KR20170039918A - Dmr를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DMR(differentially methylated region)을 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 특정 유전자의 발현량과 게노믹 DNA의 메틸화 차이에 의한 프로파일을 활용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 따르면, 돼지의 산자수를 저비용으로 단기간에 효과적으로 예측하고, 산자수가 우수한 돼지의 계통을 제공할 수 있다.

Description

DMR를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법{Composition and method for prediction of swine fecundity using genomic differentially methylated region}

본 발명은 DMR(differentially methylated region)을 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 특정 유전자의 발현량과 게노믹 DNA의 메틸화 차이에 의한 프로파일을 활용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법에 관한 것이다.

돼지의 산자수는 다른 형질에 비하여 매우 높게 평가되지만, 상대적으로 유전력이 낮고, 기술적 한계가 있어 개량이 쉽게 이루어지지 못하고 있다. 산자수는 매우 복잡한 형질로서 배란율, 초기 배아의 생존율, 태아의 생존율, 자궁의 용량과 능력, 젖꼭지 수 등의 다양한 형질에 의해서 결정되는 지수이다.

산자수를 증대시키기 위해서 적합한 영양공급과 암퇘지의 관리, 유전적 요소 등에 노력을 기울이고 있는데 유전학적 선발은 다산능을 가진 암퇘지를 생산하는데 크게 기여하고 있다. 암퇘지 개량은 주로 번식 능력과 모돈의 강건성에 주안점을 두어 개량하며, 그 주요 항목은 산자수, 포유개시두수, 생시체중, 21일령 복당체중, 21일령 육성수 등이다.

기존의 산자수 육종 방법은 생산성 및 품질 개선과 관련된 육종 기술 분야가 대부분이며, 이러한 육종기술은 장기적이고 고비용이라는 단점이 있기 때문에 돼지의 산자수 증대기술의 개발은 현재 전무한 상황이다.

최근에는 산자수와 이유두수 개량을 위한 돼지 산자능력 검정 사업의 중요성이 재인식되고 있다. 이에 국내는 물론 유럽에서도 산자수가 많은 모돈의 집단을 만들어 그 집단에서 계속적으로 우수 계통을 육성하고 있는데 이를 하이퍼 프로리픽 라인 (hyper-prolific line)이라고 한다. 미국, 영국, 일본 등의 선진국에서도 다산성 계통의 육성을 위하여 산자가 많은 것으로 잘 알려진 중국 재래종인 메이시안 (Meishan)종을 이용하여 돼지 산자수 개량에 많은 연구가 활발히 진행되고 있지만, 아직은 실효성 있는 결과를 얻지 못하고 있다.

한국등록특허 제0444160호(2004.08.02.)

본 발명의 목적은 저비용으로 단기간에 돼지의 산자수를 효과적으로 예측할 수 있고, 산자수가 우수한 돼지의 계통을 조성할 수 있는 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명자들은 산자수가 우수한 흑돼지 품종을 유전자원으로 개량하기 위해 산자수가 우수한 모돈과 산자수가 열등한 모돈의 자궁으로부터 메틸화를 분석하여 DMR을 확보하였으며, RNA를 분석하여 확보된 DEG와 연관성을 분석하여 연관성이 있는 유전자를 이용하여 산자수와의 연계성을 정립함으로써 산자수가 우수한 흑돼지 계통 조성을 위한 진단기술을 제공한다.

따라서 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 돼지의 CPXM2 (NC_010456.4), VTCN1 (NC_010446.4), SYT13 (NC_010444.3), CREG1 (NC_010446.4), 및 TFF2 (NC_010455.4)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA의 발현수준 및 메틸화 여부를 측정하는 제제를 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 돼지의 산자수 예측용 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트를 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 올리고 뉴클레오티드 어레이 칩, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 2마리 이상의 돼지로부터 메틸화 정도를 조사하는 단계; 유전자의 발현량을 정량화하고 평균 발현량을 구하는 단계; 및 하기 표 1의 적어도 하나의 유전자가 1~5의 경우에 속하는 돼지를 그렇지 않은 돼지보다 더 높은 산자수를 갖는 돼지로 판명하는 것을 포함하는 돼지의 산자수 예측방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 돼지의 산자수를 단기간에 저비용으로 효과적으로 예측하고, 산자수가 우수한 돼지의 계통을 제공할 수 있다.

