KR100321510B1 - 선택적인 제한단편의 증폭:디엔에이(dna) 핑거프린트법 - Google Patents

선택적인 제한단편의 증폭:디엔에이(dna) 핑거프린트법 Download PDF

Info

Publication number
KR100321510B1
KR100321510B1 KR1019940700959A KR19940700959A KR100321510B1 KR 100321510 B1 KR100321510 B1 KR 100321510B1 KR 1019940700959 A KR1019940700959 A KR 1019940700959A KR 19940700959 A KR19940700959 A KR 19940700959A KR 100321510 B1 KR100321510 B1 KR 100321510B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
restriction
primer
fragments
fragment
Prior art date
Application number
KR1019940700959A
Other languages
English (en)
Inventor
마크 자뷰
피어터 보스
Original Assignee
키진 엔.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8208616&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR100321510(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 키진 엔.브이. filed Critical 키진 엔.브이.
Application granted granted Critical
Publication of KR100321510B1 publication Critical patent/KR100321510B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Auxiliary Devices For Music (AREA)
  • Reverberation, Karaoke And Other Acoustics (AREA)
  • Power Conversion In General (AREA)

Abstract

본 발명은 소정의 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다수의 제한 부위를 포함하며, 적어도 일부분의 핵산 서열은 미공지되어 있는 출발 DNA의 일부분 이상을 조절 증폭시키기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 방법을 인간, 동물 또는 식물의 DNA 핑거프린트법에 적용하고, 제한 단편 길이 다형성의 확인에 적용하는 방법도 포함한다. 또한, 이 방법을 적용하기 위한 킷트도 포함한다.

Description

선택적인 제한 단편의 증폭: 디앤에이(DNA) 핑거프린트법
1. 발명의 분야
본 발명은 식물 및 동물 품종 개량, 변종, 또는 재배변종의 동정, 진단 의약, 동물 및 식물의 질병 진단, 인체의 유전 질환의 동정, 가족 관계 분석, 법정상의 분석(forensic analysis), 및 미생물 타이핑(microbial typing)을 비롯한 수 많은 여러가지 분야에 사용되는 DNA 핑거프린트법(fingerprinting)의 적용 및 DNA 마커(marker)의 사용 방법에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 미생물로부터 보다 고등한 식물, 동물 및 인간까지의 범위에 속하는 게놈내의 특이적인 DNA 마커를 검출하고 DNA 핑거프린트하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 여러가지 적용 분야에서 본 발명의 방법에 사용되는 합성 DNA 분자 및 이것에 기초한 생성물에 관한 것이다.
2. 발명의 배경
2.1. DNA 핑거프린트법
DNA 핑거프린트법 또는 DNA 타이핑(typing), 뿐만아니라 유전자 타이핑(genotyping), 프로파일 및 DNA 동정 분석의 기타 방법들은 개체, 변종, 또는 품종, 또는 종들의 게놈이나 유전 구조내의 유사성이나, 또는 하나 이상의 독특한 특징을 특성 규명하는 것을 의미한다. 일반적인 방식은 유전 관계가 가까우면 가까울수록 동일성이 더욱 커지거나 게놈들의 유사성이 더욱 적합하게 되며, 결과적으로 게놈내의 독특한 특징은 더욱 드물게 된다. 이러한 유사하거나 독특한 특징은 유기체 DNA를 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)로 절단한 후 그 DNA를 분석함으로써 나타낼 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제는 보통 4개 내지 8개의 염기 길이인 짧은 뉴클레오티드 서열을 인식하고 DNA 2가닥을 절단함으로써 별도 길이의 DNA 단편들을 산출하는 효소이다. 이들의 고도의 서열 특이성으로 인해, 제한 엔도뉴클레아제는 매우 특이적인 방식으로 DNA 분자를 절단할 것이다. 그 결과 DNA 단편들의 재생 가능한 세트가 산출된다. DNA 단편들은 다공성 매트릭스, 또는 겔 상에서 그들의 길이에 따라 분별되어 일반적인 밴드 패턴을 산출할 수 있으며, 이것은 유기체의 유전 구조의 DNA 핑거프린트(fingerprint)를 구성한다.
2.2. DNA 다형성
관련성이 매우 큰 종, 변종 또는 품종들의 핑거프린트를 비교해 보면, DNA 핑거프린트는 동일하거나 매우 유사할 수 있다. 별도의 동일한 DNA 핑거프린트내에서 차이가 관찰될 때, 이러한 차이를 DNA 다형성(DNA polymorphism)이라고 한다. 이것은 핑거프린트에서 나타나는 새로운 DNA 단편이다. 이 DNA는 그 위치에서 다형태인 것이라고 말할 수 있으며, 이 새로운 DNA 단편은 DNA 마커로서 사용될 수 있다. 제한 효소의 절단으로 수득되는 DNA 핑거프린트시 검출된 DNA 다형성은 DNA 서열내의 다음과 같은 변형들로부터 산출될 수 있다: 제한 엔도뉴클레아제 표적 부위를 없애는 돌연변이, 새로운 표적 부위를 산출하는 돌연변이, 2개의 제한 부위 사이의 삽입, 결실 또는 역위.
이러한 DNA 다형성을 일반적으로 RFLP, 제한 단편 길이 다형성(RestrictionFragment Length Polymorphism)이라고 한다. 이러한 돌연변이적 변화가 멘델 방식으로 유전될때, 이 변화는 진실한 유전 마커로서 작용할 것이다. 결과적으로, DNA 다형성은 다른 유전 마커와 동일한 방식으로 유전 마커로서 사용될 수 있다: 혈통 분석, 형질의 유전에 대한 유전적 연구, 개체 동정.
2.3. DNA 핑거프린트 기법
바이러스를 제외한 거의 모든 생물 유기체의 경우, 그 유기체의 총 게놈 DNA의 제한 분해물은 개별적인 밴드를 헤아릴 수 없을 정도로 많은 밴드를 생성한다. 따라서, 모든 DNA 핑거프린트 방법들은 단지 소분획의 DNA 단편만을 가시화하여 DNA 핑거프린트를 구성하는 밴드 패턴을 단순하게 하는 원리를 기초로 한다.
가장 널리 사용되는 방법은 유기체의 DNA를 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고, 이 제한 단편을 겔 전기영동으로 분별시킨 뒤, 이 분별된 DNA 단편을 막(membrane) 위로 전이 및 결합시킨 다음, 이 막을 특정 DNA 단편〔"프로브"(probe)〕과 하이브리드화(hybriaize)시키는 것이다. 이 DNA 단편은 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고 있는 막위의 DNA 단편(또는 단편들)과 2본쇄 DNA 분자를 형성할 것이다. 이 프로브가 가시화할 수 있는 마커로 표지되어 있는 경우, 이 프로브가 결합된 DNA 단편도 가시화될 수 있다. 이 절차를 일반적으로 "서던 하이브리드화(Southern hybridization)"라고 말한다. 밀접하게 관련된 게놈 DNA 분자내에서 상기 프로브가 결합하는 상응하는 제한 단편의 크기들에서 차이가 관찰될 때, 이러한 차이를 DNA 다형성이라고 하며, 보다 구체적으로는 제한 단편 길이 다형성이라고 한다. 제한 단편 길이의 차이는 DNA 프로브에 의해 인식되는 유전자좌의 상이한 대립 유전자 형태에 대응한다. DNA 핑거프린트를 위한 서던 하이브리드화 방법이 보편적으로 사용되어 왔으나, 이러한 방법은 힘들고 시간 소모적이다.
또한, 상기 방법은 해상능이 낮으며, 따라서 고작 단일 반응에서 1개의 유전자좌 또는 수개의 유전자좌를 기록하는데에만 사용될 수 있다.
2.4. 폴리머라제 연쇄 반응
폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기법은 생체외에서 특정 DNA 단편을 합성하는 방법이다. 이 방법은 DNA 분자 상의 독특한 서열에 결합하는 특이적인 올리고뉴클레오티드와 열안정성 DNA 폴리머라제의 사용을 기초로 한다. 이 올리고뉴클레오티드들은 DNA의 상대편 가닥에 어닐링(annealing)하여 DNA 합성 반응에서 각각 새로운 DNA 가닥의 합성을 유도하여 프라이머로서 작용하도록 고안된다. 따라서, 1주기의 합성 반응으로 프라이머들 사이의 DNA 분자의 완전한 카피(copy)가 만들어지게 되어, 프라이머들 사이의 DNA가 복제된다. DNA 합성의 각 주기는 DNA 양을 배가시키며, 이로써 2개의 프라이머 사이에 포함된 DNA를 증폭시키게 된다. 결과적으로, PCR 기법은 소량의 "기질 DNA"(substrate DNA)를 사용하여 정확한 DNA 단편을 합성할 수 있도록 한다.
3. 발명의 개요
본 발명에서 본 발명자들은 한가지 이상의 제한 효소로 유기체의 DNA를 절단한 후 수득되는 제한 단편을 PCR 방법으로 증폭시키는 새로운 방법을 고안했다. 이러한 PCR 방법의 새로운 적용에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 공지된 DNA 서열에대하여 유도되는 것이 아니고 제한 단편의 말단을 인식하도록 고안된 것이다. 이러한 목적으로 올리고뉴클레오티드 링커(또는 어뎁터; adaptor)를 상기 말단에 첨가함으로써 제한 단편의 말단을 변형시키는 것이 필요하다. 이러한 이유는 제한 효소의 말단들은 일반적으로 단지 수개의 뉴클레오티드(즉, 2 내지 8개의 뉴클레오티드)를 갖고 있어 PCR 증폭을 위한 프라이머를 고안하는데 사용하기에는 너무 짧기 때문이다.
