CN105524983A - 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒。所述方法包括：第一轮扩增、消化引物、第二轮扩增、混合、回收、测序、分析。在本发明中，第一轮扩增采用通用序列+各个基因的特定引物组成的混合物，此时多重扩增起作用的是每个基因的特定序列，每个基因前面都加上了通用序列；第二轮扩增引物采用标签序列+通用序列，此时扩增起作用的是通用序列，最后的产物前面又都加上了可识别的标签序列。通过对每个样本都引入独特的引物标签序列，使样本在第二代高通量测序技术检测时，每个样本的测序结果都可以通过其独特的引物标签序列找回，可以应用于同时检测大量样本的多个不同基因位点，大大降低了测序成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及标记和捕获多个样本的特定基因的方法和试剂盒，特别是，涉及基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒。
背景技术
新一代高通量测序仪的出现大大降低了核酸测序成本，其具有高通量、低成本、测序错误率低等特点。应用第二代高通量测序技术，可以对混合的核酸分子进行序列测定，同时分辨和测出每个独立的序列，使得该测序技术在高通量标记开发成为可能。
随着高通量测序技术在人类疾病研究、微生物基因组测序等方面的广泛开展，如何最大限度发挥第二代测序技术的高通量和大数据量等特点，降低单样本测序成本成为下一步测序技术的发展方向，具有很大的市场前景和价值。
然而，常规的PCR-index技术，对于每个PCR产物的index标签都是需要单独进行扩增标记，然后将所有的产物混合测序，当PCR片段较多时，不仅操作繁琐，而且很难控制片段混合的均一性，会导致最终测序结果中片段之间数据量差距巨大。
发明内容
本发明的目的是利用高通量测序技术对大量样本中的特定基因相关序列同时进行测序分析，解决传统方法通量低、测序成本高的问题，扩大第二代测序技术在PCR测序领域的应用。
针对本发明的目的，本发明整合了多重扩增技术和PCR-index技术，提供了一种新型的PCR扩增技术方案，利用PCR反应在PCR产物两端各引入一个引物标签，通过PCR产物两端引入的引物标签可以特异地得到PCR产物的样本信息，同时通过引物标签和扩增引物的组合，能够特异地得到PCR产物对应的样本上的基因信息。
根据本发明的一个方面，提供了一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法，包括以下步骤：
第一轮扩增：使用由通用序列和针对特定基因的扩增引物组成的第一轮扩增引物组合对各样本的一个或多个特定基因进行扩增，以使每个基因的扩增产物的两端上都加上了通用序列，其中，所述通用序列中的正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
第二轮扩增：使用由标签(index)序列和通用序列组成的第二轮扩增引物对第一轮扩增得到的产物进行扩增，以使扩增产物的两端都加上与其他样本区分的可识别的标签序列；
混合：将各样本的第二轮扩增产物混合在一起；
回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带；
测序：将回收的DNA混合物进行测序；
分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
优选地，本发明提供了一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法，包括以下步骤：
1)引物设计：
第一轮扩增引物：根据待测的特定基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和测序方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5`端分别加上一段特定的正向通用序列和反向通用序列，组成第一轮扩增引物组合，其中，所述正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
本发明的通用序列是一段扩增效率比较高的序列，设计通用序列遵循以下原则：(1)通用序列本身的GC含量在40.0％－60.0％，(2)减少通用序列添加在PCR引物上后，对PCR引物造成的严重发卡(haripin)、二聚体(dimer)情况的出现，(3)通用序列不会和模板进行非特异扩增；
第二轮扩增引物：根据样本的数量设计不同的标签序列(index序列)，在正向标签序列和反向标签序列的3`端分别加上正向通用序列和反向通用序列构成正向标签引物和反向标签引物，组成第二轮扩增引物(标签引物)组合，其中，设计的标签引物的数量遵循以下规则：正向标签引物的数量×反向标签引物的数量≥样本数量，以及其中，在第二轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列分别与第一轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列相同，以及其中，正向标签引物的标签序列与反向标签引物的标签序列可以彼此相同或不同；