도 1은 DMR의 차이를 히트맵 (heat map)으로 나타낸 도면으로, 저 메틸화 (hypo-)와 과메틸화 (hyper-methylation region)은 각각 초록색과 붉은색으로 나타내고 있다.
도 2는 유전자의 부위에 따른 메틸화 수준을 나타내는 도면이다.
도 3은 메틸화 차이를 보이는 영역의 유전자들을 기능에 따라 분류하여 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 DMR과 DEG의 상관관계를 점 그래프로 나타낸 도면이다.
도 5는 메틸화와 발현량의 차이가 연관성이 있는 CPXM2 (NC_010456.4), VTCN1 (NC_010446.4), SYT13 (NC_010444.3), CREG1 (NC_010446.4), 및 TFF2 (NC_010455.4) 유전자의 메틸화와 발현량을 각각 보여주는 도면이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 돼지의 CPXM2 (NC_010456.4), VTCN1 (NC_010446.4), SYT13 (NC_010444.3), CREG1 (NC_010446.4), 및 TFF2 (NC_010455.4)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA의 발현수준 및 메틸화 여부를 측정하는 제제를 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명에서 상기의 '발현수준을 측정'하는 것은 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 것일 수 있다.

상기에서 'mRNA의 수준을 측정하는 것'은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호분석법, 노던 블롯팅, DNA 마이크로어레이 등을 포함한 종래 알려진 임의의 방법에 의하여 분석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자에 특이적인 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이 상에 상기 생물학적 시료로부터 분리된 mRNA 또는 그로부터 유도된 cDNA를 혼성화시키고, 그 결과 얻어진 혼성화 정도를 측정함으로써 이루어질 수 있다. 상기 혼성화 정도는 형광 측정 및 전기적 측정과 같은 당업계에 알려진 임의의 측정 방법에 의하여 측정될 수 있다. 이 경우, 상기 프로브 또는 표적 핵산은 검출가능한 적절한 표지로 표지되어 있을 수 있다. 여기에서, 상기 cDNA는 상기 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자를 표적으로 하는 센스 및 안티 센스 프라이머 쌍을 프라이머로 한 RT-PCR에 의하여 직접적으로 증폭된 것일 수 있다.

상기에서 '단백질의 수준을 측정하는 것'은 종래 알려진 임의의 단백질 측정 또는 검출 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 분석방법이 사용될 수 있다. 항체를 이용한 단백질 분석 방법에는, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선 면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역기염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 ELISA에는 직접적 ELISA, 간접적 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA, 간접적 샌드위치 ELISA 등이 포함된다. 웨스턴 블롯팅이란, 전체 단백질을 분리하고, 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시키고, 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법이다. 그 외에 단백질 수준을 측정하는 방법에는, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 효소, 기질, 조효소, 리간드 등을 이용하는 방법이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 한, 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의하여 수행된 핵산 증폭에 의하여 얻어진 증폭 산물의 양을 측정함으로써 결정되는 것일 수 있다.

상기 조성물에는 시료 중의 상기 마커 유전자 또는 그로부터 발현된 핵산 발현 산물과의 혼성화 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물에는 상기 프로브를 안정화시키고, 반응의 매질이 되는 버퍼, 용매 등을 더 포함할 수 있다.

본 명세서 전체에 있어서, '프로브'라는 용어는, 표적 핵산과 부분적으로 또는 완전히 상보적인 핵산 가닥으로서, 표적 핵산과 염기 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 표적 핵산에 완전 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 핵산뿐만 아니라, 펩티드 핵산을 포함한 상보적 결합을 할 수 있는 종래 알려진 임의의 핵산 유도체가 포함된다.

상기 프로브와 표적 핵산의 결합 (일반으로, 혼성화라고도 함)은, 서열 의존적으로 일어나는 것으로 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 일반적으로 혼성화 반응은 특정한 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 Tm 보다 약 5℃ 낮은 온도에서 이루어진다. 상기 Tm 은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열에 결합한 상태를 의미한다. 혼성화 반응 조건의 예는, pH 7.0 내지 8.3, 0.01 내지 1.0M Na+ 이온 농도일 수 있다. 또한, 표적 핵산과 프로브의 특이성을 높이기 위하여는, 표적 핵산과 프로브의 결합을 불안정하게 하는 조건, 예를 들면, 높은 온도, 높은 농도의 불안정화제 (예를 들면 포름아미드)의 존재하에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 메틸화 검출은 다음의 방법을 활용할 수 있다.

1. 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR)

게놈 DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하면 5'-CpG-3' 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비 메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 대하여 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비 메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하고, 게놈 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비 메틸화인 경우에는 비 메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어지므로 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

2. 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR)

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 게놈 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 LCgreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다.

