CN104450872A

CN104450872A - 一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法

Info

Publication number: CN104450872A
Application number: CN201310444865.2A
Authority: CN
Inventors: 余坚; 高维强; 赵仰星; 孙晋枫; 张红宇; 顾峻; 何英华; 王韦
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明涉及一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法。本发明还提供了适用于进行人基因组CpG甲基化水平测序的BSP引物。本发明的方法适用于微量样品的基因组DNA检测，本发明的方法不仅可实现高通量检测，而且检测效率高、成本低廉，并能与最新高通量测序技术衔接。

Description

一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学的DNA甲基化分析领域；更具体地，本发明涉及一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法。

背景技术

DNA序列改变以外的调控机制异常在肿瘤的发生、发展过程中更为普通和重要，这种不依赖于DNA序列变化的可遗传的调控机制被称为表观遗传学机制，包括组蛋白乙酰化、DNA甲基化、MicoRNA、非编码长RNA等。其中以DNA甲基化研究最为深入，无论在针对个别基因、还是在新兴的全基因组学层面以及功能调控领域都被广泛研究，并且在肿瘤临床实践的诊断和治疗中的DNA甲基化的应用前景也受到了很大的重视。在肿瘤细胞中，一些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的基因呈现出高甲基化的状态并转录失活，受累基因包括抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期控制基因和抗凋亡基因等，由此促进了肿瘤的发生发展。DNA甲基化的研究不仅可以从新的角度使人们进一步了解肿瘤的发生发展机制，肿瘤细胞DNA呈现出的异常甲基化谱式已经成为一个新的肿瘤生物标志物的研究领域，而且由于DNA甲基化修饰的可逆性，使其也具有成为分子治疗靶点的可能。

当今DNA甲基化研究的主要方法分为全基因层面和基因层面。在全基因组层面包括以DNA杂交为基础的芯片技术，有用特定蛋白富集基因组中甲基化DNA片段后再与芯片杂交的CHIP-chip技术和将基因组DNA进行亚硫酸修饰后与芯片杂交的methylation array技术；以高通量为基础的下一代测序技术，其中同样包括用特定蛋白富集基因组中甲基化DNA片段后进行测序的方法如MethylCap-seq、MeDIP-seq和将基因组DNA进行亚硫酸修饰后进行高通量测序的方法如Genome-wide Bisulfite-seq、Reduced Representation BisulfiteSequencing(RRBS)。需要说明的是只有Genome-wide Bisulfite-seq、ReducedRepresentation Bisulfite Sequencing(RRBS)这2种方法是单碱基分辨率的DNA甲基化检测方法，其他组学研究方法都需后续的单基因单位点层面的甲基化状况检测验证。在特定基因层面的检测方法包括以PCR(聚合酶链式反应)为基础对特定DNA序列的MSP(甲基化特异性PCR)、qMSP(荧光定量甲基化特异性PCR)、MSRE-qPCR(甲基化敏感内切酶酶切定量PCR)；以测序为基础的BSP(亚硫酸处理PCR产物测序)、焦磷酸测序。以PCR为基础的技术方法简便，但仅对引物或探针退火的几个CpG(CG二核苷酸)位点进行检测。焦磷酸测序一个反应只能对60bp左右的特定序列中的CpG位点进行甲基化检测，检测1个样本需200元，当需检测大样本受检样本和多区域甲基化水品时，价格极其昂贵，如需检测100个样本中5个区域的甲基化水平，大致费用为：100*5*200=10万元。而BSP方法是最为常用的特定位点单碱基分辨率的甲基化检测，可对500bp内的PCR产物中的多个CpG检测，但一个PCR反应只能检测一个样品的一个特定位点，且需对PCR产物进行复杂的连接克隆转化，并对克隆进行5个以上的一代测序(每个测序成本最少30元)，无法进行多样本多位点的甲基化检测，特别是微量DNA样本的多特定位点甲基化检测，当检测大样本，多区域甲基化水平时，同样价格昂贵，同样如需检测100个样本中5个区域的甲基化水平，大致费用为：100*5*5*30=75,000元。