本发明设计标签序列遵循以下原则：(1)序列本身的GC含量在40.0％－60.0％，(2)减少标签序列添加在PCR引物上后，对PCR引物造成的严重发卡(haripin)、二聚体(dimer)情况的出现，(3)标签序列中避免3个或3个以上重复碱基，(4)标签序列之间序列差异度大于3个碱基；
2)第一轮扩增：将针对各样本的扩增一个或多个特定基因的第一轮扩增引物组合混合，在适于多重扩增目的核酸的条件下对所有样本分别进行扩增；
3)消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
4)第二轮扩增：用上一步中对应样本消化后的产物作为模板，根据不同样本设计的标签引物，进行第二轮扩增，从而分别给每个样本的各个扩增产物都加上了可以与其他样本区分的标签序列，由此每个样本都得到带有可识别标签序列的多重PCR扩增产物；
5)混合：将各样本的第二轮PCR扩增产物均一地混合在一起；
6)回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带；
7)测序：将回收的DNA混合物进行测序；
8)分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
优选地，步骤1中，所述标签序列的长度可以为5-20bp，更优选地，所述标签序列的长度可以为6-8bp。
优选地，步骤2和步骤4中，扩增所采用的酶均为高保真DNA聚合酶，由此减少扩增带来的DNA突变率。
优选地，步骤2中，PCR扩增只进行8-10个循环，由此减少多重扩增引物之间的扩增效率差别。
优选地，步骤3中，将第一轮PCR扩增产物在85℃加热5分钟，然后快速冰浴冷却，使产物中的引物二聚体解链成单链引物，然后用单链消化酶进行消化，由此减少引物二聚体的存在对后续扩增的影响。
优选地，步骤3所用的单链消化酶为核酸外切酶I(ExonucleaseI)，该酶为单链特异性3’→5’核酸外切酶，不分解双链DNA及RNA。
优选地，步骤4中第二轮扩增进行20-25个循环。
优选地，步骤7中利用pair-End技术(例如IlluminaHiseq2000、IlluminaHiseq2500和IlluminaMiseq)进行测序，获得DNA混合物的序列。
优选地，步骤7中测序采用PCR-FREE文库，由此减少相似序列之间的交叉干扰。
另一方面，本发明还提供一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的试剂盒，其中，所述试剂盒包括以下引物：
第一轮扩增引物：根据待测的特定基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和测序方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5`端分别加上一段特定的正向通用序列和反向通用序列，组成第一轮扩增引物组合，其中，所述正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
本发明的通用序列是一段扩增效率比较高的序列，设计通用序列遵循以下原则：(1)通用序列本身的GC含量在40.0％－60.0％，(2)减少通用序列添加在PCR引物上后，对PCR引物造成的严重发卡(haripin)、二聚体(dimer)情况的出现，(3)通用序列不会和模板进行非特异扩增；
第二轮扩增引物：根据样本的数量设计不同的标签序列，在正向标签序列和反向标签序列的3`端分别加上正向通用序列和反向通用序列构成正向标签引物和反向标签引物，组成第二轮扩增引物(标签引物)组合，其中，设计的标签引物的数量遵循以下规则：正向标签引物的数量×反向标签引物的数量≥样本数量，以及其中，在第二轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列分别与第一轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列相同，优选地，所述标签序列的长度可以为5-20bp，更优选地，所述标签序列的长度为6-8bp，以及其中，正向标签引物的标签序列与反向标签引物的标签序列可以彼此相同或不同；
本发明设计标签序列遵循以下原则：(1)序列本身的GC含量在40.0％－60.0％，(2)减少标签序列添加在PCR引物上后，对PCR引物造成的严重发卡(haripin)、二聚体(dimer)情况的出现，(3)标签序列中避免3个或3个以上重复碱基，(4)标签序列之间序列差异度大于3个碱基。
优选地，在本发明中，所述样本的数量可为：样本数量≤可设计的正向标签引物的数量×可设计的反向标签引物的数量。
