CN111020034B - 新型的诊断肿瘤的标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类DNA表观修饰相关的疾病标志物，所述标志物在患有肿瘤的患者中表现出显著性的甲基化状态的差异。所述肿瘤标志物可作为临床肿瘤的诊断、筛查、分型、检测、预后的标志物，也可作为肿瘤临床辅助诊断或预后的新型分子，或可用于设计诊断试剂及试剂盒。

Description

新型的诊断肿瘤的标志物及其应用
技术领域
本发明属于疾病诊断标志物领域，更具体地，本发明涉及新型的诊断肿瘤的标志物及其应用。
背景技术
表观遗传学(Epigenomics)是研究基因在不发生DNA序列改变的情况下，基因功能的可遗传的变化，并最终导致表型变化的一门学科。表观遗传学主要包括DNA甲基化(DNAmethylation)，组蛋白修饰(histone modification)，microRNA水平变化等生化过程。DNA甲基化是研究较为深入的表观遗传学机制，在包括诊断和治疗在内的肿瘤临床实践中有着应用前景。DNA甲基化是指生物体内在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。
在基因组中98％以上的CpG二核苷酸散在的分布位于具有转录依赖性的转座潜能的重复序列中。在正常细胞中，这些CpG处于高度甲基化/转录沉默的状态，而在肿瘤细胞中这些CpG发生了广泛的去甲基化，导致重复序列的转录、转座子的活化，基因组的高度不稳定性和原癌基因转录增强。余下的占总量2％左右的CpG密集地分布于较小的区域(CpG岛)。约40-50％的基因启动子区域或其附近存在CpG岛，暗示DNA甲基化可能参与该类基因转录调控机制。
在肿瘤细胞中，一些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的CpG岛会发生高甲基化而导致基因的转录失活。受影响的基因包括DNA修复基因，细胞周期控制基因和抗凋亡基因等抑癌基因。基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后，进行PCR(甲基化特异PCR，MSP)检测可有效地确定受试DNA片段的特定位点的甲基化状态。
人类基因组全序列尽管已经被人们所掌握，但是基因组序列纷繁复杂，哪些基因或哪些区段与疾病密切相关，仍然是目前本领域研究的重要课题。因此，有必要结合表观遗传学技术筛选有用于疾病诊断的新标志物。在本发明人的前期研究中，找到了一部分基于甲基化修饰的肿瘤标记物。但是，仍然有必要找到更多的新型肿瘤标志物，从而为肿瘤的诊断提供更多的途径。将来的肿瘤诊断必然需要多种标志物的联合运用，以提高诊断的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供新型的诊断肿瘤的标志物及其应用。
在本发明的第一方面，提供分离的人核酸或其转变而来的核酸在制备肿瘤筛查、诊断、检测或预后评估的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述的人核酸包括(1)SEQ ID NO:1～16任一所示核苷酸序列的核酸或核酸组合，或含有所述序列中至少1个，如包括2～80个(可以是2～80的正整数的任一数)或3～77个(可以是3～77的正整数的任一数)修饰的CpG位点的核酸修饰的CpG位点的核酸或核酸组合；或(2)与(1)的核酸在序列上互补的核酸或核酸组合；其中，所述由人核酸转变而来的核酸为对应于(1)或(2)的核酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
在另一优选例中，与SEQ ID NO:1～16任一所示核苷酸序列的核酸互补的核酸分别是SEQ ID NO:17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107所示核苷酸序列的核酸。
在另一优选例中，所述肿瘤的样本包括：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。
在本发明的另一方面，提供一种分离的人核酸或核酸组合，包括：(1)SEQ ID NO:1～16任一所示核苷酸序列的核酸，或含有所述序列中至少1个修饰的CpG位点的核酸；或(2)与(1)的核酸在序列上互补的核酸。较佳地，所述“含有所述序列中至少1个修饰的CpG位点的核酸”具有约20～1392bp的长度，如长度30、40、50、60、70、80、100、150、200、300、500、1000bp。
在一个优选例中，所述修饰的CpG位点包括发生5-醛甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-甲基化修饰或5-羧甲基化修饰的CpG位点。
在另一个优选例中，所述分离的人核酸包括选自下组的核酸：SEQ ID NO:1～16任一所示核苷酸序列的核酸；SEQ ID NO:1中第122～175位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:2中第35～65位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:3中第52～65位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:4中第33～70位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:5中第273～291位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ IDNO:6中第2～43位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:7中第112～167位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:8中第16～46位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:9中第1～28位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:10中第27～40位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:11中第63～91位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:13中第1～39位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:14中第21～32位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:15中第497～536位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；或SEQ ID NO:16中第44～76位核苷酸序列或其互补的序列的核酸。
在本发明的另一方面，提供一种由前述所述分离的核酸或核酸组合转变而来的核酸或核酸组合，对应于前述分离的核酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
在另一优选例中，所述经转变而来的核酸或核酸组合由对应于前述分离的如SEQID NO:1～16的核酸或核酸组合，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理转变而来。较佳地，包括：如SEQ ID NO:18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108所示核苷酸序列的核酸或核酸片段，或如SEQ ID NO:19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109所示核苷酸序列的核酸或核酸片段；所述核酸片段包括至少1个(如包括2～80个，可以是2～80的正整数的任一数)修饰的CpG位点。较佳地，所述核酸片段具有约20～1392bp的长度，如长度30、40、50、60、70、80、100、150、200、300、500、1000bp。
在另一优选例中，所述的核酸的片段中包括：SEQ ID NO:18中第122～175位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:24中第35～65位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:30中第52～65位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:36中第33～70位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:42中第273～291位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:48中第2～43位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQID NO:54中第112～167位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:60中第16～46位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:66中第1～28位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:72中第27～40位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:78中第63～91位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:90中第1～39位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:96中第21～32位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；SEQ ID NO:102中第497～536位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；或SEQ ID NO:108中第44～76位核苷酸序列或其互补的序列的核酸。
在本发明的另一方面，提供一种试剂或试剂组合，其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求3～8任一所述的核酸的全长或片段，其中包括至少1个(如包括2～80个，可以是2～80的正整数的任一数)修饰的CpG位点；较佳地，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列，较佳地所述的基因序列包括基因Panel或基因群组；较佳地，所述的试剂或试剂组合包括特异性检测SEQ ID NO:1～16中2～16条(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15条)序列的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列(基于所述基因序列而设计)，较佳地所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。
在本发明的另一方面，提供一种制备试剂的方法，所述试剂用于肿瘤诊断、筛查、检测、分型或预后评估，所述方法包括：提供前面任一所述的分离的人核酸，以所述核酸全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个(如包括2～80个，可以是2～80的正整数的任一数)修饰的CpG位点；较佳地，所述的检测试剂包括但不限于：引物，探针，芯片或试纸。
在另一优选例中，，所述的检测试剂包括特异性检测SEQ ID NO:1～16中2～16条(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16条)序列的试剂；较佳地，多种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16条)所述的检测试剂被整合于芯片上。
在本发明的另一方面，提供一种用于进行肿瘤检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒，该试剂盒中包括前面所述的试剂或试剂组合。
在另一优选例中，所述的试剂或试剂组合包括引物。
在另一优选例中，所述的引物包括：所述的引物包括选自下组的引物：SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21，或还包括SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27，或还包括SEQID NO:28；SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33，或还包括SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:38和SEQ IDNO:39，或还包括SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，或还包括SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，或还包括SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57，或还包括SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63，或还包括SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69，或还包括SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75，或还包括SEQID NO:76；SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81，或还包括SEQ ID NO:82；SEQ ID NO:86和SEQ IDNO:87，或还包括SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93，或还包括SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99，或还包括SEQ ID NO:100；SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105，或还包括SEQ ID NO:106；和/或SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111，或还包括SEQ IDNO:112。
在一个优选例中，所述的试剂盒中还可包括但不限于：DNA纯化试剂，DNA提取试剂，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐，PCR扩增试剂。