3. 파이로시퀀싱

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 게놈 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하고 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하여 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 지수로 나타낼 수 있다.

4. 메틸화된 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩

메틸화된 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 게놈 DNA를 메틸화된 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하고 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

5. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제

차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비 메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다. 여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이며, 메틸화된 CGs와 비 메틸화된 CGs를 모두 절단하는데, 예를 들면, MspI가 있다.

6. 바이설파이트 시퀀싱

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비 메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비 메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비 메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 돼지 산자수 예측용 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트가 제공될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

이때, 상기 키트는 상기 메틸화의 검출에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 2마리 이상의 돼지로부터 메틸화 정도를 조사하는 단계; 유전자의 발현량을 정량화하고 평균 발현량을 구하는 단계; 및 하기 표 1의 적어도 하나의 유전자가 1~5의 경우에 속하는 돼지를 그렇지 않은 돼지보다 더 높은 산자수를 갖는 돼지로 판명하는 것을 포함하는 돼지의 산자수 예측방법이 제공될 수 있다.

[표 1]

상기에서 '상향조절'이라는 말은, 높은 산자수를 나타내는 돼지에서 발현이 유의적으로 증가한 것을 의미한다. 즉, 산자수를 알 수 없는 돼지의 유전자 프로필을 얻었을 때, 이들 유전자의 발현량이 유의적으로 증가하였다는 사실을 통계적으로 확보할 수 있다면, 이들 돼지의 산자수가 높을 것으로 예측할 수 있다. 마찬가지로, '하향조절'이라는 말은 높은 산자수를 나타내는 돼지에서 발현이 유의적으로 감소한 것을 의미하며 이 역시 돼지의 산자수를 예측하는데 활용될 수 있다.

상기 표 1에 따라 돼지의 산자수를 예측하는데 있어서, 표본의 수가 증가할수록 예측의 정확성이 높아지는 것은 자명하다.

본 발명에 있어서, 돼지의 종류에는 특별한 제한이 없으나, 흑돼지가 바람직하다.

본 명세서에서 용어 '과메틸화(hypermethylation)'는 테스트되는 DNA 시료의 DNA 서열내에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드에서 5-메틸시토신의 양이, 정상 대조군 DNA 시료내에서의 대응하는 CpG 디뉴클레오티드에서 발견되는 5-메틸시토신의 양과 비교하여 증가되어 있는 메틸화 상태를 의미한다.

본 명세서에서 용어 '저메틸화(hypomethylation)'는 테스트되는 DNA 시료의 DNA 서열내에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드에서 5-메틸시토신의 양이, 정상 대조군 DNA 시료내에서의 대응하는 CpG 디뉴클레오티드에서 발견되는 5-메틸시토신의 양과 비교하여 감소되어 있는 메틸화 상태를 의미한다.

본 발명은 검체로부터 획득된 특정 유전자의 발현량에 대한 정보와 메틸화의 정보를 분석하여 돼지의 산자수를 예측한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

I. DMR 정보의 구축

1. 자궁 시료 채취 및 게놈 바이설파이트 시퀀싱 결과

샘플의 채취는 흑돼지 모돈으로부터 산자수 연관 차트를 참조하여 평균 산자수 12두(higher litter size, >12 이상, 평균 12.1두)와 7두(lower litter size, <7두 이하, 평균 7두)에 대해 자궁을 수거하고 동일 부위에 일정량을 절취한 후 액체질소로 급 냉동하였다. 수거된 버크셔 산자수 고(high) 및 저(low) 샘플로부터 Wizard genomic DNA purification kit (promega, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다.

2. 메틸시토신 ( Methylcytosine ) 맵핑의 종합 및 메틸화의 분포

메틸화가 발생한 부위(site)를 계수(counting)한 결과 CG가 우월적으로 메틸화가 발생하였다. 상대적으로 CHG나 CHH는 매우 낮은 메틸화 경향을 보였다. 전체 DMS(differentially methylated sites)는 depth 3 및 difference 0.1의 기준에서 2,481,194로 확인되었고 전체 게놈 중 12%에 해당하는 수치를 보였다. 표 2에서와 같이 이들 중 메틸화에 차이를 내는 위치는 4,399개로 저메틸화 위치 2,169와 과메틸화 위치 2,230으로 확인되었다.