更优选地，本发明提供了一种基于高通量测序的标记和捕获多个(25个以下)样本的嗜铬细胞瘤相关的SDHB、SDHC、SDHD、RET、VHL5个基因的一个或多个外显子的试剂盒，其中，所述外显子为选自MDHB-EXON1、SDHB-EXON2、SDHB-EXON3、SDHB-EXON4、SDHB-EXON5、SDHB-EXON6、SDHB-EXON7、SDHB-EXON8、SDHC-EXON1、SDHC-EXON2、SDHC-EXON3、SDHC-EXON4、SDHC-EXON5、SDHC-EXON6、SDHD-EXON1、SDHD-EXON2、SDHD-EXON3、SDHD-EXON4、RET-EXON10、RET-EXON11、RET-EXON13、RET-EXON14、RET-EXON15、RET-EXON16、VHL-EXON1、VHL-EXON2和VHL-EXON3中的一种或多种；所述试剂盒包括以下引物：
第一轮扩增引物包括选自下列中的一对或多对：
第二轮扩增引物包括选自下列正向标签引物和反向标签引物组成的一对或多对：
Index_01_FATCACGTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_01_RATCACGCAGGAAACAGCTATGACC
Index_02_FCGATGTTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_02_RCGATGTCAGGAAACAGCTATGACC
Index_03_FTTAGGCCTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_03_RTTAGGCCCAGGAAACAGCTATGACC
Index_04_FTGACCATGTAAAACGACGGCCAGT
Index_04_RTGACCACAGGAAACAGCTATGACC
Index_05_FACAGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_05_RACAGTGCAGGAAACAGCTATGACC
其中，所选择的第二轮扩增引物的数量遵循以下规则：正向标签引物的数量×反向标签引物的数量≥样本数量。
本发明具有如下有益效果：
本发明通过优化多重PCR反应的循环数，使第一轮多重PCR反应只进行线性扩增，最大限度的减少多重引物之间的扩增效率差别，通过第二轮扩增时通用引物的平行扩增，使多重扩增产物中各个基因的相关产物量尽量接近，提高了测序数据的有效性。
在本发明中，第一轮扩增采用的是通用序列+各个基因的特定引物组成的混合物，这时候多重扩增起作用的是每个基因的特定序列，每个基因的前面都加上了通用序列。第二轮扩增引物采用的是标签序列+通用序列，这时候扩增起作用的是通用序列，最后的产物前面又都加上了可识别的标签序列。通过以上合理的引物设计和PCR策略，在PCR产物的5`末端添加引物标签序列(index序列)。通过对每个样本都引入独特的引物标签序列，使样本在第二代高通量测序技术检测时，每个样本的测序结果都可以通过其独特的引物标签序列找回，可以应用于同时检测大量样本的多个不同基因位点，大大降低了测序成本。
附图说明
图1是本发明的标记和捕获多个样本的特定基因的方法的示意图。
具体实施方式
现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
以下实施例中所使用的设备和试剂如下：血液基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，高速离心机SIGMA3-30K，核酸扩增仪ABI2720，PCR试剂TaKaRaExHotStartVersion，核酸外切酶Takara(ExonucleaseI(E.coli))。
实施例1
嗜铬细胞瘤相关的SDHB、SDHC、SDHD、RET、VHL5个基因的27个外显子测序，共25例临床样本：
1)引物设计：
针对5个基因的27个外显子设计相应的扩增引物，相关参数：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。正向扩增引物和反向扩增引物的5`端分别加上一段通用序列，所设计的引物如下，下划线是引入的通用序列：
按照以下规则设计标签序列：正向标签引物的数量×反向标签引物的数量≥样本数量，在本实施例中，根据25个样本设计5对标签序列，3`端加上通用序列组成第二轮扩增所用的标签引物，通过5对标签引物的组合扩增，在第二轮扩增时对每个样本的各个目的片段都加上可以区分的标签序列(index序列)，所设计的引物如下，下划线是引入的通用序列：
Index_01_FATCACGTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_01_RATCACGCAGGAAACAGCTATGACC
Index_02_FCGATGTTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_02_RCGATGTCAGGAAACAGCTATGACC
