JP7391082B2 - 腫瘍を診断するためのdnaメチル化に関連するマーカー及びその使用 - Google Patents
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Description
(a) SEQ ID NO:1に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(b) SEQ ID NO:3に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(c) SEQ ID NO:5に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(d) SEQ ID NO:7に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(e)上記(a)~(d)のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも1個(例えば2~40個、より具体的に3、5、8、10、15、20、25、30、35個)の修飾されたCpGサイトが存在するもの;及び/又は
(f) 上記(a)~(e)のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸(アンチセンス鎖)。
一つの好ましい例では、それが、バイサルファイトで処理された前記の(a)~(e)と対応するポリヌクレオチドから転換されてなる。
(g) SEQ ID NO:2に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(h) SEQ ID NO:4に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(i) SEQ ID NO:6に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(j) SEQ ID NO:8に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(k)上記(g)~(j)のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも1個(例えば2~40個、より具体的に3、5、8、10、15、20、25、30、35個)の修飾されたCpGサイトが存在するものを含む。
容器、及び容器に位置する前記の試薬又は試薬の組み合わせ;好ましくは、各試薬は別々の容器に位置する。
(i)試料を提供し、DNAを抽出すること;
(ii)その中の未修飾のシトシンがウラシルに転化するように、検出しようとする試料を処理する;好ましくは、上記の修飾が、5-メチル化修飾(5mC)、5-ヒドロキシメチル化修飾(5hmC)、5-ホルミル化修飾又は5-カルボキシル化修飾を含む;好ましくは、バイサルファイトでステップ(i)に記載されたDNAを処理すること;
(iii)(ii)で処理されたゲノムDNAにおける上記のポリヌクレオチド又はそのフラグメントの修飾状況を分析すること。
本明細書で使用される場合、「単離」とは、物質をその元の環境から単離することを指す(天然物質である場合、元の環境は自然環境である)。例えば、生細胞において、自然状態にあるポリヌクレオチドとポリペプチドは、単離・精製されないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然状態で共存する他の物質から単離される場合、それは単離・精製されるものである。
本明細書で使用される場合、「サンプル」または「試料」は、任意の個体または単離された組織、細胞、または体液から得られる、DNAメチル化状態の検出に適した物質を含む。
腫瘍の診断のための有用な標的を見つけるために、本発明者らは、広範囲かつ詳細な研究を経て、最終に、一連の遺伝子配列領域であるCTSM-4F、CTSM-2BE、CTSM-3C、CTSM-4Iを見つけた。これらの遺伝子配列領域のメチル化状態が、腫瘍組織と非腫瘍組織では有意差があるので、上記遺伝子のいずれかのプロモーター領域に異常なメチル化状態(高メチル化)が検出されると、当該受検者が、がんのハイリスクグループであることを判定できる。
そして、本発明が、単離されたポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドは、ヒトゲノムから由来し、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7に示されたヌクレオチド配列を有し、腫瘍患者の腫瘍細胞において、当該ポリヌクレオチド配列の複数箇所の5’-CpG-3’の塩基Cポジションに、5-メチルシトシン(5mC)が生成される。本発明が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:7に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつ少なくとも1個(例えば2~40個、より具体的に3、5、8、10、15、20、25、30、35個)のメチル化CpGサイトが存在するものも含む。上記のポリヌクレオチド又はフラグメント又は相補鎖(アンチセンス鎖)は、検出試薬又は検出キットのデザインに用いられても良い。