본 발명은 제한 엔도뉴클레아제로 게놈 DNA 분자를 분해함으로써 수득되는 복잡한 DNA 단편들의 혼합물중에서 하나 또는 그 이상의 제한 단편을 증폭시키기 위한 폴리머라제 연쇄 반응 기법(PCR)의 신규한 사용을 기초로 한다. 본 발명의 한가지 특별한 장점은 제한 단편의 5' 및 3' 말단의 뉴클레오티드 서열이 결정되지 않은 상태에서 DNA 제한 단편들을 증폭시킬 수 있다는 것이다. 이러한 경우에는 증폭될 제한 단편의 각 가닥에 하이브리드화하는 통상의 서열 특이적인 프라이머들을 규정할 수 없으며, 따라서 증폭 목적으로 당업계에서 공지된 방법은 사용할 수 없게 된다.
본 발명의 방법은 예를 들면 2가지 다른 방식으로 사용되어 2가지 상이한 적용 형태를 유도할 수 있다:
(1) PCR 기법으로 증폭될 하나 이상의 제한 단편 소그룹을 임의적으로 선택함으로써 게놈을 DNA 핑거프린트하는 방법. 본 발명은 또한 상술한 방법에 사용하기 위한 합성 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 방법의 일부 적용예는 법정상의 타이핑, 미생물 동정, 변종 동정, 혈통 분석 및 유전 형질에 결합된 DNA 마커의선별 등이다;
(2) 다형성일 수 있는 하나 이상의 소정의 DNA 단편을 PCR 증폭으로 동정하는 방법. 본 발명은 또한 상술한 방법에 사용하기 위한 특이적인 합성 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 방법의 일부 적용예는 인체의 유전 질환을 스크리닝하고, 식물 및 동물의 품종 개량에서 농업적 형질의 유전을 모니터하고, 질병의 감염인자를 검출하는 것이다.
제1도는 제한 효소로 게놈 DNA 분자를 분해함으로써 수득한 표지된 제한 단편을 PCR 증폭하는 일반적 방법의 개요를 도시한 것이다.
제2도는 제한 단편들의 상이한 말단들, 즉, 단면 말단(flush ends) 및 점착 말단(staggered ends)에 어뎁터(adaptor)를 라이게이션(ligation)하는 것을 도시한 것이다.
제3도는 표지된(tagged) 제한 단편의 PCR 증폭을 도시한 것이다. 박스 영역은 제한 단편에 연결된 어뎁터 및 PCR 증폭에 사용되는 프라이머를 나타낸다. 화살표는 DNA 합성의 방향을 나타낸다.
제4도는 표지된 제한 단편의 PCR 증폭의 개요를 도시한 것이다.
제5도는 표지된 제한 단편의 PCR 증폭에 사용된 선택적인 프라이머의 일반적인 고안을 나타낸다. 화살표는 제한 단편의 말단에 존재하는 역위된 반복 서열(inverted repeat sequence)을 나타낸다. 프라이머들의 선택성은 선택적인 염기 서열과 제한 단편 주형 DNA의 염기 서열 사이에 각각 완전한 정합(match)이 존재하는 경우와 완전한 부정합(mismatch)이 존재하는 경우의 2가지 실례로 예시된다.
제6도는 어뎁터 서열에 인접한 트리뉴클레오티드 서열을 갖고 있는 주형 DNA 분자를 선별하는 PCR 프라이머를 사용하여 선택적 PCR 증폭시키는 원리를 보여준다.
제7도는 표지된 제한 단편의 선택적 PCR 증폭을 도시한다.
제8도는 각각 6개의 선택 염기로 이루어진 2가지 PCR 프라이머의 혼합물을 사용한 단편 특이적 증폭의 원리를 보여준다. 각 프라이머는 제한 단편의 각각의 가닥에서 2본쇄 구조를 형성하며, 이로써 DNA 합성이 개시(화살표로 표시됨)될 수 있는 프라이머/주형 복합체를 형성한다.
제9도는 인식되는 2개의 뉴클레오티드 서열과 이 2개의 서열을 분리시키는 거리를 비롯하여, 선택적인 제한 단편 증폭의 방법으로 인식되는 일반적인 서열 요소들을 도시한 것이다.
제10도는 증폭된 단편 길이 다형성을 동정하는 방법에서 검출되는 변화된 뉴클레오티드 서열의 유형을 도시한 것이다.
제11도는 선택성을 증가시키는 프라이머를 사용하여 PstI으로 제한 분해된 토마토 DNA의 증폭 결과를 분석한 1.0% 아가로즈 겔을 나타낸 것이다.
제12도는 단편 특이적인 프라이머를 사용하여 토마토 DNA의 3가지 상이한 PstI 단편을 특이적으로 증폭시킨 결과를 분석한 1.0% 아가로즈 겔을 나타낸 것이다.
제13도는 2가지 토마토주(Tomato line)를 선택 제한 단편 증폭시켜 수득되는 DNA 핑거프린트의 2.5% 폴리아크릴아미드/1% 아가로즈 겔을 나타낸 것이다.
제14도는 효소 복합물 PstI/MseI을 사용하여 SRFA시킨 4가지 토마토주의 DNA 핑거프린트의 4.5% 변성 폴리아크릴아미드 겔 부분을 나타낸 것이다.
제15도는 효소 복합물 PstI/MseI을 사용하여 SRFA시킨 10가지 락투카(Lactuca)주의 DNA 핑거프린트의 4.5% 변성 폴리아크릴아미드 겔 부분을 나타낸 것이다.
제16도는 효소 복합물 PstI/TaqI 및 EcoRI/TaqI을 사용하여 함께 SRFA시킨 2가지 옥수수 주의 DNA 핑거프린트의 4.5% 변성 폴리아크릴아미드 겔 부분을 나타낸 것이다.
제17도는 효소 복합물 ApaI/TaqI을 사용하여 SRFA시킨 26가지 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)균주의 DNA 핑거프린트의 4.5% 변성 폴리아크릴아미드 겔 부분을 나타낸 것이다.
제18도는 효소 복합물 SseI/MseI을 사용하여 SRFA 시킨 4가지 가축 동물인 병아리, 돼지, 소 및 말의 여러 개체들의 DNA 핑거프린트의 4.5% 변성 폴리아크릴아미드 겔 부분을 나타낸 것이다.
5.1. 정의
하기의 상세한 설명 및 실시예에서는 다수의 용어가 사용된다. 명세서 및 특허청구 범위의 명확하고 일관된 이해를 위해 다음의 정의를 제시하였다.
제한 엔도뉴클레아제 : 제한 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소는 2본쇄 DNA 분자중의 특정 염기 서열(표적 부위)을 인식하여 모든 표적 부위에서 DNA 분자의 양 가닥을 절단하는 효소이다.
- 제한 단편 : 제한 엔도뉴클레아제에 의해 분해되어 생성된 DNA 분자를 제한 단편이라 한다. 어떤 주어진 게놈은 특정 제한 엔도뉴클레아제에 의해 제한 단편의 독특한 세트로 분해될 것이다. 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성된 DNA 단편은 겔 전기 영동에 의해 분리 및 검출된다.
- 제한 단편 길이 다형성(RFLP) : 예를 들면, 두 종류의 밀접하게 연관된 유기체의 게놈 DNA는 많은 부위에서 그들의 뉴클레오티드 서열 조성에 차이를 나타낼 것이다. 이러한 차이가 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위내에서 발생하는 경우에는 변형된 표적 부위가 그 지점에서 절단되지 않을 것이다. 이처럼 뉴클레오티드 서열의 변화는 다른 유기체내에 존재하지 않는 새로운 표적 부위를 도입하여 그 지점에서 제한 효소에 의해 DNA가 절단될 수 있게 할 수 있다. 또는, 한 유기체내에서 제한 엔도뉴클레아제에 대한 두개의 표적 부위 사이에서 발생하는 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실은 상기 표적 부위간의 거리를 변경시킬 것이다. 이러한 이유로 두 유기체의 DNA를 분해시키면 다른 길이를 갖는 제한 단편이 생성될 것이다. 그 결과 두 유기체의 DNA의 분해에 의해 생성된 제한 단편의 길이는 다형성을 나타낼 것이다.
- 겔 전기 영동법 : 제한 단편을 검출하기 위해, 크기에 의거하여 2본쇄의 DNA 분자를 분별하기 위한 분석 방법이 필요하다. 이러한 분별화를 달성하기 위해가장 널리 사용된 기법은 겔 전기 영동법이다. 이 겔내에서 DNA 단편들이 움직이는 속도는 그들의 크기에 좌우된다 ; 따라서, 단편 길이가 증가함에 따라 이동하는 거리는 감소한다. 겔 전기 영동법에 의해 분별화된 DNA 단편은 패턴에 포함된 단편의 수가 적은 경우에는 염색 절차에 의해 직접 가시화될 수 있다.
- 합성 올리고뉴클레오티드 : 화학적으로 합성될 수 있는 바람직하게는 약 10 내지 약 50개의 염기를 갖는 1본쇄의 DNA 분자를 합성 올리고뉴클레오티드라 한다. 일반적으로, 이러한 합성 DNA 분자는 연관된 서열을 갖는 분자류로 합성될 수 있지만, 독특한 뉴클레오티드 서열을 갖고, 이러한 뉴클레오티드 서열 내의 특정 위치에 다른 뉴클레오티드 조성을 갖도록 고안된다. 합성 올리고뉴클레오티드란 용어는 독특한 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자를 나타내는데 사용될 것이다. 혼합된 합성 올리고뉴클레오티드란 용어는 연관된 합성 올리고뉴클레오티드류를 나타내는데 사용될 것이다.