3. 산자수 그룹간 전체 메틸화(global methylation )의 상관관계

산자수 두 샘플 사이에서 공통적(common)이면서도, depth=3에 해당하는 DMR을 분석하였다. 메틸화 되는 위치에 존재하는 유전자의 정보를 기준으로 도 1을 작성하였다. 전체 메틸화 위치에서 gene body안에서 확인된 과메틸화 영역은 175개이고 저메틸화 영역은 148개이다. 표 3와 표4에서 각각 과메틸화 영역 및 저메틸화 영역에 해당하는 정보를 나타냈다. 도 1에서 보는 것처럼 붉은 색으로 표시된 부분이 과메틸화 영역이고 초록색으로 표시된 부분이 저메틸화 영역이다. 이들 유전자들을 기능별로 분석해 보면 먼저 과메틸화 영역은 세포골격조직(cytoskeleton organization), 단백질 티로신키나제 활성(protein tyrosine kinase activity), 시냅스전달조절(regulation of synaptic transmission)에 해당하는 유전자들로 이루어져 있으며 저메틸화 되는 영역은 대표적으로 전사조절자활성(transcription regulator activity)에 해당하는 유전자들로 이루어져 있었다.

4. 맵핑된 DMR 의 메틸화 CG ( ^m CG )의 종합적인 결과 분석

유전자 부위에 대한 평균 CG 메틸화 수준을 측정해 본 결과 도 2에서와 같이 TSS (transcription start site) 주위에서 메틸화 수준이 낮아지고 gene body 부분에서 평균 50% 수준으로 나타나는 것으로 관찰되었다. 또한, TTS (transcription termination site) 및 downstream 1 kb에서는 gene body보다 약간 낮은 메틸화 빈도가 관찰되었다. 산자수 그룹에 따른 gene body에서 메틸화 빈도 분포 패턴은 일반적으로 유사한 것으로 나타났다.

산자수에 따른 DMR을 유전자의 기능별로 분류 하였을 때 산자수가 낮은 그룹에 비해서 산자수가 높은 그룹에서 과메틸화 되어 있는 경우는 생리적 프로세스(biological process)와 분자적 기능(molecular function) 두 가지로 크게 그룹을 나눌 수가 있었는데 생리적 프로세스(biological process)는 세포골격조직(cytoskeleton organization), 분화 관련 세포형태합성(cell morphogenesis involved in differentiation)과 인산화반응(phosphorylation) 기능을 가진 유전자가 대표적이었으며, 분자적 기능(molecular function) 그룹에 해당하는 유전자들은 단백질 동질이합체 활성(protein homodimerization activity) 기능을 하는 것으로 나타났다.

반면 저메틸화로 나타난 유전자들은 생리적 프로세스(biological process) 와 세포 구성성분(cellular component)에 해당하는 기능으로 나눌 수가 있었는데 이들 중 생리적 프로세스(biological process)에 해당하는 유전자들은 전사의 포지티브 조절(positive regulation of transcription), 미발달 형태발생(embryonic morphogenesis), 및 막조직(membrane organization) 기능을 하는 것으로 분류할 수 있었고, 세포 구성성분(cellular component)에서는 원형질막(plasma membrane part), 세포결합(cell-cell junction)의 기능을 하는 유전자들로 나타났다.

II. DEG 정보의 구축

1. 자궁 시료 채취 및 mRNA 시퀀싱

흑돼지 모돈으로부터 산자수 연관 차트를 참조하여 평균 산자수 12두(higher litter size)와 7두(lower litter size)에 대해 도축 후 자궁을 수거하고 RNA에 대해 2x100 bp 리드 길이로 시퀀싱이 수행되었다.

2. RNA 시퀀싱 결과 분석

낮은 산자수(TN1410R3382)와 높은 산자수(TN1410R3379)의 각 3두로부터 RNA를 분리하여 풀링(pooling) 후 RNA-seq을 수행하였다. 수행된 결과로서 총 리드수는 38,312,494(낮은 산자수)와 52,584,638(높은 산자수)로 나타났으며, 이 중에서 적합한 페어드 리드(properly paired read)는 각각 22,649,360(59.12%)와 31,915,162(60.69%)의 리드수를 보였다.

낮은 품질의 서열을 제거하기 위해, 서열 정보 중 N으로 나타난 염기의 비율이 전체 서열의 10% 이상 포함되어 있거나, Q20 미만의 염기가 40%이상인 리드를 제거하였으며, 평균 품질이 Q20 이하인 리드 역시 제거하였다. 필터링 전 과정은 내부 제작된 프로그램에 의해서 수행되었다. 서열 정렬 및 분석에 사용된 참조 유전체는 Ensembl (Flicek P. et al., 2013)에서 제공된 정보를 이용하였으며 72버전이 사용되었다. 필터링된 서열은 STAR 2.3.0e (Dobin et al, 2013)를 이용하여 유전체 서열에 정렬되었으며, 서열 정렬과정에서 ensembl 72버전의 유전자 정보가 사용되었다. 레퍼런스 게놈(Reference genome)에 의한 총 돼지(Sus scrofa) 유전자의 수는 25,323개로 예측되었고, 전사체(transcripts)의 수는 30,587개로 나타났다.

