CN117070633A - DNA甲基化标志物TAGMe-4及其在肿瘤检测中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种表观遗传修饰相关的肿瘤标记物TAGMe‑4，利用肿瘤中标志物特异性位点异常高甲基化现象来检测肿瘤。所述TAGMe‑4基因序列区域在癌组织和癌旁组织之间存在显著的甲基化差异，只要检测到TAGMe‑4基因序列区域存在异常高甲基化状态，即可判定该受检者属于肿瘤高危人群。并且，TAGMe‑4呈现的这种在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在的显著差异广谱地存在于不同种类的肿瘤中，覆盖实体瘤以及非实体瘤，从而可以作为一种泛癌标记物，例如用于针对人群的规模化筛查。
Description
技术领域
本发明属于药物学以及基因表观修饰领域，更具体地，本发明涉及一种DNA甲基化标志物TAGMe-4及其在肿瘤检测中的用途。
背景技术
肿瘤的发生是一个多因素、多阶段、复杂渐进的过程，正常细胞转化成恶性肿瘤细胞需经历多步骤和多阶段过程，其中包括启动阶段、促进阶段和演进阶段。这使癌症的研究更为复杂。
癌细胞的生物学研究包括一系列内容，如癌细胞膜、糖蛋白糖链结构、细胞跨膜信号传导、细胞凋亡及调控、细胞的分化诱导和恶性转化、恶性生长的信息传递、治疗的分子目标、癌基因与抑癌基因的作用以及癌转移的机制等。
近年来肿瘤的治疗已取得了很大的进展。除了传统的肿瘤治疗手段如肿瘤外科治疗、放射治疗、化学治疗得到改进之外，随着肿瘤分子生物学、细胞生物学等基础学科的发展，新的治疗方法及手段不断地涌现，某些探索已逐渐从实验室研究走向临床研究。然而要真正地评价其临床疗效还有待于更深入的研究及临床观察。
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，其在维持正常细胞功能、胚胎发育、疾病发生以及人类肿瘤中发挥着至关重要的作用。DNA甲基化的水平，尤其是基因启动子区甲基化的水平直接影响着基因的转录活性，控制着基因的表达，在生命过程中DNA甲基化扮演着重要的角色。因此DNA甲基化的研究在表观遗传学，甚至在整个生命科学领域都是研究的重中之重。
DNA甲基化的检测方法很多，其一为基于甲基化敏感限制性内切酶(methylation-sensitive restriction endonucleases,MSREs)的方法；甲基化敏感的限制性内切酶是一类对甲基化修饰敏感的内切酶。此类酶在其切割位点中含有一个甲基化碱基就可以阻断该内切酶对DNA的切割，再通过Southern Blot或者PCR来检测。这种方法中最常用的是HpaII和MspI这一对内切酶，HpaII和MspI识别序列相同但HpaII对甲基化敏感而MspI对甲基化不敏感，此法的优点是操作简单，缺点是因为受到内切酶酶切位点的限制，对于可研究的甲基化区域受到很大的限制。另一为基于DNA甲基化抗体的方法；基于抗体的DNA甲基化研究方法是应用甲基胞嘧啶抗体或是甲基化结合蛋白的抗体来研究DNA甲基化。其原理和操作都类似于ChIP，即将抗体亲和的DNA片段进行芯片杂交或者测序。优点是可以在全基因组范围内研究DNA甲基化的变化情况，但此方法缺乏精确性，无法知道单个碱基的甲基化情况，而且该方法容易受到基因组中不同区域CG含量的影响，从而对于基因组中低CG含量的区域缺乏敏感性。又一为基于亚硫酸氢钠的方法；DNA甲基化的检测方法中应用最广的是基于亚硫酸氢钠的方法。其优点在于可以精确检测单碱基分辨率甲基化变化情况。这种方法的原理为DNA经过亚硫酸氢钠处理后未被甲基化修饰的C(胞嘧啶)可转变为U(尿嘧啶)，然而有甲基化修饰的C则不会发生改变，经过PCR扩增后测序，再与原序列对比就可以得到基因组中某段区域的甲基化修饰情况。
尽管如此，在具有方法学的基础上，本领域仍然亟待寻找可用于诊断、预后和预测癌症发生发展的分子靶标，以提供更多更优的检测效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA甲基化标志物TAGMe-4及其在肿瘤检测中的用途。
在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸或由其转变而来的多核苷酸在制备检测肿瘤的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述的多核苷酸包括：(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段，或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中，由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
作为一种实施方式，所述修饰包括5-甲基化修饰(5mC)、5-羟甲基化修饰(5hmC)、5-醛甲基化修饰(5-fC)或5-羧甲基化修饰(5-caC)。
作为一种实施方式，所述SEQ ID NO:1还包括其序列变体，或同源序列。
作为一种实施方式，所述序列变体或同源序列为与所述SEQ ID NO:1所示序列相比，具有80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、95％以上、96％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、99.8％以上序列同一性的序列。相应地，也包括由所述序列变体或同源序列转变(非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变)而来的多核苷酸。
作为一种实施方式，所述的鉴定包括诊断、检测、筛查或预后评估。
作为一种实施方式，所述由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸。
作为一种实施方式，所述至少1个修饰的CpG位点为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～88号的任一CpG位点或其组合(如2～88个，更具体如3，5，10，11，12，15，20，25，30，35，40，45个)；较佳地为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第3～19号的任一CpG位点或其组合、第20-88号任一CpG位点或其组合。
作为一种实施方式，所述多核苷酸片段为SEQ ID NO:1中第40～157位或第10～185位所示核苷酸序列的多核苷酸。
作为一种实施方式，所述的肿瘤包括(但不限于)：呼吸系统肿瘤，消化系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，血液系统肿瘤，神经系统肿瘤，头颈部肿瘤，皮肤系统肿瘤，内分泌系统肿瘤或骨骼系统肿瘤。
作为一种实施方式，所述肿瘤包括：肺癌，肝癌，前列腺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，尿路上皮癌，胆道肿瘤，胃癌，乳腺癌，食管癌，脑胶质瘤，结直肠癌，白血病，胰腺癌，甲状腺癌，黑色素瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，骨肉瘤，淋巴瘤，肾细胞癌或卵巢癌。