- 라이게이션(ligation) : 두개의 2본쇄 DNA 분자를 함께 공유 결합시키는 리가제(ligase) 효소에 의해 촉매되는 효소 반응을 라이게이션이라 한다. 일반적으로, DNA 양 가닥이 함께 공유 결합되지만, 하나의 말단에 화학적 또는 효소적 변형을 통해 두 가닥중 한 가닥의 라이게이션을 막을 수도 있다. 이러한 경우에 공유 결합은 DNA 두가닥중 한가닥에서만 일어나게 된다.
- 어뎁터(adaptor) : 제한된 수의 염기쌍(예, 10 내지 30 개의 염기쌍 길이)을 가진 짧은 2본쇄 DNA 분자를 제한 단편의 말단에 연결될 수 있도록 고안하였다. 어뎁터는 두개의 합성 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있는데, 이 합성 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진다. 두개의 합성 올리고뉴클레오티드를 혼합한 경우, 그들은 적절한 조건하의 용액 중에서 2본쇄 구조를 형성할 것이다. 어뎁터 분자의 한쪽 말단은 제한 단편의 말단에 연결될 수 있도록 고안되었고 다른쪽 말단은 연결될 수 없도록 고안되었다.
- 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) : 생체외에서 기질 DNA로부터 DNA 단편을 합성하는 효소 반응을 PCR이라 한다. 상기 반응은 두개의 합성 올리고뉴클레오티드의 사용, 그리고 열안정성 DNA 폴리머라제의 사용을 포함하는데, 이러한 올리고뉴클레오티드는 DNA 분자중의 뉴클레오티드 서열에 상보적이며 수백내지 수천개의 염기쌍으로 이루어진 짧은 거리에 의해 분리되어 있다. 이러한 연쇄 반응은 예를 들면 일련의 10 내지 30 주기(cycle)로 이루어져 있다. 각 주기에서 기질 DNA는 고온에서 일차로 변성된다. 냉각후 과량으로 존재하는 합성 올리고뉴클레오티드는 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 기질 DNA 분자상의 특정 부위에서 용액중의 기질 DNA 분자와 2본쇄 구조를 형성할 것이다. 그 다음, 올리고뉴클레오티드-기질 DNA 복합체는 DNA 폴리머라제에 의해 촉매된 DNA 합성 반응을 위한 개시 부위로서 작용하여, 그 결과 기질 DNA 가닥에 상보적인 새로운 DNA 가닥을 합성하게 된다.
- DNA 증폭 : DNA 증폭이란 용어는 생체외에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 2본쇄 DNA 분자의 합성을 나타내는데 사용되었다. PCR 반응 생성물을 증폭된 DNA 단편이라 한다.
- 프라이머(primer) : 일반적으로, 프라이머란 용어는 DNA의 합성을 시작시킬 수 있는 DNA 가닥을 의미한다. DNA 폴리머라제는 프라이머 없이 처음부터 새로DNA를 합성할 수 없다 : 상보적인 가닥이 조합될 뉴클레오티드의 순서를 지시하도록 주형(template)으로 사용되는 반응에서, 현존하는 DNA 가닥을 단지 연장시킬 수 있을 뿐이다. 합성 올리고뉴클레오티드 분자가 PCR 반응에서 프라이머로 사용될 것이다.
- 서던 하이브리드화 절차 : 서던 블롯팅(southern blotting)이라고도 하는 서던 하이브리드화 절차의 목적은 나일론 막 또는 니트로셀룰로오스 필터 페이퍼와 같은 지지체상에 아가로스 겔 전기영동법에 의해 물리적으로 분별된 DNA를 분별 절차에 의해 생긴 DNA 단편의 상대적 위치를 유지시키면서 전이시키는 것이다. 아가로스 겔에서부터 지지체로 전이시키는데 사용되는 방법은 겔에서 DNA를 모세관 작용에 의해 지지체로 유인하는 것이다.
- 핵산 하이브리드화 : 핵산 하이브리드화는 나일론 막 또는 니트로 셀룰로오스 필터 페이퍼와 같은 지지체상에서 1본쇄 DNA의 하이브리드화에 의해 관련된 DNA 서열을 검출하는데 사용된다. 상보성 염기 서열을 가진 핵산 분자를 적절한 조건하의 용액내에서 혼합한다면 2본쇄 구조를 재형성할 것이다. 하나의 상보성 1본쇄 핵산이 지지체상에 고정되어 있더라도 두개의 상보성 1본쇄 핵산 사이에서 2본쇄 구조가 형성될 것이다. 서던 하이브리드화 절차에서는 후자의 현상이 일어난다.
- 하이브리드화 프로브 : 서던 하이브리드화 절차에서 특정 DNA 서열을 검출하기 위해서는, 표지된 DNA 분자 또는 하이브리드화 프로브를 나일론 막 또는 니트로셀룰로오스 필터페이퍼 같은 지지체에 결합된 분별된 DNA와 반응시킨다. 표지된 DNA 프로브에 상보적인 DNA 서열을 운반하는 필터상의 영역은 재어닐링 반응에 의해 표지된다. 이러한 표지를 나타내는 필터의 영역은 사용된 표지의 유형에 따라 검출될 수 있다. 하이브리드화 프로브는 일반적으로 옥수수 게놈의 특정 DNA 서열의 분자 클로닝에 의해 생성된다.
5.2. 바람직한 구체예의상세한 설명
본 발명은 특히 길이 다형성을 비롯하여 제한 단편 다형성(RFPs)의 검출에 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 적용될 수 있도록 하는 방법 및 수단에 관한 것이다. 본 발명은 RFPs의 검출 방법, 본 발명의 방법들에 사용되는 합성 올리고 뉴클레오티드, RFPs을 검출하기 위한 수단을 포함하는 킷트, 및 식물 및 동물의 품종 개량, 유전학적으로 유전된 질병의 진단, 유기체의 동정, 및 법정상의 타이핑 등을 수행하기 위해 본 발명의 방법 및 절차를 적용하는 것을 포함한다.
특히, 본 발명은 임의의 유기체, 미생물, 식물, 동물 또는 인간으로부터 수득되는 개개의 게놈 제한 단편 또는 게놈 제한 단편들의 군을 식별하기 위한 수단을 제공하며, 이것은 개별적으로 하나 이상의 특정 형질에 유전적으로 연결되거나, 또는 유기체, 변종 또는 개체를 식별하는데 사용될 수 있는 게놈의 핑거프린트(fingerprint)를 집합적으로 제공한다.
제한 단편의 제조 및 식별을 위한 본 발명의 일반적인 방법은 제한 엔도뉴클레아제의 사용, 제한 단편에 합성 올리고뉴클레오티드의 라이게이션, 그리고 제한 단편의 PCR 증폭을 포함한다(제1도). 제한 엔도뉴클레아제는 특정 부위, 즉, 표적 부위에서 게놈 DNA 분자를 절단하여 제한 단편을 생성한다.
제한 단편 말단에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 알거나 또는 모르는 경우에도 제한 단편의 PCR 증폭은 먼저 합성 올리고뉴클레오티드(어뎁터)를 제한 단편의 말단에 연결시켜 PCR 증폭에 사용된 프라이머에 대한 고착 염기(anchor base)로서 제공될 두개의 공동 표지(tag)를 갖는 각각의 제한 단편을 제공함으로써 본 발명에 따라 달성될 수 있다.
통상적으로, 제한 효소는 양 가닥의 말단 뉴클레오티드가 염기쌍을 형성하고 있는 단면(flush) 말단, 또는 두 가닥중 한 가닥이 돌출되어 짧은 단일 가닥의 연장부를 지닌 점착(staggered) 말단을 생성한다(제2도). 단면 말단을 갖는 제한 단편의 경우에, 어뎁터는 하나의 단면 말단을 갖는 것이 사용된다. 점착 말단을 갖는 제한 단편인 경우에는, 제한 단편의 단일 가닥의 연장부에 상보적인 단일 가닥의 연장부를 갖는 것을 어뎁터로 사용한다. 따라서, 각 유형의 제한 단편 특이적인 어뎁터가 사용되는 경우에는, 어뎁터가 제한 단편에 연결될 수 있도록 말단중 하나만 다른 것이 사용된다. 통상적으로, 사용된 어뎁터는 두개의 합성 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있는데, 상기 합성 올리고뉴클레오티드는 서로 부분적으로 상보적이며, 일반적으로 약 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 12 내지 22개의 뉴클레오티드 길이를 가지며 용액내에서 함께 혼합되는 경우에 2본쇄 구조를 형성한다. 리가제 효소를 사용하여 어뎁터를 제한 단편의 혼합물에 연결시킨다. 제한 단편에 대해 과량 몰의 어뎁터를 사용하는 경우에는 모든 제한 단편은 결국 양말단에 어뎁터를 운반하게 될 것이다. 상기 방법으로 제조된 제한 단편은 표지된 제한 단편이라 하고, 상기 방법은 제한 단편의 표지화라고 언급할 것이다.
어뎁터는 연속적인 PCR 증폭 반응에 사용되는 앞에서 정의한 특징을 갖는 프라이머의 주형으로서 제공될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 제한 단편은 그들의 말단 양쪽에 같은 어뎁터를 가지며 하나의 PCR 프라이머를 제3도에 도시한 바와 같이 제한 단편을 증폭시키기 위해 사용할 수 있다. 이러한 경우에 있어서 모든 제한 단편은 같은 방식으로 표지되기 때문에, 표지된 제한 단편의 혼합물의 PCR 증폭은 동조 방식으로 모든 제한 단편을 증폭시킨다는 것이 명백하다. DNA를 절단시키는데 두가지 다른 제한 효소를 사용하는 다른 구체예에서는, 두개의 다른 어뎁터를 제한 단편의 말단들에 연결한다. 이러한 경우에 두가지 다른 PCR 프라이머는 상기 제한 단편을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 두가지 제한 효소를 사용하는 또 다른 구체예에서는 상기 효소의 말단들 중 하나에 대한 어뎁터를 바이오티닐화(biotinylation)한다. 이것은 바이오티닐화된 분자를 분리시키는 통상적인 방법을 사용함으로써, 상기 제한 효소에 대하여 적어도 하나의 말단을 갖는 제한 단편을 복잡한 제한 단편의 혼합물중에서 선택할 수 있도록 한다. 이러한 단계는 제한 단편이 출발 혼합물의 복잡성을 감소시키고 PCR 증폭에 앞서 집적(enrichment) 단계를 구성하는데, 이로써 어떤 경우에는 백그라운드(background)를 감소시킨다. 몇개의 다른 단편의 동시 증폭을 다중 PCR(multiplex PCR)이라 한다. 다중 제한 단편 증폭의 원리는 제4도에 예시하였다.