Index_03_FTTAGGCCTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_03_RTTAGGCCCAGGAAACAGCTATGACC
Index_04_FTGACCATGTAAAACGACGGCCAGT
Index_04_RTGACCACAGGAAACAGCTATGACC
Index_05_FACAGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_05_RACAGTGCAGGAAACAGCTATGACC
2)第一轮扩增：
每对引物单独调试合格后，将27对引物分别稀释到100μM，然后等量混合，PCR体系：3μL10xExtaq缓冲液，3μLdNTP混合物(各2.5μM)，2μL混合引物，0.3μLExtaqHS(5U/μL)，2μL模板DNA(20-50ng/μL),ddH2O补充到30μL。PCR反应按下述条件进行：模板DNA变性95℃保持5min。PCR反应循环条件：
以下进行8个循环：
第1步：95℃进行30秒；
第2步：55℃进行30秒；
第3步：72℃进行30秒；
8个循环完成后，保持在4℃。
3)消化引物
将第一轮扩增产物在85℃加热5分钟，然后快速冰浴冷却，采用TakaraExonucleaseI对第一轮扩增产物进行消化残留引物，酶切体系：10×ExonucleaseI缓冲液2μL，ExonucleaseI(50U/μL)0.5μL，PCR产物模板10μL，ddH2O补充到20μL。酶切反应按下述条件进行：37℃，30min；80℃，15min。
4)第二轮扩增
通过5对标签引物上下游分别配对，在第二轮PCR扩增时对25个样本加上可识别的标签序列，样本两端标签组合见表1，PCR体系：3μL10xExtaqbuffer，3μLdNTPMixture(2.5μMeach)，1μL正向标签引物，1μL反向标签引物，0.3μLExtaqHS(5U/μL)，2μL消化引物后的PCR产物,ddH2O补充到30μL。PCR反应按下述条件进行：模板DNA变性95℃保持5min。PCR反应循环条件：
以下进行20个循环：
第1步：95℃进行30秒；
第2步：55℃进行30秒；
第3步：72℃进行30秒；
20个循环完成后，保持在4℃。
表1样本两端标签组合表
| Index_01_F | Index_02_F | Index_03_F | Index_04_F | Index_05_F | |
| Index_01_R | 1# | 6# | 11# | 16# | 21# |
| Index_02_R | 2# | 7# | 12# | 17# | 22# |
| Index_03_R | 3# | 8# | 13# | 18# | 23# |
| Index_04_R | 4# | 9# | 14# | 19# | 24# |
| Index_05_R | 5# | 10# | 15# | 20# | 25# |
5)混合：将带有标签序列的第二轮PCR扩增产物根据浓度均一地混合在一起；
6)回收：回收400bp-500bp范围之间的所有DNA条带；
7)测序：将回收的DNA混合物，采用IlluminaMiseq，PE300(贝瑞和康生物技术有限公司)进行测序，获得DNA混合物的序列。
8)分析：IlluminaMiseq产物的测序结果是一系列DNA序列，通过查找测序结果中25个样本各自独特的标签序列，将获得的测序结果首先与样本一一对应，然后根据27个外显子的引物序列，再将序列对应到样本的每个基因上。所有的25个样本的27个外显子都能够在测序结果中找到对应的数据，每个样本对应的reads数(序列条数)如下表2所示，27个外显子序列对应的序列条数如下表3所示(仅列出部分样本的数据)，25个样本之间序列条数差异最大在3倍左右，27个外显子序列对应的序列条数差异最大在10倍左右，表明我们的多样本标记方法能够有效的区分每个标签对应的DNA序列。
表2每个样本对应的序列条数和GC_数
| 序列条数 | GC_数(％) | |
| 1# | 300,948 | 57.9 |
| 2# | 224,022 | 57.45 |
| 3# | 218,094 | 58.43 |
| 4# | 194,818 | 58.02 |
| 5# | 183,318 | 57.83 |
| 6# | 176,534 | 58.37 |
| 7# | 158,132 | 57.25 |
| 8# | 153,246 | 56.66 |
| 9# | 144,548 | 56.51 |
| 10# | 138,482 | 56.91 |
| 11# | 132,748 | 54.57 |
| 12# | 125,434 | 58.65 |
| 13# | 123,674 | 58.01 |
| 14# | 123,662 | 56.91 |
| 15# | 121,238 | 55.77 |
| 16# | 119,626 | 58.22 |
| 17# | 113,556 | 58.26 |
| 18# | 110,646 | 57.26 |
| 19# | 109,642 | 55.19 |