作为一种实施方式，所述的检测肿瘤针对肿瘤(包括早期、中期或晚期的肿瘤)其癌前病变。
作为一种实施方式，所述检测肿瘤针对的样本包括(但不限于)：组织样本、体液样本、血液样本。
作为一种实施方式，所述样本包括(但不限于)：石蜡包埋样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本等。
在本发明的另一方面，提供一种制备肿瘤的检测试剂的方法，包括：(a)提供分离的多核苷酸或由其转变而来的多核苷酸，包括(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变；较佳地，所述至少1个修饰的CpG位点为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～88号的任一CpG位点或其组合；较佳地为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第3～19号的任一CpG位点或其组合、第20～88号任一CpG位点或其组合；较佳地，所述多核苷酸片段为SEQ IDNO:1中第40～157位或第10～185位所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)以(a)的多核苷酸作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂。
作为一种实施方式，对于所述靶序列，可以制备一组或多组试剂。
作为一种实施方式，所述的检测试剂包括但不限于：引物，探针，芯片或试纸。
作为一种实施方式，所述的检测试剂被整合于芯片上。
在本发明的另一方面，提供一种特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况的试剂或试剂组合，其中所述的靶序列是：(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变；较佳地，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列，较佳地，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组；较佳地，所述的试剂或试剂组合包括：扩增SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中第40～157位或第10～185位的引物。
作为一种实施方式，所述的试剂或试剂组合为：含有SEQ ID NO:3中第29-58位序列和SEQ ID NO:4中第28-55位序列的引物。
作为一种实施方式，所述的试剂或试剂组合为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4序列的引物。
作为一种实施方式，所述的试剂或试剂组合为：SEQ ID NO:7-16所示任一序列连接SEQ ID NO:3中第29-58位序列形成的引物，SEQ ID NO:17-26所示任一序列连接SEQ IDNO:4中第28-55位序列形成的引物。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂或试剂组合的用途，用于制备检测肿瘤的试剂盒。
在本发明的另一方面，提供一种用于进行检测肿瘤的试剂盒，其中包括所述的试剂或试剂组合。
作为一种实施方式，所述试剂盒中还可包括但不限于：DNA纯化试剂，DNA提取试剂，Bisulfite，PCR扩增试剂。
作为一种实施方式，所述的试剂盒中还包括：用于标明检测操作步骤和结果判定标准的说明书。
在本发明的另一方面，提供一种分析待测样本的甲基化水平的方法，包括：(i)从待测样本中获取的多核苷酸；和(ii)分析所提取的多核苷酸中靶序列或其片段的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是：(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变；SEQ ID NO:1所示核苷酸序列经转变而来的多核苷酸，对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
作为一种实施方式，检测所提取的多核苷酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化特异PCR、甲基化敏感限制性内切酶酶切法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray，或它们的组合；或
作为一种实施方式，所述分析所提取的多核苷酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：(i)对所提取的多核苷酸进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用Bisulfite处理步骤(i)所述的核酸；和(ii)分析经(i)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。
作为一种实施方式，利用Bisulfite处理步骤(i)所述的多核苷酸；和(ii)分析经(i)处理的多核苷酸中所述的靶序列的修饰情况。
作为一种实施方式，甲基化水平异常是指该多核苷酸CpG中的C发生高度甲基化。
作为一种实施方式，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。
作为一种实施方式，所述分析甲基化水平的方法不是诊断性的方法，也即其不以直接获得疾病的诊断结果为目的。
作为一种实施方式，所述检测样品的甲基化水平的方法为体外方法。
作为一种实施方式，所述甲基化敏感限制性内切酶为对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶；包括但不限于：HhaI，BmgBI，HaeII，RruI，TaiI、Bsu15I、Hin6I、HpyCH4IV、NarI等其中一或多种的组合。
