CN102933721A - 用于高通量筛选的组合序列条形码 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及至少两个核苷酸序列标识符的组合在制备用于高通量测序的样本DNA中的方法和用途。因此，在多种制备的样本DNA的高通量测序中，样本DNA的各制备包括至少两个核苷酸序列标识符的独特组合，其中第一核苷酸序列标识符选自核苷酸序列标识符的一组，且第二核苷酸序列标识符选自核苷酸序列标识符的一组。

Description

用于高通量筛选的组合序列条形码
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及用于测序方法的样本DNA的制备。更具体地，本发明涉及用于高通量测序的核苷酸序列标识符的用途。
背景技术
对低成本测序的高度需求已带动了高通量测序技术的发展。在这种技术中，平行生产数以百万计的序列。例如，454 Life Sciences，现在Roche Applied Sciences开发出了样本DNA的高通量测序技术，其涉及步骤：使DNA片段化，将接头连接至DNA片段，用包被有引物的珠捕获单一DNA片段，在油中的水滴内部在珠上扩增各DNA片段（乳液PCR（emulsion PCR）），随后各珠装载到皮升的孔中，并用焦磷酸测序对各扩增的DNA片段进行测序。一般情况下，高通量测序技术涉及将接头连接至DNA片段（接头可包括用于捕获的引物结合位点）、DNA片段的扩增和/或测序。因为可以产生大量的序列，来自不同来源的样本往往组合于单次高通量测序运行中。为了从样本池（pool）中追溯各样本的来源，目前的高通量测序应用依赖于核苷酸序列标识符的使用。术语核苷酸序列标识符（NSI，（基于序列的条形码或序列索引是可互换的术语并且具有相同的含义。核苷酸序列标识符是一段特定的核苷酸序列，该序列被用作标识符。核苷酸序列标识符包含在引物结合位点的接头下游，从而当从引物结合位点测序时，标识符序列的核苷酸序列得以确定。将包含不同核苷酸序列标识符的不同接头连接至不同样本，之后可以合并样本。当合并样本的序列被确定时，核苷酸序列标识符随着接头所连接的片段的部分序列被一起测序。因此核苷酸序列标识符的存在或不存在确定池中样本DNA的存在或不存在。随着核苷酸序列标识符被一起测序的内部序列的序列，进一步使得能够将该序列指定到其所来源的特定样本，因为核苷酸序列标识符用来鉴定样本DNA来源。
例如，由Roche开发的高通量测序系统（Genome Sequencer FLX系统）使用多重标识符序列（multiplexed identifier sequence，MID）。MIDs是10-mer序列，其并入接头以便将序列读取指定到单个样本。目前正在使用的有超过100个不同的MIDs（454 Life Science Corp(2009)Technical Bulletin No.005-2009）。相似的核苷酸序列标识符可用于其它测序系统。
例如，Rigola等人PLoS ONE.2009;4(3):e4761和WO 2007/037678中描述了这样的方法，在其中核苷酸序列标识符并入引物5′端。通常，核苷酸序列标识符和靶序列没有显著的互补性。因此，引物在5′端含有包含核苷酸序列标识符的一段以及在3′端含有和靶序列互补的序列。当用引物对（引物包括核苷酸序列标识符）扩增样本时，扩增子将包括核苷酸序列标识符。当随后合并样本，并进行高通量测序方法时，核苷酸序列标识符将用来鉴定所测序的扩增子的来源。因此，通过确定核苷酸序列标识符确定扩增子的来源。同时，已被扩增并随着核苷酸序列标识符一起被测序的内部序列也可以被追溯到其所来源的样本。
在这两种情况下，包括核苷酸序列标识符的接头或引物概念是相同的，即确定使用高通量测序平台从多个DNA样本所产生的序列的样本来源，其中DNA样本在样本制备过程中的某些时刻已被多路化（multiplexed），如被组合或被合并。
发明内容
自推出以来，高通量测序技术能力的能力每两年提高一个数量级。采用高通量测序，使得可以多路化越来越多的样本数，为了鉴定样本来源所需的独特接头或引物的数目也越来越多。尽管使用100个不同引物或接头可能已具有挑战性，当数目增至1000时，这可能会成为瓶颈。因此，需要能够减少所要使用的引物和/或接头的数目，因为这可简化样本制备、可减少工作量、可优化技术性能并能降低成本。本发明使得能够减少所需不同的引物和/或接头的数目。通过使用所谓的“分割条形码（split barcode）”可减少数目。根据本发明的分割条形码是出现在至少两个接头和/或引物上的核苷酸序列标识符。使用例如引物对和/或一对接头制备样本DNA（或样本DNA的组合），对中的各引物或接头含有一个核苷酸序列标识符。产生的扩增子或接头连接的DNA片段包括至少两个核苷酸序列标识符。对于各不同样本，可以使用核苷酸标识符的独特组合。核苷酸序列标识符的组合，也一起表示为分割条形码，用作标识符。
附图说明
图1.用两个核苷酸序列标识符从样本DNA制备扩增子的方法。提供样本DNA（1），样本DNA包括两侧为两个引物结合位点（P1和P2）的内部序列（IS），以及一对扩增引物（2），扩增引物在3′端包括和引物结合位点互补的序列以及在其5′（端）包括核苷酸序列标识符（NSI1和NSI2）。用扩增引物扩增样本DNA（3），产生在两侧带有两个核苷酸序列标识符的扩增子（5′表示核苷酸链的5′端，3′端没有注解）。
图2.用两个核苷酸序列标识符从样本DNA制备接头连接的DNA片段的方法。
提供样本DNA（1），使其片段化提供DNA片段（2），提供包括第一和第二NSI（NSI1和NSI2）的一对接头（3），接头连接到DNA片段的两端，产生接头连接的DNA片段（4）（5′表示核苷酸链的5′端）。
图3.用2、3或4个核苷酸序列标识符从样本DNA制备扩增的接头连接的DNA片段的方法。
提供样本DNA（1），使其片段化提供DNA片段（2），提供一对接头，其中的至少一个包括NSI（NS1和任选（NS2))且两者都包括引物结合位点（P1和P2），接头连接DNA片段（3），即内部序列（IS），产生接头连接的DNA片段（4），其在接头连接的DNA片段两端包括引物结合序列。提供一对扩增引物（5），各在3′端包括和序列引物结合位点互补的序列，以及至少一个扩增引物在5′端包括核苷酸序列标识符（NSI3或任选（NSI4））。用扩增引物的对扩增接头连接的DNA片段（6）。结果（7）是含有至少两个NSI的扩增的接头连接的DNA片段。所述至少两个NSI可以在IS两侧，和/或所述至少两个NSI可以在IS同一侧（5′表示核苷酸链的5′端；括号表示在方法中纳入第二和/或第四NSI是任选的）。
图4.用2、3或4个核苷酸序列标识符从样本DNA制备接头连接的扩增子的方法。提供样本DNA（1），样本DNA包括两侧为两个引物结合位点（P1和P2）的内部序列（IS），以及一对扩增引物（2），扩增引物在3′端包括和引物结合位点互补的序列，以及引物中的至少一个在5′端包括核苷酸序列标识符（NSI1和任选（NSI2））。用扩增引物扩增样本DNA（3），产生带有至少一个核苷酸序列标识符的扩增子（4）。提供一对接头，接头包括第三和任选第四核苷酸NSI（NSI3和任选（NSI4）），接头连接至扩增子的各端，从而提供接头连接的扩增子（6）。所述至少两个NSI可以在IS两侧，和/或所述至少两个NSI可以在IS同一侧（5′表示核苷酸链的5′端；括号表示此方法中纳入第二和/或第四NSI是任选的）。
图5.用于确定接头连接的DNA片段的两个核苷酸序列标识符的序列的方法。
提供样本DNA（1），使其片段化提供DNA片段（2），提供包括第一和第二NSI（NSI1和NSI2）的一对接头（3），接头连接到DNA片段的各端，产生接头连接的DNA片段（4）。各接头包括测序引物结合位点（SEQ1和SEQ2），任选各包括扩增引物结合位点（（P1）和（P2））。位点在接头中存在的顺序是：（P）-SEQ-NSI，如（P1）-SEQ1-NSI1。连接到DNA片段的接头一侧是含有NSI的一侧。可任选用针对引物结合位点的引物扩增接头连接的DNA片段（4）。接头连接的DNA片段的各链，可作为用于测序反应的模板。所用的一个模板链表示如下：3′-（P1）-SEQ1-NSI1-IS-NSI2（P2）-SEQ2-5′，其中测序引物是用来针对SEQ1的。
提供测序引物，从而从各模板从SEQ1或SEQ2确定NSI的序列。可分别确定该序列。可连续确定该序列，如，比如在配对末端测序中（5′表示核苷酸链的5′端）。
图6.用于确定接头连接的DNA片段的两个核苷酸序列标识符序列的方法：单读取双标签。
提供样本DNA（1），使其片段化提供DNA片段（2），提供包括第一和第二NSI（NSI1和NSI2）的一对接头，接头连接到DNA片段的各端（3），产生接头连接的DNA片段（4）。各接头包括测序引物结合位点（SEQ1或SEQ2），任选各包括扩增引物结合位点（（P1）或（P2））。位点在两个接头中存在的顺序：（P1）-SEQ1-NSI1和SEQ2-NSI2-（P2）。接头连接至DNA片段，从而（P1）和（P2）位点是接头连接的DNA片段的外侧位点（4），可任选用针对其的引物扩增接头连接的DNA片段（5）。在使用SEQ1和SEQ2测序引物结合位点（即使用相应的不同测序引物）的两个不同的测序反应中，接头连接的DNA片段的一条链，可作为测序的模板。所用的模板链表示如下：3′-（P1）-SEQ1-NSI1-IS-SEQ2-NSI2-（P2）-5′（5′表示核苷酸链的5′端）。
图7.用于从样本DNA确定扩增子的两个核苷酸序列标识符的序列的方法。提供样本DNA（1），样本DNA包括两侧为两个引物结合位点（P1和P2）的内部序列（IS），以及一对扩增引物（2），扩增引物在3′端包括和引物结合位点互补的序列以及在5′端包括测序引物结合位点（SEQ）。在扩增引物中上述二者之间，设置核苷酸序列标识符。用扩增引物扩增样本DNA（3），产生在各侧带有两个核苷酸序列标识符的扩增子，在扩增子的外端有两个SEQ（SEQ1和SEQ2）。扩增子的各链可作为用于测序反应的模板。所用的一个模板链表示如下：3′-SEQ1-NSI1-P1-IS-P2-NSI2-SEQ2-5′，测序引物是用来针对SEQ1的。提供测序引物，从而从各模板确定NSI序列。可分别确定该序列。可连续确定该序列，如，比如在配对末端测序中（5′表示核苷酸链的5′端）。
图8.用于从样本DNA确定扩增子的两个核苷酸序列标识符的序列的方法：单读取双标签。提供样本DNA（1），样本DNA包括两侧为两个引物结合位点（P1和P2）的内部序列（IS），以及一对扩增引物（2），扩增引物在3′端包括和引物结合位点互补的序列（C1或C2）。除此之外，引物还包括NSI和测序引物结合位点，包括不同位点/序列的不同引物表示如下：5′-SEQ1-NSI1-C1和C2-SEQ2-NSI2-5′。用扩增引物扩增样本DNA（3），产生在各侧带有核苷酸序列标识符的扩增子，在扩增子的一个外端有SEQ1，在另一外端有NSI2（4）。在使用SEQ1和SEQ2测序引物结合位点（即使用相应的不同测序引物）的两个不同的测序反应中，扩增子的一条链可作为测序的模板。所用的模板链表示如下：3′-SEQ1-NSI1-P1-IS-P2-SEQ2-NSI2-5′（5′表示核苷酸链的5′端）。
图9.用于从样本DNA确定扩增子的四个核苷酸序列标识符的序列的方法：单读取双标签。
提供样本DNA（1），样本DNA包括两侧为两个引物结合位点（P1和P2）的内部序列（IS），以及一对扩增引物（2），扩增引物在3′端包括和引物结合位点互补的序列（C1或C2）。除此之外，引物还包括NSI，以及引物之一还包括测序引物结合位点。包括不同区段的不同引物表示如下：5′-NSI1-C1和C2-SEQ2-NSI2-5′。用扩增引物扩增样本DNA（3），产生在扩增子的一个外端带有两个核苷酸序列标识符的扩增子。之后，提供一对接头（4）。一个接头包括测序引物结合位点（SEQ1）和NSI（NSI3），另一引物包括NSI（NSI4）。接头连接至扩增子的各端，产生接头连接的扩增子，其中SEQ1区段在接头连接的扩增子的外端（5），SEQ1和SEQ2在IS的两侧。在使用SEQ1和SEQ2测序引物结合位点（即使用相应的不同测序引物）的两个不同的测序反应中，接头连接的DNA片段的一条链可作为测序模板。所用的模板链表示如下：3′-SEQ1-NSI3-NSI1-IS-SEQ2-NSI2-NSI4-5′（5′表示核苷酸链的5′端）。
图10.用于从样本DNA确定扩增子的四个核苷酸序列标识符的序列的方法。