| 20# | 109,166 | 57.76 |
| 21# | 109,034 | 57.53 |
| 22# | 104,186 | 56.96 |
| 23# | 104,048 | 56.74 |
| 24# | 103,178 | 57.3 |
| 25# | 98,990 | 58.02 |
表327个外显子序列对应的序列条数(以1号样本和2号样本为例)
Claims (10)
1.一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法，包括以下步骤：
第一轮扩增：使用由通用序列和针对特定基因的扩增引物组成的第一轮扩增引物组合对各样本的一个或多个特定基因进行扩增，以使每个基因的扩增产物的两端上都加上了通用序列，其中，所述通用序列中的正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
第二轮扩增：使用由标签序列和通用序列组成的第二轮扩增引物对第一轮扩增得到的产物进行扩增，以使扩增产物的两端都加上与其他样本区分的可识别的标签序列；
混合：将各样本的第二轮扩增产物混合在一起；
回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带；
测序：将回收的DNA混合物进行测序；
分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
2.一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法，包括以下步骤：
1)引物设计：
第一轮扩增引物：根据待测的特定基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和测序方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5`端分别加上一段特定的正向通用序列和反向通用序列，组成第一轮扩增引物组合，其中，所述正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
第二轮扩增引物：根据样本的数量设计不同的标签序列，在正向标签序列和反向标签序列的3`端分别加上正向通用序列和反向通用序列构成正向标签引物和反向标签引物，组成第二轮扩增引物组合，其中，设计的第二轮扩增引物的数量遵循以下规则：正向标签引物的数量×反向标签引物的数量≥样本数量，以及其中，在第二轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列分别与第一轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列相同，以及其中，正向标签引物的标签序列与反向标签引物的标签序列可以彼此相同或不同；
2)第一轮扩增：将针对各样本的扩增一个或多个特定基因的第一轮扩增引物组合混合，在适于多重扩增目的核酸的条件下对所有样本分别进行扩增；
3)消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
4)第二轮扩增：用上一步中对应样本消化后的产物作为模板，根据不同样本设计的第二轮扩增引物，进行第二轮扩增，从而分别给每个样本的各个扩增产物都加上了可以与其他样本区分的标签序列，由此每个样本都得到带有可识别标签序列的多重PCR扩增产物；
5)混合：将各样本的第二轮PCR扩增产物均一地混合在一起；
6)回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带；
7)测序：将回收的DNA混合物进行测序；
8)分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述标签序列的长度为5-20bp，优选地，所述标签序列的长度为6-8bp。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一轮扩增和第二轮扩增所采用的酶均为高保真DNA聚合酶。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在第一轮扩增中，PCR扩增进行8-10个循环；和/或，第二轮扩增进行20-25个循环。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，消化引物时，将第一轮PCR扩增产物在85℃加热5分钟，然后快速冰浴冷却，使产物中的引物二聚体解链成单链引物，然后用单链消化酶进行消化；和/或，消化引物所用的单链消化酶为核酸外切酶I。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，测序利用pair-End技术(例如IlluminaHiseq2000、IlluminaHiseq2500和IlluminaMiseq)进行测序，获得DNA混合物的序列；和/或，测序中采用PCR-FREE文库。