在其它优选例中，所述的试剂盒中还包括：用于标明检测操作步骤和结果判定标准的说明书。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂或试剂组合的用途，用于制备肿瘤诊断、筛查、检测分型或预后评估的试剂盒。
在本发明的另一方面，提供检测待测样品的甲基化水平的方法，包括：提取待测样品的核酸；以及检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述任一所述的经转变而来的核酸。
在另一优选例中，检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合；或SEQ ID NO:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。
在另一优选例中，所述检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：(i)对所提取的核酸进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；(ii)分析经(i)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。
在另一优选例中，步骤(ii)中，分析的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR(MSP)、或它们的组合以及SEQ ID NO:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。并且，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。
在另一优选例中，所述的甲基化谱式的方法不是诊断性的方法，也即其不以直接获得疾病的诊断结果为目的。
在另一优选例中，所述检测样品的甲基化谱式的方法为体外方法。
在另一优选例中，步骤(ii)包括：(1)对(i)的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。
在另一优选例中，所述的甲基化谱式异常是指该核酸CpG中的C发生高度甲基化。
根据前面任一方面，所述肿瘤包括：血液系统肿瘤，消化系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，神经系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，其他系统肿瘤；较佳地，所述血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤癌；其他系统肿瘤如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、基于公共数据库信息，分析靶基因中相应位点在肿瘤组织或正常组织中的甲基化水平的结果图。
图2、十种肿瘤细胞系以及三例白细胞对照样本中，靶基因位点的甲基化水平的结果图。
图3、白血病临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
图4、乳腺癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
图5、直肠癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
图6、食管癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
图7、胃部临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
图8、头颈部肿瘤临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
图9、肝癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
图10、肺癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
图11、胰腺癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列中的位点在实验组和对照组中甲基化值比较。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究和分析，分离获得了一类DNA表观修饰相关的疾病标志物，所述标志物在患有肿瘤的患者中表现出显著性的甲基化状态的差异，这种差异统计学意义显著，且在实体瘤以及非实体瘤等诸多肿瘤中均能表现出这种差异，所述的非实体瘤如血液肿瘤，所述的实体瘤如肝癌、肺癌等。因此，本发明的肿瘤标志物可作为临床肿瘤的诊断、筛查、分型、检测、预后的标志物，也可作为肿瘤临床辅助诊断或预后的新型分子，或可用于设计诊断试剂及试剂盒。
本发明中，术语“样品”或“样本”包括从任何个体(较佳地为人)或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如，所示的样本可以包括但不限于：血液样本、组织样本、石蜡包埋样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。
本发明中，术语“高(度)甲基化”是指在一个基因序列中CpG存在高度甲基化、羟甲基化、醛甲基化或羧甲基化修饰。例如，以甲基化特异PCR(MSP)分析手段而言，以甲基化特异性引物所进行的PCR反应可获得阳性的PCR结果即可认为该受试的DNA(基因)区处于高甲基化状态。例如，以实时定量甲基化特异性PCR而言，高甲基化状态的判定可根据其对照样品的甲基化状态的相对值分析统计学差异。
本发明中，SEQ ID NO:1～16任一所示基因序列或其部分区域的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在显著的差异，只要检测到所述基因序列区域存在异常高甲基化状态，即可判定该受检者罹患肿瘤或属于肿瘤高危人群。并且，SEQ ID NO:1～16任一所示基因序列或其部分区域呈现的这种在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存的显著差异广谱地存在于不同种类的肿瘤中，包括实体瘤如肠癌、肺癌等，同时也包括非实体瘤。实体瘤以及非实体瘤的研究结果在临床研究中得以证实，详细的内容可见实施例中的具体记载。
根据上述，本发明提供了来源于人基因组特定区域的核酸，其具有SEQ ID NO:1～16任一所示基因序列或其部分区域，同时还包括其反义链。在肿瘤细胞内，该核酸序列中多处5’-CpG-3’的碱基C位置上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。
针对本发明提供的一个或多个CpG进行检测均是可以的，因此本发明也包含所述核苷酸序列的核酸的片段，且其中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个可以包括2～80个，可以是2～80的正整数的任一数，更具体如3，5，8，10，12，15，18，20，30，40，50，60，70个。
根据本发明所提供的人基因组中该特定片段的信息后，本领域技术人员可以方便地获得所述CpG位点，加以应用。本发明的实施例中提供了一系列的含有CpG位点的序列片段，这些片段可以作为较佳实施方式的一些例子，但是应理解，根据本发明提供的信息，人们可以作出变化，选择其它的片段。
本发明也包括SEQ ID NO:1～16任一所示核苷酸序列或序列片段或其互补序列的基因Panel或基因群组。针对所述的基因Panel或基因群组，也可以通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。
应理解，多种多样的可用于分析甲基化状态的技术均可被应用于本发明中，本发明对此类检测技术没有特别的限制。本发明提供的核酸可以作为基因组中分析甲基化状态的关键区域，可通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态，进而分析肿瘤的发生或发展情况。
本发明的SEQ ID NO:1～16任一所述的核酸或其片段或与其互补的序列，可在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。因此，本发明还提供了上述核酸(包括其互补链(反义链))经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的核酸，包括：SEQ ID NO:18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108所示核苷酸序列的核酸或核酸片段，或如SEQ ID NO:19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109所示核苷酸序列的核酸或核酸片段。这些核酸可作为设计检测试剂或检测试剂盒的更为直接的靶点。
本发明也包含上述核酸或其反义链经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的核酸的片段，且其中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个可以包括2～80个，可以是2～80的正整数的任一数，更具体如3，5，8，10，12，15，18，20，30，40，50，60，70个。本领域人员可以理解的是，在本发明提供了基于一条DNA链的CpG编号后，与之互补的DNA链中各个CpG位点相应于正义链的编号是根据本发明所提供的内容易于获得的。
本发明的SEQ ID NO:1～16任一所示核苷酸序列的核酸和/或其互补核酸可被整合于一个或若干个整体中，如一个或若干个核酸集中，供本领域技术人员运用，如从该核酸集中选择一条或多条核酸或核酸的片段，设计靶向分析试剂。所设计的靶向分析试剂，也可被整合于一个或若干个整体中，如一个或若干个试剂盒中。这种整合有利于实现高通量的分析。
本发明的由SEQ ID NO:1～16任一所示核苷酸序列的核酸和/或其互补核酸转变而来的核酸，也可被整合于一个或若干个整体中，如一个或若干个核酸集中，供本领域技术人员运用，如从该核酸集中选择一条或多条核酸或核酸的片段，设计靶向分析试剂。所设计的靶向分析试剂，也可被整合于一个或若干个整体中，如一个或若干个试剂盒中，或一片或若干片芯片中。这种整合有利于实现高通量的分析。
在本发明的提供了靶基因的基础上，本领域公知的这些技术以及即将发展的一些技术，均可被应用于本发明中，来实施甲基化水平的检测。测定核酸的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP)或实时定量甲基化特异性PCR，Methylight)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。例如，检测甲基化水平时可使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法，其基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。此外，其他可用的技术还有：qPCR法、二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术或HPLC法以及组合基因群组检测法等该领域常规方法。尽管本发明的实施例中提供了一些优选的方式，但本发明的总体方案并不限于此。
作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中核酸的甲基化谱式的方法。所述的方法基于的原理是：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在后续的PCR扩增过程中转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理核酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的核酸多态性(SNP)。基于上述原理来鉴定检测样品中核酸的甲基化谱式，可以有效区分出甲基化与非甲基化的胞嘧啶。
本发明所述的方法包括：包括：首先提供样品、提取基因组DNA；其次，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；再次，分析经步骤(b)处理的基因组DNA中是否存在甲基化谱式异常。
本发明的方法可用于：对受试者样品进行检测，评估受试者是否患有肿瘤；或用于区分肿瘤高危人群。所述的方法可以是不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形，例如不以判断疾病最终结果为目的的情形、人群地域性分析研究、科学研究、人口普查等。
在本发明的优选实施例中，通过PCR扩增及焦磷酸测序法检测DNA甲基化，实际应用中并不限于该方法，本领域已知的或正在改进的其它DNA甲基化检测方法亦可。在进行PCR扩增中，所应用的引物并不限于是实施例中所提供的，还可以获得与本发明实施例所提供的引物在序列上存在不同，但仍然针对于本发明所指示的核酸或相应CpG位点的引物。
围绕本发明所提供的标记物核酸，其它本领域技术人员已知的确定基因组的序列、其变异及甲基化状态的检测方法和试剂均可包括在本发明中。
本发明提供了一种制备肿瘤检测试剂的方法，包括：提供所述的核酸，以所述核酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的检测试剂可以包括但不限于：芯片，引物，探针，等等；在获得了所述的标记物后，检测试剂的选择是本领域技术人员可以做到的。
在得知了核酸的序列后，设计引物是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包含CpG序列在内，与其中CpG互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中TpG互补为针对原为去甲基化的基因区)。在本发明优选的实施例中，所述的试剂是引物，所述的引物优选地为被列于表2～表17中的那些。除了引物，其它的诊断或检测试剂也是可以制备的，包括但不限于探针、芯片等。
所述的试剂也可以是试剂组合，例如引物组合。例如，所述的组合包括多于一组的引物，从而可分别扩增上述的多条核酸。
本发明还提供了体外检测样品中核酸的甲基化谱式的试剂盒，该试剂盒包括：容器，以及位于容器中的上述引物对。
所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增等所需的各种试剂以及其它试剂，例如样本处理试剂。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。
本发明的方法及试剂用于诊断临床肿瘤时，准确性非常高，这在本发明实施例中针对多种肿瘤临床样本的检测中得以体现。本发明可应用于肿瘤前期筛查、疗效判定、辅助诊断、预后监测等等领域，或如前所述的不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、与肿瘤相关的标志物的筛选及获得
人类疾病的发生或发展与基因存在密切的相关性。而人基因组存在庞大而复杂的基因信息，其中隐藏着疾病发生发展密切相关的基因，同时也可能存在一些能够区分疾病和非疾病的基因或片段。本发明人致力于肿瘤诊断研究，为了获得与肿瘤密切相关的基因，本发明人对人基因组进行了大量的分析，从中探寻在肿瘤以及非肿瘤中甲基化存在显著差异的分子，在大量分析以及试验论证的基础上，本发明人确定了一系列可以作为肿瘤标志的基因区段，包括选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:16的基因区段，具体的序列列于表1中。
SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:16的经重亚硫酸盐处理后序列分别是SEQ ID NO:18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108。
同时，本发明人还获得了SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:16的反向互补序列，它们分别是SEQ ID NO:17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107。针对于所述反向互补序列的经重亚硫酸盐处理后序列分别是SEQ ID NO:19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109。
本发明人根据每一靶基因区段进行分组，每一靶区段、其反向序列以及它们的经重亚硫酸盐处理后序列归为一组，分为16组，如表1。
表1*
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*表中，以“.”标示的碱基为甲基化CpG位点或其经过重亚硫酸盐处理后相应位点，所述位点(下方)对应的数字为CpG编号；下划线的位置为后续部分实施例中的检测靶位置区域。
实施例2、基于公共数据库信息来分析相应靶基因的甲基化水平
本发明人汇总了公共数据库(所述公共数据库包括TCGA，Roadmap，ENCODE)中肿瘤组织样本的DNA甲基化数据集。肿瘤组织样本共包括以下17种：膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胆囊癌，结肠癌，直肠癌，头颈部肿瘤，食管癌，肾癌，肝癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌，黑色素瘤，胃癌，甲状腺癌，子宫内膜癌)；正常组织样本包括以下17种：膀胱组织，乳腺组织，宫颈组织，胆囊组织，结肠组织，头颈部组织，食管组织，肾组织，肝组织，肺组织，胰腺组织，前列腺组织，皮肤组织，胃组织，甲状腺组织，子宫内膜组织。获取各样本的DNA甲基化数据集后，计算SEQ ID NO:1～16所示序列在所有肿瘤以及对照样本中的平均甲基化水平。
结果如图1，可见肿瘤样本中SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平普遍在70％以上，而对照正常组织样本中则普遍低于10％。因此，肿瘤样本中SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平显著高于对照样本。
实施例3、诊断试剂的制备以及肿瘤细胞甲基化水平检测
一、诊断试剂的设计
1、组1
针对组1的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为对应于SEQ IDNO:1中013～022号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表2。
表2
2、组2
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:2中05～11号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表3。
表3
3、组3
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:3中03～06号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表4。
表4
4、组4
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:4中04～12号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表5。
表5
5、组5
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:5中13～17号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表6。
表6
6、组6
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:6中01～04号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表7。
表7
7、组7
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:7中08～18号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表8。
表8
8、组8
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:8中02～07号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表9。
表9
9、组9
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:9中01～05号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表10。
表10
10、组10
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:10中05～09号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表11。
表11
11、组11
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:11中04～07号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表12。
表12
12、组12
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:12中01～05号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表13。
表13
13、组13
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:13中01～07号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表14。
表14
14、组14
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:14中02～05号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表15。
表15
15、组15
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:15中26～31号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表16。
表16
16、组16
针对组的靶基因位置进行引物设计。其中，焦磷酸检测CpG位点为相应于SEQ IDNO:16中07～12号的CpG位点(即表1中下划线部分序列相应位置所含CpG)。引物序列具体如表17。
表17
二、针对肿瘤细胞的甲基化检测
本发明人收集了十种肿瘤细胞，获得其基因组，检测其中SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平。所述肿瘤细胞为A549(肺癌)，HCT116(结直肠癌)，K562(慢性髓细胞白血病)，97L(肝癌)，Hela(宫颈癌)，HUCCT1(胆管上皮癌)，SW1990(胰腺癌)，GBC-SD(胆囊癌)，MCF7(乳腺癌)，746T(胃癌)。同时，本发明人收集了三例白细胞(WBC1～3)作为对照样本。
检测时采用焦磷酸测序法(pyrosequencing)，主要步骤如下：
利用焦磷酸测序法来检测肿瘤样本与非肿瘤样本的甲基化差异，具体步骤包括：
(1)获取样本：选择肿瘤细胞系-白细胞对照，或者从临床获取癌旁/非癌-癌组织样本，白细胞、癌旁/非癌样本作为对照组，肿瘤细胞系，癌组织样本作为肿瘤检测实验组；
(2)DNA提取：分别提取实验组和对照组DNA；本实验用酚氯仿抽提法；
(3)重亚硫酸盐处理：以重亚硫酸盐处理提取的DNA样本，按照步骤操作；本实验中用ZYMO Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit，货号D5006；
(4)引物设计：根据靶基因序列，设计PCR扩增引物与焦磷酸测序引物，如后续相应列表中所示；
(5)PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳：以重亚硫酸盐处理后的样本作为PCR的模板，进行PCR扩增，扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增的特异性；
(6)焦磷酸测序：通过QIAGEN公司的Pyro Mark Q96 ID焦磷酸测序仪进行检测，按照其说明书步骤进行操作；
(7)甲基化值计算：焦磷酸测序可以独立检测出目标区域内单个CpG位点的甲基化情况，计算所有CpG位点甲基化平均值作为该样本中的甲基化值；
(8)结果分析：比较对照组与实验组中靶基因序列的甲基化值。
结果如图2(每组柱体由左向右对应于标注自上而下的顺序，箭头处为对照)，在十种肿瘤细胞系以及三例白细胞对照样本中检测，SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平(约50～99％)均显著高于白细胞对照样本(约20％以下)。
实施例4、白血病临床检测
本发明人从临床获取12例非白血病骨髓涂片样本作为对照组，同时获取12例白血病骨髓涂片样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQ IDNO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图3，显示在白血病临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～8倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于白血病临床诊断。
实施例5、乳腺癌临床检测
本发明人从临床获取5例乳腺癌癌旁组织样本作为对照组，同时获取5例乳腺癌组织样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图4，显示在乳腺癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组(箭头所指的柱体)，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～8倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于乳腺癌临床诊断。
实施例6、直肠癌临床检测
本发明人从临床获取7例结直肠癌癌旁组织样本作为对照组，同时获取7例结直肠癌组织样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图5，显示在结直肠癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组(箭头所指的柱体)，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～8倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于直肠癌临床诊断。
实施例7、食管癌临床检测
本发明人从临床获取10例食管癌癌旁组织样本作为对照组，同时获取10例食管癌组织样本作为实验组，按照以上实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQ IDNO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图6，显示在食管癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组(箭头所指的柱体)，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～7倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于食管癌临床诊断。
实施例8、胃癌临床检测
本发明人从临床获取5例胃部炎症患者组织样本作为对照组，同时获取5例胃癌组织样本作为实验组，按照以上实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图7所示，显示在胃癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组(箭头所指的柱体)，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～4倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于胃癌临床诊断。
实施例9、头颈部肿瘤临床检测
本发明人从临床获取10例头颈部肿瘤癌旁组织样本作为对照组，获取10例头颈部肿瘤组织样本作为实验组，按照以上实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQID NO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图8所示，显示在头颈部肿瘤临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组(箭头所指的柱体)，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～4倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于头颈部肿瘤临床诊断。
实施例10、肝癌临床检测
本发明人从临床获取9例肝癌癌旁组织样本作为对照组，获取9例肝癌组织样本作为实验组，按照以上实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图9所示，显示在肝癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组(箭头所指的柱体)，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～4倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于肝癌临床诊断。
实施例11、肺癌临床检测