本発明の新たな発見に基づき、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するための、ポリヌクレオチド配列に基づいてデザインされた検出試薬も提供する。本分野に既知された確定なゲノムの配列とメチル化状態の検出方法と試薬は、いずれも本発明に適用できる。
また、上記のキットには、さらに、DNAの抽出、DNAの精製、PCR増幅などに必要な様々な試薬も含んでも良い。
ポリヌクレオチドのメチル化プロファイルは、既存の技術(例えばメチル化特異的PCR(MSP)またはリアルタイム定量的メチル化特異的PCR、Methylight)、または開発中と開発予定の他の技術によって測定することができる。
本発明に記載された方法が、以下を含む:(a)試料を提供し、ゲノムDNAを抽出する;(b)バイサルファイトでステップ(a)のゲノムDNAを処理し、ゲノムDNAにおけるメチル化されていないシトシンをウラシルに転化する;(c)ステップ(b)で処理されたゲノムDNAにメチル化プロファイル異常の存在の有無を分析する。
一、検出配列に対する説明
この実施例では、SEQ ID NO: 1に示されるCTSM-4F腫瘍マーカーの配列を提供し、ただし、ボックスによって示される塩基は潜在的なメチル化CpGサイトであり、最適な検出領域は中央の下線が引かれた領域である。
CGCCCAGTAAGTTACGGAAAAGGCGGAGACAGAGGTTTCGTTCCCGCCCCTCCAATTCAGTCTCCAAAAAGGTCCGCATAATTGATATATAAGGGGCTTCAGTGTGTAGCAAAGTTGCAAAAGTTAAGAGTTGTTGTTTGTCTTCGATCATGTCTGGTAGAGGCAAAGGTGGTAAAGGTTTAGGAAAGGGAGGCGCCAAGCGCCATCGCAAAGTGCTGCGTGACAACATACAGGGCATCACGAAGCCCGCCATCCGTCGCTTGGCCCGACGCGGCGGCGTGAAACGCATTTCGGGCCTCATTTATGAGGAGACCCGCGGTGTTCTTAAGGTGTTCCTGGAGAATGTGATACGGGACGCCGTAACCTACACGGAGCACGCCAAGCGTAAGACAGTCACTGCAATGGATGTTGTCTACGCGCTCAAGCGCCAGGGACGCACTCTGTACGGCTTTGGTGGCTGAGCCTCACCCCGGCTTTTTATTTAACAGCTCACCCATAAAAGGCCCTTTTCAGGGCCACCTCCTTCGTCACACGAAGGGCTGTAACTGATGACGACTTGGGTTTCGTTTTGTAAATTTGGGATTCTAACTGAGTTAAACCGAGCCGTTTTTAGCGATCTTCCTAAGATGGCGGATGTGCTAAGGAGAAAGGGAAGGCGAAACATTAGAAACTTGTTCAGGTATTTCGATCGCAAACATT
1、検出しようとするサンプルの入手:がん組織及び相応する腫瘍随伴コントロール組織を含む臨床組織サンプルを選択した。
SEQ ID NO:2は、以下に示される:
YGTTTAGTAAGTTAYGGAAAAGGYGGAGATAGAGGTTTYGTTTTYGTTTTTTTAATTTAGTTTTTAAAAAGGTTYGTATAATTGATATATAAGGGGTTTTAGTGTGTAGTAAAGTTGTAAAAGTTAAGAGTTGTTGTTTGTTTTYGATTATGTTTGGTAGAGGTAAAGGTGGTAAAGGTTTAGGAAAGGGAGGYGTTAAGYGTTATYGTAAAGTGTTGYGTGATAATATATAGGGTATTAYGAAGTTYGTTATTYGTYGTTTGGTTYGAYGYGGYGGYGTGAAAYGTATTTYGGGTTTTATTTATGAGGAGATTYGYGGTGTTTTTAAGGTGTTTTTGGAGAATGTGATAYGGGAYGTYGTAATTTATAYGGAGTAYGTTAAGYGTAAGATAGTTATTGTAATGGATGTTGTTTAYGYGTTTAAGYGTTAGGGAYGTATTTTGTAYGGTTTTGGTGGTTGAGTTTTATTTYGGTTTTTTATTTAATAGTTTATTTATAAAAGGTTTTTTTTAGGGTTATTTTTTTYGTTATAYGAAGGGTTGTAATTGATGAYGATTTGGGTTTYGTTTTGTAAATTTGGGATTTTAATTGAGTTAAATYGAGTYGTTTTTAGYGATTTTTTTAAGATGGYGGATGTGTTAAGGAGAAAGGGAAGGYGAAATATTAGAAATTTGTTTAGGTATTTYGATYGTAAATATT
SEQ ID NO: 2に基づき、ネステッドPCR及びパイロシーケンスの特徴によって、増幅プライマーとシーケンシングプライマーのセットを提供し、表1に示された(SEQ ID NO: 2の二重下線または太字の配列に対応する):
1回目のPCR増幅システム:
サンプルのメチル化値を分析することにより、腫瘍サンプルとコントロールサンプルを効果的に区別することができ、コントロールサンプルでは、CTSM-4Fは低メチル化状態にあり、腫瘍サンプルでは、CTSM-4Fは高メチル化状態にある。
1、直腸がんの検出と分析
病院から得られた直腸がんに診断されたサンプルから、ランダムに4つの結腸直腸がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
病院から得られた肝臓がんに診断されたサンプルから、ランダムに8つの肝臓がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