综上所述，当今的甲基化组学研究都需要在后续的试验中，在多样本(临床样本或细胞样本)中对批量的来自于甲基化组学中特定位点进行验证，但上述的基因层面的技术都无法胜任这种多样本多位点的高通量单碱基分辨率甲基化检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法。

在本发明的第一方面，提供一种高通量检测目的基因组的甲基化水平的检测方法，所述方法包括：

(1)提取n个受试样本的目的基因组DNA；其中n为≥10的正整数(较佳地，n为10-500的正整数；如15，20，50，100，140，150，200，300，400)；

(2)对来自n个受试样本的目的基因组DNA分别用重硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理，分别获得n种处理产物；

(3)分别以(2)的n种处理产物为模板，分别用BSP引物组扩增含有CpG位点的序列，获得一一对应每一受试样本的n种扩增产物；

(4)分别提供种(较佳地，当为整数时，提供种)Illumina Index adapter正向接头和相同数量反向接头，每一正向接头和一反向接头编成一组，形成个不同组(较佳地，当为整数时，形成n个不同组)；选择其中的n个组，每组中对正向接头与反向接头退火形成双链Illumina Index adapter，获得的n组退火形成双链Illumina Index adapter与(3)获得的n种扩增产物分别连接；获得各自连接有不同组的接头的n种连接产物；

(5)将(4)中获得的各自连接有不同组的接头的n种连接产物进行混合，用针对Illumina Index adapter接头的引物序列进行PCR扩增，进行高通量测序。

在本发明的另一方面，提供一种构建用于高通量检测目的基因组的甲基化水平的多样本文库的方法，所述方法包括：

(1)提取n个受试样本的目的基因组DNA；其中n为≥10的正整数(较佳地，n为5-500的正整数；如10，20，50，100，140，150，200，300，400)；

(3)分别以(2)的n种处理产物为模板，分别用BSP引物组扩增含有CpG位点的序列，获得一一对应每一受试样本的n种扩增产物；所述的BSP引物组的各引物中设置可与Illumina Index adapter接头连接的序列；

(5)将(4)中获得的各自连接有不同组的接头的n种连接产物进行混合，用针对Illumina Index adapter接头的引物序列进行PCR扩增，获得的扩增产物即为多样本文库。

在一个优选例中，前述两种方法能实现高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测。

在另一优选例中，所述的目的基因组是人基因组，也可延伸到其它物种，如哺乳动物、微生物、植物。

在另一优选例中，所述的BSP引物包括上下游引物，根据CpG位点序列两端的非CpG位点区域设计，但允许存在简并碱基。

在另一优选例中，步骤(3)和步骤(4)之间，还包括对步骤(3)获得对扩增产物分别进行纯化的步骤。

在另一优选例中，步骤(5)中，PCR扩增后还包括纯化的步骤，之后再进行测序。

在另一优选例中，步骤(5)中，PCR扩增优选应用热启动高保真的Taq酶。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述的BSP引物组包括SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:60的序列。

在另一优选例中，步骤(3)中，根据SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:60的引物的退火温度，分成多个PCR扩增系统，分别进行扩增；较佳地，SEQ ID NO:1～SEQID NO:22的引物退火温度52℃，在一个PCR扩增系统中扩增；SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:50的引物退火温度54℃，在一个PCR扩增系统中扩增；SEQ ID NO:51～SEQ ID NO:60的引物退火温度60℃，在一个PCR扩增系统中扩增。

在另一优选例中，n为小于144的正整数，步骤(4)中，所述的Illumina Indexadapter正向接头的核苷酸序列如SEQ ID NO:61～SEQ ID NO:72所示；所述的Illumina Index adapter反向接头的核苷酸序列如SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:84所示。

在另一优选例中，所述的步骤(3)的扩增产物的3’末端包括A突出，所述的Illumina Index adapter正向接头的3’末端设计为T突出，它们存在配对互补；并且，所述的Illumina Index adapter正向接头的3’末端T上游的碱基与反向接头的5’末端碱基具有相互配对的8-16对碱基，从而发生互补配对。

在另一优选例中，步骤(5)中，运用Illumina solexa，SOLID，Ion Torrent或454方法测序。

在另一优选例中，所述的方法为非疾病诊断方法；该方法并非以获得疾病诊断结果或健康状况为直接目的；也即：根据现有技术中的医学知识和该本发明公开的内容，还不能够直接获得疾病的诊断结果或健康状况。