本发明人从临床获取8例肺癌癌旁组织样本作为对照组，获取8例肺癌组织样本作为实验组，按照以上实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图10所示，显示在肺癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组(箭头所指的柱体)，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～5倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于肺癌临床诊断。
实施例12、胰腺癌临床检测
本发明人从临床获取6例胰腺癌癌旁组织样本作为对照组，获取6例胰腺癌组织样本作为实验组，按照以上实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组SEQ ID NO:1～16所示序列的甲基化水平。
结果如图11所示，显示在胰腺癌临床样本中，SEQ ID NO:1～16所示序列在实验组中甲基化值显著高于对照组(箭头所指的柱体)，甲基化水平的增加幅度普遍约在2～6倍。
因此，对SEQ ID NO:1～16任一所示序列进行甲基化水平检测，可以用于胰腺癌临床诊断。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海奕谱生物科技有限公司
<120> 新型的诊断肿瘤的标志物及其应用
<130> 199414
<160> 112
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 231
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
cgagtagaag gtgtaggtgt cggacatgcg gtcgtcgagg cggcgctggc agcagtactc 60
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ccgcggcgcg aagcgcagct tgccgtggcc gcgcacgtag agcaggatga agccgaaggc 180
ctccgagtgc cggtcgaaga agtactcgtt gcgctcgcgg tcgtagtcgt c 231
<210> 2
<211> 87
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
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tgtgcccggg tcagggggcg agctgcg 87
<210> 3
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 5
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agaggagaag agaggacagt gtggcctctc cctgagtcgg gccccagcag taccgggtcc 180
ccggaatctc ccaccacccc aactcgcagt tttccgagtc tcttcgcact cccgccttgg 240
gaaccacagg gttcgttgct gggaagctgt ctcgggaccg cgtgcggagc gggagggggg 300
ctctcaagct ggcagggccg gggcttgagg ggcaggatgc agccaggctg gagtcgttgg 360
ccattttgaa agtgagtgcg catacctgta cattcggttc attaaaacac gaatcattaa 420
ccggatgcga aaggcgtcat ttatgccgcg gacggggcac tggcgggagg gaaaatgcct 480
aaaaggaggc gggtgcagag ggtggaggac actttgaacg cccctcggct tgggagccgc 540
tttgtgttta gagtaatttt cccgagggcg 570
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
ccggggaatg ggaggtgcga ctcggtcccc cacctctacc ccgggcac 48
<210> 7
<211> 311
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
cggatcccta cagtgcctcc cagcctgggc gggagcggcg gctgcgtcgc tgaaggttgg 60
ggtccttggt gcgaaaggga ggcagctgca gcctcagccc caccccagaa gcggccttcg 120
catcgctgcg gtgggcgttc tcgggcttcg acttcgccag cgccgcgggg cagaggcacc 180
tggagctcgc agggcccaga cctgggttgg aaaagcttcg ctgactgcag gcaagcgtcc 240
gggaggggcg gccaggcgaa gccccggcgc tttaccacac acttccgggt cccatgccag 300
ttgcatccgc g 311
<210> 8
<211> 282
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
cgttcccagg agctccgagg cgcagcggcg acagaggttc gccccggcct gctagcattg 60
gcattgcggt tgactgagct tcgcctaaca ggcttgggga gggtgggctg ggctgggctg 120
ggctgggctg ggtgctgccc ggctgtccgc ctttcgtttt cctgggaccg aggagtcttc 180
cgctccgtat ctgcctagag tctgaatccg actttctttc ctttgggcac gcgctcgcca 240
gtggagcact tcttgttctg gccccgggct gatctgcacg cg 282
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
cgtggggcaa ggaggccgcg gaaacgcg 28
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
cgcgggcgct cccgctccag gtcccccgcc gtcggcggcg cacactgaac cgaagacctc 60
g 61
<210> 11
<211> 1313
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
acggcttgtc agtgttgctc ttctgattcc agcccgaggt cctggtctcg gggggctaaa 60
agcgagggaa actccgtgtt aataacccgc gtgttaatga cctgcgtgaa gctggaggcc 120
aaaggatgag gcgggaggac ttggcaagag aagtccccag aaactttcgc ttagggagtg 180
tctcccccca cccccaccac gcccctccgc gtcagcctgg cctcttcccc caggcgtttt 240
gaccccgcat cccccctcgc catccaggac agagacaggt gtcaggactc aattcccgaa 300
gcaattcctt tctcttcaga ggcaggagcc tggcactgat ttcttcaccc taattgcctg 360
caccagaaag aagaggggga ggggaagagg gtcgggaggc gggaaaggat agctctgtaa 420
tgctctcaga gctgagccaa aaaggaaaag aaagcaaaac gacaaaaaac tgatccgtgt 480
cctgcatgtt ggcagcagac aaccttcctt gctgctgagc tgtcccgggt ggcttcaccg 540
cggctgggga atccgagcca ttccttccac gtgctaagat gtccctctaa gccctcagct 600
cctgccagaa gtagccaaat tacctttctt cgtactgtaa acttccttta aaacatacaa 660
actcataacc tggaaaagtc gacaaggacg cctttcactt tggcagggga agaagacgac 720
tggcttgcat ctgggggtca ggaaggacag ttccatctcc ctctgaggga agacggggtt 780
gaggggtaat cctcccccag aaaatgcaga gcctggaact gtccagactc tggcctgaaa 840
cctcctgggt gtaaggccat gaatctgctc gacttgctca cgggcgggaa ggaaacaagg 900
aaacaacgaa aagtttcctg cgaagtgacc aacatcccct attttttaaa aattccgtgt 960
gagacctgag aacacactgt gaagcggggt tcggagaacg acccctcccg cgttccgcgc 1020
ccagcggggt cgcagggctg cgagcccggc tgtagcaaag ctttctcggc cgcgtcctcc 1080
ctccggattc ggtaggccag gctcgggcgc gcccttccca caccaacaaa ccatctttcc 1140
cgactcagca gaggcccaca ggggcgcagc cgctgtccct ccgcccttgg cccagcggcg 1200
ccgccctggt acgccaggcc tgaaggcagg gccggcccgc gccacgcagg gtctccctta 1260
ggcggcgcct tagggtgaaa tgcggggcca agcctgacct gccggggtgc ccc 1313
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
cgcggcccac tttccccata gccgcagctt ccggcg 36
<210> 13
<211> 144
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
cgctgcgcgt cagagcgctg ctcccgcgtc ctcctgccgg cagaagcccc tgcagtgcgc 60
cccgcgacca ccagctggaa ccaaaaggcg gcgcgcaggc gcggagccca cggggagccc 120
aggctggggc gcgtgtcagc tccg 144
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
ccggggcaca gaagctgcag cggcgcgggg cggtgggctg tgagc 45
<210> 15
<211> 1106
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
cggccgggac cagcgcaagc agggactttg cggggacacc gcttctccaa cagagcaagg 60
cctggcccac gtttccggtt tctcctaact tccttttatt gccttccttt gcttcgcaag 120
ttccatctac ccctccagct acagagcccc acctctaggc acaggaagct tcccggaaaa 180
agaaaggctg tcccagaaag agaccgagag agactttcca aacttcgggc atagccacgg 240
caattcccag tctgctaatg ccaaggcggg cgcgtaaggc cgcctaaatc tagacctccc 300
tcctcactca tttcaaaaaa taacaacgtg ccagccacct ccgcagatac cgccggctgg 360
tgcttgccca ggagacgcca gggccagagc gccactccca gcatcgaaat ggcagagaga 420
aagcgcagct ccaaattccc cttcagaggt taagcctcaa tcattgtgtc ccttccctag 480
ggactgctgg cgctctcgcc cactggcgat gattatgcgc ctagaactcg accgcgaagc 540
aactaatagg aaaacatatg gtgtcaattt ggatgctccg cgcctcgcgc acacccggga 600
acgagcggca caaagccctg ccggccggcc cgcgaccccg cgcccctcgg ggcctgccag 660
ccgggccgca gcgacaaacg ctcagggctg cgcgccctgg ctggggcccg cccgagagac 720
agcctgcggc tggggagtct gagctccaag gggagagccc agccgccgaa ggcgagccta 780
ccggccaagc cctggggtcc ggcaggttct gcacaactac tcccgcaaag ctcgccacct 840
ttgtgccctt tcctcagcta cgcgcttacc agccccggaa gcaccagggg gcgaccggcg 900
tttccaaaac agatggataa ggtgctgggg accctcctta agcctgtgtg gttcggccag 960
ggcaggctgc tggaagaccc gggcctttcc acactttgag ttcagttgag ccccgacgcc 1020
gtgtgcctca accgtaacct caaaccgggc ctggtttcgc tgggcctcca ggctcccagg 1080
tcggagctct agactagccc tgccgc 1106
<210> 16
<211> 76
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
ccgactcccg cgggtctccg cgccgaaccc acctggctcc tatcgcacgg gacattcccg 60
acccacccac gccgcg 76
<210> 17
<211> 231
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
gacgactacg accgcgagcg caacgagtac ttcttcgacc ggcactcgga ggccttcggc 60
ttcatcctgc tctacgtgcg cggccacggc aagctgcgct tcgcgccgcg gatgtgcgag 120