病院から得られた頭頸部腫瘍に診断されたサンプルから、ランダムに5つの頭頸部腫瘍サンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
病院から得られた肺がんに診断されたサンプルから、実験グループとして、ランダムに5つの肺がん血漿サンプルを選択し、コントロールグループとして、5つの正常なヒト血漿サンプルを選択した。
一、検出配列に対する説明
この実施例では、SEQ ID NO:3に示されるCTSM-2BE腫瘍マーカーの配列を提供し、ただし、ボックスによって示される塩基は潜在的なメチル化CpGサイトである。最適な検出領域は中央の下線が引かれた領域である。
SEQ ID NO:3は、以下に示される:
AGCTGTTTGTTAAATAGGCTTTCATTTTAATTTTTTAAAAAATATTTTCACTAGTTAGACGGAATATTTATTTCTGATCCTCGTTGTAGGGCTAAACTAGGTGTGACTTGCTTTTCCATTAAGGACTGTAGCCATTTTGGCTAAGAAAGTCTTTCCTGTCTTAGCTCTCTTCAAGAGATGCTATTTACTTTTTTGTTGTTGTTTTCTCCGGAGCTTTATTGCCTACCCTTTATTTTCACGATGTGTTTGTGCATTCTGTAAAAAGTGGGAAACACTGTTCTCCGGATTGTGTGGGTGATCGCCGGTCGCCTAGCTTGCCGTTCTTCAGGTATCTCCTGCTGCTCCAGAATCTACATCTGAATGTCAAGGCATAGCTTTTCCAGGAGCTTTTAAACCGACCTTTCAATTCGAAGACGTAACTGCGCCAGGAGCTTTGTCTCCCTGGCATATAAAAGCATAGAAGAGAGCAACTTCTGGTTTTTAAAATAAGTAAACTAATCTGAATTGTTTGCAATGGTAGGAACTTGTTATATAAAATGTTAATTAGGTGGCCCGTGCTCGAAAACTGCTCTCAGGATATGACCAATGGGAGAGTAGACCTAAGCTCCTTCATTTGCATGCAGA
SEQ ID NO:4は、以下に示される:
AGTTGTTTGTTAAATAGGTTTTTATTTTAATTTTTTAAAAAATATTTTTATTAGTTAGAYGGAATATTTATTTTTGATTTTYGTTGTAGGGTTAAATTAGGTGTGATTTGTTTTTTTATTAAGGATTGTAGTTATTTTGGTTAAGAAAGTTTTTTTTGTTTTAGTTTTTTTTAAGAGATGTTATTTATTTTTTTGTTGTTGTTTTTTTYGGAGTTTTATTGTTTATTTTTTATTTTTAYGATGTGTTTGTGTATTTTGTAAAAAGTGGGAAATATTGTTTTTYGGATTGTGTGGGTGATYGTYGGTYGTTTAGTTTGTYGTTTTTTAGGTATTTTTTGTTGTTTTAGAATTTATATTTGAATGTTAAGGTATAGTTTTTTTAGGAGTTTTTAAATYGATTTTTTAATTYGAAGAYGTAATTGYGTTAGGAGTTTTGTTTTTTTGGTATATAAAAGTATAGAAGAGAGTAATTTTTGGTTTTTAAAATAAGTAAATTAATTTGAATTGTTTGTAATGGTAGGAATTTGTTATATAAAATGTTAATTAGGTGGTTYGTGTTYGAAAATTGTTTTTAGGATATGATTAATGGGAGAGTAGATTTAAGTTTTTTTATTTGTATGTAGA
1、乳がんの検出と分析
病院から得られた乳がんを診断されたサンプルから、ランダムに8つの乳がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
上記のサンプルのDNAを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドPCR、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、CpGサイトのメチル化値を分析・計算した。
図5に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるCTSM-2BEのメチル化は、乳がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、乳がんにおけるCTSM-2BEは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた乳がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
病院から得られた頭頸部腫瘍を診断されたサンプルから、ランダムに6つの頭頸部腫瘍サンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
上記のサンプルのDNAを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドPCR、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、CpGサイトのメチル化値を分析・計算した。