提供样本DNA（1），样本DNA包括两侧为两个引物结合位点（P1和P2）的内部序列（IS），以及一对扩增引物（2），扩增引物在3′端包括和引物结合位点互补的序列（C1或C2）。此外，引物还包括NSI。包括不同区段的不同引物表示如下：5′-NSI1-C1和C2-NSI2-5′。用扩增引物扩增样本DNA（3），产生在扩增子的一个外端带有两个核苷酸序列标识符的扩增子。之后，提供一对接头（4）。各接头包括测序引物结合位点（SEQ1或SEQ2）和NSI（NSI3或NSI4）。接头连接至扩增子的各端，产生接头连接的扩增子，其中SEQ1和SEQ2区段在接头连接的扩增子的外端（5）。接头连接的扩增子的各链可作为测序反应的模板。提供测序引物，从而从各模板确定NSI序列。可分别确定该序列。可连续确定该序列，如，比如在配对末端测序中。所用的模板链之一表示如下：3′-SEQ1-NSI3-NSI-1-P1-IS-P2-NSI2-NSI4-SEQ2-5′，其中使用的测序引物是针对SEQ1的（5′表示核苷酸链的5′端）。
图11.用引物对的扩增（UT1，通用尾1；BC1，条形码部分1，UT2通用尾2；BCP2，条形码部分2）。
A.通用尾1可以是序列引物位点1（粗黑箭头）和通用尾2可以是序列引物位点2（点画箭头），如，在Illumina GA配对末端测序的情况中的P5和P7。
B.通用尾1可以是序列引物位点1（粗黑箭头）和通用尾2可以是序列引物位点2（虚线箭头），如，在具有从同一链的两次引物事件的Illumina GA测序的情况中的P5和P7。
图12.一对条形码接头的连接（P5，P5+seq.pr.位点；BC1，条形码部分1；BC2，条形码部分2；P7，P7+seq.pr.位点；B，平端接头）。
A.EcoRI和Msel条形码接头连接至EcoRI/Msel消化的DNA，其中条形码部分1（EcoRI侧）和2（Msel侧）的组合唯一地限定样本。
B.EcoRI和平端条形码接头连接至样本，其中先用EcoRI消化样本，随后是EcoRI条形码接头连接（条形码1），随后将接头连接的片段进行片段化，补平（polishing）任选端，随后是平端接头连接（条形码2），其中条形码部分1（EcoRI侧）和条形码部分2（平端侧）的组合唯一地限定样本。
具体实施方式
定义
在如下描述和实施例中，使用了一些术语。为了提供对说明书和权利要求（包括这种术语所给出的范围）清楚一致的理解，提供下面的定义。除非此处另有指明，否则所用的所有技术和科学术语，同本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的，具有相同含义。所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的公开通过参考其全部并入此处。
实施本发明方法中所用常规技术的方法对于技术人员而言将是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的常规技术操作对于本领域技术人员是公知的，并在例如以下参考文献中进行了讨论：Sambrook等人，Molecular Cloning.A LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NewYork,1987及其定期更新；以及丛书Methods in Enzymology,Academic Press,SanDiego。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文清楚地另有指明。例如，分离DNA包括分离多个DNA分子（如10个、100个、1000个、1万个、10万个、百万个、或者更多分子）。
“核苷酸序列”，根据本发明可包括核苷酸（比如嘧啶和嘌呤碱基，分别优选为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤）的任何聚合物或寡聚物，及其组合（见Albert L.Lehninger,Principles of Biochemistry,793-800（Worth Pub.1982），其被整体引用并纳入此处用于各个目的）。本发明考虑任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分，及其任何化学变体，比如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。聚合物或寡聚物在组成方面可以是异质的或均质的，并且可以分离自天然发生的来源或者可以是人工或合成生产的。此外，核苷酸序列可以是DNA或RNA，或其混合物，并且可以以单链或双链形式永久或暂时存在，包括同源双链、异源双链和杂交状态。
“样本DNA”根据本发明是指源自生物体并包含DNA的样本。“样本DNA”不仅可包括来自包含DNA的生物体的细胞，还包括从来自生物体的细胞分离的DNA。只要“样本DNA”包括可用于本发明方法中的DNA，这样的样本DNA就可用于本发明。从其可获得样本DNA的生物体是例如植物、哺乳动物、真菌和微生物。样本DNA也可包括表达的序列标签或cDNA，其中由于RNA表达于生物体的细胞中，通过反转录将其转换成双链DNA。样本DNA也可包括获自生物体不同位点、和/或获自几个不同生物体的合并的样本DNA。合并的样本DNA可被合并于例如一个3-D池方案（pooling scheme）中，从而可确定包括在样本DNA中的各样本的来源（例如，如WO2007/037678中描述的）。
“片段化DNA”包括当应用到样本DNA时产生DNA片段的任何技术。本领域公知的技术是超声、剪切和/或酶限制，但也可考虑其它技术。
“限制性内切酶”或“限制性酶”是一种酶，其识别例如双链DNA分子中的特异性核苷酸序列（识别位点），并将在每个识别位点处或附近切割DNA分子的两条链，产生平的或3′-或5′-突出端。识别的特异性核苷酸序列可确定切割的频率，如6个核苷酸的核苷酸序列发生在平均每4096个核苷酸上，4个核苷酸的核苷酸序列发生得更频繁地，出现在平均每256个核苷酸上。I型限制性酶在不同于其识别位点的地方切割，离其识别位点有一定的距离（至少1000bp）。识别位点是不对称的，并且由两个部分组成—一个含3-4个核苷酸，另一个含4-5个核苷酸—由约6-8个核苷酸的间隔分开。II型限制性酶具有通常未分割的和回文的且4-8个核苷酸长的识别位点。它们在同一位点识别和切割DNA。IIs型在其识别序列之外进行切割，IIB型在其识别位点的两侧切割DNA来切掉识别位点。III型限制性酶（如，EcoP15）识别两个单独的反向的非回文序列。它们在识别位点后切割DNA约20-30个碱基对。IV型限制性酶切割甲基化DNA。
“补平”包括用于使具有3′或5′突出的双链核苷酸序列变为平端的任何技术。例如，在这种情况，使用超声或使用酶使样本DNA片段化产生交错的（突出）端。DNA聚合酶I、大（Klenow）片段可以用来填补5′突出（也称为3′凹端）且去掉3′突出，或绿豆核酸酶可以用来去掉3′或5′突出。
“连接”根据本发明涉及单独双链核苷酸序列的连接。双链DNA分子可以是平端的，或可具有兼容的突出（粘性突出），从而突出可以彼此杂交。DNA片段的连接可以是利用连接酶、DNA酶的酶促的。然而，也可使用非-酶促连接，只要DNA片段被连接上，即形成共价键。通常，在连接反应中，形成单独链的羟基和磷酸基团之间的磷酸二酯键。双链核苷酸序列可在连接之前被磷酸化。
“扩增引物”是指可以引发DNA合成的单链核苷酸序列。DNA聚合酶没有引物不能从头合成DNA。扩增引物杂交至DNA，即形成碱基对。可以形成碱基对的核苷酸彼此是互补的，例如胞嘧啶和鸟嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶。扩增引物和存在的DNA链之间的互补性无需为100％，即并非引物的所有碱基都需要与存在的DNA链碱基配对。扩增引物所杂交（或部分杂交）的存在的DNA链（如样本DNA或接头连接的DNA片段）的序列，通常被称为引物结合位点（PBS）。从与存在的DNA链杂交的引物的3′端，使用存在的链作为模板并入核苷酸（模板指导的DNA合成）。我们也可涉及合成的寡核苷酸分子，其在扩增反应中用作“引物”。扩增反应中新合成的核苷酸序列可被称为内部序列。一旦进行PCR反应，内部序列通常是两个引物结合位点之间的序列。根据本发明，可以在扩增步骤中使用引物向DNA引入额外的序列。这可以通过提供具有额外序列（如标识符、测序接头或捕获配体如生物素部分）的引物来实现。可以通过在引物的5′端提供修饰，而在来自引发DNA合成的引物部分上游引入修饰。
“扩增”或“扩增”是指多核苷酸的扩增反应，即，一群多核苷酸从一个或多个起始序列被复制。扩增可涉及各种的扩增反应，包括但不限于聚合酶链反应（PCR）、线性聚合酶反应、基于核酸序列的扩增、滚环扩增等反应。通常情况下，扩增引物用于扩增，扩增反应的产物是扩增子。
“测序引物”指的是单链核苷酸序列，其可以引发DNA的合成，并用于测序DNA。扩增引物也可用作测序引物。测序引物可用作扩增引物。没有引物DNA聚合酶不能从头合成DNA。测序引物杂交至DNA，即形成碱基对。可以形成碱基对的核苷酸彼此是互补的，例如胞嘧啶和鸟嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶。扩增引物和存在的DNA链之间的互补性无需为100％，即并非引物的所有碱基都需要与存在的DNA链碱基配对。测序引物所杂交（部分杂交）的存在的DNA（如样本DNA或接头连接的DNA片段）链的序列，通常被称为测序引物结合位点（SEQ）。从与存在的DNA链杂交的测序引物的3′端，使用存在的链作为模板并入核苷酸（模板指导的DNA合成）。在合成过程中，可以检测到特定核苷酸（A、T、C或G）的并入，如焦磷酸测序法或者当使用荧光标记的核苷酸时。或者，可以使用链终止法，如Sanger测序或染料终止测序。在任何情况下，只要可以通过用测序引物合成DNA并检测并入的核苷酸和/或合成的片段来确定DNA模板的核苷酸顺序，就可以考虑这些和其它方法。
“测序”是指确定核酸样本如DNA或RNA中核苷酸（碱基序列）的顺序。可获得许多技术，如Sanger测序和高通量测序技术（HTS）。Sanger测序可涉及通过（毛细管）电泳检测的测序，其中多达384个毛细管可在一次运行中进行序列分析。高通量测序涉及在一次当中平行测序数千或数百万或更多的序列。HTS可以被定义为下一代测序（即基于固相焦磷酸测序的技术）或定义为下-下代测序（基于单核苷酸实时测序（SMRT））。HTS技术是可用的，如Roche、Illumina和Applied Biosystems（Life Technologies）所提供的。其它高通量测序技术由如下描述和/或获得：Helicos、Pacific Biosciences、Complete Genomics、Ion TorrentSystems、Oxford Nanopore Technologies、Nabsys、ZS Genetics、GnuBio。这些测序技术的每一个在实际测序步骤前有自己的制备样本的方式。这些步骤可包括在高通量测序方法中。在某些情况下，出于效率或经济的原因，特别是用于测序步骤的步骤可能被整合到实际测序步骤前的样本制备操作中。例如，连接到片段的接头可包含可用于随后测序步骤的区段（所谓的测序接头）。或用于在测序之前扩增片段子集的引物，在其序列中可包含引入区段的部分，该区段可被用于之后的测序步骤中，例如，通过经由扩增步骤在扩增子中引入可用于随后测序步骤的测序接头或捕获部分。还取决于所使用的测序技术，扩增步骤也可以省略。
“接头”是具有有限数目的碱基对的短双链DNA分子，例如约10至约100个碱基对的长度，它是这样设计的，它们可以被连接到DNA片段或扩增子的端部。接头通常由两个合成的寡核苷酸组成，合成的寡核苷酸具有至少部分地彼此互补的核苷酸序列。接头可能有平端、可能有交错端、或平端和交错端。交错端是一个3′或5′突出。当在溶液中在适当的条件下混合两个合成的寡核苷酸时，它们将彼此退火形成双链结构。退火后，接头分子的一端可以经过设计，从而使得它和限制性片段的端兼容，并可以连接至此；接头的其它端可以经过设计，从而使得它不被连接，但不一定是这样，例如当接头连接于DNA片段之间时。在某些情况下，接头可以连接至片段上以提供进行接头连接片段的后续操作的起点，例如用于扩增或测序。在后者的情况下，所谓的测序接头可被连接至片段上。
发明详述
根据本发明的第一方面，提供了至少两个核苷酸序列标识符的组合在制备用于高通量测序的样本DNA中的用途。因此，提供了包括这样的步骤的方法，其中至少两个核苷酸序列标识符的组合用于制备用于高通量测序的样本DNA。通过根据此处的样本DNA的制备，意味着这样制备样本DNA从而至少两个NSI包括在样本DNA中，即至少两个NSI包括在例如扩增子和/或接头连接的DNA片段或其扩增子中。因此所述至少两个NSI包括在样本DNA的核苷酸序列中从而单个多核苷酸分子包括至少两个NSI。NSI的组合作为样本DNA的独特标识符（分割条形码）。