ctctccttct acaacgagat gatctactgg ggcctggagg gcgcgcacct cgagtactgc 180
tgccagcgcc gcctcgacga ccgcatgtcc gacacctaca ccttctactc g 231
<210> 18
<211> 231
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(231)
<223> y is c or u
<400> 18
ygagtagaag gtgtaggtgt yggauatgyg gtygtygagg yggygutggu aguagtauty 60
gaggtgygyg uuutuuaggu uuuagtagat uatutygttg tagaaggaga gutyguauat 120
uygyggygyg aagyguagut tguygtgguy gyguaygtag aguaggatga aguygaaggu 180
utuygagtgu yggtygaaga agtautygtt gygutygygg tygtagtygt u 231
<210> 19
<211> 231
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(231)
<223> y is c or u
<400> 19
gaygautayg auygygagyg uaaygagtau ttuttygauy gguautygga gguuttyggu 60
ttuatuutgu tutaygtgyg ygguuayggu aagutgygut tygyguygyg gatgtgygag 120
ututuuttut auaaygagat gatutautgg gguutggagg gygyguauut ygagtautgu 180
tguuagyguy guutygayga uyguatgtuy gauauutaua uuttutauty g 231
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物
<400> 20
tttaggtttt agtagattat ttygttgtag 30
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 引物
<400> 21
aaaaccttcr acttcatcct actctac 27
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 引物
<400> 22
gtagaaggag agttygtata tt 22
<210> 23
<211> 87
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
cgcagctcgc cccctgaccc gggcacagcg cgctacccgc ggacgcaagc gcgagcagcg 60
tggacccgcc agagaagtcg gtcctcg 87
<210> 24
<211> 87
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(87)
<223> y is c or u
<400> 24
ygaggauyga uttututggy gggtuuaygu tgutygygut tgygtuygyg ggtagygygu 60
tgtguuyggg tuagggggyg agutgyg 87
<210> 25
<211> 87
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(87)
<223> y is c or u
<400> 25
yguagutygu uuuutgauuy ggguauagyg ygutauuygy ggayguaagy gygaguagyg 60
tggauuyguu agagaagtyg gtuutyg 87
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> 引物
<400> 26
gtaggggagt tygtatttga gygaggat 28
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 引物
<400> 27
caactcrccc cctaacccra acacaac 27
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物
<400> 28
tttggygggt ttaygttgtt 20
<210> 29
<211> 311
<212> DNA/RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
ggggtgcggg cccctctcct tgtcctgctt ttcagcatct ttggcaattg cgcaaagttg 60
cttgggttgc aatggtgggg tgcagggggc gctcggctgc tgcacctgtt agtgctgggc 120
ccaggttgag aggcgacctc cagcccccac aataatgtcc cgggctctct ggtttgggtc 180
ctcgcagcgc ccgattgacc gccagcgata cgacgagaac gaggacttgt cggacgtgga 240
ggagatcgtc agcgtccgcg gcttcagcct ggaggagaag cttcgcagcc agctgtacca 300
gggggacttc g 311
<210> 30
<211> 311
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(311)
<223> y is c or u
<400> 30
ygaagtuuuu utggtauagu tggutgygaa guttutuutu uaggutgaag uygyggaygu 60
tgaygatutu utuuaygtuy gauaagtuut ygttutygty gtatygutgg yggtuaatyg 120
ggygutgyga ggauuuaaau uagagaguuy gggauattat tgtgggggut ggaggtyguu 180
tutuaauutg gguuuaguau taauaggtgu aguaguygag yguuuuutgu auuuuauuat 240
tguaauuuaa guaautttgy guaattguua aagatgutga aaaguaggau aaggagaggg 300
guuyguauuu u 311
<210> 31
<211> 311
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(311)
<223> y is c or u
<400> 31
ggggtgyggg uuuututuut tgtuutgutt ttuaguatut ttgguaattg yguaaagttg 60
uttgggttgu aatggtgggg tguagggggy gutyggutgu tguauutgtt agtgutgggu 120
uuaggttgag aggygauutu uaguuuuuau aataatgtuu ygggututut ggtttgggtu 180
utyguagygu uygattgauy guuagygata ygaygagaay gaggauttgt yggaygtgga 240
ggagatygtu agygtuygyg guttuaguut ggaggagaag uttyguaguu agutgtauua 300
gggggautty g 311
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 引物
<400> 32
gtgtaygaag tttttttggt atagttggtt g 31
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 引物
<400> 33
aaaacttatc raacrtaaaa aaaatc 26
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 引物
<400> 34
gaagtttttt ttttaggttg aag 23
<210> 35
<211> 70
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
cggcctcgaa tttcgtccgc ggtcggccag gcgccgcgct ttggttcctt tcccactccg 60
cggtccccgg 70
<210> 36
<211> 70
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(70)
<223> y is c or u
<400> 36
uyggggauyg yggagtggga aaggaauuaa agygyggygu utgguygauy gyggaygaaa 60
ttygagguyg 70
<210> 37
<211> 70
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(70)
<223> y is c or u
<400> 37
ygguutygaa tttygtuygy ggtygguuag gyguygygut ttggttuutt tuuuautuyg 60
yggtuuuygg 70
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> 引物
<400> 38
ggttygggtt ttggtttata ttyggggat 29
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物
<400> 39
tacracccta actttaaaac aattttacaa 30
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物
<400> 40
gagtgggaaa ggaattaaag 20
<210> 41
<211> 570
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
cgccctcggg aaaattactc taaacacaaa gcggctccca agccgagggg cgttcaaagt 60
gtcctccacc ctctgcaccc gcctcctttt aggcattttc cctcccgcca gtgccccgtc 120
cgcggcataa atgacgcctt tcgcatccgg ttaatgattc gtgttttaat gaaccgaatg 180
tacaggtatg cgcactcact ttcaaaatgg ccaacgactc cagcctggct gcatcctgcc 240
cctcaagccc cggccctgcc agcttgagag cccccctccc gctccgcacg cggtcccgag 300
acagcttccc agcaacgaac cctgtggttc ccaaggcggg agtgcgaaga gactcggaaa 360
actgcgagtt ggggtggtgg gagattccgg ggacccggta ctgctggggc ccgactcagg 420
gagaggccac actgtcctct cttctcctct tccttggggc tctgatgccc acccgggcga 480
gcgcttttct ctggctctgg gttcctttct tacctcctct ttctttctcc acaccccttt 540
tctgtctctg tgtctggcag tctcagccgg 570
<210> 42
<211> 570
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(570)
<223> y is c or u
<400> 42
uyggutgaga utguuagaua uagagauaga aaaggggtgt ggagaaagaa agaggaggta 60
agaaaggaau uuagaguuag agaaaagygu tyguuygggt ggguatuaga guuuuaagga 120
agaggagaag agaggauagt gtgguututu uutgagtygg guuuuaguag tauygggtuu 180
uyggaatutu uuauuauuuu aautyguagt tttuygagtu tuttyguaut uuyguuttgg 240
gaauuauagg gttygttgut gggaagutgt utygggauyg ygtgyggagy gggagggggg 300
ututuaagut gguaggguyg ggguttgagg gguaggatgu aguuaggutg gagtygttgg 360
uuattttgaa agtgagtgyg uatauutgta uattyggttu attaaaauay gaatuattaa 420
uyggatgyga aaggygtuat ttatguygyg gaygggguau tggygggagg gaaaatguut 480
aaaaggaggy gggtguagag ggtggaggau autttgaayg uuuutyggut tgggaguygu 540
tttgtgttta gagtaatttt uuygagggyg 570
<210> 43
<211> 570
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(570)
<223> y is c or u
<400> 43
yguuutyggg aaaattautu taaauauaaa gyggutuuua aguygagggg ygttuaaagt 60
gtuutuuauu ututguauuy guutuutttt agguattttu uutuuyguua gtguuuygtu 120
ygygguataa atgayguutt tyguatuygg ttaatgatty gtgttttaat gaauygaatg 180
tauaggtatg yguautuaut ttuaaaatgg uuaaygautu uaguutggut guatuutguu 240
uutuaaguuu ygguuutguu aguttgagag uuuuuutuuy gutuyguayg yggtuuygag 300
auaguttuuu aguaaygaau uutgtggttu uuaaggyggg agtgygaaga gautyggaaa 360
autgygagtt ggggtggtgg gagattuygg ggauuyggta utgutggggu uygautuagg 420
gagagguuau autgtuutut uttutuutut tuuttggggu tutgatguuu auuygggyga 480