図6に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるCTSM-2BEのメチル化は、頭頸部腫瘍サンプルのメチル化よりも有意に低かったが、頭頸部腫瘍におけるCTSM-2BEは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた頭頸部腫瘍マーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
病院から得られた肺がんを診断されたサンプルから、ランダムに8つの肺がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
上記のサンプルのDNAを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドPCR、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、CpGサイトのメチル化値を分析・計算した。
図7に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるCTSM-2BEのメチル化は、肺がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、肺がんにおけるCTSM-2BEは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた肺がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
病院から得られた膵臓がんを診断されたサンプルから、ランダムに8つの膵臓がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
上記のサンプルのDNAを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドPCR、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、CpGサイトのメチル化値を分析・計算した。
図8に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるCTSM-2BEのメチル化は、膵臓がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、膵臓がんにおけるCTSM-2BEは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた膵臓がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
一、検出配列に対する説明
この実施例では、SEQ ID NO:5に示されるCTSM-3C腫瘍マーカーの配列を提供し、ただし、ボックスによって示される塩基は潜在的なメチル化CpGサイトである。最適な検出領域は中央の下線が引かれた領域である。
SEQ ID NO:5は、以下に示される:
TGGGGCAACTCATCCAATAAGATTGTCTAGTAATGAACCAATCAGTCTGGTCACTCTTCAGCCAATGATTTTATCGCGCGGGACTTTTGAAATATTACAGGACCAATCAGAATGTTTCTCACTATATTTAAAGGCCACTTGCTCTCAGTTCACTACACTTTTGTGTGTGCTCTCATTGCAAATGGCTCGTACGAAGCAAACAGCTCGCAAGTCTACCGGCGGCAAAGCTCCGCGCAAGCAGCTTGCTACTAAAGCAGCCCGTAAGAGCGCTCCGGCCACCGGTGGCGTGAAGAAACCTCATCGCTACCGCCCGGGCACCGTGGCCTTGCGCGAAATCCGTCGCTACCAGAAGTCCACCGAGCTGCTGATCCGGAAGCTGCCGTTCCAGCGCCTGGTGCGAGAAATCGCCCAGGACTTCAAAACCGACCTGCGTTTCCAGAGCTCTGCGGTGATGGCGCTGCAGGAGGCTTGTGAGGCCTACCTGGTGGGACTCTTCGAAGACACCAATCTGTGCGCTATTCACGCTAAACGCGTCACCATCATGCCCAAAGATATCCAGCTGGCACGTCGCATCCGTGGGGAAAGGGCATAAGTCTGCCCGTTTCTTCCTCATTGAAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACTCACAATTTCACTTAAAAACAGTTGTAACCCA
SEQ ID NO:6は、以下に示される:
TGGGGTAATTTATTTAATAAGATTGTTTAGTAATGAATTAATTAGTTTGGTTATTTTTTAGTTAATGATTTTATYGYGYGGGATTTTTGAAATATTATAGGATTAATTAGAATGTTTTTTATTATATTTAAAGGTTATTTGTTTTTAGTTTATTATATTTTTGTGTGTGTTTTTATTGTAAATGGTTYGTAYGAAGTAAATAGTTYGTAAGTTTATYGGYGGTAAAGTTTYGYGTAAGTAGTTTGTTATTAAAGTAGTTYGTAAGAGYGTTTYGGTTATYGGTGGYGTGAAGAAATTTTATYGTTATYGTTYGGGTATYGTGGTTTTGYGYGAAATTYGTYGTTATTAGAAGTTTATYGAGTTGTTGATTYGGAAGTTGTYGTTTTAGYGTTTGGTGYGAGAAATYGTTTAGGATTTTAAAATYGATTTGYGTTTTTAGAGTTTTGYGGTGATGGYGTTGTAGGAGGTTTGTGAGGTTTATTTGGTGGGATTTTTYGAAGATATTAATTTGTGYGTTATTTAYGTTAAAYGYGTTATTATTATGTTTAAAGATATTTAGTTGGTAYGTYGTATTYGTGGGGAAAGGGTATAAGTTTGTTYGTTTTTTTTTTATTGAAAAGGTTTTTTTTAGAGTTATTTATAATTTTATTTAAAAATAGTTGTAATTTA