3. DEG 분석 결과

발현량 측정은 Cufflinks v2.1.1 (Trapnell C. et al, 2010)를 이용하였다. 발현량 측정을 위해서 ensembl 72 버전의 유전자 정보를 사용하였으며, 논코딩(non-coding) 유전자 영역은 -mask 옵션을 이용하여 발현량 측정에서 제외하였다. 발현량 측정의 정확성을 높이기 위하여 다중-리드-보정(multi-read-correction)과 프랙-바이어스-보정(frag-bias-correct) 옵션을 추가로 사용하였으며, 다른 옵션은 기본값으로 사용하였다.

특이발현 유전자 분석을 위해서 HTSeq-count v0.5.4p3 (Anders S. et al, 20140)을 이용하여 각 유전자의 리드 숫자를 계산하였으며, 인터섹션-논엠프티(intersection-nonempty) 규칙과 페어드-엔드(Paired-end) 서열을 고려하여 계산을 수행하였다. 계산된 각 유전자의 리드 숫자를 이용하여 TCC(Sun J. et al, 2013)를 이용한 특이 발현 유전자 분석을 수행하였다. TCC 옵션은 반복을 고려한 iDEGES/edgeR 방법을 이용하였으며, 특이발현 유전자 선택은 다중 테스트(multiple-testing) 과정에서 생기는 오류를 보정한 Q-밸류를 기준으로 0.05 미만을 기준값으로 하였다.

DEG를 분석해 본 결과, 유의적으로 DEG에 해당되는 유전자는 총 789개로 나타났다. 이들 유전자 중 p<0.01와 q<0.05를 만족하는 유의한 DEG를 선발 하여서 높은 산자수 그룹의 유전자 중 낮은 산자수 그룹의 경우와 비교하여 높은 발현을 보이는 유전자는 82개이며, 낮은 발현을 보이는 유전자는 17개로 나타났다.

III. 산자수에 따른 CG- DMR 과 DEG 의 연관성 분석 결과

DNA 메틸화에 따르는 유전자의 발현 변화 양상을 분석하기 위해 DMR과 DEG 정보를 비교 분석하였다. 전체 DMR 중에 gene body에서 메틸화가 측정된 위치들의 정보를 가로축으로 표시하고 각 유전자의 DEG분석으로 발현량을 세로축으로 표시하였다(도 4). 통상적으로 메틸화 수준이 낮으면 발현량이 증가하고 메틸화 수준이 높으면 발현량이 감소한다고 잘 알려져 있고 이런 메틸화의 패턴은 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 영역에 위치할 때 더욱 효과적으로 알려져 있다. DMR/DEG를 표현한 점그래프에서 프로모터 위치에 메틸화의 변화가 있으면서 메틸화에 따른 발현량이 조절되는 유전자는 표 1과 같다. CPXM2 (NC_010456.4), VTCN1 (NC_010446.4), SYT13 (NC_010444.3), CREG1 (NC_010446.4), 및 TFF2 (NC_010455.4) 다섯 개의 유전자의 메틸화 정도와 발현량 정도를 도 5에서 나타내고 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

1. 돼지의 CPXM2 (NC_010456.4), VTCN1 (NC_010446.4), SYT13 (NC_010444.3), CREG1 (NC_010446.4), 및 TFF2 (NC_010455.4)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA의 발현수준 및 메틸화 여부를 측정하는 제제를 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 흑돼지의 산자수를 예측하는 것을 특징으로 하는 돼지의 산자수 예측용 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항 기재의 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 키트가 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 돼지의 산자수 예측용 키트.
   
5. 2마리 이상의 돼지로부터 유전자의 발현량을 정량화하고 평균 발현량을 구하는 단계;
   상기 돼지의 유전자에 대한 메틸화 여부를 조사하는 단계; 및
   하기 표 1의 적어도 하나의 유전자가 1~5의 경우에 속하는 돼지를 그렇지 않은 돼지보다 더 높은 산자수를 갖는 돼지로 판명하는 것을 포함하는 돼지의 산자수 예측방법.
   [표 1]
   

   

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