gyguttttut utggututgg gttuutttut tauutuutut ttutttutuu auauuuuttt 540
tutgtututg tgtutgguag tutuaguygg 570
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<223> 引物
<400> 44
gtattttygt tttgggaatt atagggtt 28
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
atcctacccc tcaaaccccr accctaccaa 30
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gttgttggga agttgtt 17
<210> 47
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
gtgcccgggg tagaggtggg ggaccgagtc gcacctccca ttccccgg 48
<210> 48
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<223> y is c or u
<400> 48
uyggggaatg ggaggtgyga utyggtuuuu uauututauu uyggguau 48
<210> 49
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<223> y is c or u
<400> 49
gtguuygggg tagaggtggg ggauygagty guauutuuua ttuuuygg 48
<210> 50
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> 引物
<400> 50
gggtatttgg agygaggaag gtgtgtta 28
<210> 51
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> 引物
<400> 51
attccaatta craaataaaa crtctttaa 29
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物
<400> 52
gagtttatta tygtggaagt 20
<210> 53
<211> 311
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
cgcggatgca actggcatgg gacccggaag tgtgtggtaa agcgccgggg cttcgcctgg 60
ccgcccctcc cggacgcttg cctgcagtca gcgaagcttt tccaacccag gtctgggccc 120
tgcgagctcc aggtgcctct gccccgcggc gctggcgaag tcgaagcccg agaacgccca 180
ccgcagcgat gcgaaggccg cttctggggt ggggctgagg ctgcagctgc ctccctttcg 240
caccaaggac cccaaccttc agcgacgcag ccgccgctcc cgcccaggct gggaggcact 300
gtagggatcc g 311
<210> 54
<211> 311
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(311)
<223> y is c or u
<400> 54
yggatuuuta uagtguutuu uaguutgggy gggagyggyg gutgygtygu tgaaggttgg 60
ggtuuttggt gygaaaggga gguagutgua guutuaguuu uauuuuagaa gygguuttyg 120
uatygutgyg gtgggygttu tyggguttyg auttyguuag yguygygggg uagagguauu 180
tggagutygu aggguuuaga uutgggttgg aaaaguttyg utgautguag guaagygtuy 240
gggaggggyg guuaggygaa guuuyggygu tttauuauau auttuygggt uuuatguuag 300
ttguatuygy g 311
<210> 55
<211> 311
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(311)
<223> y is c or u
<400> 55
ygyggatgua autgguatgg gauuyggaag tgtgtggtaa agyguygggg uttyguutgg 60
uyguuuutuu yggayguttg uutguagtua gygaaguttt tuuaauuuag gtutggguuu 120
tgygagutuu aggtguutut guuuygyggy gutggygaag tygaaguuyg agaayguuua 180
uyguagygat gygaagguyg uttutggggt ggggutgagg utguagutgu utuuutttyg 240
uauuaaggau uuuaauuttu agygayguag uyguygutuu yguuuaggut gggagguaut 300
gtagggatuy g 311
<210> 56
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 引物
<400> 56
tgaaggttgg ggtttttggt gygaaaggga g 31
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物
<400> 57
taaaccctac raactccaaa tacctctacc 30
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> y is c or u
<400> 58
gtagttttag ttttatttta g 21
<210> 59
<211> 282
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
cgcgtgcaga tcagcccggg gccagaacaa gaagtgctcc actggcgagc gcgtgcccaa 60
aggaaagaaa gtcggattca gactctaggc agatacggag cggaagactc ctcggtccca 120
ggaaaacgaa aggcggacag ccgggcagca cccagcccag cccagcccag cccagcccac 180
cctccccaag cctgttaggc gaagctcagt caaccgcaat gccaatgcta gcaggccggg 240
gcgaacctct gtcgccgctg cgcctcggag ctcctgggaa cg 282
<210> 60
<211> 282
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(282)
<223> y is c or u
<400> 60
ygttuuuagg agutuygagg yguagyggyg auagaggtty guuuygguut gutaguattg 60
guattgyggt tgautgagut tyguutaaua gguttgggga gggtgggutg ggutgggutg 120
ggutgggutg ggtgutguuy ggutgtuygu utttygtttt uutgggauyg aggagtuttu 180
ygutuygtat utguutagag tutgaatuyg autttutttu utttggguay gygutyguua 240
gtggaguaut tuttgttutg guuuygggut gatutguayg yg 282
<210> 61
<211> 282
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(282)
<223> y is c or u
<400> 61
ygygtguaga tuaguuyggg guuagaauaa gaagtgutuu autggygagy gygtguuuaa 60
aggaaagaaa gtyggattua gaututaggu agatayggag yggaagautu utyggtuuua 120
ggaaaaygaa aggyggauag uyggguagua uuuaguuuag uuuaguuuag uuuaguuuau 180
uutuuuuaag uutgttaggy gaagutuagt uaauyguaat guuaatguta guagguyggg 240
gygaauutut gtyguygutg yguutyggag utuutgggaa yg 282
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物
<400> 62
tgggatttta ygatttatty gttaatttat 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物
<400> 63
aatcaaccrc aataccaata ctaacaaacc 30
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 引物
<400> 64
taatttatyg tttttaggag ttt 23
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
cgcgtttccg cggcctcctt gccccacg 28
<210> 66
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> y is c or u
<400> 66
ygtgggguaa ggagguygyg gaaaygyg 28
<210> 67
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> y is c or u
<400> 67
ygygtttuyg ygguutuutt guuuuayg 28
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物
<400> 68
tttygttatt ttggagttty gagttgagtt 30
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 引物
<400> 69
cattaaacrc ttccrtctcc ccraaac 27
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物
<400> 70
ggtagaagat gataggttag 20
<210> 71
<211> 61
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
cgaggtcttc ggttcagtgt gcgccgccga cggcggggga cctggagcgg gagcgcccgc 60
g 61
<210> 72
<211> 61
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<223> y is c or u
<400> 72
ygygggygut uuygutuuag gtuuuuyguy gtyggyggyg uauautgaau ygaagauuty 60
g 61
<210> 73
<211> 61
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<223> y is c or u
<400> 73
ygaggtutty ggttuagtgt gyguyguyga yggyggggga uutggagygg gagyguuygy 60
g 61
<210> 74
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> 引物
<400> 74
gtttttattt gagttttttg ygttagttgt tt 32
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 引物
<400> 75
cctacraaat cttcrattca atatac 26
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 引物
<400> 76
gttttygttt taggttttt 19
<210> 77
<211> 1313
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
ggggcacccc ggcaggtcag gcttggcccc gcatttcacc ctaaggcgcc gcctaaggga 60
gaccctgcgt ggcgcgggcc ggccctgcct tcaggcctgg cgtaccaggg cggcgccgct 120
gggccaaggg cggagggaca gcggctgcgc ccctgtgggc ctctgctgag tcgggaaaga 180
tggtttgttg gtgtgggaag ggcgcgcccg agcctggcct accgaatccg gagggaggac 240
gcggccgaga aagctttgct acagccgggc tcgcagccct gcgaccccgc tgggcgcgga 300
acgcgggagg ggtcgttctc cgaaccccgc ttcacagtgt gttctcaggt ctcacacgga 360
atttttaaaa aataggggat gttggtcact tcgcaggaaa cttttcgttg tttccttgtt 420
tccttcccgc ccgtgagcaa gtcgagcaga ttcatggcct tacacccagg aggtttcagg 480
ccagagtctg gacagttcca ggctctgcat tttctggggg aggattaccc ctcaaccccg 540
tcttccctca gagggagatg gaactgtcct tcctgacccc cagatgcaag ccagtcgtct 600
tcttcccctg ccaaagtgaa aggcgtcctt gtcgactttt ccaggttatg agtttgtatg 660
ttttaaagga agtttacagt acgaagaaag gtaatttggc tacttctggc aggagctgag 720
ggcttagagg gacatcttag cacgtggaag gaatggctcg gattccccag ccgcggtgaa 780