1、結腸直腸がんの検出と分析
病院から得られた結腸直腸がんを診断されたサンプルから、ランダムに9つの結腸直腸がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
病院から得られた頭頸部がんを診断されたサンプルから、ランダムに5つの頭頸部がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
病院から得られた肺がんを診断されたサンプルから、ランダムに6つの肺がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
一、検出配列に対する説明
この実施例では、SEQ ID NO:7に示されるCTSM-4I腫瘍マーカーの配列を提供し、ただし、ボックスによって示される塩基は潜在的なメチル化CpGサイトである。最適な検出領域は中央の下線が引かれた領域である。
SEQ ID NO:7は、以下に示される:
TACCCATAAAAGAAAGCTGCCATCACAGGCAGCAGACCTTTGTTCTCTGACCACTTGATAATGTCAGGACGCGGCAAAGGAGGTAAGGGCCTGGGGAAAGGGGGTGCCAAGCGCCACCGCAAGGTGCTGCGCGACAACATCCAGGGTATCACCAAGCCAGCCATTCGGCGCCTTGCTCGCCGCGGCGGCGTGAAGCGCATTTCTGGCCTCATCTATGAGGAGACCCGCGGAGTGTTGAAGGTGTTCCTGGAGAACGTGATCCGGGACGCCGTGACCTACACGGAGCACGCCAAGCGCAAGACGGTCACCGCCATGGACGTGGTCTACGCGCTCAAGCGCCAGGGCCGCACCCTCTATGGCTTCGGCGGCTAAAT
SEQ ID NO:8は、以下に示される:
TATTTATAAAAGAAAGTTGTTATTATAGGTAGTAGATTTTTGTTTTTTGATTATTTGATAATGTTAGGAYGYGGTAAAGGAGGTAAGGGTTTGGGGAAAGGGGGTGTTAAGYGTTATYGTAAGGTGTTGYGYGATAATATTTAGGGTATTATTAAGTTAGTTATTYGGYGTTTTGTTYGTYGYGGYGGYGTGAAGYGTATTTTTGGTTTTATTTATGAGGAGATTYGYGGAGTGTTGAAGGTGTTTTTGGAGAAYGTGATTYGGGAYGTYGTGATTTATAYGGAGTAYGTTAAGYGTAAGAYGGTTATYGTTATGGAYGTGGTTTAYGYGTTTAAGYGTTAGGGTYGTATTTTTTATGGTTTYGGYGGTTAAAT
1、乳がんの検出と分析
病院から得られた乳がんを診断されたサンプルから、ランダムに4つの乳がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
病院から得られた結腸直腸がんを診断されたサンプルから、ランダムに5つの結腸直腸がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
病院から得られた頭頸部がんを診断されたサンプルから、ランダムに6つの頭頸部がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
病院から得られた肺がんを診断されたサンプルから、ランダムに7つの肺がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
Claims (14)
- 腫瘍検出用の試薬又はキットの調製における、単離されたポリヌクレオチドの使用であって、
前記腫瘍は、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、及び頭頸部腫瘍を含み、
前記単離されたポリヌクレオチドは、
(a) SEQ ID NO:1に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
(e) 前記(a)のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在するものと、及び/又は
(f)前記(a)のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸であって、かつその中に少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在するものと、
を含むことを特徴とする使用。 - 前記修飾は、5-メチル化修飾、5-ヒドロキシメチル化修飾、5-ホルミル化修飾又は5-カルボキシル化修飾を含むことを特徴とする請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。
- 単離されたポリヌクレオチドの使用において、