在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸或其转变而来的多核苷酸，所述的多核苷酸包括：(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；较佳地，所述至少1个修饰的CpG位点为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～88号的任一CpG位点或其组合；较佳地为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第3～19号的任一CpG位点或其组合、第20～88号任一CpG位点或其组合；较佳地，所述多核苷酸片段为SEQ ID NO:1中第40～157位或第10～185位所示核苷酸序列的多核苷酸；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中，由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、在肺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图2、在肝癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图3、在前列腺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图4、在宫颈癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图5、在子宫内膜癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图6、在尿路上皮癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图7、在胆道肿瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图8、在胃癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图9、在乳腺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图10、在食管癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图11、在脑胶质瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图12、在结直肠癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图13、在白血病临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以非白血病骨髓涂片样本作为对照。
图14、在胰腺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图15、在甲状腺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图16、在黑色素瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照，以正常皮肤组织样本作为对照。
图17、在鼻咽癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图18、在口腔癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图19、在喉癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图20、在骨肉瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图21、在淋巴瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以正常淋巴样本作为对照。
图22、在肾细胞癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图23、在卵巢癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中的甲基化水平(左图)以及灵敏度和特异性(右图)，以癌旁组织为对照。
图24、SEQ ID NO:1中20-88号甲基化位点(CpG)在癌细胞与正常对照细胞中甲基化水平的BSP验证。
具体实施方式
本发明提供了一种表观遗传修饰相关的肿瘤标记物TAGMe-4，利用肿瘤中标志物特异性位点异常高甲基化现象来检测肿瘤。所述TAGMe-4基因序列区域在癌组织和癌旁组织之间存在显著的甲基化差异，只要检测到TAGMe-4基因序列区域存在异常高甲基化状态，即可判定该受检者属于肿瘤高危人群。并且，TAGMe-4呈现的这种在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在的显著差异广谱地存在于不同种类的肿瘤中，覆盖实体瘤以及非实体瘤，从而可以作为一种泛癌标记物，例如用于针对人群的筛查。
本发明中，也包括具有与SEQ ID NO:1(或括其反向互补序列所示核苷酸序列具有保守性的或序列同一性较高的、SEQ ID NO:1(或其反向互补序列)序列的“保守性变异序列”。所述“序列同一性较高”例如高于90％、高于92％、高于95％、高于98％高于99％等。应理解，不同的生物个体之间，可能在个别序列位点上存在不同(例如可能存在一些无意义的SNP)，但这不影响基于本发明的总体方案的检测。
根据上述，本发明提供了来源于人基因组特定区域的核酸，其具有SEQ ID NO:1所示基因序列或其部分区域，同时还包括其反义链。在肿瘤细胞内，该核酸序列中多处5’-CpG-3’的碱基C位置上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)或其它类似的表观修饰。
针对本发明提供的一个或多个CpG进行检测均是可以的，因此本发明也包含所述核苷酸序列的核酸的片段，且其中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个可以包括SEQ ID NO:1或其反向互补序列中1～88个，更具体如2，3，5，10，15，17，20，25，30，35，40，50，60，70，80，85个。显而易见的是，在本发明提供了基于一条DNA链的CpG编号后，与之互补的DNA链中各个CpG位点相应于正义链的编号是根据本发明所提供的内容易于获得的。
根据本发明所提供的人基因组中所述特定片段的信息后，本领域技术人员可以方便地获得所述CpG位点，加以应用。本发明的实施例中提供了一系列的含有CpG位点的序列片段，这些片段可以作为较佳实施方式的一些例子，但是应理解，根据本发明提供的信息，人们可以作出变化，例如选择更长的、但含有本发明的序列的序列，或选择与本发明相对序列在区域上有交叉的序列。
本发明也包括SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或序列片段或其互补序列的基因Panel或基因群组。针对所述的基因Panel或基因群组，也可以通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。
应理解，多种多样的可用于分析甲基化状态的技术均可被应用于本发明中，本发明对此类检测技术没有特别的限制。本发明提供的核酸可以作为基因组中分析甲基化状态的关键区域，可通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态，进而分析肿瘤的发生或发展情况。
本发明的SEQ ID NO:1所述的核酸或其片段或与其互补的序列，可在经过重亚硫酸盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。因此，本发明还提供了上述核酸(包括其互补链(反义链))经过重亚硫酸盐处理后获得的核酸，包括：SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的核酸或核酸片段。这些核酸可作为设计检测试剂或检测试剂盒的更为直接的靶点。