在本发明的另一方面，提供一种用于高通量检测目的基因组的甲基化水平的检测试剂盒，所述试剂盒中包括：SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:60的BSP引物。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：

SEQ ID NO:61～SEQ ID NO:72所示的Illumina Index adapter正向接头；和

SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:84所示的Illumina Index adapter反向接头。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：重硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：DNA抽提试剂；荧光定量PCR检测试剂；PCR扩增试剂；PCR纯化试剂；和/或DNA连接试剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、高通量多样本多特定区域甲基化水平检测方法流程示意图，图中核酸链应为双链。图中的重硫酸盐也可以替换为重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐。

图2、重硫酸盐扩增产物与接头标签连接示意图。其中，标签序列即Index序列。Illumina Index adapter由Illumina公司测序引物序列-标签序列-Illumina公司测序引物序列T构成。

图3、各待检样本多区域BSP产物与Index adapter连接后电泳，箭头所指为正确分子量连接产物。

图4、各待检样本BSP-Index adapter连接产物，经测序引物扩增后电泳图。

具体实施方式

鉴于现有技术中无法提供一种准确、高效的高通量测定基因组甲基化水平的技术现状，本发明人经过研究和探索，提供了一种可对多样本多特定位点进行单碱基分辨率甲基化检测的高通量方法；本发明的方法适用于微量样品的基因组DNA检测，优选是微量纳克级的基因组DNA，更优选的是30～100ng的基因组DNA。本发明还提供了适用于进行人基因组CpG甲基化水平测序的BSP引物。本发明的方法不仅可实现高通量检测，而且检测效率高、成本低廉，并能与最新高通量测序技术衔接。

BSP检测技术

亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR，BSP)方法是检测基因甲基化的经典方法，其原理为：用亚硫酸氢盐修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理多核苷酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的多核苷酸多态性(SNP)。基因组DNA经亚硫酸盐处理后，以本发明所述的BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T)，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。

然而，传统的BSP检测方法具有很大的局限，无法实现多样本的同时检测。

用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理，将未甲基化的C碱基转变为U碱基，而甲基化的C碱基不变，从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异，所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意：(1)引物设计不能含有CpG位点，以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异；(2)引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点，BSP扩增片段长度可在100-200bp。

本发明的方法在常规的BSP(亚硫酸处理PCR产物测序)方法基础上，进行了以下创新：(1)设计了适用于高通量检测的BSP引物；(2)引入Illumina公司常规建库标签，对每一个被测样品单独BSP反应产物经纯化处理后加上Illumina测序接头，同时加上双端标签序列以区分被测样品。(3)混合所有加上标签的BSP产物，纯化后进行Illumina公司二代高通量双端测序。该方法的流程示意图如图1。

本发明设计的BSP引物，适用于针对多个特定位点同时进行扩增检测。本发明人在设计BSP引物时，注重退火温度(TM)设定的均一化，尽量使得多对引物在进行单一被检样本BSP扩增时置入同一反应管中，实现在一个BSP反应中同时扩增多个不同位点DNA序列。当被检测区域较多，本发明人将诸多引物按照若干种退火温度进行归类，每种温度包含多个监测区域的BSP引物，分别扩增，扩增结束后混合产物。

作为本发明的优选方式，运用SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:60作为BSP引物。分析上述引物的退火温度，本发明人将之分成多个PCR扩增系统，分别进行扩增。更佳地，SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22的引物退火温度52℃，在一个PCR扩增系统中扩增；SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:50的引物退火温度54℃，在一个PCR扩增系统中扩增；SEQ ID NO:51～SEQ ID NO:60的引物退火温度60℃，在一个PCR扩增系统中扩增。