単離されたポリヌクレオチドは、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドから転換され、請求項1の配列と対応し、修飾されたCpGサイトのシトシンCが変化せず、未修飾のシトシンがTに転換することを特徴とする請求項1又は2に記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。 - 請求項3に記載の単離されたポリヌクレオチドは、
(g) SEQ ID NO:2に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
(k) 前記(g)のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在するものと、
を含むことを特徴とする請求項3に記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。 - 請求項1~4のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、該標的配列を特異性的に検出する検出試薬をデザインすることを含む腫瘍検出試薬を調製する方法であって、
前記腫瘍は、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、及び頭頸部腫瘍を含み、
前記標的配列には、少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在し、
前記腫瘍検出試薬は、プライマーを含み、前記プライマーは、SEQ ID NO: 9~12に示されたプライマーである、
調製する方法。 - 前記検出試薬が、プローブを含む、請求項5に記載の調製する方法。
- 腫瘍検出用のキットの調製における、試薬又は組み合わせた試薬の使用であって、
前記腫瘍は、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、及び頭頸部腫瘍を含み、
標的配列を特異的に検出し、前記標的配列は、請求項1~4のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントであり、
少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在し、
前記試薬は、プライマーを含み、前記プライマーは、SEQ ID NO: 9~12に示されたプライマーである、
ことを特徴とする試薬又は組み合わせた試薬の使用。 - 前記検出試薬が、プローブを含む、請求項7に記載の試薬又は組み合わせた試薬の使用。
- 前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、前記標的配列が、SEQ ID NO: 1の240~296位のヌクレオチドのフラグメントを含むことを特徴とする請求項7または8に記載の試薬又は組み合わせた試薬の使用。
- 腫瘍検出用の検出キットであって、
前記腫瘍は、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、及び頭頸部腫瘍を含み、
容器、及び容器に位置する請求項7~9のいずれか一つに記載の試薬又は組み合わせた試薬
を含むことを特徴とする検出キット。 - 腫瘍検出に用いられる、請求項1に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントのメチル化プロファイルを検出する方法であって、
前記フラグメントは、その中に少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在するものであり、
前記腫瘍は、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、及び頭頸部腫瘍を含み、
(i)試料を提供し、DNAを抽出するステップと、
(ii)その中の未修飾のシトシンがウラシルに転化するように、検出しようとする試料を処理するステップと、
(iii)(ii)で処理されたゲノムDNAにおける請求項2又は3に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントの修飾状況を分析するステップと、
を含むことを特徴とする生体外で試料における請求項1に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントのメチル化プロファイルを検出する方法。 - 前記修飾が、5-メチル化修飾、5-ヒドロキシメチル化修飾、5-ホルミル化修飾又は5-カルボキシル化修飾を含む、請求項11に記載の検出する方法。
- バイサルファイトでステップ(i)に記載のDNAを処理する、請求項11または12に記載の検出する方法。
- ステップ(iii)には、前記分析の方法が、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、qPCR法、次世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、DNA濃縮検出法、Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)技術、HPLC法、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項11~13のいずれか一つに記載の方法。
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