本发明的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸和/或其互补核酸和/或其一或多条片段可被整合于一个或若干个整体中，如一个或若干个核酸集中，供本领域技术人员运用，如从该核酸集中选择一条或多条核酸或核酸的片段，设计靶向分析试剂。所设计的靶向分析试剂，也可被整合于一个或若干个整体中，如一个或若干个试剂盒中。
本发明的由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸和/或其互补核酸和/或其一或多条片段转变(例如经重亚硫酸盐转化)而来的核酸，也可被整合于一个或若干个整体中，如一个或若干个核酸集中，供本领域技术人员运用，如从该核酸集中选择一条或多条核酸或核酸的片段，设计靶向分析试剂。所设计的靶向分析试剂，也可被整合于一个或若干个整体中，如一个或若干个试剂盒中，或一片或若干片芯片中。
在本发明的提供了靶基因及其表观特点的基础上，本领域公知的这些技术以及即将发展的一些技术，均可被应用于本发明中，来实施甲基化水平的检测。测定核酸的甲基化水平可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP)或实时定量甲基化特异性PCR，Methylight)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。例如，检测甲基化水平时可使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法，其基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。此外，其他可用的技术还有：qPCR(Me-qPCR)法、二代测序法、焦磷酸测序法、Sanger测序法、重亚硫酸盐转化测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术或HPLC法以及组合基因群组检测法等该领域常规方法。尽管本发明的实施例中提供了一些优选的方式，但本发明的总体方案并不限于此。
作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中核酸的甲基化水平的方法。所述的方法基于的原理是：重亚硫酸盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在后续的PCR扩增过程中转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过重亚硫酸盐处理核酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的核酸多态性(SNP)。基于上述原理来鉴定检测样品中核酸的甲基化水平，可以有效区分出甲基化与非甲基化的胞嘧啶。
本发明所述的方法包括：包括：首先提供样品、提取基因组DNA；其次，利用重亚硫酸盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；再次，分析经步骤(b)处理的基因组DNA中是否存在甲基化水平异常。
本发明的方法可用于：对受试者样品进行检测，评估受试者是否患有肿瘤；或用于区分肿瘤高危人群。所述的方法可以是不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形，例如不以判断疾病最终结果为目的的情形、人群地域性分析研究、科学研究、人口普查等。
在本发明的优选实施例中，通过PCR扩增及焦磷酸测序法检测DNA甲基化，实际应用中并不限于该方法，本领域已知的或正在改进的其它DNA甲基化检测方法亦可。在进行PCR扩增中，所应用的引物并不限于是实施例中所提供的，还可以获得与本发明实施例所提供的引物在序列上存在不同，但仍然针对于本发明所指示的核酸或相应CpG位点的引物。
作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中核酸的甲基化情况的方法，所述方法为甲基化敏感限制性内切酶酶切法(methylation sensitive restrictionendonuclease，MSRE)。当在其切割位点中含有一个甲基化碱基时，所述的甲基化敏感限制性内切酶不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。这一方法的优点包括：无须知道靶DNA一级结构的详细信息，并可提供CpG岛甲基化状态的直接评价，包括取得一些对被检基因甲基化的定量分析信息。
围绕本发明所提供的标记物核酸，其它本领域技术人员已知的确定基因组的序列、其变异及甲基化状态的检测方法和试剂均可包括在本发明中。
本发明提供了一种制备肿瘤检测试剂的方法，包括：提供所述的核酸，以所述核酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的检测试剂可以包括但不限于：芯片，引物，探针，等等；在获得了所述的标记物后，检测试剂的选择是本领域技术人员可以做到的。
在得知了核酸的序列后，设计引物是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包含CpG序列在内，与其中CpG互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中TpG互补为针对原为去甲基化的基因区)。在本发明优选的实施例中，所述的试剂是引物，所述的引物优选地为被列于实施例中的那些。除了引物，其它的诊断或检测试剂也是可以制备的，包括但不限于探针、芯片等。
所述的试剂也可以是试剂组合，例如引物组合。例如，所述的组合包括多于一组的引物，从而可分别扩增上述的多条核酸。
本发明还提供了体外检测样品中核酸的甲基化水平的试剂盒，该试剂盒包括：容器，以及位于容器中的上述引物对。
所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增等所需的各种试剂以及其它试剂，例如样本处理试剂。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。
本发明提供了多肿瘤(Pan-cancer)的标志物，可以适用于针对宫颈脱落细胞等的检测，待测样本的获得是容易的，且是无创的。这与临床上需要手术获取组织样本的情形相比，受试者的痛苦大大减少、依从性佳，且临床医师的操作也更为容易。显然，这呈现了非常显著的进步。
本发明的方法及试剂用于诊断临床肿瘤时，准确性非常高，这在本发明实施例中针对多种肿瘤临床样本的检测中得以体现。本发明可应用于肿瘤前期筛查、疗效判定、辅助诊断、预后监测等等领域，或如前所述的不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的描述。实施例仅用于更清楚的说明本发明的技术方案，本发明的保护范围以权利要求中所提出的为依据。
实施例1甲基化检测靶点的确定
1.获取人DNA序列SEQ ID NO:1，为TAGMe-4基因序列；