8.一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的试剂盒，其中，所述试剂盒包括以下引物：
第一轮扩增引物：根据待测的特定基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和测序方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5`端分别加上一段特定的正向通用序列和反向通用序列，组成第一轮扩增引物组合，其中，所述正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
第二轮扩增引物：根据样本的数量设计不同的标签序列，在正向标签序列和反向标签序列的3`端分别加上正向通用序列和反向通用序列构成正向标签引物和反向标签引物，组成第二轮扩增引物组合，其中，设计的第二轮扩增引物的数量遵循以下规则：正向标签引物的数量×反向标签引物的数量≥样本数量，以及其中，在第二轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列分别与第一轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列相同，以及其中，正向标签引物的标签序列与反向标签引物的标签序列可以彼此相同或不同。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述标签序列的长度为5-20bp，优选地，所述标签序列的长度为6-8bp。
10.一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的嗜铬细胞瘤相关的SDHB、SDHC、SDHD、RET、VHL5个基因的一个或多个外显子的试剂盒，其中，所述外显子为选自SDHB-EXON1、SDHB-EXON2、SDHB-EXON3、SDHB-EXON4、SDHB-EXON5、SDHB-EXON6、SDHB-EXON7、SDHB-EXON8、SDHC-EXON1、SDHC-EXON2、SDHC-EXON3、SDHC-EXON4、SDHC-EXON5、SDHC-EXON6、SDHD-EXON1、SDHD-EXON2、SDHD-EXON3、SDHD-EXON4、RET-EXON10、RET-EXON11、RET-EXON13、RET-EXON14、RET-EXON15、RET-EXON16、VHL-EXON1、VHL-EXON2和VHL-EXON3中一种或多种；所述试剂盒包括以下引物：
第一轮扩增引物包括选自下列中的一对或多对：
SDHB-1FTGTAAAACGACGGCCAGTCTATTGCGCACGCTCGCTGT
SDHB-1RCAGGAAACAGCTATGACCCCCATCAGCTCCAGGCAGTC
SDHB-2FTGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGTGTCACTAGCCCCTA
SDHB-2RCAGGAAACAGCTATGACCAAACAGAGCCATCGGATGAT
SDHB-3FTGTAAAACGACGGCCAGTGAACGTTACATAAATACCACTGGA
SDHB-3RCAGGAAACAGCTATGACCCTATCAGCTTTGGCCAGC
SDHB-4FTGTAAAACGACGGCCAGTAGGGAGAAAAGCCAACAG
SDHB-4RCAGGAAACAGCTATGACCAGGAGCCTTAAATACTCAAACA
SDHB-5FTGTAAAACGACGGCCAGTGGAAAAGAGTCTGGCTTCTGC
SDHB-5RCAGGAAACAGCTATGACCTGCCAGTTCCTCTCCAGAAT
SDHB-6FTGTAAAACGACGGCCAGTTCACCCCTTGGATTTTGCTA
SDHB-6RCAGGAAACAGCTATGACCGACTGGATGGCAATGAAGGA
SDHB-7FTGTAAAACGACGGCCAGTTGGAGATGAGGCATCTAAGC
SDHB-7RCAGGAAACAGCTATGACCCCCCTAGGCTCACACTGAAA
SDHB-8FTGTAAAACGACGGCCAGTTTTGAGGGACTTGATTTGCAT
SDHB-8RCAGGAAACAGCTATGACCCGGCAAGTAAAGGAACAGGT
SDHC-1FTGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAACCAGCTAGGCAGAG
SDHC-1RCAGGAAACAGCTATGACCGACGGGAAAAGGGGTCTCTA
SDHC-2FTGTAAAACGACGGCCAGTGAAAATGGTATCAAGGACACTGA
SDHC-2RCAGGAAACAGCTATGACCAATGGCGTGAACCCAAGA
SDHC-3FTGTAAAACGACGGCCAGTTTACAGGCCTGAGCAACCAT