또한 본 발명은 특별히 고안된 프라이머의 한정 및 조절된 증폭이 가능한 방식, 특히 본 발명의 특정 구체예로서 표지된 제한 단편의 작은 서브세트만이 증폭되도록 하는 방식으로 PCR 증폭 반응을 유도하는 특정 방법들에 기초한다.
일반적으로, 게놈 DNA 및 특히 동물, 식물 또는 인간의 게놈 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 분해물은 매우 많은 수의 제한 단편을 산출한다. 제한 단편의 수는 게놈의 크기 및 게놈내에 제한 엔도뉴클레아제의 표적 부위의 발생 빈도수에 좌우되며, 즉, 표적 부위내의 뉴클레오티드의 수에 의해 주로 결정된다. 통상적으로 사용되는 제한 엔도뉴클레아제들의 표적 부위중의 뉴클레오티드의 수는 4 내지 8개의 범위이다. 유기체들의 게놈 크기는 미생물의 경우에는 수백만개의 염기쌍에서부터 동물 및 식물의 경우에는 수십억개의 염기쌍에 이르기까지 광범위하다. 따라서, 제한 효소로 게놈 DNA 분자를 절단한 후 수득되는 제한 단편의 수는 수백개 내지 수백만개로 다양할 수 있다. 일반적으로, 제한 단편의 수는 겔 전기 영동법에 의해 분별된 게놈 DNA 분해물중에서 개개의 제한 단편을 식별할 수 없을 만큼 매우 많다. 이러한 분해물은 통상적으로 밴드의 번짐(smear)을 일으킨다.
따라서, 표지된 제한 단편의 PCR 증폭은 모든 단편이 PCR 반응에서 동조적으로 함께 증폭되므로 밴드의 번짐을 일으킬 수 있다. 큰 크기의 게놈 DNA에 적용 가능한 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 증폭될 제한 단편의 수를 제한하는 일반적 원리를 사용했다. 이것은 비교적 적은 수의 표지된 제한 단편만이 PCR 증폭 반응중에 증폭되도록 표지된 제한 단편의 서브세트를 미리 선택함으로써 실시된다.
본 발명의 상기 구체예에서 정의된 선택 원리는 제5도에 예시된 바와 같이 PCR 증폭용 프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오티드의 고안에 있다.
표지된 제한 단편은 다음의 일반적인 구조를 가진다 : 양쪽에 역위된 DNA 서열(불변 서열: constant sequence)이 측면 결합된 가변성 DNA 서열(표지하기 전의 제한 단편에 대응함). 역위된 DNA 서열(불변 DNA 서열)은 제한 엔도뉴클레아제의표적 서열부 및 제한 단편의 양말단에 부착된 어뎁터 서열부로 구성되어 있다. 불변 DNA 서열 사이에 포함된 제한 단편의 가변 서열(variable sequence)은 일반적으로 공지되어 있지 않으며, 따라서 임의의 서열 조성을 가진다. 결론적으로, 불변 DNA 서열의 측면에 접해 있는 뉴클레오티드 서열은 제한 단편의 다량의 혼합물중에서 전적으로 무작위적인 것이다.
따라서, 본 발명은 불변 뉴클레오티드 서열부를 함유하는 특이적인 PCR 프라이머, 및 수득된 제한 단편의 제한된 서브세트를 증폭시키는 본 발명의 구체예인 경우에는 가변 뉴클레오티드 서열부를 함유하는 특이적인 PCR 프라이머를 제공한다. 불변 서열부인 경우에 뉴클레오티드 서열은 프라이머가 제한 단편의 말단에서 하나의 DNA 가닥의 불변 DNA 서열과 완전한 염기쌍을 형성하도록 고안된다. 가변서열부는 선택용의 1 내지 10개 범위의 염기로 구성된 무작위로 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"가변 서열"(variable sequence)이란 표현은 제한 단편의 서브세트를 증폭시키기 위한 목적에서 일정하게 유지되는 서열을 형성하는 선택된 뉴클레오티드로 이루어진 서열로 좀더 정확히 규정할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서는, 몇개의 구별된 프라이머를 규정하기 위해 선택용 염기들의 여러 서열들이 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 프라이머는 동일한 불변 서열 및 상기 형성된 프라이머들과는 상이한 선택된 염기로부터 제조된 가변 서열을 가질 수 있다.
이 프라이머들의 '3 말단에 이 가변(선택) 서열의 부가는 PCR 단계에서 증폭될 표지된 제한 단편의 예비 선택을 지시할 것이며 : PCR 반응이 적절한 조건하에서 수행될 때 프라이머는 단지 가변 DNA 서열이 제5도에 예시된 바와 같이 표지된 제한 단편의 주형 가닥과 완전한 염기쌍을 형성하는 표지된 제한 단편상에서 DNA 합성을 개시할 것이다.
선택은 프라이머의 가변 서열부에 존재하는 뉴클레오티드의 수에 의해 결정된다 : 가변(선택) 서열부내의 뉴클레오티드의 수와 함께 프라이머의 선택성은 증가한다. 본 발명자들은 또한 선택용 염기(selective base)란 용어를 가변 서열부내의 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용할 것이며 따라서 이들 염기의 선택이 선택용 프라이머를 제공한다는 것을 나타낸다. 따라서, 표지된 제한 단편은 사용된 프라이머의 선택용 염기가 단편의 말단에서 둘다 상보적인 서열을 인식할 때에만 증폭된다는 것이 밝혀졌다. 프라이머가 단지 하나의 말단과 정합한다면 증폭은 지수적이라기 보다는 직선적이 될 것이며 그 생성물은 비검출 상태로 남아 있을 것이다.
여러가지 수의 선택용 염기를 갖는 가변 서열로 수득되는 선택도(the degree of selectivity)는 일반식 42n을 사용함으로써 미리 추정할 수 있다(이 때, n은 선택 염기의 수와 같다): 1개의 선택용 염기가 사용되는 경우에는, 16개의 표지된 단편중 1개만이 증폭될 것이고, 2개의 선택용 염기가 사용되는 경우에는 256개 중 1개만이, 3개의 선택용 염기가 사용되는 경우에는 4,096개중 1개만이, 4개의 선택용 염기가 사용되는 경우에는 65,536개중 1개만이 증폭될 것이다. 따라서 본 발명의 바람직한 제 1구체예에서는 사용된 제한 효소에 의해 생성된 단편의 수와는 무관하게 임의의 게놈 DNA 분해물중에서 표지된 제한 단편의 무작위적인 서브세트를 선택적으로 증폭시킬 수 있다.
바람직한 구체예에서, 선택용 뉴클레오티드의 수는 증폭될 제한 단편의 수가 5개 내지 200개로 제한되도록 선택된다. 이 숫자는 단편의 수를 42n으로 나눔으로써 계산할 수 있지만, 모든 제한 단편이 동일한 효율로 증폭될 수 있는 것은 아니기 때문에 정확한 예측은 가능하지 않다. 그러므로, 실제로 증폭된 단편은 이론상 예측되는 것보다 더 적을 수 있다. 두개(또는 그 이상)의 프라이머의 혼합물을 사용할 수 있음을 또한 주목해야 한다. 이것은 각 프라이머에 의해 인식되는 단편들 및 추가로 두 프라이머에 의해 인식되는 단편들을 증폭시킨다. 마지막으로, 프라이머의 선택용 뉴클레오티드와 상보적인 주형 사이의 염기쌍 형성에 근거한 선택은 PCR 반응에서 어닐링 단계에 선택된 온도에 의해 강한 영향을 받으며, 이 온도가 프라이머/주형 복합체의 융해 온도 이하이거나 또는 이와 매우 유사한 온도인 경우, 프라이머들은 불완전한 정합성인 주형 서열에 어닐링하여 상기 복합체내에 부정합을 발생시킨다는 것을 주목하여야 한다. 이것은 예측된 것보다 보다 많은 단편의 증폭을 야기하여 보다 많은 가변적인 결과를 산출하기 때문에 피해야만 한다.
본 발명에 따라 제공되는 PCR 산물은 크기에 따라 DNA 분자를 분리하고, 적당한 작용제로 DNA 분자를 염색시키는 표준 분별 방법을 사용함으로써 식별할 수 있다. 한편, PCR 증폭에 사용된 프라이머는 적합한 방사성 표지한 발색단 또는 형광 발색단으로 표지하므로써 크기에 의한 분별후에 반응 산물을 식별할 수 있다.본 발명의 바람직한 구체예에서는, 아가로즈, 폴리아크릴아미드 또는 복합된 아가로즈 폴리아크릴아미드와 같은(이들에 국한되는 것은 아님) 표준 겔 매트릭스를 사용한 겔 전기영동에 의해 상기 PCR 산물을 분별한다. 본 발명에 따라 수득되는 PCR 산물은 또한 증폭된 제한 단편(ARF : amplified restriction fragments)이라는 용어로 나타낸다.