上述序列(正义链)中，实线下划线标示的每一“CG”代表1个甲基化修饰的CpG位点，从5’至3’依次编号为第1～88号“CG”(第1～88号甲基化修饰的CpG位点)。虚线下划线对应实施例的部分方案中的上游引物和下游引物设计区域；斜体加黑区对应实施例的部分方案中的检测靶区域。
2.获取重亚硫酸盐(Bisulfite)转化后的DNA序列SEQ ID NO:2，其中Y代表C或U(T)；
上述序列(正义链)中，实线下划线标示的每一“YG”代表1个经转化后的甲基化修饰的CpG位点，从5’至3’依次编号为第1～88号“YG”(第1～88号经转化后的甲基化修饰的CpG位点)。虚线下划线对应实施例的部分方案中的上游引物和下游引物设计区域；斜体加黑区对应实施例的部分方案中的检测靶区域。
3.确定检测区域，并在检测区域上下游设计引物。
实施例2引物设计与合成
1.设计长度在25～35bp，CG含量适中的第一轮PCR引物，并使扩增长度在100～300bp；
2.在第一轮引物(表1)的末端添加barcode(Sample-ID)；
3.在第一轮引物的末端加tag序列，用于建库；
4.合成第一轮PCR反应的引物及带Illumina接头和index的二轮PCR反应引物(表1)。
表1
其中，F1和R1扩增对应SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中第10～185位的序列(包含引物互补区段，含有的CpG位点第3～20号)，其中第40～157位含有的CpG位点第3～19号。
实施例3引物验证
合成一对引物对阴阳性参考品进行两轮PCR反应：
第一轮PCR反应体系如表2。
表2
第二轮PCR反应体系如表3。
表3
实施例4引物池的构建
验证完引物PCR效率后，合成带有不同barcode的引物池，并进行引物稀释与组合(表4)，第一轮PCR F引物和R引物有M×N种(10×10种)组合方式，可以同时进行多样本的同时检测和定位。表4中，F1引物中小写碱基对应表1中上游引物F1中第1-21位(Illumina接头)、大写碱基为测序标签，标签之后连接与靶检测序列区段互补的碱基(后续实施例中连接SEQ ID NO:3中第29-58位)；R1引物中小写碱基对应表1中上游引物R1中第1-20位、大写碱基为测序标签，标签之后连接与靶检测序列区段互补的碱基(后续实施例中连接SEQ IDNO:4中第28-55位)。第二轮引物为表1中F2和R2。
表4
其中，R表示A或G。
实施例5TAGMe-4 CpG位点在肿瘤组织与非肿瘤组织的甲基化差异-NGS测序法
1.获取临床样本：从临床获取癌旁/非癌-癌组织样本，癌旁/非癌样本作为对照组，癌组织样本作为肿瘤检测实验组；
2.DNA提取：分别提取实验组和对照组DNA；本实验用吸附柱法提取(也可不限于该方法)；
3.重亚硫酸盐处理：以重亚硫酸盐处理提取的DNA样本，严格按照步骤操作；本实验中用ZYMO Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit，货号D5006(也可不限于该方法)；
4.用引物池中的引物(第一轮PCR引物)以及Illumina系统通用测序引物(第二轮PCR引物)，常规方法进行两轮PCR扩增构建NGS文库。
5.PCR扩增之后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段特异性，每个样本取PCR产物5ul，混样，纯化回收目的片段文库进行NGS测序；
6.解析测序结果：根据引物barcode序列提取样本的测序信息；
7.TAGMe-4甲基化值计算：NGS测序可以独立检测出目标区域内单个CpG位点的甲基化情况，计算所有CpG位点甲基化中位数值作为TAGMe-4在该样本中的甲基化值；
8.结果分析：比较非肿瘤组织与肿瘤组织中TAGMe-4甲基化值并通过ROC曲线确定cutoff值。
实施例6TAGMe-4:肺癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取40例样本，其中20例肺癌癌旁样本作为对照组(normal)、20例肺癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建肺癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图1，显示在肺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(****P<0.0001)。敏感性为90％，特异性均为100％。
实施例7TAGMe-4:肝癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取34例样本，其中17例肝癌癌旁样本作为对照组、17例肝癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建肝癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图2，显示在肝癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(**P<0.01)。敏感性为70.59％，特异性为94.12％。
实施例8TAGMe-4:前列腺癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取40例样本，其中20例前列腺癌癌旁样本作为对照组、20例前列腺癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建前列腺癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图3，显示在前列腺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(***P<0.001)。敏感性为75％，特异性为80％。
实施例9TAGMe-4:宫颈癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取40例样本，其中20例宫颈腺癌癌旁样本作为对照组、20例宫颈癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建宫颈癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图4，显示在宫颈癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(****P<0.0001)。敏感性为90％，特异性为90％。
实施例10TAGMe-4:子宫内膜癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取36例样本，其中18例子宫内膜癌癌旁样本作为对照组、18例子宫内膜癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建子宫内膜癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图5，显示在子宫内膜癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(****P<0.0001)。敏感性为66.67％，特异性为94.44％。