从设计的角度，对可用的核苷酸序列标识符的数目没有实际限制。例如，一个核苷酸就已经可以作为核苷酸序列标识符。因此，可设计4个不同的核苷酸序列标识符：A、G、C或T。这种单个核苷酸标识符两侧的序列可用于引导NSI的鉴定。通过增加条形码的大小，可能性的数目增加。三个DNA碱基允许64种可能的3-mer序列（43）、256种可能的4-mers序列（=44）、1024种可能的5-mers序列（=45）、以及4096种可能的7-mers序列（=46）等。然而实际上，优选选择来自这些序列的子集，来避免在相同实验中使用仅有一个碱基区别（比如，例如在4-mers情况中GATC和GATT）的核苷酸序列标识符，因为这可导致在一个碱基扩增-或测序误差的情况下的错误指定。相似地，可优选避免使用具有两个相同的连续的碱基的核苷酸序列标识符（如在5-mer情况中AATGC具有两个连续的A），因为某些NGS平台对所谓的“同聚物”序列有较高的误差率。尽管这种选择准则，通常不缺少合适的核苷酸序列标识符，因为其长度增加一个碱基就产生高四倍的可从中选择的起始数目。
因此，例如当在制备的样本DNA的高通量测序方法中确定两个NSI序列时，两个NSI的组合确定制备的样本DNA的来源。这种方式可显著减少NSI的数目，并且因此例如可显著减少所要用的不同引物和/或接头的数目。例如，对于100个样本，目前使用100个NSI，如包括NSI的100个不同正向引物同一个反向引物组合。根据本发明，通过使用分割条形码，10个NSI就足够了，并且因此可使用10个不同的正向引物和10个不同的反向引物，由此可产生100个独特组合。因此，所要用的引物总数显著减少，数目从101个引物降低到20个引物。因此，降低了样本制备流程的复杂程度、增加了样本等同表示（representation）的可能、降低了工作量和所需的储存容量并降低了实验成本。
在另一实施方式中，提供了至少两个NSI的组合在制备用于高通量测序的样本DNA中的用途，其中在高通量测序中使用多个制备的样本DNA，其中各样本DNA制备包括至少两个NSI的独特组合，其中第一NSI选自一组NSI，且第二NSI选自一组NSI。
所用的NSI的组包括所有NSI。对于各样本DNA，核苷酸序列标识符选自这样的组。这意味着对于样本DNA对于至少两个NSI，可以在NSI的组合中选择相同的NSI。此外，对于样本DNA对于至少两个NSI，可以在NSI的组合中选择不同的NSI。只要NSI的组合对于各样本DNA是独特的，这种组合就可用。NSI的组还可包括至少两个NSI的亚组，其中各第一和第二NSI可选自不同亚组。除了第一和第二NSI，其它可用的NSI选自NSI的组。一组NSI可包括至少4、10、100或1000个NSI。
应当理解，其中贯穿本发明提供一组NSI，该组可实质上提供，即不是物理上的。例如该组可在计算机上（in silico）和/或物理上（in physico）提供。例如，一组NSI可作为一个序列列表而提供。NSI可选自该列表并用于在计算机上设计引物和/或接头。因此应理解，提供一组NSI和提供接头的随后步骤可包括在计算机上提供一组NSI（其选自计算机上的NSI组）、在计算机上设计接头、和随后物理上提供包括NSI的接头。或者，还可物理上提供NSI并直接使用，例如，在这样的情形中，其中使用由核苷酸序列标识符组成的接头。或者例如，可物理上提供NSI并连结（如连接或其它）至其它核苷酸链，从而产生接头和/或扩增引物，从而提供包括NSI的接头和/或扩增引物。
本发明的原理是通过使用至少两个不同核苷酸序列标识符产生大量独特组合，其中核苷酸序列标识符并入各样本，以及探索倍增的能力以便减少预付的试剂成本。在表1中显示了对于两个NSI的一些数学最优情况。
表1.具有两个NSI的NSI最优组合
Figure BDA00002541299800101
如所述，概念并不限于表2中所示的实例，但也可以考虑其它的组合。例如，可选择次优的组合。也可以选择可能涉及两个以上NSI的组合。例如，利用10个NSI，组合四个NSI，10×10×10×10=10,000个的独特组合是可能的。在所用的设计和/或组合策略中，也要考虑实践上的考虑，如涉及样本DNA的制备的实践考虑。
制备的样本DNA是已经进行处理的样本DNA，借此至少两个核苷酸序列标识符包含在DNA中，即至少两个NSI包括在含有两个NSI和来自样本DNA的序列的DNA分子中。DNA分子可以是双链DNA分子或单链DNA分子。应了解制备的样本DNA可包括多个不同的DNA分子，各DNA分子含有NSI的独特组合，从而各DNA分子可被指定到它源于的样本DNA。在高通量测序方法中，用高通量测序可确定来自多个DNA分子的各DNA分子的序列。
在一个实施方式中制备的样本DNA包括扩增子。比如至少两个NSI包括在所用的引物中来制备扩增子。因此扩增子包括来自所用的至少两个不同引物的至少两个NSI。例如可在PCR反应中制备扩增子。也可从巢式PCR制备扩增子，即在第一PCR反应中用第一套引物制备第一扩增子，随后由第二PCR反应用第二套引物制备第二扩增子，其中第二套引物不同于第一套引物以及该第二套引物扩增第一PCR反应的扩增子。例如可进行巢式PCR扩增非常低浓度的DNA序列，或例如可以用来提供一个附加标识符或多个附加标识符。
在一个实施方式中，制备的样本DNA包括接头连接的DNA片段，样本DNA进行片段化，并且接头连接到DNA片段。至少两个接头被连接到DNA片段，至少两个接头中的每一个包括一个NSI。
在一个实施方式中，制备的样本DNA包括扩增子和接头连接的片段。
在一个实施方式中，制备的样本DNA包括扩增的接头连接的片段和/或接头连接的扩增子。比如，随后样本DNA可进行片段化、接头连接和扩增。相反，样本DNA可以例如随后进行扩增、片段化、和接头连接。在本实施方式中，样本DNA制备中使用的所有扩增引物和/或接头中的至少两个包括NSI。
在一个实施方式中，根据本发明的方法包括：
a）提供接头和/或扩增引物，其中至少第一接头或扩增引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符，提供第二接头或扩增引物，其包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符，其中任选地，提供其它接头或扩增引物，其包括选自核苷酸序列标识符的组的其它核苷酸序列标识符；
b）提供多个样本DNA；
c）使用接头和/或扩增引物在样本DNA上进行连接和/或扩增反应，以提供包括第一、第二和任选其它核苷酸序列标识符的连接的和/或扩增的样本DNA；
d）使用高通量测序确定至少第一、第二和其它核苷酸序列标识符的序列；
e）确定连接的和/或扩增的样本DNA的样本来源。
只要在样本DNA的制备中，使用至少两个位于单个DNA分子末端的NSI，其中单个DNA分子包括两个NSI和来自样本DNA的DNA序列，那么根据本发明可以考虑这样的样本制备方法。因此，可以将单独的不同接头连接步骤和/或单独的扩增步骤组合，以便在制备的样本DNA中纳入至少两个NSI。样本DNA的制备也可包括不涉及NSI加入的步骤。
应了解，在样本DNA的制备中，也可包括在随后测序步骤中可进行的步骤，反之亦然。随后测序步骤所需的步骤也可包括在样本DNA的制备中。例如，在测序反应中，测序引物可用于结合模板中存在的测序引物结合位点。因此，样本DNA制备中所用的接头和/或扩增引物可另外包括测序引物结合位点。或者，测序引物结合位点可加入到高通量测序方法中，只要这些附加的序列是在靠后的阶段。
除了在高通量测序方法中至少两个NSI的测序，来自样本DNA的序列也可被测序。这样的序列也被称为内部序列，因为这些是用样本DNA制备方法捕获和/或扩增的序列，并可能代表来自目标样本DNA的未知序列。这些内部序列也可随着NSI一起被测序，从而可以通过NSI的组合确定包括这些内部序列的样本来源。这种方式，例如通过比较内部序列和/或比较内部序列与参考序列，可检测不同样本之间的多态性，如小核苷酸多态性、缺失、插入等。此外，这些内部序列也可有助于将不同读取指定给制备的样本DNA，例如如下所述的情况中，其中不同的测序读取用来建立重叠群。
高通量测序涉及数千或数百万或更多序列的一次平行测序。无论使用何种高通量测序方法，确定制备的样本DNA的NSI，从而NSI的各组合可指定至制备的样本DNA。例如，通过比对和组合不同测序读取可建立重叠群，借此至少两个NSI可以偶联，并因此可以指定到包括至少两个NSI的单一DNA分子。此外，例如当内部序列相对较大时，在从两端需要片段内部序列的情况下，优选可在制备的样本DNA的互补链上进行两个测序反应。当两个测序读取可被指定到制备的样本DNA时，其中包括至少两个NSI和来自样本DNA的DNA序列，就可以考虑这种高通量测序方法。此外，在高通量测序方法中从单一测序读取可确定至少两个NSI。
例如，在所谓的配对末端测序法中，在第一测序反应中，使用链当中的一条作为模板，可确定第一序列包括NSI。第一测序反应后，从首先用作模板的链可产生互补链。使用这种新生成的链作为第二模板，可随后进行第二测序反应。因此，在该方法中使用两个DNA模板链。例如，第一测序模板链的结构可以是3′-序列引物结合位点1-NSI1-内部序列-反向互补NSI 2-反向互补序列引物结合位点2-5′。第一次测序反应后，可以产生第一测序模板链的反向互补，其随后可用在第二测序反应中。第二测序反应因此具有下面的模板：3′-序列引物结合位点2-NSI 2-反向互补内部序列-反向互补NSI 1-反向互补序列引物结合位点1-5′。因为这两个序列读取共同定位（如，在相同的孔中，相同的珠），含有NSI 1和NSI 2的两个序列读取可指定给相同的制备的样本DNA并用于鉴定制备的样本DNA。样本制备和随后测序的这种情形描述于图5、7和10中。
在一个实施方式中，在高通量测序方法中，使用制备的样本DNA的单一DNA模板。通过根据本发明的单一DNA模板是指包括至少两个核苷酸序列标识符的单链DNA分子。应了解，来自制备的样本DNA的单一DNA模板可包括多个单一DNA模板分子，例如包括源自样本DNA的不同内部序列，其中各不同内部序列连接有NSI的独特组合。例如当制备的样本DNA是扩增子（或多个扩增子）时，扩增子包括两条DNA链。在本实施方式中，只有扩增子的一条链用于测序反应以确定NSI序列。通过这种方式，可确定制备的样本DNA的来源，而不需要建立重叠群和/或不需要源自另一DNA模板的序列。NSI可在制备的样本DNA的内部序列两侧。NSI也可以在制备的样本DNA的（内部序列的）一侧。在这些情况下，制备的样本DNA的单一DNA模板分子可以具有下列结构：3′-序列引物结合位点-NSI1-内部序列-NSI2-5′或3′-序列引物结合位点-NSI1-NSI2-内部序列-5′。制备的样本DNA可包括附加的序列。序列引物结合位点、NSI和内部序列的顺序是此结构表示中所关注的。在样本DNA的制备过程中和/或高通量测序方法中可纳入序列引物结合位点。高通量测序中产生的序列的长度和/或质量可能是有限的。另一方面，测序长度可能会受到限制，使得不能确定内部序列两侧的两个NSI。有利的是，使NSI位于内部序列的一侧上，即首先测序的单一DNA模板的部分，从而在单一读取中可以确定两个序列。NSI也可以位于内部序列的两侧。
在一个实施方式中，使用的单一DNA模板可包括两个测序引物结合位点，其中各测序引物结合位点位于不同核苷酸序列标识符的3′。一般情况下，单一DNA模板可包括第一区段和第二区段，两者之间是源自样本DNA的内部序列。第一区段包括测序引物结合位点，位于其5′是NSI和任选其它NSI，第二区段包括第二测序引物结合位点，位于其5′是NSI和任选其它NSI。在这种情况下，制备的样本DNA的单一DNA模板可以具有下列结构：3′-序列引物结合位点1-NSI 1-内部序列-序列引物结合位点1NSI2-5′。制备的样本DNA可包括附加序列。序列引物结合位点、NSI和内部序列的顺序是此结构表示中所关注的。因此，测序引物结合位点可直接位于核苷酸序列标识符的3′，但附加序列也可以存在于测序引物结合位点和核苷酸序列标识符之间。在这种情况下，从单一模板，在高通量测序方法中可以连续进行两个不同的测序反应。一个测序反应将确定一个（或多个）NSI，以及第二测序反应（确定）第二NSI（或更多）。在使用相同模板的高通量测序方法中所进行的本实施方式的两个测序反应，此后可以被称为“单读取双标签”测序。这种单读取双标签的情形描述于图6、8和9。