gccacccggg acagctcagc agcaaggaag gttgtctgct gccaacatgc aggacacgga 840
tcagtttttt gtcgttttgc tttcttttcc tttttggctc agctctgaga gcattacaga 900
gctatccttt cccgcctccc gaccctcttc ccctccccct cttctttctg gtgcaggcaa 960
ttagggtgaa gaaatcagtg ccaggctcct gcctctgaag agaaaggaat tgcttcggga 1020
attgagtcct gacacctgtc tctgtcctgg atggcgaggg gggatgcggg gtcaaaacgc 1080
ctgggggaag aggccaggct gacgcggagg ggcgtggtgg gggtgggggg agacactccc 1140
taagcgaaag tttctgggga cttctcttgc caagtcctcc cgcctcatcc tttggcctcc 1200
agcttcacgc aggtcattaa cacgcgggtt attaacacgg agtttccctc gcttttagcc 1260
ccccgagacc aggacctcgg gctggaatca gaagagcaac actgacaagc cgt 1313
<210> 78
<211> 1313
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1313)
<223> y is c or u
<400> 78
aygguttgtu agtgttgutu ttutgattuu aguuygaggt uutggtutyg gggggutaaa 60
agygagggaa autuygtgtt aataauuygy gtgttaatga uutgygtgaa gutggagguu 120
aaaggatgag gygggaggau ttgguaagag aagtuuuuag aaautttygu ttagggagtg 180
tutuuuuuua uuuuuauuay guuuutuygy gtuaguutgg uututtuuuu uaggygtttt 240
gauuuyguat uuuuuutygu uatuuaggau agagauaggt gtuaggautu aattuuygaa 300
guaattuutt tututtuaga gguaggaguu tgguautgat ttuttuauuu taattguutg 360
uauuagaaag aagaggggga ggggaagagg gtygggaggy gggaaaggat agututgtaa 420
tgututuaga gutgaguuaa aaaggaaaag aaaguaaaay gauaaaaaau tgatuygtgt 480
uutguatgtt gguaguagau aauuttuutt gutgutgagu tgtuuygggt gguttuauyg 540
yggutgggga atuygaguua ttuuttuuay gtgutaagat gtuuututaa guuutuagut 600
uutguuagaa gtaguuaaat tauutttutt ygtautgtaa auttuuttta aaauatauaa 660
autuataauu tggaaaagty gauaaggayg uutttuautt tgguagggga agaagaygau 720
tgguttguat utgggggtua ggaaggauag ttuuatutuu ututgaggga agayggggtt 780
gaggggtaat uutuuuuuag aaaatguaga guutggaaut gtuuagautu tgguutgaaa 840
uutuutgggt gtaagguuat gaatutguty gauttgutua ygggygggaa ggaaauaagg 900
aaauaaygaa aagtttuutg ygaagtgauu aauatuuuut attttttaaa aattuygtgt 960
gagauutgag aauauautgt gaagyggggt tyggagaayg auuuutuuyg ygttuygygu 1020
uuagyggggt yguagggutg ygaguuyggu tgtaguaaag utttutyggu ygygtuutuu 1080
utuyggatty ggtagguuag gutygggygy guuuttuuua uauuaauaaa uuatutttuu 1140
ygautuagua gagguuuaua ggggyguagu ygutgtuuut uyguuuttgg uuuagyggyg 1200
uyguuutggt ayguuagguu tgaagguagg guygguuygy guuayguagg gtutuuutta 1260
ggyggyguut tagggtgaaa tgygggguua aguutgauut guyggggtgu uuu 1313
<210> 79
<211> 1313
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1313)
<223> y is c or u
<400> 79
gggguauuuy gguaggtuag guttgguuuy guatttuauu utaaggyguy guutaaggga 60
gauuutgygt ggygyggguy gguuutguut tuagguutgg ygtauuaggg yggyguygut 120
ggguuaaggg yggagggaua gyggutgygu uuutgtgggu ututgutgag tygggaaaga 180
tggtttgttg gtgtgggaag ggygyguuyg aguutgguut auygaatuyg gagggaggay 240
gygguygaga aagutttgut auaguygggu tyguaguuut gygauuuygu tgggygygga 300
aygygggagg ggtygttutu ygaauuuygu ttuauagtgt gttutuaggt utuauaygga 360
atttttaaaa aataggggat gttggtuaut tyguaggaaa uttttygttg tttuuttgtt 420
tuuttuuygu uygtgaguaa gtygaguaga ttuatgguut tauauuuagg aggtttuagg 480
uuagagtutg gauagttuua ggututguat tttutggggg aggattauuu utuaauuuyg 540
tuttuuutua gagggagatg gaautgtuut tuutgauuuu uagatguaag uuagtygtut 600
tuttuuuutg uuaaagtgaa aggygtuutt gtygautttt uuaggttatg agtttgtatg 660
ttttaaagga agtttauagt aygaagaaag gtaatttggu tauttutggu aggagutgag 720
gguttagagg gauatuttag uaygtggaag gaatggutyg gattuuuuag uygyggtgaa 780
guuauuyggg auagutuagu aguaaggaag gttgtutgut guuaauatgu aggauaygga 840
tuagtttttt gtygttttgu tttuttttuu tttttggutu agututgaga guattauaga 900
gutatuuttt uuyguutuuy gauuututtu uuutuuuuut uttutttutg gtguagguaa 960
ttagggtgaa gaaatuagtg uuaggutuut guututgaag agaaaggaat tguttyggga 1020
attgagtuut gauauutgtu tutgtuutgg atggygaggg gggatgyggg gtuaaaaygu 1080
utgggggaag agguuaggut gaygyggagg ggygtggtgg gggtgggggg agauautuuu 1140
taagygaaag tttutgggga uttututtgu uaagtuutuu yguutuatuu tttgguutuu 1200
aguttuaygu aggtuattaa uaygygggtt attaauaygg agtttuuuty guttttaguu 1260
uuuygagauu aggauutygg gutggaatua gaagaguaau autgauaagu ygt 1313
<210> 80
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> 引物
<400> 80
gtttgttagt gttgtttttt tgattttag 29
<210> 81
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 引物
<400> 81
ctccaacttc acrcaaatca ttaaca 26
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 引物
<400> 82
ttggtttygg ggggttaaaa g 21
<210> 83
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
cgccggaagc tgcggctatg gggaaagtgg gccgcg 36
<210> 84
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223> y is c or u
<400> 84
ygygguuuau tttuuuuata guyguagutt uyggyg 36
<210> 85
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223> y is c or u
<400> 85
yguyggaagu tgyggutatg gggaaagtgg guygyg 36
<210> 86
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223> 引物
<400> 86
gaaagttttt ttttaatatt ygggtaaatt tagaga 36
<210> 87
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(33)
<223> 引物
<400> 87
ctattctata aaaacctcca atttttttat tct 33
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 引物
<400> 88
tattygggta aatttagaga aatagtg 27
<210> 89
<211> 144
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
cggagctgac acgcgcccca gcctgggctc cccgtgggct ccgcgcctgc gcgccgcctt 60
ttggttccag ctggtggtcg cggggcgcac tgcaggggct tctgccggca ggaggacgcg 120
ggagcagcgc tctgacgcgc agcg 144
<210> 90
<211> 144
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(144)
<223> y is c or u
<400> 90
ygutgygygt uagagygutg utuuygygtu utuutguygg uagaaguuuu tguagtgygu 60
uuygygauua uuagutggaa uuaaaaggyg gygyguaggy gyggaguuua yggggaguuu 120
aggutggggy gygtgtuagu tuyg 144
<210> 91
<211> 144
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(144)
<223> y is c or u
<400> 91
yggagutgau aygyguuuua guutgggutu uuygtgggut uygyguutgy gyguyguutt 60
ttggttuuag utggtggtyg yggggyguau tguaggggut tutguyggua ggaggaygyg 120
ggaguagygu tutgaygygu agyg 144
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物
<400> 92
ttgaatttga tttggtaayg gatgaaaatt 30
<210> 93
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 引物
<400> 93
craaacrcac tacaaaaact tctacc 26
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 引物
<400> 94
agtattttta gataattt 18
<210> 95
<211> 45
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
gctcacagcc caccgccccg cgccgctgca gcttctgtgc cccgg 45
<210> 96
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(45)
<223> y is c or u
<400> 96
uygggguaua gaagutguag yggygygggg yggtgggutg tgagu 45
<210> 97
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(45)
<223> y is c or u
<400> 97
gutuauaguu uauyguuuyg yguygutgua guttutgtgu uuygg 45
<210> 98
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 引物
<400> 98
atttygagta ttgttaggtt gttggagagg t 31
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 引物
<400> 99
aaaaacrctc ccctacatat actc 24
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 引物
<400> 100