实施例11TAGMe-4:尿路上皮癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取40例样本，其中20例尿路上皮癌癌旁组织样本作为对照组、20例尿路上皮癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建尿路上皮癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图6，显示在尿路上皮癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(****P<0.0001)。敏感性为100％，特异性为80％。
实施例12TAGMe-4:胆道肿瘤临床样本验证-NGS测序法
临床获取32例样本，其中16例胆道肿瘤癌旁样本作为对照组、16例胆道肿瘤样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建胆道肿瘤临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图7，显示在胆道肿瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(****P<0.0001)。敏感性为75％，特异性为93.75％。
实施例13TAGMe-4:胃癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取10例样本，其中5例胃癌癌旁样本作为对照组、5例胃癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建胃癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图8，显示在胃癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为80％，特异性为100％。
实施例14TAGMe-4:乳腺癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取16例样本，其中8例乳腺癌癌旁样本作为对照组、8例乳腺癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建乳腺癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图9，显示在乳腺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为75％，特异性为87.5％。
实施例15TAGMe-4:食管癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例食管癌癌旁样本作为对照组、6例食管癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建食管癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图10，显示在食管癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(**P<0.01)。敏感性为100％，特异性为83.3％。
实施例16TAGMe-4:脑胶质瘤临床样本验证-NGS测序法
临床获取14例样本，其中7例脑胶质瘤癌旁样本作为对照组、7例脑胶质瘤样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建脑胶质瘤临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图11，显示在脑胶质瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为85.71％，特异性为71.43％。
实施例17TAGMe-4:结直肠癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例结直肠癌癌旁样本作为对照组、6例结直肠癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建结直肠癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图l2，显示在结直肠癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为83.33％，特异性为100％。
实施例18TAGMe-4:白血病临床样本验证-NGS测序法
临床获取10例样本，其中5例非白血病骨髓涂片样本作为对照组、5例白血病骨髓涂片样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建白血病临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图13，显示在白血病临床样本中，TAGMe-4在白血病骨髓涂片中甲基化值显著高于非白血病骨髓涂片(**P<0.01)。敏感性为100％，特异性为100％。
实施例19TAGMe-4:胰腺癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取10例样本，其中5例胰腺癌癌旁组织样本作为对照组、5例胰腺癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建脂肪肉瘤临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图14，显示在胰腺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为80％，特异性为100％。
实施例20TAGMe-4:甲状腺癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例甲状腺癌癌旁组织样本作为对照组、6例甲状腺癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建甲状腺肿瘤临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图15，显示在甲状腺癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(**P<0.01)。敏感性为100％，特异性为100％。
实施例21TAGMe-4:黑色素瘤临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例正常皮肤组织样本作为对照组、6例皮肤黑色素瘤样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建黑色素瘤临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图16，显示在黑色素瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为83.33％，特异性为80％。