此外，本发明与现有常规BSP技术相比，还具有以下明显技术效果：(1)传统BSP方法只能每次检测一个样品中的一个位点中的甲基化状况，如需对多个特定位点进行甲基化检测时，就需要进行多次BSP反应。其操作繁琐和对微量DNA的样本无法进行反复多次甲基化检测，而本发明的技术方案：单反应管多个BSP引物同时针对多个待检测特定位点，很好的解决了这问题。(2)传统BSP都需对每个样品的每个BSP产物进行纯化、载体连接，转化、鉴定，再分别进行5到10个克隆的普通测序，当面对大批量待检样品和多特定区域甲基化检测时，其操作繁琐和成本昂贵缺点显露无疑。而本发明的一种技术方案中：对每一个样本多位点BSP产物双端分别加上标签，少量的标签序列就能区分大量的被检测样本，如12×12=144，即用24条标签就能区分144个被检测样本，利用Illumina公司2代高通量双端测序的大数据量测序结果，结合前面的单反应多位点BSP，将加上标签的BSP产物混合，就可一次测序而得到大量样本、大量特定位点的甲基化状况，且每个位点测序次数远远大于普通BSP的10次。高效，节约样本，高通量，可靠的甲基化信息结果是本发明的最大优点。(3)甲基化水平检测成本较低，如前所言，当同样检测100个样本中5个区域的甲基化水平时，检测60bp区域，焦磷酸测序需要最低成本10万元；而BSP克隆测序虽然成本较低，检测300bp区域需7.5万元，但其每个待检样本每个待检区域的有效覆盖度(有效测序次数)仅5次；而本发明方法优选应用二代测序中Illumina公司的Solexa，现该测序普通成本为8000元得到2G的测序数据，如果本发明人检测100个样本中5个区域的甲基化水平，采用双端100bp，测序数据4G，加上Index接头合成成本，总费用大致2万元，但每个待检样本每个待检区域的平均有效覆盖度(测序次数)达到400次，即使有效率50%，其覆盖度也远远大于前2项技术。

本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：

步骤A：目的基因组DNA抽提纯化

目的基因组是人，也可以是其它物种，包括植物例如拟南芥、水稻；哺乳动物例如人、小鼠；微生物、昆虫例如果蝇，DNA抽提方法可以使用传统的手工抽提和商品化的抽提试剂盒。

步骤B：基因组DNA经重亚硫酸盐(或重硫酸盐、亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐)处理转化

将步骤A所取得的基因组DNA用重亚硫酸盐处理，优选Qiagen重亚硫酸盐处理试剂盒，从而即使非甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，也保护了基因组DNA的完整性，使其避免降解成小分子量的DNA。如果同时检测多个样本，要用Q-PCR反应校正均一化各样本DNA量。

步骤C：单样本单次反应多特定基因扩增

对待检测的基因组上多个位点(区域)，以重亚硫酸盐处理转化后基因组序列为模板设计BSP引物，该上下游引物应避免含有CpG序列，但允许存在简并碱基。在一个PCR反应管中加入步骤B的产物做为模板，加入多个待检测位点BSP混合引物，加入热启动Taq酶系统，置入PCR扩增仪，进行扩增。

步骤D：单样本单次反应多特定基因扩增产物纯化，与含有标签(Index)序列的测序接头连接。

被检测样本经步骤C所得到的产物，经用优选2%的琼脂糖电泳分离切胶纯化，因为步骤C为PCR产物，其3’末端为A突出，与特别设计退火后的含有标签(Index)序列的测序接头连接(其设计为T突出)。每个待检测样本与唯一一种含有标签(Index)序列的测序接头连接，以区分样本。

步骤E：连接产物混合后PCR扩增成库并切胶纯化

因为已经对BSP产物加上了区分样本标签的测序接头，所以将步骤D所得产物混合，用针对测序接头的引物序列进行PCR扩增，PCR扩增优选热启动高保真的Taq酶，扩增产物经用优选2%的琼脂糖电泳分离，选取目标分子量电泳产物切胶纯化，所得产物即待测序的文库。

步骤F：对步骤E所获产物进行第二代高通量测序

本发明的一个具体实施方式中，使用的是第二代高通量测序(Illuminasolexa)，但不限于此，还包括SOLID，Ion Torrent，454等。

本发明公开了一种多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化检测方法。本发明提供的方法提供了对每个样本的不同BSP(亚硫酸测序PCR)产物用标签序列(index)与其他样本区分，最终混合多个带有特异标签样本的多个不同BSP产物，形成扩增子文库，经高通量二代测序，即可根据Index区分不同样本，根据BSP引物区分不同靶点，达到多样本多靶点单碱基分辨率甲基化率检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