본 발명의 수단 및 방법을 사용하여 임의의 복합 게놈의 제한 효소 분해물로부터 ARF의 세트들을 생성시킬 수 있다. 본 발명은 ARF를 분리하는데 사용되는 겔 분별 시스템의 해상능에 따라 수득된 제한 단편의 수가 조정되게 한다. 특정 구체예에 있어서, 선택용 프라이머는 나중에 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리되는 5 내지 10 개의 ARF를 산출하도록 고안한다. 또 다른 특정 구체예는 나중에 폴리아크릴아미드 겔 또는 혼합 폴리아크릴아미드-아가로즈 겔과 같은(이들에 국한되는 것은 아님)고 해상도 겔 전기영동 시스템에서 분리되는 20 내지 50개의 ARF가 산출되도록 고안된 선택용 프라이머를 사용한다.
또 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 제한 효소(들)는 20 내지 1000개의 염기쌍을 지닌 크기 범위의 제한 단편을 산출하는 것을 선택하는데, 이것은 PCR 증폭에 대해 통상 알려진 바와 같이 이 단편 크기 범위가 가장 효과적으로 증폭되기 때문이다. 다양한 표준 겔 매트릭스상에서 다수의 단편을 분리시킬 수 있지만, 최선의 결과는 DNA 서열 분석에 현재 사용되는 변성 폴리아크릴아미드 겔 시스템상에서의 분리에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명에 의해, PCR 증폭 반응에서 각각 상이한 선택용 프라이머를 사용함으로써 여러 세트의 ARF가 수득된다. 분리후 식별되는 ARF의 패턴은 게놈 DNA의 독특하고 완전하게 재현 가능한 핑거프린트로 이루어진다. 이러한 핑거프린트는 법의학적 타이핑, 유기체의 진단상의 동정, 그리고 종, 품종, 변종 또는 개체의 동정과 같은(이들에 국한되는 것은 아님) 다양한 응용 분야에 사용될 수 있다. 동정의 수준은 특정 군의 여러 구성원들에 의해 나타나는 유사도(the degree of similarity)(가변도; the degree of variability)에 의해 측정된다. 가변도 또는 유사도는 관련 게놈의 뉴클레오티드 조성에 있어서의 변화 정도로서 측정된다. 본 발명의 근본 원리는 제9도에 예시한 바와 같이 각각의 증폭된 제한 단편에서 일정한 거리만큼 서로 분리되어 있는 2 개의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것이다. 상기 두 뉴클레오티드 서열은 각각 2 개의 부분, 즉 (a) 제한 엔도뉴클레아제의 표적 부위, (b) 선택용 프라이머에 포함되어 있는 표적 부위에 인접한 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 관련 유기체, 종, 변종, 품종 또는 개체에서, 상기 서열 인자 및 그들의 상대적인 거리는 그 보다 더 크게 또는 보다 더 적게 보존된다. 그러므로, 핑거프린트는 게놈들 사이의 서열 관련도를 결정하는 기초를 이룬다. 한편, ARF 패턴의 차이를 사용하여 게놈을 각각 구별할 수 있다. 게놈을 핑거프린트하는 기타 방법들에 대한 본 발명의 특별한 잇점은 본 방법으로 얻을 수 있는 높은 해상능이다 : 즉 수십개 또는 수백개까지의 ARF를 동시에 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특정 적용예로는 제한 단편 다형성(RFP)의 식별 및 검색을 포함한다. 게놈 DNA의 뉴클레오티드 조성의 변화는 종종 제한 단편의 다형성을 초래하며, 즉 삽입 또는 결실은 이들을 포함하는 제한 단편의 크기에 영향을 미치며(제 10도), 뉴클레오티드 변화는 제한 엔도뉴클레아제 표적 부위의 제거 또는 새로운 제한 엔도뉴클레아제 표적 부위의 생성을 초래한다(제11도). 그러한 변화를 동정하는데 가장 흔히 사용되는 기술은 클로닝된 DNA 프로브를 사용하는 서던 블로팅 실험이며, 이 기술은 보통 제한 단편 길이 다형성(RFLP:restriction fragment length polymorphism) 검색법으로 불린다. 이 기술은 상이한 게놈들 사이에서 연관된 RFLP에 대해 서던 블로팅 실험으로 무작위 클로닝된 DNA 단편을 광범위하게 검색한다. 본 발명의 방법에 의해 상이한 게놈들로부터 얻은 ARF를 직접 비교하므로써 RFP를 식별할 수 있다. 원칙적으로, 본 발명의 방법은 RFP의 검색용으로 보다 민감한 데, 그 이유는 제한 엔도뉴클레아제의 표적 부위에서의 차이가 확인될 뿐만아니라, 선택용 PCR 프라이머에 포함된 인접 뉴클레오티드 서열에서의 차이가 확인되기 때문이다. 결국, 본 발명의 방법은 RFLP를 검색하는 훨씬 우수한 방법을 이룬다.
RFLP는 현재 법의학적 타이핑, 인간의 유전병의 모니터 및 식물 및 동물의 품종 개량에서 농경학적 형질의 유전의 모니터와 같이 다양한 적용 분야에 사용되고 있다. 근본 원리는 특정 유전 형질과 밀접하게 연결된 특정 DNA 다형성을 이용하여 특정 유전 형질의 존재 여부를 모니터할 수 있다는 것이다.
본 발명의 방법에 의한 ARF 패턴 분석은 특정 유전 형질과 다형성 ARF의 유전적 연관을 규명하는데 사용할 수 있다. 그러한 다형성 ARF는 또한 클로닝된 DNA 프로브를 사용하는 서던 블로팅 실험에서 검출되는 RFLP 형 DNA 다형성과 그들을 구별하기 위해 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP:amplified fragment lengthpolymorphism)이라 언급한다.
본 발명의 한 가지 특별한 적용예로는 특정 유전 형질에 연결된 AFLP의 검출을 포함한다. 이 적용예는 특정 유전 형질에 있어서 차이를 나타내는 밀접하게 연관된 개체의 게놈 DNA의 제한 효소 분해물내에서 상이한 선택용 프라이머로 얻은 ARF 패턴의 분석을 포함하며, 하나 이상의 AFLP의 유전과 특정 유전 형질에 의해 발현되는 표현형 사이의 상호 관련을 찾을 수 있는 분석 기술의 사용을 포함한다.
본 발명의 제2의 바람직한 구체예는 하나 이상의 특정 제한 단편을 식별하기 위한 본 발명의 방법의 사용을 포함한다. 하나의 특정 제한 단편은 먼저 제한 단편의 각 말단부의 처음 8-12개의 염기의 뉴클레오티드 서열을 결정하므로써 표지시킨 제한 단편의 복합 혼합물로부터 증폭시킬 수 있다. 이들 서열을 기초로 하여, 제한 단편의 상보적 가닥에 존재하는 제한 부위의 측면 서열과 상보적인 서열을 나타내는 각각 5 내지 10 개의 선택용 뉴클레오티드를 가진 2 개의 프라이머를 만들 수 있다. 그러한 프라이머 세트를 사용하여, PCR 증폭 후 단일의 증폭된 단편을 얻을 수 있다. 이 방법에 사용되는 제한 단편은 클로닝된 제한 단편이거나 또는 증폭된 제한 단편일 수 있다. 약간의 제한 단편은 매우 효율적으로 증폭될 수 없으므로, 다형성 DNA 마커를 식별하기 위한 본 발명의 바람직한 방법은 먼저 무작위적으로 선택된 단편 세트를 증폭시키고, PCR 증폭 후에 강한 밴드를 생성시키는 AFLP를 동정하는 것을 포함한다. 이들 AFLP를 서열 분석하여 제한 단편 특이적인 프라이머를 개발하기 위해 특성 분석할 수 있다. 통상, AFLP는 겔로부터 상응하는 DNA 밴드를 절단하고, 양 말단의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 제한 엔도뉴클레아제 표적 부위에 인접한 처음 5 내지 10개의 뉴클레오티드 서열을 확정하므로써 분리한다. 일단 이들 뉴클레오티드 서열을 알면, 게놈 DNA 분해물로부터 단지 단일 제한 단편만을 증폭시키는 제한 단편 특이적인 프라이머를 만들 수 있다. 본 발명의 상기 특정 구체예에서는, 2 개의 상이한 선택용 프라이머로 구성된 한 세트를 사용하여 특정의 제한 단편을 검출할 수 있다. 한 세트내의 2개의 선택용 프라이머 각각에 있어서 선택용 염기는 제8도에 예시한 바와 같이, 제한 엔도뉴클레아제 표적 부위에 인접한 뉴클레오티드 서열과 상보적이 되도록 선택한다. 각각의 프라이머에 포함될 선택용 염기의 수는 제한 엔도뉴클레아제 단편 혼합물의 복잡도에 따라 다르다.
PCR 기술은 불과 지난 몇년 동안 엄청나게 발전하였으며, 빠른 속도로 인체 보건에 있어 가장 널리 사용되는 진단 방법중의 하나가 되고 있다. 그 응용예로는 무엇보다도 전염병의 검색 및 유전병의 검색을 들 수 있다. 각 진단 시험은 특정 길이의 하나 이상의 DNA 단편을 산출하기 위해 PCR 반응에서 프라이머로서 사용되는 2 개의 특이적인 합성 올리고뉴클레오티드의 사용을 기초로 한다. 질병 검색에서, 상기 시험은 샘플당 하나의 DNA 분자 만큼 적은 양의 존재를 검색하여 특징적 DNA 단편을 제공한다. 유전병의 경우에, 정상과 질병의 대립 유전자 사이를 그 산물로 식별할 수 있도록 프라이머를 만들 수 있다. 그 특징은 프라이머에 상보작인 게놈내 DNA 단편에 있어서의 서열 차이에 따라, 또는 두 프라이머 사이의 거리 차에 따라 달라진다.