实施例22TAGMe-4:鼻咽癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例鼻咽癌癌旁样本作为对照组、6例鼻咽癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建鼻咽癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图17，显示在鼻咽癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为83.33％，特异性为83.33％。
实施例23TAGMe-4:口腔癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例口腔癌癌旁样本作为对照组、6例口腔癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建口腔癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图18，显示在口腔癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(**P<0.01)。敏感性为83.33％，特异性为100％。
实施例24TAGMe-4:喉癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例喉癌癌旁样本作为对照组、6例喉癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建喉癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图19，显示在喉癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(**P<0.01)。敏感性为100％，特异性为100％。
实施例25TAGMe-4:骨肉瘤临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例骨肉瘤癌旁样本作为对照组、6例骨肉瘤样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建骨肉瘤临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图20，显示在骨肉瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(**P<0.01)。敏感性为100％，特异性为100％。
实施例26TAGMe-4:淋巴瘤临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例正常淋巴样本作为对照组、6例淋巴瘤样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建淋巴瘤临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图21，显示在淋巴瘤临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为66.67％，特异性为83.33％。
实施例27TAGMe-4:肾细胞癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例肾细胞癌癌旁样本作为对照组、6例肾细胞癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建肾细胞癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图22，显示在肾细胞癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(*P<0.05)。敏感性为83.33％，特异性为100％。
实施例28TAGMe-4:卵巢癌临床样本验证-NGS测序法
临床获取12例样本，其中6例卵巢癌癌旁样本作为对照组、6例卵巢癌样本作为实验组，按照以上实施例4所述的引物组合方式(表4中任选第一轮引物1对，第二轮引物为表1中F2和R2)，进行两轮PCR反应，构建卵巢癌临床样本的NGS文库，按照NGS测序步骤，分析TAGMe-4甲基化水平；
结果如图23，显示在卵巢癌临床样本中，TAGMe-4在癌组织中甲基化值显著高于癌旁组织(**P<0.01)。敏感性为100％，特异性为83.33％。
实施例29、单一CG位点的检测性能分析
利用前述实施例中获取的临床样本，分析第9至19号CG位点(SEQ ID NO:1中第10～185位区段内的CG位点)各自作为单一CG位点用于检测癌症的可行性。单一CG位点的甲基化修饰情况通过NGS测序法进行。
如表5-表9所示，单一CG位点已能呈现相对较高的灵敏度和特异性，也可以作为甲基化修饰分析的靶标，能够进行癌症的分析检测。
表5
表6
表7
/>
表8
表9
实施例30、TAGMe-4 CpG位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异—亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP-Bisulfite Sequencing PCR)
该亚硫酸氢盐处理后测序法步骤如下：
1.提取血液系统肿瘤细胞系(髓性白血病细胞系K562)、结直肠癌细胞系(HCT116)、胰腺癌细胞系(SW1990)、人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)、胃癌细胞系(BGC-823)、乳腺癌细胞系(BT-549)和宫颈癌细胞系(HeLa)基因组DNA与其对应正常细胞基因组DNA；
2.分别用重亚硫酸盐处理提取的癌细胞系与正常细胞系基因组DNA，作为后续PCR扩增的模板；
3.根据SEQ ID NO:2的序列设计扩增引物，如表10，进行扩增。
4.PCR扩增之后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段特异性，切胶回收目的片段，连接插入T载体，转化感受态大肠杆菌，涂菌板，第二天挑克隆测序，每个片段挑取大于10个克隆进行Sanger测序。
表10、BSP引物
SEQ ID NO:1区域中20-88甲基化位点癌细胞与正常对照细胞甲基化水平BSP验证如图24，结果显示癌细胞TAGMe-4甲基化水平显著高于正常细胞。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Claims (11)
1.分离的多核苷酸或由其转变而来的多核苷酸在制备检测肿瘤的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述的多核苷酸包括：