使用此方法，本发明人以140个人外周循环血基因组DNA(40ng)样品，选30个特定区域(100bp左右，分别包含6到15个CpG不等)进行单碱基甲基化水平的检测。主要实验试剂如下：

1、DNA抽提

共140例受试人群，每人取外周血抗凝血浆400ul，用微量DNA抽提试剂盒(Tiangen)抽提游离DNA，最终溶解于30ul TE(Tris-EDTA)缓冲液中，用DNA定量仪Qubit(Invitrogen)，对每例DNA定量。

2、DNA重亚硫酸盐处理

按Qubit定量结果，140例DNA样本中的每例受试样本取相同量DNA，本次为20ng，并加入TE缓冲液至体积40ul。DNA重亚硫酸盐处理使用EpiTect bisulfateKIT(Qiagen)，按说明书操作，处理后最终溶解于25ul洗脱液中。

3、样品浓度均一化

对上述亚硫酸处理后样品，使用GAPDH的BSP引物，Sybgreen PCR预混系统(Tiangen)，进行实时荧光定量PCR检测，确定每个样品的Ct值，根据Ct值稀释样品，使140例的各受试样本亚硫酸处理后DNA模板均一化。

4、单受检样本多区域同时扩增及检测

设计待检区域BSP引物，尽量把多个受检区域的BSP引物退火温度设计为相同的温度，以便在一个反应管中同时扩增多个受检区域。如果受DNA序列限制，可将多个受检区域的BSP引物退火温度设计为几个，分别扩增后，将BSP产物混合。根据反复研究和验证，最终确定的引物如表1。

表1

以140例的各受试样本亚硫酸处理后的DNA为模板，分别进行扩增。本实施方式中，由于待检样本的微量，将退火温度分为52℃(包括11个受检区域)、54℃(包括14个受检区域)、60℃(包括5个受检区域)。根据引物的不同退火温度，将相同退火温度的引物混合形成一个扩增系统，但每一引物是2.5pmol/ul(或2.5uM)。

PCR反应条件如下：

扩增结束后，混合每个待检样本的3个温度PCR产物，取1ul、1:5000稀释，以单独的30个受检区域的BSP引物检测稀释后产物，以确定每一个受检区域的扩增成功与否。

鉴定完毕后，用PCR纯化试剂盒(Axygen)纯化每个待检样本的扩增产物。

5、连接含标签的测序接头和割胶纯化接头和扩增子连接后产物

将含有Index的Illumina Index adapter寡核苷酸(见表2)用TE缓冲液溶解于100uM，分别取10ul置0.25ul PCR管中，12×12配对形成144组独立接头(针对140例待测样本)，将PCR管置于PCR扩增仪上，启动退火程序：95，10min；10sec/循环，-0.1℃/循环，重复750个循环；降温至20℃，得到50uM的共20ul部分退火形成双链的Illumina Index adapter。

表2、双端高通量测序的相关序列(5’→3’)，粗体序列为Index序列

表中，Illumina Index adapter a1～a12为正向序列(正向接头寡核苷酸)，Illumina Index adapter b1～b12为反向序列(反向接头寡核苷酸)。

待检样本扩增产物分别与Illumina Index adapter连接：

待检样本扩增产物分别与Illumina Index adapter连接的示意图如图2所示。连接后，将Illumina Index adapter接头和待检样本扩增产物连接后产物在4%的琼脂糖上进行电泳(见图3)，分离未连接接头，割取含正确分子量的连接产物，用凝胶回收纯化试剂盒回收正确分子量连接产物，最终溶解于30ul TE中。