在所用的样本制备期间和/或高通量测序方法期间，可以合并不同样本或不同样本的部分，从而可以同时进行的步骤可以同时进行。样本来源可能仍确定为无样本或不同样本的部分被合并，借此可能无法再追溯样本的来源。例如，在这样的情形中，在样本DNA的制备中，在不同步骤中加入NSI，可有助于在这样的步骤后合并至少一部分制备的样本。例如，在这样的情形中，其中6个NSI用于36个样本，各样本DNA首先进行这样的步骤，即加入6个不同NSI（A-F）中之一。可以合并包括独特标识符的样本（A1、B1、C1、D1、E1、F1），现在各池可接受6个标识符之一的加入，6个的每组具有独特第二标识符（A2、B2、C2、D2、E2或F2），其中A1和A2等可以或可以不是相同的。最后，一旦制备所有样本DNA,可通过任何可能的方式合并制备的样本DNA（部分或作为一个整体），因为现在合并至少两个独特标识符。
用于鉴定包括至少两个NSI独特组合的制备的样本DNA的样本来源，不同方法是可能的。
在本发明的一个实施方式中，提供一种用于从多个样本DNA鉴定扩增子样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一扩增引物，各第一引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
d）提供第二扩增引物，各第二引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
e）用一对独特的第一和第二扩增引物扩增各样本DNA，得到扩增子；
f）任选地，合并至少部分扩增子；
g）使用高通量测序确定扩增子的第一标识符序列和第二标识符序列的序列；
h）确定扩增子的样本来源。
本实施方式的这个方法的样本制备的示意图显示于图1。在该方法中两个NSI包括在第一和第二扩增引物中。扩增子包括两个NSI。扩增引物可被设计成用于扩增感兴趣的特定内部序列。通过对扩增子的至少部分内部序列和两个NSI进行测序，各测序的（部分）内部序列可被指定到其所来自的样本DNA。或者，可以这样设计扩增引物使得它们选择性的针对特定引物结合位点。仅通过确定两个NSI的序列，来确定特定样本DNA的扩增子的存在或不存在。使用的扩增引物可具有适合接头连接的磷酸化5′端，其可用于随后的高通量测序方法。或者，如果需要的话，扩增子可被磷酸化。
在一个实施方式中，提供一种用于从多个样本DNA鉴定接头连接的DNA片段的样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一接头，各第一接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
d）提供第二接头，各第二接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
e）各样本DNA进行片段化；
f）将一对独特的第一和第二接头连接至各片段化的样本DNA，得到接头连接的DNA片段；
g）任选地，合并至少部分接头连接的DNA片段；
h）使用高通量测序确定接头连接的DNA片段的第一标识符序列和第二标识符序列的序列；
i）确定接头连接的DNA片段的样本来源。
显示本实施方式的方法的样本制备的示意图显示于图2。在该方法中，两个接头连接到DNA片段。如图2中所示，接头可连接至片段的两个位点中的任一个。这特别适合于使用这样的接头连接策略的高通量测序方法。许多将两个不同接头连接至片段的策略是可能的。例如，首先用带有两个不同识别位点的两种限制性酶对DNA进行片段化。这不仅产生这样的DNA片段，其具有作为一种限制性酶的结果的端部，还产生这样的片段，其具有作为两种限制性酶的结果的端部。当这样设计两种不同接头使其可以连接到各端的特异性限制性端时，可以形成包括两个不同接头的接头连接的片段。此外，形成包括两个相同接头的接头连接片段。或者，例如可使用单一限制性酶将DNA片段化，随后向其连接兼容接头。接下来，可再次将接头连接的片段片段化，但这次使用例如超声。接下来将片段的端补平，并向补平的端连接平端接头。其结果是接头连接的片段的混合物，包括含有限制性酶兼容接头和平端兼容接头的接头连接的片段。在这两种情形中，形成可包括两个NSI的接头连接的片段。只能确定包括两个不同接头的接头连接的片段的样本来源，因为它是确定样本来源所需的两个NSI的组合。
在一个实施方式中，提供一种用于鉴定接头连接的扩增子的样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一扩增引物；
d）提供第二扩增引物；
e）用一对第一和第二扩增引物扩增样本DNA，得到扩增子；
f）任选地，合并样本DNA的至少部分扩增子，其中各样本DNA是利用不同的引物对进行扩增的；
g）任选，扩增子进行片段化；
h）提供第一接头，各第一接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
i）提供第二接头，各第二接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
j）任选，提供其它接头，各接头包括选自核苷酸序列标识符的组的其它核苷酸序列标识符；
k）将第一接头连接至（片段化的）扩增子；
l）任选地，合并来自步骤k）的至少部分接头连接的扩增子；
m）用第二和其它接头重复连接步骤，各连接步骤之后任选地，合并至少部分获得的接头连接的扩增子；
n）使用高通量测序确定步骤m）中获得的接头连接的扩增子的第一、第二和任选其它标识符序列的序列；
o）确定接头连接的扩增子的样本来源。
在本实施方式中，各样本DNA进行至少一个PCR扩增反应。对各样本可以进行多重PCR反应，例如针对不同靶序列。可任选合并各样本的这些不同扩增子。在本实施方式中，可以在不同步骤中加入的NSI，并在每个步骤之后，可合并至少部分接头连接的扩增子。
在其它一些实施方式中，连接接头和扩增相结合，其中可以通过确定制备的样本DNA的2-4个NSI来确定制备的样本DNA的样本来源。
在一个实施方式中，提供一种用于从多个样本DNA鉴定扩增的接头连接的DNA片段的样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一接头，各第一接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
d）提供第二接头，各第二接头任选地包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
e）各样本DNA进行片段化；
f）将至少第一接头和任选第二接头连接至片段化的样本DNA，得到接头连接的DNA片段；
g）任选地，合并至少部分接头连接的DNA片段；
h）提供第一扩增引物，各第一引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第三核苷酸序列标识符；
i）任选地，提供第二扩增引物，各第二引物任选包括选自核苷酸序列标识符的组的第四核苷酸序列标识符；
j）用第一扩增引物和任选第二扩增引物扩增接头连接的DNA片段，其中第一、任选第二、第三和任选第四NSI的组合对于各样本是独特的，得到扩增的接头连接的DNA片段；
k）任选地，合并至少部分扩增的接头连接的DNA片段；
l）使用高通量测序确定扩增的接头连接的DNA片段的第一、任选第二、第三和任选第四标识符序列的序列；
m）确定扩增的接头连接的DNA片段的样本来源。
本实施方式的方法的样本制备的示意图显示于图3。在这种情形下，可按如上所述制备接头连接的片段。或者，只有一个接头已连接到片段上。除了NSI以外，接头可以包括可用于随后扩增的引物结合位点，优选测序引物结合位点。在片段各侧使用相同的接头的情形下，可使用相同的扩增引物扩增接头连接的片段。引物结合位点还可以包括（部分）NSI。或者，可使用（更多）选择性引物，其需要附加（不同）的核苷酸，其互补于内部序列限制性识别位点序列之外的DNA片段内部序列。选择性引物的概念是例如在WO2006/137733中所充分描述的，本实施方式中的方法可能涉及使用这种选择性引物的样本DNA制备。例如，设计引物使得它互补于（部分）接头序列，以及包括限制性识别位点和附加的核苷酸的接头所连接的样本DNA的内部序列。该附加的核苷酸是使得引物具有选择性的选择性核苷酸。平均来说，选择性引物可以结合四个接头连接的限制性片段中的一个并具有3′端延长。从AFLP（EP534858）中众所周知选择性引物的概念是一种复杂性降低的方法。
在任何情况下，最终的结果是扩增的接头连接的片段，该片段可包括至少两个NSI，或甚至3或4个NSI。包括更多NSI可能是有利的，因为这可能甚至进一步减少NSI数目。例如，其中对于10,000个样本，在两个NSI（100×100）的组合中需要100个NSI，在四个NSI（10×10×10×10）的组合中需要10个NSI。
在一个实施方式中，提供一种用于鉴定接头连接的扩增子的样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一扩增引物，各第一引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
d）提供第二扩增引物，各第二引物任选包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
e）用一对第一和第二扩增引物扩增各样本DNA，得到扩增子；
f）任选地，合并至少部分样本DNA的扩增子，其中各样本DNA是利用不同的引物对进行扩增的；
g）任选，扩增子进行片段化；
h）提供第一接头，各第一接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第三核苷酸序列标识符；
i）任选地，提供第二接头，各第二接头任选地包括选自核苷酸序列标识符的组的第四核苷酸序列标识符；
j）将至少第一接头和任选第二接头连接至（片段化的）扩增子，其中第一、任选第二、第三和任选第四核苷酸序列标识符的组合对于各样本是独特的，得到接头连接的扩增子；
k）任选地，合并至少部分接头连接的扩增子；
l）使用高通量测序确定接头连接的扩增子的第一、任选第二、第三和任选第四标识符序列的序列；
m）确定接头连接的扩增子的样本来源。
本实施方式的方法的样本制备的示意图显示于图4。在这种情形下，可按如上所述进行样本DNA扩增，其中现在至少引物中的一个包括NSI。可直接使用扩增子（有或没有补平），接头可连接到扩增子。在这种情形下，接头连接的扩增子将在各端包括相同的接头。这个接头连接的扩增子可进行进一步片段化以及至第二接头的接头连接以获得具有两个不同接头的接头连接的扩增子。或者，扩增子可以进行片段化步骤，产生具有两个不同端部的片段，其中端部与两个不同接头相兼容。在任何情况下，形成包括2-4个NSI的接头连接的扩增子。
在一个实施方式中，在根据任何如上所述方法的方法中，在使用高通量测序确定标识符序列的序列的步骤中，从制备的样本DNA的单一DNA模板确定标识符序列的序列。应了解在如上方法中制备的样本DNA包括扩增子、接头连接的片段、接头连接的扩增子和/或扩增的接头连接的片段。
在一个实施方式中，在单一DNA模板中，第一、第二和任选其它标识符序列是内部序列的至少3′或5′。从制备的样本DNA的单一DNA模板确定制备的样本DNA中的序列标识符序列，独特鉴定样本来源所需的标识符序列的组合是内部序列的至少3′或5′。因此可以制备DNA测序模板，其将具有两侧为序列引物结合位点和内部序列的标识符序列。例如，这样的DNA测序模板的3′端可以通过下列示意表示：′3-SEQ1-NSI4-NSI3-NSI2-NS1I-IS-（等）。通过这种方式，当模板的序列被确定时，所有的序列标识符被首先确定。仅通过在内部序列的一端上添加序列标识符可产生这样的DNA模板。例如，通过仅向DNA片段的一端添加接头、和/或通过使用非对称的接头、或通过使用扩增引物组，其中只有一个引物包括序列标识符。或者，接头和/或扩增引物可被添加到DNA片段的5′和3′端，从而在两端定位所有的序列标识符。这样的DNA模板可以通过下列示意表示：′″3-SEQ1-NSI4-NSI3-NSI2-NS 1I-IS-NSI 1-NSI2-NSI3-NSI4-5′。这些不同策略的组合也是可能的，在一个或多个单独的步骤中使NSI添加到IS两端并仅在一端。这样的DNA模板可以通过下列示意表示：′″3-SEQ1-NSI2-NSI 1-IS-NSI 1-5′。只要使用这样的策略，在其中产生这样的DNA模板，在该模板上序列标识符的独特组合两侧为序列引物结合位点和内部序列，这样的DNA模板就足够了。因此，可以使用带和不带核苷酸序列标识符的扩增引物和/或接头的不同组合。例如，如在实施例3和4中所示，当任选的NSI2和NSI4将对应着NSI1和NS3时，产生合适的DNA模板（即它将仍然需要序列引物结合位点，其可以在用于高通量测序的样本制备中添加）。相似的，NSI2和NSI4序列可能不包括在内。此外，NSI2可能不包括在内，且NSI4对应着NS3，或NS 12可对应着NSI 1，且不包括NSI4。在这种情形下，只有DNA模板的一端可以包括所有的NSI。在另一个实施方式中，当从制备的样本DNA的单一DNA模板确定标识符序列的序列时，单一DNA模板可包括两个测序引物结合位点，其中各测序引物结合位点位于不同核苷酸序列标识符的3′，其中在高通量测序方法中从单一DNA模板的两个测序引物结合位点用两个测序引物进行两个不同测序反应。两个不同测序引物结合位点和相应的5′NSI或NSI可以在制备的样本DNA的内部序列的两侧。制备的样本DNA可以是如上所述的扩增子、接头连接的片段、接头连接的扩增子和/或扩增的接头连接的片段。