이 프라이머는 극히 높은 정도의 특이성을 나타내기 때문에, 상이한 질병을 동시에 점검하는 것이 가능한 데, 이 방법을 종종 다중 PCR(multiplex PCR)로 언급하기도 한다. 그러나, 다중 PCR 방법은 일반적으로 단지 몇개의, 즉, 5 내지 8 개의 상이한 형질만을 동시에 점검할 수 있다는 제한이 따른다. 이 제한에 대한 과학적인 근거는 PCR 증폭의 최적 조건(어닐링 온도, Mg+ 농도. 프라이머 농도)이 사용한 프라이머쌍에 따라 크게 달라진다는 것이다. 다중 PCR에서는, 모든 프라이머쌍들이 검출 가능한 산물을 생성시킨다는 절충 조건을 확립해야 한다. 게다가, 이러한 현상외에도 상이한 단편의 증폭 효율이 크게 차이나는 현상이 추가된다. 결국, 본 발명자들은 특정 프라이머쌍의 산물을 다중 PCR 반응에서 검출할 수 없다는 문제점에 종종 직면해 왔다.
본 발명에 사용되는 모든 프라이머는 그 뉴클레오티드 서열에 상당한 공통 부분을 가지고 있기 때문에, 본 발명의 방법은 근본적으로 다중 PCR의 상기 제한들을 극복한다. 게다가, AFLP를 선택하므로서, 동일한 효율로 증폭되는 DNA 마커를 선별한다. 그러므로, 상이한 선택용 프라이머에 대한 PCR 증폭의 최적 조건은 통상 사용되는 서열 특이적인 프라이머의 경우 관찰되는 것보다 변화가 훨씬 더 적다. 본질적으로, 상기에서 계산한 바와 같이, 복합 게놈에서 일정 크기의 단일 DNA 단편을 검출하는데 요구되는 특이성을 얻는데 필요한 합성 올리고뉴클레오티드내의 염기들의 수와 효율적인 PCR 증폭에 최적인 올리고뉴클레오티드의 길이 및 조성 사이에 이상적인 절충 조건이 존재한다. 따라서, 본 발명의 방법은 다중 PCR 보다 훨씬 우수한 방법을 제공한다.
본 발명은 임의의 게놈으로부터 DNA 마커를 분리하고 DNA 핑거프린트의 모든 가능한 이용 분야에 그러한 DNA 마커를 사용하는 일반 방법을 제공한다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이며, 본 발명은 이들 실시예에 국한되지는 않는다.
실시예 1
PSTI을 사용한 토마토 DNA의 선택 제한 단편 증폭
A) DNA의 분리 및 변형
문헌〔Bernatzski 및 Tanksley, Theor. Appl. Genet. 72, 314-321〕에 설명된 바와 같이 어린 잎에서 총 토마토 DNA(Lycopersicon esculentum c. v. Moneymaker)를 분리했다. 신선한 잎 1g당 일반적인 수득량은 50-100μg DNA이었다. DNA를 Pst I(파마시아)로 분해시키고, 2본쇄(ds) Pst I-어뎁터를 하기 설명된 절차에 따라서 제한 단편에 연결시켰다. 상기 어뎁터는 하기 구조를 갖는다.
상기 어뎁터내의 3'TGCA-측쇄(overhang)는 Pst I에 의해 생성된 점착 말단에 어닐링한다. 5' C-잔기는 A로 교체되어 있기 때문에, 상기 어뎁터를 라이게이션시키면 Pst I 인식 서열 CTGCAG는 복원되지 않는다. 라이게이션 반응은 최종 결과가 거의 전적으로 DNA 단편-어뎁터 분자가 되도록 고안 하였다. 이는 1. 무인산화된 어뎁터를 사용하여, 어뎁터-어뎁터 라이게이션을 배제시키며, 2. 라이게이션 및 제한 분해 반응을 동시에 실시함으로써 이루어진다. 후자의 절차는 임의의 단편-단편라이게이션 생성물의 제한 분해를 초래하여 그 생성물을 거의 완전하게 제거한다. 이 생성물에서는 Pst I 인식 서열이 복원되지 않기 때문에, 어뎁터-단편 라이게이션 생성물은 제한 효소에 의해 분해될 수 없다. 어뎁터 라이게이션에 사용된 반응 조건은 2μg 토마토 DNA, 0.2μg 어뎁터, 20 유니트 Pst I, 1 유니트 T4 DNA-리가제, 10mM 트리스 HAc pH 7.5, 10mM MgAc, 50mM KAc, 2mM 디티오트레이톨, 0.5mM ATP를 함유한 것이다.
37℃에서 3시간 동안 20μl의 반응 부피내에서 라이게이션 반응을 실시했다. 어뎁터 라이게이션 후에, 선별 침강으로 연결되지 않은 어뎁터를 제거했다. 상기 목적을 위해, 반응 혼합물의 부피를 100μl로 증가시키고, NH4Ac를 최종 농도가 2.5M이 되게 첨가했다. -20℃의 100μl 에탄올을 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 실온에서 배양했다. 4℃로 냉각된 에펜도르프 원심 분리기내에서 10분동안 14000rpm으로 DNA를 원심분리하여 수집했다. DNA 펠릿을 실온에서 0.5ml의 70% 에탄올로 1회 세척하고, 40μl의 T0.1E(10mM 트리스. HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)에 용해시켰다. DNA를 -20℃에서 저장했다. 본 명세서에서 설명된 선별적인 침강 절차는 반응 혼합물에서 연결되지 않은 어뎁터를 효율적으로 제거하였지만, 작은 DNA-단편(≤ 200bp)도 또한 소실됐다.
B) 증폭 반응
상기 제조된 DNA를 Pat I-단편의 증폭에 대한 주형으로서 사용했다. PCR에 대한 반응 혼합물은 1ng의 주형 DNA, 150ng의 프라이머, 1유니트의 Taq DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머), 200μM의 총 4종류의 dNTP, 10mM 트리스. HCl pH 8.5, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 총 부피가 50μl가 되게 가한 H2O를 함유한다.
반응 혼합물을 20μl의 경 광유로 덮어서 증폭 반응 동안의 증발을 방지한다. 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 5초당 1℃의 속도로 60℃에서 72℃로 온도를 증가시키고, 72℃에서 21/2분간 유지시키는 순환 프로파일을 사용하여 퍼킨 엘머 DNA 가열 순환기상에서 PCR을 실시했다. 총 33회의 순환을 실시했다. 반응후, 20μl의 클로로포름을 첨가하고, 10μl의 부가 염료, 이 경우에는 0.1% w/v의 염료 오렌지 G(Merck)를 갖는 50% 수크로스를 첨가했다. 그후, 이를 반응 혼합물과 잘 혼합한 후, 부가 염료가 보충된 반응 혼합물물 원심분리하여 유기층(광유 및 클로로포름)을 분리했다. 1.0% 아가로스 겔상에서 20μl의 상기 반응 혼합물을 분석했다.
C) 선택도가 증가된 프라이머를 사용한 토마토 DNA의 증폭 반응
Pst I으로 제한분해하고, Pst I-어뎁터가 표지된 토마토 DNA를 상기 설명된 조건을 사용하여 증폭시켰다. 4가지 다른 프라이머는 하기 서열을 갖는 것으로 선택했다:
프라이머 1은 DNA를 변형시키기 위해 사용된 어뎁터의 상부 가닥의 일부이므로, 모든 Pst I-한편을 증폭시켜야만 한다. 프라이머 2는 어뎁터 서열의 일부, Pst I-인식 서열(소문자) 및 하나의 선택용 뉴클레오티드(굵은 문자)를 포함하며, 이론적으로는 모든 Pst I-단편의 약 1/16 부분을 증폭시켜야 한다. 프라이머 3 및 4는 프라이머 2와 유사하나, 각각 2개 및 3개의 선택용 뉴클레오티드를 함유하므로, Pst I-단편의 약 1/256 및 1/4096을 증폭시키는 것으로 기대된다. 1.0%의 아가로스 겔에서 반응 혼합물의 일부를 분석했으며, 이를 제11도에 나타낸다. 제11도의 레인 1 및 6은 DNA 마커를 함유하며, 이의 크기는 왼쪽에 표시한다. 레인 2, 3, 4 및 5는 각각 프라이머 1, 2, 3 및 4를 사용하여 얻은 PCR을 함유한다. 그 결과, 3개의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머의 경우에만, 증폭된 단편의 수가 뚜렷한 밴드 패턴을 산출했다. 다른 3가지 프라이머는 아가로스 겔 상에서 분리되지 않는 밴드 패턴을 산출했으며, 이는 PCR 생성물이 너무 많이 생성되었기 때문이다. 상기 많은 PCR 생성물내에서 항상 특정 단편이 우세하며, 다른 PCR 생성물들의 배경 번짐상에 밴드로서 나타난다. 아마도 이런 강력한 생성물은 토마토 게놈상에서 보다 높은 복제수로 존재하거나, 다른 생성물보다 더 효율적으로 증폭하는 것으로 추정된다. 토마토 게놈 DNA의 Pst I-단편의 총 수가 20,000 내지 100,000이기 때문에, 아가로스 겔 상에서 뚜렷한 밴드 형태를 생성하려면 3개의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머를 사용해야만 한다는 것을 예측할 수 있다.