SDHC-3RCAGGAAACAGCTATGACCTACCCTGAAGGGTTCACCTC
SDHC-4FTGTAAAACGACGGCCAGTACAGGAATGCAAAAGCTGGT
SDHC-4RCAGGAAACAGCTATGACCTCAAGTGCTGAGTTTCAAAGGA
SDHC-5FTGTAAAACGACGGCCAGTCAGGGGTCCCAGTTTTATGT
SDHC-5RCAGGAAACAGCTATGACCGAGCGAGACTCCACTCTTGG
SDHC-6FTGTAAAACGACGGCCAGTAAGGTGGGGCATAAGGGTAG
SDHC-6RCAGGAAACAGCTATGACCTGCTCCAAGGAGATCTGAAAA
SDHD-1FTGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCTCGACTTCCGACA
SDHD-1RCAGGAAACAGCTATGACCCCTTCGGGTAAACATCTGGA
SDHD-2FTGTAAAACGACGGCCAGTACATGCAGATGTTCCCTGGT
SDHD-2RCAGGAAACAGCTATGACCTGTCTGCCCAAAGGTGTAAA
SDHD-3FTGTAAAACGACGGCCAGTCCCTTGTGCTAAAAGACTTCAAA
SDHD-3RCAGGAAACAGCTATGACCTCAACAAATTTAGGGCATTTCA
SDHD-4FTGTAAAACGACGGCCAGTTGATGTTATGATTTTTTCTTTTT
SDHD-4RCAGGAAACAGCTATGACCCAATTCTTCAAAGTATGAAGTCA
RET-10FTGTAAAACGACGGCCAGTTATGCTTGCGACACCAGTTG
RET-10RCAGGAAACAGCTATGACCAGAGGGAGGGAGGGAAGTTT
RET-11FTGTAAAACGACGGCCAGTATGAGGCAGAGCATACGCAG
RET-11RCAGGAAACAGCTATGACCAGAGGAGTAGCTGACCGGGA
RET-13FTGTAAAACGACGGCCAGTAGCCTCAAGCAGCATCGTCT
RET-13RCAGGAAACAGCTATGACCGGCAGGAGCAGTAGGGAAAG
RET-14FTGTAAAACGACGGCCAGTGCTGAGGCTTCAAGGTCTGC
RET-14RCAGGAAACAGCTATGACCAGAGCCATATGCACGCACCT
RET-15FTGTAAAACGACGGCCAGTGCCTGACGACTCGTGCTAT
RET-15RCAGGAAACAGCTATGACCCCACTAATCTTCGGTATCTTTCC
RET-16FTGTAAAACGACGGCCAGTGCCCCTTCAAAGATGTGTGT
RET-16RCAGGAAACAGCTATGACCGCTAGCACTGCAGACAGGT
VHL-1FTGTAAAACGACGGCCAGTTGGTCTGGATCGCGGAGGGAAT
VHL-1RCAGGAAACAGCTATGACCGCTGGGTCGGGCCTAAGCGCCGG
VHL-2FTGTAAAACGACGGCCAGTGTGGCTCTTTAACAACCTTTGC
VHL-2RCAGGAAACAGCTATGACCCCTGTACTTACCACAACAACCTT
VHL-3FTGTAAAACGACGGCCAGTTTCCTTGTACTGAGACCCTAGT
VHL-3RCAGGAAACAGCTATGACCAGCTGAGATGAAACAGTGTAAGT
第二轮扩增引物包括选自下列正向标签引物和反向标签引物组成的一对或多对：
Index_01_FATCACGTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_01_RATCACGCAGGAAACAGCTATGACC
Index_02_FCGATGTTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_02_RCGATGTCAGGAAACAGCTATGACC
Index_03_FTTAGGCCTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_03_RTTAGGCCCAGGAAACAGCTATGACC
Index_04_FTGACCATGTAAAACGACGGCCAGT
Index_04_RTGACCACAGGAAACAGCTATGACC
Index_05_FACAGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
Index_05_RACAGTGCAGGAAACAGCTATGACC
其中，所选择的第二轮扩增引物的数量遵循以下规则：正向标签引物的数量×正向标签引物的数量≥样本数量。
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