在一个实施方式中，单一DNA模板包括两个测序引物结合位点，其中至少一个测序引物结合位点位于至少两个核苷酸序列标识符的3′，并且其中在高通量测序方法中从单一DNA模板的两个测序引物结合位点用两个测序引物进行两个不同测序反应。
在一个实施方式中，当从制备的样本DNA的单一DNA模板确定标识符序列的序列时，单一DNA模板可包括两个测序引物结合位点，其中各测序引物结合位点位于一个或更多核苷酸序列标识符的3′，并且其中在高通量测序方法中从单一DNA模板的两个测序引物结合位点用两个测序引物进行两个不同测序反应。两个不同测序引物结合位点和相应的5′NSI或NSI可以在制备的样本DNA的内部序列的两侧。一个或更多核苷酸序列标识符中的各个可以是相同的。这样的结构可表示为如下：′-3′-SEQ1-NS1-NS2-IS-SEQ2-NS1-NS2-5′。通过这种方式，通过从单一模板测序，独特标识符的两个独特组合被测序两次。这种制备的样本DNA可以是如上所述的扩增子、接头连接的片段、接头连接的扩增子和/或扩增的接头连接的片段。
在一个实施方式中，当从制备的样本DNA的单一DNA模板确定标识符序列的序列时，单一DNA模板可包括两个测序引物结合位点，其中一个测序引物结合位点位于两个或更多核苷酸序列标识符的3′，并且其中另一个测序引物结合位点可位于邻近内部序列。在高通量测序方法中，从单一DNA模板的两个测序引物结合位点用两个测序引物进行两个不同测序反应。两个不同测序引物结合位点和相应的可以在制备的样本DNA的内部序列的两侧。这样的结构可表示为如下：′-3′-SEQ1-IS-SEQ2-NS1-NS2-5′。通过这种方式，通过在一个测序运行中从单一模板测序可以确定内部序列，以及在另一个测序运行中可以确定序列标识符的独特组合。
实施例
实施例1
如下，例举了采用分割条形码的用于样本制备的两种不同应用，但涉及向样本并入两种不同分子的其它样本制备方法也在本发明的范围内：
1）采用两个条形码引物的PCR扩增；
2）向经两种限制性酶消化的样本或向单一酶消化随后接头连接1的样本连接接头，随后是片段化和片段化端的平端化，随后是接头连接2。
PCR 扩增
提供对带有分割条形码（条形码1和条形码2）的引物对功能元件的描述，通过配对末端测序（A）或从具有两次引物事件的相同链的测序（B）确定分割条形码。在图11中提供示意图。在图11A中观察到通用尾1（粗箭头）可以是序列引物位点1（即用于测序的引物位点）和通用尾2（点画箭头）可以是序列引物位点1（即用于测序的引物位点），实例是分别用于Illumina GA配对末端测序中的P5和P7引物。图11B中通用尾1（粗箭头）可以是序列引物位点1（即用于测序的引物位点）和通用尾2（点画箭头）可以是序列引物位点2（即用于测序的引物位点），实例是分别用于具有两次引物事件的从相同链的Illumina GA中的P5和P7引物。概念可以用于涉及使用引物对扩增的任何方法。其实例是扩增子测序（如突变检测，自然多态性）、涉及PCR引物（如KASP引物、Scorpions引物等）的多重SNP基因分型。
接头连接
在整个基因组物理制图实验中，组合了480个不同BAC池样本。这将需要480个不同EcoRI条形码接头。通过使用带有5nt条形码的80个EcoRI接头组合上带有3nt条形码的6个Msel接头，来避免这种接头的量，其中组合产生独特的480个8-mer条形码。在这种情况下，通过进行两次序列引物事件进行测序，如上PCR扩增和图11B中描述的。在图12中，描述了在Illumina GA测序情况下的使用两个条形码接头的概况（使用P5和P7扩增与序列引物区）。A部分描述使用两种限制性酶消化DNA的样品制备，而B部分描述使用限制性酶和平端接头连接的组合的样本制备。涉及使用两个条形码接头的替代样本制备方法在本发明的范围内。概念可以用于涉及两个接头连接的任何方法，如限制性片段测序、AFLP、RAD、WGP、全基因组测序、配对末端测序、降低的指示的测序（Reduced representationsequencing）等。

Claims (18)

1.至少两个核苷酸序列标识符的组合在制备用于高通量测序的样本DNA中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中在高通量测序中使用多个制备的样本DNA，其中样本DNA的各制备包括至少两个核苷酸序列标识符的独特组合，其中第一核苷酸序列标识符选自一组核苷酸序列标识符，且第二核苷酸序列标识符选自核苷酸序列标识符的组。
3.根据权利要求2的用途，其中除了第一和第二核苷酸序列标识符以外，还使用选自核苷酸序列标识符的组的其它核苷酸序列标识符。
4.根据权利要求1-3的用途，其中制备的样本DNA包括扩增子。
5.根据权利要求1-4的用途，其中制备的样本DNA包括接头连接的DNA片段。
6.根据权利要求1-5的用途，其中制备的样本DNA包括扩增的接头连接的片段和/或接头连接的扩增子。
7.根据权利要求1-6的用途，其中在高通量测序方法中使用制备的样本DNA的单一DNA模板。
8.根据权利要求7的用途，其中单一DNA模板包括两个测序引物结合位点，其中各测序引物结合位点位于不同核苷酸序列标识符的3’。
9.用于鉴定连接的和/或扩增的样本DNA的样本来源的方法，包括：
a）提供接头和/或扩增引物，其中至少第一接头或扩增引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符，提供第二接头或扩增引物，其包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符，其中任选地，提供其它接头或扩增引物，其包括选自核苷酸序列标识符的组的其它核苷酸序列标识符；
b）提供多个样本DNA；
c）使用接头和/或扩增引物在样本DNA上进行连接和/或扩增反应，以提供包括第一、第二和任选其它核苷酸序列标识符的连接的和/或扩增的样本DNA；
d）使用高通量测序确定至少第一、第二和任选其它核苷酸序列标识符的序列；
e）确定连接的和/或扩增的样本DNA的样本来源。
10.用于从多个样本DNA鉴定扩增子样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一扩增引物，各第一引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
d）提供第二扩增引物，各第二引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
e）用一对独特的第一和第二扩增引物扩增各样本DNA，得到扩增子；
f）任选地，合并至少部分扩增子；
g）使用高通量测序确定扩增子的第一标识符序列和第二标识符序列的序列；
h）确定扩增子的样本来源。
11.用于从多个样本DNA鉴定接头连接的DNA片段的样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一接头，各第一接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
d）提供第二接头，各第二接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
e）各样本DNA进行片段化；
f）将一对独特的第一和第二接头连接至各片段化的样本DNA，得到接头连接的DNA片段；
g）任选地，合并至少部分接头连接的DNA片段；
h）使用高通量测序确定接头连接的DNA片段的第一标识符序列和第二标识符序列的序列；
i）确定接头连接的DNA片段的样本来源。
12.用于鉴定接头连接的扩增子的样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一扩增引物；
d）提供第二扩增引物；
e）用一对第一和第二扩增引物扩增样本DNA，得到扩增子；
f）任选地，合并样本DNA的至少部分扩增子，其中各样本DNA是利用不同的引物对进行扩增的；
g）任选，扩增子进行片段化；
h）提供第一接头，各第一接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
i）提供第二接头，各第二接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
j）任选，提供其它接头，各接头包括选自核苷酸序列标识符的组的其它核苷酸序列标识符；
k）将第一接头连接至（片段化的）扩增子；
l）任选地，合并来自步骤k）的至少部分接头连接的扩增子；
m）用第二和其它接头重复连接步骤，各连接步骤之后任选地，合并至少部分获得的接头连接的扩增子；
n）使用高通量测序确定步骤m）中获得的接头连接的扩增子的第一、第二和任选其它标识符序列的序列；
o）确定接头连接的扩增子的样本来源。
13.用于从多个样本DNA鉴定扩增的接头连接的DNA片段的样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一接头，各第一接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
d）任选地，提供第二接头，各第二接头任选包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
e）各样本DNA进行片段化；
f）将至少第一接头和任选第二接头连接至片段化的样本DNA，得到接头连接的DNA片段；
g）任选地，合并至少部分接头连接的DNA片段；
h）提供第一扩增引物，各第一引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第三核苷酸序列标识符；
i）任选地，提供第二扩增引物，各第二引物任选包括选自核苷酸序列标识符的组的第四核苷酸序列标识符；
j）用第一扩增引物和任选第二扩增引物扩增接头连接的DNA片段，其中第一、任选第二、第三和任选第四核苷酸序列标识符的组合对于各样本是独特的，得到扩增的接头连接的DNA片段；
k）任选地，合并至少部分扩增的接头连接的DNA片段；
l）使用高通量测序确定扩增的接头连接的DNA片段的第一、任选第二、第三和任选第四标识符序列的序列；
m）确定扩增的接头连接的DNA片段的样本来源。
14.用于鉴定接头连接的扩增子的样本来源的方法，其包括步骤：
a）提供多个样本DNA；
b）提供一组核苷酸序列标识符；
c）提供第一扩增引物，各第一引物包括选自核苷酸序列标识符的组的第一核苷酸序列标识符；
d）提供第二扩增引物，各第二引物任选包括选自核苷酸序列标识符的组的第二核苷酸序列标识符；
e）用一对第一和第二扩增引物扩增各样本DNA，得到扩增子；
f）任选地，合并至少部分样本DNA的扩增子，其中各样本DNA是利用不同的引物对进行扩增的；
g）任选，扩增子进行片段化；
h）提供第一接头，各第一接头包括选自核苷酸序列标识符的组的第三核苷酸序列标识符；
i）任选，提供第二接头，各第二接头任选包括选自核苷酸序列标识符的组的第四核苷酸序列标识符；
j）将至少第一接头和任选第二接头连接至（片段化的）扩增子，其中第一、任选第二、第三和任选第四核苷酸序列标识符的组合对于各样本是独特的，得到接头连接的扩增子；
k）任选地，合并至少部分接头连接的扩增子；
l）使用高通量测序确定接头连接的扩增子的第一、任选第二、第三和任选第四标识符序列的序列；
m）确定接头连接的扩增子的样本来源。
15.根据权利要求9-14任一项的方法，其中在使用高通量测序确定标识符序列的序列的步骤中，从制备的样本DNA的单一DNA模板确定标识符序列的序列。
16.根据权利要求15的方法，其中在单一DNA模板中，第一第二和任选其它标识符序列是内部序列的至少3′或5′。
17.根据权利要求16的方法，其中单一DNA模板包括两个测序引物结合位点，其中各测序引物结合位点位于不同核苷酸序列标识符的3′，并且其中在高通量测序方法中从单一DNA模板的两个测序引物结合位点用两个测序引物进行两个不同测序反应。