D) 서던 블롯에 의한 증폭된 단편의 분석
증폭된 단편을 서던 블롯상에서 테스트하여 그 단편이 동일한 크기를 갖는 진실한 제한 단편에 해당하는 지를 증명했다. 이를 위해서, 프라이머 4로 수득되는4개의 각각의 단편을 아가로스 겔에서 절단 분리했다. 유리 비이드(Gene Clean, 제조업자 Bio 101)에 의한 흡착을 이용해 상기 겔 슬라이스에서 DNA를 정제하고, 정제된 DNA의 일부를 재증폭시켜 각각 약 1μg의 4개의 DNA 단편을 수득했다. 1.0%의 정제용 아가로스 겔상에서 상기 재증폭 반응물을 전기 영동시키고, 목적하는 DNA 단편을 정제했다. 제조업자(Boehringer Mannheim)가 제공한 절차에 따라 무작위 6량체 표지 킷트를 사용하여 (α-32P)dATP로 200ng의 각 단편을 표지시켰다. 총 토마토 DNA를 Pst I으로 제한 분해시키고, 1.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 각각 약 3μg의 제한 DNA를 함유하는 4개의 뚜렷하게 분리된 레인을 사용했다. 그다음 제조업자(New England Nuclear)가 지시한 바대로 유전자 선별+하이브리드화 막에 아가로스 겔을 블롯팅시켰다. 블롯팅시킨 후, 겔을 4조각으로 절단하고, 각각에 Pst I으로 제한 분해된 토마토 DNA의 1레인을 첨가한다. 문헌〔Klein-Lankhorst et al., Theor Apll. Genet. 81, 661-667〕에 설명된 절차에 따라 상기 4개의 DNA 조각을 각각 4개의 DNA 프로브중 하나에 하이브리드시켰다. 하이브리드된 블롯을 코닥 XAR5 필름을 사용하여 40시간동안 자동 방사선 사진 촬영했다. 수득된 결과는 4개의 DNA 프로브에 의해 인식된 모든 게놈 DNA 단편이 상기 프로브와 동일한 길이를 갖는다는 것을 나타냈다. 이는 프로브로 사용된 상기 증폭된 단편이 블롯상에서 검출된 단편에서 유래한다는 것을 증명한다.
E) 단일 제한 단편의 선택 증폭
토마토 게놈 DNA로부터 분리된 Pst I-인식 서열 다음의 서열이 알려져 있는3개의 상응하는 무작위 Pst I-단편에 대해 3가지 세트의 프라이머를 고안 했다. 5개의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머 세트는 하기 제시된 바와 같이 제조했다.
프라이머 세트 1 :
서열 1 :
프라이머 세트 2 :
서열 2 :
프라이머 세트 3 :
서열 1 :
토마토 DNA를 Pst I으로 분해하고 어뎁터를 상술한 바와 같이 제한 단편의말단에 연결시켰다. 이 DNA를 프라이머 세트 1 또는 2 또는 3과 함께 PCR내의 주형으로서 사용했고, 전술한 것들 중 하나의 반응 조건을 사용했다. 각 PCR의 반응 생성물을 1.0% 아가로스 겔 상에서 분석했다. 이 겔은 제12도에 제시한다. 제12도는 13개의 레인을 갖고 있고, 이중 1,2,12 및 13레인은 DNA 마커이다. 이 마커들의 크기(킬로베이스(kb))는 겔의 양편에 제시된다. 레인 3,6 및 9는 Pst I로 제한 분해된 3개의 상기 Pst I-단편을 각각 갖고 있는 플라스미드 DNA를 나타내며, 이 플라스미드 DNA는 벡터 단편, pUC18(Yanibch-Perron et al., Gene 33, 103-119), 및 삽입된 Pst I-단편을 산출한다. 레인 4 및 5는 각각 5fg의 상응하는 플라스미드 DNA 및 1ng의 총 게놈 DNA와 함께 프라이머 세트 1을 사용하여 증폭시킨 것을 나타낸다. 레인 7 및 8은 플라스미드 DNA 및 총 게놈 DNA와 프라이머 세트 2를 사용하여 증폭시킨 것을 나타내며, 레인 10 및 11은 프라이머 세트 3을 사용하여 증폭시킨 것을 나타낸다. 상기 결과는 5개의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머와 함께 선택 제한 단편 증폭 기술을 사용하여 20,000이상의 단편 혼합물중에서 단일 Pst I-단편을 증폭시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
F) SRFA를 사용한 DNA 다형성의 식별
상술한 부분에서, 선택 제한 단편 증폭 기술을 사용하면 서열 정보가 유용할 경우, 무작위적인 또는 특정 단편의 제한 단편을 증폭시킬 수 있다는 것을 명백하게 예시했다. 그러나, 그 기술은 동일한 종의 2개체 사이의 제한 부위 다형성에 대해서도 탐색할 수 있어야 한다. 이는 하기에 2개의 토마토 주(Tomato lines)를 가지고 설명되며, 이 토마토주들은 관련성이 크나, 이들 중에서 하나는뿌리혹선층(root knot nematode) 내성 유전자, Mi를 갖고 있다는 점에서 서로 상이하다. 상기 Mi-유전자는 식용 토마토 엘. 에스쿨렌툼(L. esculentum)과 간접적으로 관련이 있는 종인 리코페르시콘 페루비아눔(Lycopersicon peruvianum)에서 유래된 것이다. 이는 엘. 에스쿨렌툼 친주와 교배시킨 후 12회 역교배시킴으로써 엘. 에스쿨렌툼 주내로 도입시켜 Mi-유전자의 존재에 대해 후손을 선별한 것이다. 그러므로, 2개의 토마토주는 이들의 유전 물질의 작은 부분, 즉 Mi-유전자 및 주변 영역에서만 다르다. 전통적인 유전법을 사용하여 Mi-영역은 상기 주의 게놈의 1% 미만을 구성하는 것으로 계산되었다.
2개의 토마토 주(83M-71392주, Mi-감수성 및 83M-71398주, Mi-내성; 네덜란드 왕국, 블레이스비크의 De Ruiter Seeds에서 구입)로부터 DNA를 분리시킨 후, Pst I로 제한 분해시키고, 상기 설명된 바와 같이 어뎁터를 제공했다. 선택용 뉴클레오티드의 연장부가 다른 프라이머를 사용하여 다수의 증폭 반응을 실시했다. 3개의 선택용 뉴클레오티드를 사용했으며, 단일 프라이머외에, 2가지의 상이한 프라이머 복합물을 사용했다. 20:1의 아크릴아미드 대 비스아크릴아미드의 비율을 지닌 2.5% 폴리아크릴아미드 및 1.0%의 아가로스로 구성된 혼합 폴리아크릴아미드/아가로스 겔 상에서 상기 반응물을 분석했다. 1.5mm의 스페이서를 사용하여 Protean II 겔 유니트(Biorad)상에서 겔을 사용했다. 총 16가지의 상이한 프라이머를 사용하여 단일 프라이머를 함유한 16개의 반응물 및 2가지 프라이머의 모든 가능한 조합물을 함유하는 120개의 반응물을 제공했다. 이 조합물 중 6개를 갖는 전형적인 겔의 예를 제13도에 나타낸다. 이 겔의 레인 1 및 14는 DNA 마커를 함유하며, 이들의크기(kb)는 겔의 오른쪽에 나타낸다. 레인 2 및 3, 4 및 5, 6 및 7등은 2개의 토마토 주의 프라이머 쌍 또는 특이적인 프라이머를 사용한 증폭을 함유한다. 제한 부위 다형성에 대한 선별은 수 많은 단편을 산출하였으며, 이중 3개가 두드러지게 나타났고, 이는 제13도의 레인 9, 11 및 12에 도시했다(작은 원으로 나타냄). 레인 9 및 11내의 다형성 밴드는 동일한데, 이는 두 반응물내에 동일한 프라이머가 존재하기 때문이다(레인 11 내의 제2의 프라이머의 존재에 차이가 있다). 레인 11 및 12의 2가지 다형성 단편을 겔에서 절단 분리했으며, 그 겔 조각을 18 게이지 바늘을 통해 분쇄시키고, 200μl의 100mM 트리스. HCl pH 8.0, 10mM EDTA내에 확산으로 용출시켜 겔 조각으로부터 DNA를 용출시켰다. 상기 언급된 바와 같이 상기 단편의 재증폭에 2μl를 사용했다. T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 200ng의 각 단편을 단면 말단화시키고, 이어서 Sma I로 제한 분해된 100ng의 플라스미드 벡터 pUC18(Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119)에 연결시켰다. 라이게이션 혼합물로 이. 콜리(E. coli)를 형질 전환시키고, 각각의 단편에 대해 하나의 재조합 이 콜린 클론을 서열 분석용으로 선택했다. 문헌〔Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕〕에 설명된 바와 같은 표준 절차를 사용하여 모든 조작을 실시했다.
상기 설명된 2개의 단편 서열을 기초로 하여 6개의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머 2가지 세트를 합성했다. 특히, 이 프라이머 세트를 사용하여 각각의 단편을 특이적으로 증폭시킬 수 있었다. 단편이 유래된 토마토 주에서만 단편이 증폭되었다. 그러나, 상기 프라이머 세트는 상기 다형성을 밝히는데 사용된 3개의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머를 사용하여 초기에 밝혀진 것과 같은 동일한 다형성을 나타냈다.
실시예 2
두가지 제한 효소에 의한 토마토 DNA의 선택 제한 단편 증폭
실시예 1에서는 선택 제한 단편 증폭(selective restriction fragment amplification)(SRFA)의 원리를 토마토 DNA 및 제한 효소 PstI을 사용하여 예증했다. 본 실시예에서는 두개의 다른 제한 효소인 PstI 및 MseI을 사용하여 SRFA를 설명할 것이다.