tttyggggta tagaagttgt a 21
<210> 101
<211> 1106
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
gcggcagggc tagtctagag ctccgacctg ggagcctgga ggcccagcga aaccaggccc 60
ggtttgaggt tacggttgag gcacacggcg tcggggctca actgaactca aagtgtggaa 120
aggcccgggt cttccagcag cctgccctgg ccgaaccaca caggcttaag gagggtcccc 180
agcaccttat ccatctgttt tggaaacgcc ggtcgccccc tggtgcttcc ggggctggta 240
agcgcgtagc tgaggaaagg gcacaaaggt ggcgagcttt gcgggagtag ttgtgcagaa 300
cctgccggac cccagggctt ggccggtagg ctcgccttcg gcggctgggc tctccccttg 360
gagctcagac tccccagccg caggctgtct ctcgggcggg ccccagccag ggcgcgcagc 420
cctgagcgtt tgtcgctgcg gcccggctgg caggccccga ggggcgcggg gtcgcgggcc 480
ggccggcagg gctttgtgcc gctcgttccc gggtgtgcgc gaggcgcgga gcatccaaat 540
tgacaccata tgttttccta ttagttgctt cgcggtcgag ttctaggcgc ataatcatcg 600
ccagtgggcg agagcgccag cagtccctag ggaagggaca caatgattga ggcttaacct 660
ctgaagggga atttggagct gcgctttctc tctgccattt cgatgctggg agtggcgctc 720
tggccctggc gtctcctggg caagcaccag ccggcggtat ctgcggaggt ggctggcacg 780
ttgttatttt ttgaaatgag tgaggaggga ggtctagatt taggcggcct tacgcgcccg 840
ccttggcatt agcagactgg gaattgccgt ggctatgccc gaagtttgga aagtctctct 900
cggtctcttt ctgggacagc ctttcttttt ccgggaagct tcctgtgcct agaggtgggg 960
ctctgtagct ggaggggtag atggaacttg cgaagcaaag gaaggcaata aaaggaagtt 1020
aggagaaacc ggaaacgtgg gccaggcctt gctctgttgg agaagcggtg tccccgcaaa 1080
gtccctgctt gcgctggtcc cggccg 1106
<210> 102
<211> 1106
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1106)
<223> y is c or u
<400> 102
ygguygggau uagyguaagu agggautttg yggggauauy guttutuuaa uagaguaagg 60
uutgguuuay gtttuyggtt tutuutaaut tuuttttatt guuttuuttt guttyguaag 120
ttuuatutau uuutuuagut auagaguuuu auututaggu auaggaagut tuuyggaaaa 180
agaaaggutg tuuuagaaag agauygagag agautttuua aauttygggu ataguuaygg 240
uaattuuuag tutgutaatg uuaaggyggg ygygtaaggu yguutaaatu tagauutuuu 300
tuutuautua tttuaaaaaa taauaaygtg uuaguuauut uyguagatau yguyggutgg 360
tguttguuua ggagayguua ggguuagagy guuautuuua guatygaaat gguagagaga 420
aagyguagut uuaaattuuu uttuagaggt taaguutuaa tuattgtgtu uuttuuutag 480
ggautgutgg ygututyguu uautggygat gattatgygu utagaautyg auygygaagu 540
aautaatagg aaaauatatg gtgtuaattt ggatgutuyg yguutygygu auauuyggga 600
aygagyggua uaaaguuutg uygguygguu ygygauuuyg yguuuutygg gguutguuag 660
uyggguygua gygauaaayg utuagggutg ygyguuutgg utgggguuyg uuygagagau 720
aguutgyggu tggggagtut gagutuuaag gggagaguuu aguyguygaa ggygaguuta 780
uygguuaagu uutggggtuy gguaggttut guauaautau tuuyguaaag utyguuauut 840
ttgtguuutt tuutuaguta ygyguttauu aguuuyggaa guauuagggg gygauyggyg 900
tttuuaaaau agatggataa ggtgutgggg auuutuutta aguutgtgtg gttygguuag 960
gguaggutgu tggaagauuy ggguutttuu auautttgag ttuagttgag uuuygayguy 1020
gtgtguutua auygtaauut uaaauygggu utggtttygu tggguutuua ggutuuuagg 1080
tyggagutut agautaguuu tguygu 1106
<210> 103
<211> 1106
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1106)
<223> y is c or u
<400> 103
gygguagggu tagtutagag utuygauutg ggaguutgga gguuuagyga aauuagguuy 60
ggtttgaggt tayggttgag guauayggyg tyggggutua autgaautua aagtgtggaa 120
agguuygggt uttuuaguag uutguuutgg uygaauuaua uagguttaag gagggtuuuu 180
aguauuttat uuatutgttt tggaaayguy ggtyguuuuu tggtguttuy ggggutggta 240
agygygtagu tgaggaaagg guauaaaggt ggygaguttt gygggagtag ttgtguagaa 300
uutguyggau uuuagggutt gguyggtagg utyguuttyg gyggutgggu tutuuuuttg 360
gagutuagau tuuuuaguyg uaggutgtut utygggyggg uuuuaguuag ggygyguagu 420
uutgagygtt tgtygutgyg guuyggutgg uagguuuyga ggggygyggg gtygyggguy 480
gguygguagg gutttgtguy gutygttuuy gggtgtgygy gaggygygga guatuuaaat 540
tgauauuata tgttttuuta ttagttgutt ygyggtygag ttutaggygu ataatuatyg 600
uuagtgggyg agagyguuag uagtuuutag ggaagggaua uaatgattga gguttaauut 660
utgaagggga atttggagut gygutttutu tutguuattt ygatgutggg agtggygutu 720
tgguuutggy gtutuutggg uaaguauuag uyggyggtat utgyggaggt ggutgguayg 780
ttgttatttt ttgaaatgag tgaggaggga ggtutagatt taggygguut taygyguuyg 840
uuttgguatt aguagautgg gaattguygt ggutatguuy gaagtttgga aagtututut 900
yggtututtt utgggauagu utttuttttt uygggaagut tuutgtguut agaggtgggg 960
ututgtagut ggaggggtag atggaauttg ygaaguaaag gaagguaata aaaggaagtt 1020
aggagaaauy ggaaaygtgg guuagguutt gututgttgg agaagyggtg tuuuyguaaa 1080
gtuuutgutt gygutggtuu ygguyg 1106
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物
<400> 104
tttagaggtt aagttttaat tattgtgttt 30
<210> 105
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(33)
<223> 引物
<400> 105
attaacacca tatattttcc tattaattac ttc 33
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 引物
<400> 106
ttttagggat tgttggygtt tt 22
<210> 107
<211> 76
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 107
cgcggcgtgg gtgggtcggg aatgtcccgt gcgataggag ccaggtgggt tcggcgcgga 60
gacccgcggg agtcgg 76
<210> 108
<211> 76
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(76)
<223> y is c or u
<400> 108
uygautuuyg ygggtutuyg yguygaauuu auutggutuu tatyguaygg gauattuuyg 60
auuuauuuay guygyg 76
<210> 109
<211> 76
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(76)
<223> y is c or u
<400> 109
ygyggygtgg gtgggtyggg aatgtuuygt gygataggag uuaggtgggt tyggygygga 60
gauuygyggg agtygg 76
<210> 110
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> 引物
<400> 110
gggttttygy gtygaattta tttggtttt 29
<210> 111
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> 引物
<400> 111
ccraatatcr atacaaaaac tcaataac 28
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 引物
<400> 112
gaatttattt ggtttttat 19

Claims (10)

1.检测分离的人核酸或其转变而来的核酸的CpG位点甲基化水平的检测试剂在制备肿瘤筛查、诊断、检测或预后评估的试剂或试剂盒中的用途；
其中，所述的人核酸为：(1).SEQ ID NO: 1中第122～175位序列；或(2).与(1)的核酸在序列上互补的核酸；
其中，由人核酸转变而来的核酸为对应于(1)或(2)的核酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变；
其中，所述肿瘤选自：肺癌、直肠癌、白血病、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、头颈部肿瘤。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤的样本包括：组织样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本。
3.如权利要求1～2任一所述的用途，其特征在于，所述修饰的CpG位点包括发生5-甲基化修饰的CpG位点。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述修饰为：5-醛甲基化修饰、5-羟甲基化修饰或5-羧甲基化修饰。
5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，分离的人核酸转变而来的核酸为SEQ IDNO: 19所示核苷酸序列的核酸。
6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂为SEQ ID NO: 20和SEQ IDNO: 21所示序列的引物。
7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，还包括SEQ ID NO: 22所示序列的引物。
8. 一种制备用于肿瘤诊断、筛查、检测、分型或预后评估的试剂的方法，包括：提供分离的人核酸或其转变而来的核酸，所述的人核酸为：(1).SEQ ID NO: 1中第122～175位序列；或(2).与(1)的核酸在序列上互补的核酸；由人核酸转变而来的核酸为对应于(1)或(2)的核酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变；
以所述核酸作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；所述肿瘤选自：肺癌、直肠癌、白血病、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、头颈部肿瘤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的检测试剂包括：引物，探针，芯片或试纸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的检测试剂被整合于芯片上。
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