18.根据权利要求16的方法，其中单一DNA模板包括两个测序引物结合位点，其中至少一个测序引物结合位点位于至少两个核苷酸序列标识符的3′，并且其中在高通量测序方法中从单一DNA模板的两个测序引物结合位点用两个测序引物进行两个不同测序反应。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105408496A (zh) * 2013-03-15 2016-03-16 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
CN105524983A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 大连晶泰生物技术有限公司 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒
CN106555226A (zh) * 2016-04-14 2017-04-05 北京京诺玛特科技有限公司 一种构建高通量测序文库的方法和试剂盒
CN106834286A (zh) * 2017-04-05 2017-06-13 北京泛生子基因科技有限公司 一步法快速构建扩增子文库的引物组合
US9834822B2 (en) 2012-09-04 2017-12-05 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CN107580632A (zh) * 2015-04-23 2018-01-12 赛卢拉研究公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
US9902992B2 (en) 2012-09-04 2018-02-27 Guardant Helath, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9920366B2 (en) 2013-12-28 2018-03-20 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
CN108165646A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 河北省农林科学院谷子研究所 一种适用于谷子的简化基因组建库方法
CN110800064A (zh) * 2017-11-06 2020-02-14 伊鲁米那股份有限公司 核酸索引化技术
US10704086B2 (en) 2014-03-05 2020-07-07 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11242569B2 (en) 2015-12-17 2022-02-08 Guardant Health, Inc. Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free DNA
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2425240A4 (en) 2009-04-30 2012-12-12 Good Start Genetics Inc METHOD AND COMPOSITION FOR EVALUATING GENETIC MARKERS
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
CA2794522C (en) 2010-04-05 2019-11-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
ES2665071T3 (es) 2012-02-17 2018-04-24 Fred Hutchinson Cancer Research Center Composiciones y métodos para identificar mutaciones de manera precisa
ES2663234T3 (es) 2012-02-27 2018-04-11 Cellular Research, Inc Composiciones y kits para recuento molecular
EP4234713A3 (en) 2012-03-20 2024-02-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods of lowering the error rate of massively parallel dna sequencing using duplex consensus sequencing
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
WO2014047646A1 (en) * 2012-09-24 2014-03-27 Cb Biotechnologies, Inc. Multiplex pyrosequencing using non-interfering noise cancelling polynucleotide identification tags
EP2746405B1 (en) * 2012-12-23 2015-11-04 HS Diagnomics GmbH Methods and primer sets for high throughput PCR sequencing
DE102013200309B3 (de) * 2013-01-11 2014-01-02 Technische Universität Dresden Verfahren zur Zusammenstellung eines Sets von Nukleinsäure-Barcodes sowie Verfahren zur Zuordnung von Nukleinsäuresequenzen nach der Sequenzierung
GB201302900D0 (en) * 2013-02-19 2013-04-03 Genome Res Ltd Nucleic acid marker molecules for identifying and detecting cross contaminationof nucleic acid samples
US10612088B2 (en) * 2013-03-14 2020-04-07 The Broad Institute, Inc. Massively multiplexed RNA sequencing
EP3013984B1 (en) 2013-06-25 2023-03-22 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for determining spatial patterns of biological targets in a sample
AU2014312208B2 (en) 2013-08-28 2019-07-25 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
EP3055676A1 (en) 2013-10-07 2016-08-17 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
AU2014346399A1 (en) * 2013-11-11 2016-06-02 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Northern Arizona University Systems and methods for universal tail-based indexing strategies for amplicon sequencing
WO2015073711A1 (en) * 2013-11-13 2015-05-21 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
US9938522B2 (en) 2014-09-25 2018-04-10 Genewiz, Inc. High throughput sequencing of end regions of long linear DNAs
EP3237616A1 (en) * 2014-12-24 2017-11-01 Keygene N.V. Backbone mediated mate pair sequencing
WO2016112073A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Good Start Genetics, Inc. Screening for structural variants
WO2016133764A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Complete Genomics, Inc. Dna sequencing using controlled strand displacement
ES2824700T3 (es) 2015-02-19 2021-05-13 Becton Dickinson Co Análisis unicelular de alto rendimiento que combina información proteómica y genómica
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
CN107406888A (zh) 2015-03-30 2017-11-28 赛卢拉研究公司 用于组合条形编码的方法和组合物
EP3901282B1 (en) 2015-04-10 2023-06-28 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US10385387B2 (en) 2015-04-20 2019-08-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for selectively amplifying and tagging nucleic acids
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
US10513732B2 (en) * 2015-07-13 2019-12-24 New York University Sequencing methods and kits
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
JP6560088B2 (ja) 2015-09-30 2019-08-14 富士フイルム株式会社 プライマーの設計方法、ｄｎａ増幅方法および解析方法
US11207393B2 (en) 2015-10-16 2021-12-28 President And Fellows Of Harvard College Regulatory T cell PD-1 modulation for regulating T cell effector immune responses
AU2016348439B2 (en) 2015-11-04 2023-03-09 Atreca, Inc. Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells
PL3387152T3 (pl) 2015-12-08 2022-05-09 Twinstrand Biosciences, Inc. Ulepszone adaptory, sposoby i kompozycje do sekwencjonowania dupleksowego
CN108430617A (zh) * 2015-12-30 2018-08-21 生物辐射实验室股份有限公司 液滴划分的基于pcr的文库制备
EP3199642A1 (en) * 2016-02-01 2017-08-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Plant breeding using high throughput sequencing