(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；或
(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；
其中，由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸；或
所述至少1个修饰的CpG位点为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～88号的任一CpG位点或其组合；较佳地为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第3～19号的任一CpG位点或其组合、第20-88号任一CpG位点或其组合；或
所述多核苷酸片段为SEQ ID NO:1中第40～157位或第10～185位所示核苷酸序列的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括：呼吸系统肿瘤，消化系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，血液系统肿瘤，神经系统肿瘤，头颈部肿瘤，皮肤系统肿瘤，内分泌系统肿瘤或骨骼系统肿瘤；
较佳地，所述肿瘤包括：肺癌，肝癌，前列腺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，尿路上皮癌，胆道肿瘤，胃癌，乳腺癌，食管癌，脑胶质瘤，结直肠癌，白血病，胰腺癌，甲状腺癌，黑色素瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，骨肉瘤，淋巴瘤，肾细胞癌或卵巢癌。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测肿瘤针对的样本包括：组织样本、体液样本、血液样本。
5.一种制备肿瘤的检测试剂的方法，包括：
(a)提供分离的多核苷酸或由其转变而来的多核苷酸，包括(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变；较佳地，所述至少1个修饰的CpG位点为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～88号的任一CpG位点或其组合；较佳地为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第3～19号的任一CpG位点或其组合、第20～88号任一CpG位点或其组合；较佳地，所述多核苷酸片段为SEQ ID NO:1中第40～157位或第10～185位所示核苷酸序列的多核苷酸；
(b)以(a)的多核苷酸作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂。
6.一种特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况的试剂或试剂组合，其中所述的靶序列是：(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变；较佳地，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列，较佳地，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组；较佳地，所述的试剂或试剂组合包括：扩增SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中第40～157位或第10～185位的引物。
7.权利要求6所述的试剂或试剂组合的用途，用于制备检测肿瘤的试剂盒；较佳地，呼吸系统肿瘤，消化系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，血液系统肿瘤，神经系统肿瘤，头颈部肿瘤，皮肤系统肿瘤，内分泌系统肿瘤或骨骼系统肿瘤；更佳地，所述肿瘤包括：肺癌，肝癌，前列腺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，尿路上皮癌，胆道肿瘤，胃癌，乳腺癌，食管癌，脑胶质瘤，结直肠癌，白血病，胰腺癌，甲状腺癌，黑色素瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，骨肉瘤，淋巴瘤，肾细胞癌或卵巢癌。
8.一种用于进行检测肿瘤的试剂盒，其中包括权利要求6所述的试剂或试剂组合。
9.一种分析待测样本的甲基化水平的方法，包括：
(i)从待测样本中获取的多核苷酸；和
(ii)分析所提取的多核苷酸中靶序列或其片段的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是：(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变；SEQ ID NO:1所示核苷酸序列经转变而来的多核苷酸，对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，检测所提取的多核苷酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化特异PCR、甲基化敏感限制性内切酶酶切法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray，或它们的组合；或
所述分析所提取的多核苷酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：(i)对所提取的多核苷酸进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用Bisulfite处理步骤(i)所述的核酸；和(ii)分析经(i)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。
11.分离的多核苷酸或其转变而来的多核苷酸，所述的多核苷酸包括：
(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸TAGMe-4，或含有其中至少1个修饰的CpG位点的多核苷酸片段；较佳地，所述至少1个修饰的CpG位点为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～88号的任一CpG位点或其组合；较佳地为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第3～19号的任一CpG位点或其组合、第20～88号任一CpG位点或其组合；较佳地，所述多核苷酸片段为SEQ ID NO:1中第40～157位或第10～185位所示核苷酸序列的多核苷酸；或
(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；
其中，由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
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