6、待检样本扩增子分别PCR扩增

应用Illumina扩增引物对待检样本扩增子分别PCR扩增，

Illumina扩增引物序列如下：

PCR-amplyf-f：5'-AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO:85)；

PCR-amplyf-r：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO:86)。

扩增方法如下：

PCR反应条件

7、扩增子文库质控检测和多样本扩增子混合成为扩增子文库

取步骤6扩增后产物5ul，在4%的琼脂糖凝胶中电泳，鉴定扩增产物分子量正确性，和各样本产物浓度见(图4)。

使用ImageJ软件，定量各待检样本的扩增产物，以此为结果，每个待检样本取同样量的步骤6扩增产物，混合。

混合后产物使用PCR纯化试剂盒(Axygen)进行纯化，去除PCR扩增体系，最终溶解于TE中，50ng/ul，总量5ug。

8、扩增子文库高通量测序

将步骤7产物送公司进行读长100bp，双端高通量测序(IlluminaHiSeq2500)。

9、测序后结果分析

数据预处理和质控见表3。

a、去除总体质量偏低的reads，将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除；

b、去除3’端质量Q低于20的碱基；

c、去除reads中所含有的接头序列最短接头匹配10bp；

d、去除长度小于20bp的测序reads。

表3

与30个目标检测区域序列mapping比对。

应用bismark(bismark版本：0.7.7；bowtie2版本：2.0.5)进行mapping。

部分结果(前70个待检样本)见表4。

总测序数：经过归类Index标签后，单个待检样本在30个受检区域总测序次数。

有效测序数：经过与30个目标检测区域序列mapping比对后测序结果符合的测序次数。

有效率：与目标区域序列符合的测序比率。

待检区域平均测序数：30个待检区域中平均每一待检区域测序覆盖总数。

待检区域平均有效测序数：30个待检区域中平均每一个待检区域与目标区域序列符合测序覆盖总数。

表4

单个样品多个区域中每一个CpG位点甲基化率结果(见表5)。

表5

以上结果可以看出，本发明的方法可以在单碱基水平上对不同的受检区域多样本同时进行甲基化水平检测，可以对不同分组的临床样本中的多个特定区域的甲基化检测和比对。虽然不同受检区域的测序覆盖度并不均一，范围从10²-10⁶，导致该结果是由于起始多引物扩增时的不均一性造成，但即使是最少的区域的覆盖度也大于普通BSP方法的甲基化克隆测序检测，具有良好的检测准确性。

并且，本发明的方法设计了一系列BSP引物，可全面地获得基因组中很多个CpG位点的甲基化信息，实现高通量、完整的检测。

尽管本发明的具体实施方式得到了详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对某些细节进行修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求极其任何等同物列出。

Claims

1.一种高通量检测目的基因组的甲基化水平的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提取n个受试样本的目的基因组DNA；其中n为≥10的正整数；

(4)分别提供种Illumina Index adapter正向接头和相同数量反向接头，每一正向接头和一反向接头编成一组，形成个不同组；选择其中的n个组，每组中对正向接头与反向接头退火形成双链IlluminaIndex adapter，获得的n组退火形成双链Illumina Index adapter与(3)获得的n种扩增产物分别连接；获得各自连接有不同组的接头的n种连接产物；

2.一种构建用于高通量检测目的基因组的甲基化水平的多样本文库的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提取n个受试样本的目的基因组DNA；其中n为≥10的正整数；

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的BSP引物组包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:60的序列。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，根据SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:60的引物的退火温度，分成多个PCR扩增系统，分别进行扩增；

较佳地，SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22的引物退火温度52℃，在一个PCR扩增系统中扩增；SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:50的引物退火温度54℃，在一个PCR扩增系统中扩增；SEQ ID NO:51～SEQ ID NO:60的引物退火温度60℃，在一个PCR扩增系统中扩增。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，n为小于144的正整数，步骤(4)中，所述的Illumina Index adapter正向接头的核苷酸序列如SEQ ID NO:61～SEQ ID NO:72所示；

所述的Illumina Index adapter反向接头的核苷酸序列如SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:84所示。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，运用Illuminasolexa，SOLID，Ion Torrent或454方法测序。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的方法为非疾病诊断方法。

8.一种用于高通量检测目的基因组的甲基化水平的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:60的BSP引物。

9.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

SEQ ID NO:61～SEQ ID NO:72所示的Illumina Index adapter正向接头；和SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:84所示的Illumina Index adapter反向接头；或

所述试剂盒中还包括：重硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐。

10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

DNA抽提试剂；

荧光定量PCR检测试剂；

PCR扩增试剂；

PCR纯化试剂；和/或

DNA连接试剂。