CA3018332A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. T-cell exhaustion state-specific gene expression regulators and uses thereof
EP3443066A4 (en) 2016-04-14 2019-12-11 Guardant Health, Inc. EARLY DETECTION METHODS FOR CANCER
US11384382B2 (en) 2016-04-14 2022-07-12 Guardant Health, Inc. Methods of attaching adapters to sample nucleic acids
ES2956757T3 (es) 2016-05-02 2023-12-27 Becton Dickinson Co Codificación con códigos de barras moleculares precisa
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP3465502B1 (en) 2016-05-26 2024-04-10 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
KR102522023B1 (ko) 2016-09-26 2023-04-17 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
JP7232180B2 (ja) 2016-11-08 2023-03-02 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 発現プロファイル分類の方法
WO2018089377A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Cellular Research, Inc. Methods for cell label classification
CN110168100A (zh) 2016-11-15 2019-08-23 奎斯特诊断投资有限责任公司 使用mitra尖端提取检测囊性纤维化突变的方法
CN110167951A (zh) 2016-11-15 2019-08-23 奎斯特诊断投资有限责任公司 使用mitra尖端提取检测dna突变的方法
ES2961580T3 (es) 2017-01-13 2024-03-12 Cellular Res Inc Revestimiento hidrófilo de canales de fluidos
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
WO2018183942A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification
WO2018226293A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US10633651B2 (en) * 2017-07-10 2020-04-28 Agilent Technologies, Inc. Assay methods and compositions for detecting contamination of nucleic acid identifiers
WO2019060716A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Freenome Holdings, Inc. SAMPLE EXTRACTION METHODS AND SYSTEMS
EP3707273B1 (en) 2017-11-08 2024-04-10 Twinstrand Biosciences, Inc. Reagents and adapters for nucleic acid sequencing and methods for making such reagents and adapters
US11946095B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Becton, Dickinson And Company Particles associated with oligonucleotides
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
EP3788170A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Becton, Dickinson and Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
JP2021530219A (ja) 2018-07-12 2021-11-11 ツインストランド・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッドTwinstrand Biosciences, Inc. ゲノム編集、クローン増殖、および関連用途を特徴付けるための方法および試薬
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
CN112805389A (zh) 2018-10-01 2021-05-14 贝克顿迪金森公司 确定5’转录物序列
CN112969789A (zh) 2018-11-08 2021-06-15 贝克顿迪金森公司 使用随机引发的单细胞全转录组分析
WO2020100079A2 (en) * 2018-11-14 2020-05-22 Foresee Genomic Ltd Multimer for sequencing and methods for preparing and analyzing the same
SG11202105824RA (en) 2018-12-10 2021-06-29 10X Genomics Inc Imaging system hardware
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
CN113574178A (zh) 2019-01-23 2021-10-29 贝克顿迪金森公司 与抗体关联的寡核苷酸
EP3947726A1 (en) 2019-04-03 2022-02-09 Agilent Technologies, Inc. Compositions and methods for identifying and characterizing gene translocations, rearrangements and inversions
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CN114051534A (zh) 2019-07-22 2022-02-15 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
EP4055160B1 (en) 2019-11-08 2024-04-10 Becton Dickinson and Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
WO2021216708A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2022074058A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Keygene N.V. Targeted sequence addition
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
WO2022109343A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101313078A (zh) * 2005-09-29 2008-11-26 科因股份有限公司 突变群体的高通量筛选
CN101365803A (zh) * 2005-12-22 2009-02-11 关键基因股份有限公司 采用高通量测序技术的改进的转录谱描述策略

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
KR100321510B1 (ko) 1991-09-24 2005-01-10 키진 엔.브이. 선택적인 제한단편의 증폭:디엔에이(dna) 핑거프린트법
US5565340A (en) * 1995-01-27 1996-10-15 Clontech Laboratories, Inc. Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR
US6403319B1 (en) * 1999-08-13 2002-06-11 Yale University Analysis of sequence tags with hairpin primers
US20060263789A1 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
EP2292788B1 (en) 2005-06-23 2012-05-09 Keygene N.V. Strategies for high throughput identification and detection of polymorphisms
WO2010021936A1 (en) * 2008-08-16 2010-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital pcr calibration for high throughput sequencing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101313078A (zh) * 2005-09-29 2008-11-26 科因股份有限公司 突变群体的高通量筛选
CN101365803A (zh) * 2005-12-22 2009-02-11 关键基因股份有限公司 采用高通量测序技术的改进的转录谱描述策略

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C GABRIEL 等: "Rapid high-throughput human leukocyte antigen typing by massively parallel pyrosequencing for high-resolution allele identification", 《HUMAN IMMUNOLOGY》, vol. 70, no. 11, 30 November 2009 (2009-11-30), pages 960 - 964 *
D RIGOLA等: "High-throughput detection of induced mutations and natural variation using KeyPoint™ technology.", 《PLOS ONE》, vol. 4, no. 3, 31 March 2009 (2009-03-31), pages 1 - 9, XP002663974, DOI: doi:10.1371/journal.pone.0004761 *

