGTATTGTTTTGT (SEQ ID NO: 19)
Cebador inverso específico de no metilación
NDRG4-U-R AAAACCAAACTAAAAACAATACACCA (SEQ ID NO: 20)
Sitio específico de no metilación
U-NDRG4-Probe TTGAGTGTTTATATTTGTTAAATTTATGT GGGTATGTTTTTG (SEQ ID NO: 21)
Cebador directo específico de metilación
TFPI2-M-F TCGTTGGGTAAGGCGTTC (SEQ ID NO: 22)
Cebador inverso específico de metilación
TFPI2-M-R AAACGAACACCCGAACCG (SEQ ID NO: 23)
Sitio de metilación específica
M-TFPI2-Probe AAAGCGTTTGGCGGGAGGAGGT (SEQ ID NO: 24)
Cebador directo específico de no metilación
TFPI2-U-F TGGTTTGTTGGGTAAGGTGTTT (SEQ ID NO: 25)
Cebador inverso específico de no metilación
TFPI2-U-R ATAAACAAACACCCAAACCACC (SEQ ID NO: 26)

Claims (14)

10
15
20
25
30
35 2.
3. 40
4.
5. 45
6.
50 7.
8.
55
9.
REIVINDICACIONES
Método para determinar la composición de ácidos nucleicos en una mezcla de ácidos nucleicos totales que comprende un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, en el que dicho primer ácido nucleico y dicho segundo ácido nucleico se derivan de fuentes diferentes, comprendiendo dicho método:
1) tratar dicha mezcla de ácidos nucleicos totales con un bisulfito, para convertir citosina no metilada en dicha mezcla de ácidos nucleicos totales en uracilo, y obtener una mezcla de ácidos nucleicos totales convertidos;
2) someter dicha mezcla de ácidos nucleicos totales convertidos a PCR cuantitativa fluorescente multiplexada usando un primer conjunto de cebadores de amplificación y un segundo conjunto de cebadores de amplificación, para capturar y amplificar un fragmento de ácido nucleico predeterminado, y obtener una razón R de un producto de amplificación metilado con respecto a un producto de amplificación no metilado de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, en el que dicho primer ácido nucleico y dicho segundo ácido nucleico contienen ambos dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, y el fragmento de ácido nucleico predeterminado en dicho primer ácido nucleico difiere del fragmento de ácido nucleico predeterminado en dicho segundo ácido nucleico en cuanto al nivel de metilación; dicho primer conjunto de cebadores de amplificación reconoce específicamente el fragmento de ácido nucleico predeterminado convertido, y dicho segundo conjunto de cebadores de amplificación reconoce específicamente el fragmento de ácido nucleico predeterminado no convertido; y se predeterminan una proporción de metilación M1 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico y una proporción de metilación M2 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico; y
3) basándose en la razón R del producto de amplificación metilado con respecto al producto de amplificación no metilado de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado, la proporción de metilación M1 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el primer ácido nucleico y la proporción de metilación M2 de dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado en el segundo ácido nucleico, determinar la composición de ácidos nucleicos en la mezcla de ácidos nucleicos totales;
en el que en la etapa 3), el contenido e del primer ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales se determina según la fórmula g=(M2+RM2-R)/[R(M2-M1)-(M1-M2)].
Método según la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de ácidos nucleicos totales es un ADN plasmático parental, dicho primer ácido nucleico es un ADN fetal y dicho segundo ácido nucleico es un ADN materno.
Método según la reivindicación 1, en el que dicho primer ácido nucleico es un ADN de células cancerosas y dicho segundo ácido nucleico es un ADN de células no cancerosas.
Método según la reivindicación 1, en el que M1 es al menos 10 veces, preferiblemente al menos 50 veces, más preferiblemente al menos 90 veces y lo más preferiblemente al menos 100 veces M2.
Método según la reivindicación 4, en el que en la etapa 3), el contenido e del primer ácido nucleico en la mezcla de ácidos nucleicos totales se determina según la fórmula b-R^M-iR+M-i].
Método según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado comprende uno o más fragmentos de ácido nucleico ubicados en cromosomas diferentes.
Método según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado comprende uno o más fragmentos de ácido nucleico ubicados en genes diferentes.
Método según la reivindicación 7, en el que dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado se selecciona del grupo que consiste en al menos una porción de los genes:
RASSF1A, SERPINB5, C21orf63, OLIG2, CBR1, SIM2, DSCAM, TRPM2, C21orf29, COL18A1, AIRE, ERG, CD48, FAIM3, ARHGAP25, BMP3, VIM, NDRG4, TFPI2, SFRP2, SEPT9 y SELPLG.
Método según la reivindicación 8, en el que para diversos genes, dicho fragmento de ácido nucleico predeterminado comprende al menos uno seleccionado de las secuencias de ácido nucleico mostradas a continuación:
Gen
Secuencia de ácido nucleico
RASSF1A
chr3:50378097-50378226
AIRE
chr21:45703903-45704111
5
10
15
20
25
SIM2
chr21:38078780-38079213
ERG
chr21:39878777-39879107
CD48
chr1:160681560-160681732
FAIM3
chr1:207096473-207096654
ARHGAP25
chr2:69001823-69002052
SELPLG
chr12:109028663-109028901
BMP3
chr4:81951942-81952808
VIM
chr10:17270431-17272617
NDRG4
chr16:58497034-58498595
TFPI2
chr7:93519367-93520184
SFRP2
chr4:154709513-154710827
SEPT9
chr17:75368689-75370506
10. Método según la reivindicación 8, en el que para el gen RASSF1A, dicho primer conjunto de cebadores de amplificación comprende:
moléculas de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 7 y 8.
11. Método según la reivindicación 8, en el que para el gen RASSF1A, dicho segundo conjunto de cebadores de amplificación comprende:
moléculas de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 4 y 5.
12. Método según la reivindicación 1, en el que se usan adicionalmente una sonda específica de metilación y una sonda específica de no metilación en dicha PCR cuantitativa fluorescente multiplexada.
13. Método según la reivindicación 12, en el que dicha sonda específica de metilación y dicha sonda específica de no metilación portan respectivamente un marcador seleccionado de al menos uno de FAM, JOE y TAMRA.
14. Método según la reivindicación 12, en el que dicha sonda específica de metilación tiene una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO: 6, y dicha sonda específica de no metilación tiene una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO: 9.
15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha sonda específica de metilación está marcada con FAM y TAMRA.
16. Método según la reivindicación 14, en el que dicha sonda específica de metilación está marcada con JOE y TAMRA.
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