Cited By (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11434523B2 (en) 2012-09-04 2022-09-06 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11773453B2 (en) 2012-09-04 2023-10-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876171B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11879158B2 (en) 2012-09-04 2024-01-23 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9834822B2 (en) 2012-09-04 2017-12-05 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9840743B2 (en) 2012-09-04 2017-12-12 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11319598B2 (en) 2012-09-04 2022-05-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9902992B2 (en) 2012-09-04 2018-02-27 Guardant Helath, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11319597B2 (en) 2012-09-04 2022-05-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11001899B1 (en) 2012-09-04 2021-05-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10995376B1 (en) 2012-09-04 2021-05-04 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10961592B2 (en) 2012-09-04 2021-03-30 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10947600B2 (en) 2012-09-04 2021-03-16 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10457995B2 (en) 2012-09-04 2019-10-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10494678B2 (en) 2012-09-04 2019-12-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10501810B2 (en) 2012-09-04 2019-12-10 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10501808B2 (en) 2012-09-04 2019-12-10 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10894974B2 (en) 2012-09-04 2021-01-19 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10041127B2 (en) 2012-09-04 2018-08-07 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10683556B2 (en) 2012-09-04 2020-06-16 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10738364B2 (en) 2012-09-04 2020-08-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10793916B2 (en) 2012-09-04 2020-10-06 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876172B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10822663B2 (en) 2012-09-04 2020-11-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10837063B2 (en) 2012-09-04 2020-11-17 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CN114574581A (zh) * 2013-03-15 2022-06-03 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
CN105408496A (zh) * 2013-03-15 2016-03-16 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
US11639526B2 (en) 2013-12-28 2023-05-02 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11639525B2 (en) 2013-12-28 2023-05-02 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11767556B2 (en) 2013-12-28 2023-09-26 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11767555B2 (en) 2013-12-28 2023-09-26 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11667967B2 (en) 2013-12-28 2023-06-06 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11649491B2 (en) 2013-12-28 2023-05-16 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11959139B2 (en) 2013-12-28 2024-04-16 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US10883139B2 (en) 2013-12-28 2021-01-05 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US10889858B2 (en) 2013-12-28 2021-01-12 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US9920366B2 (en) 2013-12-28 2018-03-20 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11434531B2 (en) 2013-12-28 2022-09-06 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US10801063B2 (en) 2013-12-28 2020-10-13 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11118221B2 (en) 2013-12-28 2021-09-14 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11149307B2 (en) 2013-12-28 2021-10-19 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11149306B2 (en) 2013-12-28 2021-10-19 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US10982265B2 (en) 2014-03-05 2021-04-20 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10870880B2 (en) 2014-03-05 2020-12-22 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11447813B2 (en) 2014-03-05 2022-09-20 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10704085B2 (en) 2014-03-05 2020-07-07 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10704086B2 (en) 2014-03-05 2020-07-07 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11091797B2 (en) 2014-03-05 2021-08-17 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11091796B2 (en) 2014-03-05 2021-08-17 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11667959B2 (en) 2014-03-05 2023-06-06 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CN105524983B (zh) * 2014-09-30 2019-06-21 大连晶泰生物技术有限公司 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒
CN105524983A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 大连晶泰生物技术有限公司 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒
CN107580632B (zh) * 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
CN107580632A (zh) * 2015-04-23 2018-01-12 赛卢拉研究公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
US11242569B2 (en) 2015-12-17 2022-02-08 Guardant Health, Inc. Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free DNA
CN106555226B (zh) * 2016-04-14 2019-07-23 大连晶泰生物技术有限公司 一种构建高通量测序文库的方法和试剂盒
CN106555226A (zh) * 2016-04-14 2017-04-05 北京京诺玛特科技有限公司 一种构建高通量测序文库的方法和试剂盒
CN106834286B (zh) * 2017-04-05 2020-02-21 北京泛生子基因科技有限公司 一步法快速构建扩增子文库的引物组合
CN106834286A (zh) * 2017-04-05 2017-06-13 北京泛生子基因科技有限公司 一步法快速构建扩增子文库的引物组合
CN110800064B (zh) * 2017-11-06 2024-03-29 伊鲁米那股份有限公司 核酸索引化技术
CN110800064A (zh) * 2017-11-06 2020-02-14 伊鲁米那股份有限公司 核酸索引化技术
CN108165646A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 河北省农林科学院谷子研究所 一种适用于谷子的简化基因组建库方法

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