DNA의 분리 및 변형
실시예 1과 같은 방법으로 어린 잎으로부터 총 토마토 DNA를 분리하였다. 소위 동유전자형인 두쌍의 주를 GemR과 GemS, 및 GCR26과 GCR151로 각각 명명된 DNA 원으로 사용하였다(이 주들에 관한 참고문헌 : Denby and Williams, 〔1962〕, Can. J. Plant Sci. 42, 681-685, Smith and Ritchie, 〔1983〕, Plant Mol. Biol Rep. 1, 41-45). 각 쌍의 동유전자형 주들의 두 개체는 유전적으로 매우 유사하나, 병원진균인 버티실륨 알보-아트라툼 (Verticillium albo-atratum)에 대한 저항성을 부여하는 형질의 유무에 차이가 있다.
상기 DNA 변형의 첫단계는 두가지 효소 PstI과 MseI로 DNA를 제한 분해하는 것으로 이루어진다. DNA를 제한 분해하고 상기 DNA-단편에 어뎁터를 연속적으로 라이게이션시키는 과정을 동일한 완충액내에서 수행하였고, 이 완충액을 RL-완충액(제한 분해-라이게이션 완충액)이라 명명하며, 10 mM Tris. HAc / 10 mM MgAc / 50 mM KAc /5 mM DTT, pH 7.5를 함유하고 있다.
PstI과 MseI에 의한 DNA 제한 분해
2.5 μg DNA
12.5 유니트 PstI (파마시아(Pharmacia), 10 유니트/μl)
12.5 유니트 MseI (엔.이. 바이오랩스(N.E. Biolabs), 4 유니트 μl)
5 μg 10xRL-완충액
H2O 총 50 μl가 되도록 첨가하는 양
37℃에서 1 시간 동안 배양하였다.
DNA 변형의 두번째 단계는 DNA 단편의 말단에 어뎁터 분자들을 라이게이션 하는 것이다. 우선, 적합한 2본쇄 어뎁터 분자들을 제조해야 한다.
어뎁터의 제조
MseI - 어뎁터
상기 어뎁터 50 pMoles/μl 용액을 만들기 위해, 8μg(1430 pMoles)의 16-mer 5-GACGATGAGTCCTGAG-3과 7μg(1430 pMoles)의 14-mer 5-TACTCAGGACTCAT-3을 총28.6 μl 부피의 물중에서 혼합하였다.
상기 어뎁터 5 pMoles/μl 용액을 만들기 위해, 5.25 μg(715 pMoles)의 바이오티닐화된 21-mer 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3과 3.5 μg(715 pMoles)의 14-mer 5-TGTACGCAGTCTAC-3을 총 143 μl의 물중에서 혼합하였다.
어뎁터 분자들의 라이게이션
상기 제한 분해된 DNA에 하기 혼합물 10 μl를 첨가하였다:
1 μl PstI 바이오 - 어뎁터 ( = 5 pMol)
1 μl MseI 어뎁터 ( = 50 pMol)
1.2 μl 10 mM ATP
1 μl 10 x RL - 완충액
1 유니트 T4 DNA 리가제(파마시아, 5 유니트/μl)
H2O 총 10 μl가 되도록 첨가하는 양
수득한 반응 혼합물 60 μl를 37℃에서 3 시간 동안 항온처리하였다.
상기 어뎁터들은 라이게이션 후에 제한 부위가 복원되지 않도록 고안하였다. 제한 효소는 라이게이션 반응 동안 여전히 활성 상태이기 때문에 이런 방식으로 단편-대-단편 라이게이션을 막는데, 그 이유는 단편 콘카터머가 제한적이기 때문이다. 어뎁터-대-어뎁터 라이게이션은 어텝터들이 인산화되어 있지 않기 때문에 가능하지 않다(실시예 1 참조).
바이오티닐화된 DNA-단편들의 선택
두개의 제한 효소를 사용한 SRFA에 대한 주형-DNA의 제조는 일반적으로 단일의 효소에 의한 SRFA 시에는 사용되지 않았던 추가 단계를 포함한다. 이 단계에서는 바이오티닐화된 어뎁터가 연결되어 있는 DNA-단편들이 다른 모든 단편들과 분리된다.
이 단계에서는 바이오티닐화된 단편들을 상자성의 스트렙트아비딘 비이드들(다이날(Dynal))에 결합시킴으로써 바이오티닐화되지 않은 단편들 (MseI-MseI-단편)로부터 분리되었다. 10μl의 비이드를 100μl STEX(100mM NaCl/10 mM 트리스 · HCl 1 mM EDTA/ 0.1% 트리톤 X-100 pH 8.0)중에서 한번 세척하고 140μl의 STEX중에 재현탁시켰다. 그 비이드를 연속적으로 상기 라이게이션 혼합물에 첨가하여 최종 부피를 200μl로 만든다. 이것을 실온에서 30분 동안 서서히 교반하면서 항온처리하여 바이오티닐화된 DNA-단편을 비이드에 적절히 결합시켰다. 비이드들을 포함하는 튜브를 자석 가까이에 놓아 비이드를 모은다. 이것은 상층액을 다른 튜브로 옮길 때 비이드가 옮겨지는 것을 방지한다. 비이드를 한번 세척하고 깨끗한 튜브로 옮겼다. 그 후 200μl STEX로 3 번 세척하였다. 마지막으로 그 비이드를 200 μl의 TO1.E (10 mM 트리스/0.1 mM EDTA, pH 8.0)중에 재현탁시킨뒤, 깨끗한 튜브로 옮겼다. 그 DNA를 4℃에 보관하였다.
제한 효소들에 의해 제한 분해되고, 어뎁터가 연결된 뒤, 상자성 스트렙트아비딘 비이드에 부착된 다음, 전술한 바와 같이 제조된 MseI-MseI 단편들로부터 정제된 상기 DNA는 다음 단계부터는 주형-DNA로 언급될 것이다.
PstI-MseI 단편의 증폭
전술한 바와 같이 제조된 주형-DNA는 상기 언급한 토마토주로부터 수득되는 모든 PstI-MseI 단편 및 추가로, 중재성 MseI-단편을 갖지 않는 소량의 PstI-PstI-단편을 포함해야만 한다. 이 실험에서는 실시예 1에서 거의 설명한 바와 같이 증폭에 의해 많은 PstI-MseI 단편들을 가시화시켰다. 본 실시예에서 서술된 방법에 의해 얻어진 단편의 종류는 실시예 1의 방법에 의해 얻어진 종류보다 훨씬 적기 때문에 상기 증폭 생성물의 겔 분석은 변성 아크릴아미드 겔상에서 수행하였다(Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 74, 560-564). 또한, 이러한 겔 타입은 1 레인당 100 개의 밴드까지 분리할 수 있으며 이것은 실시예 1의 아가로스 겔의 약 10 배에 해당한다. 단편들은 (γ-32P)ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나아제로 하나의 PCR-프라이머의 5' 말단을 표지시킴으로써 가시화시켰다.
PCR-프라이머의 표지
표지시키기 위해 선택된 프라이머는 MseI-프라이머-1로 명명되는 19-mer 5-GATGAGTCCTGAGTAAgaa-3이며, 여기에서 소문자는 선택용 뉴클레오티드를 나타낸다. 표지화는 다음과 같이 수행한다 :
3.0μl 18-mer (50ng/μl 용액 = 150 ng)
5.0μl(γ-32P)-ATP (10 μCi/μl 용액 = 50 μCi)
3.0 μl 250 mM 트리스 · HCl/100 mM MgCl2/50 mM DTT, pH 7.5
0.5 μl T4-키나아제(파마시아, 10 유니트/μl)
18.5 μl H2O
총부피는 30μl이며 이것을 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 각 PCR에 대해 상기 5' 표지된 프라이머 1 μl을 가하였다.
총 28 가지의 PCR을 수행하였고. 그 중, 4 개의 주형-DNA들은 각각 7 개의 프라이머 조합물로 증폭시켰다. 각 프라이머 조합물은 같은 MseI-프라이머(전술한 MseI-프라이머-1)를 가졌으나, PstI-프라이머는 다양하게 선택할 수 있다. 총 7개의 다른 프라이머를 선택할 수 있다(MseI-프라이머에서와 같이, 선택용 뉴클레오티드들은 소문자로 표시됨):
PstI-프라이머-1 : 5-GACTGCGTACATGCAGga-3
PstI-프라이머-2 : 5-GACTGCGTACATGCAGgt-3
PstI-프라이머-3 : 5-GACTGCGTACATGCAGgg-3
PstI-프라이머-4 : 5-GACTGCGTACATGCAGag-3
PstI-프라이머-5 : 5-GACTGCGTACATGCAGat-3
PstI-프라이머-6 : 5-GACTGCGTACATGCAGct-3
PstI-프라이머-7 : 5-GACTGCGTACATGCAGta-3
모든 PCR-프라이머들을 50 ng/μl의 농도로 H2O에 용해시켰다.
증폭 반응
PCR-혼합물은 다음 성분들로 이루어진다 :
2.0 μl 주형 - DNA
1.0 μl 5'-표지된 MseI-프라이머(5 ng)
0.5 μl 표지되지 않은 MseI-프라이머(25 ng)
0.6 μl PstI-프라이머(30 ng)
2.0 μl 100 mM 트리스 · HCl/15 mM MgCl2/ 500 mM KCl, pH 8.5
0.8 μl 5 mM dNTPs
0.1 μl Taq 폴리머라제(polymerase)(Cetus Perkin Elmer, 5 유니트 μl)
13.0 μl H2O
상기 반응 성분들을 모두 가하고, 잘 혼합한 뒤 일반적으로 PCR의 주성분인 효소를 마지막으로 첨가하였다. 가능한한 연이어 반응을 시작한다.
증폭은 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 9600 가열 순환기상에서 수행하였다. 그 순환 프로파일은 다음과 같다:
1회 순환 : 변성 : 94℃에서 30초
어닐링 : 65℃에서 30초
연장 : 72℃에서 60초
11회 순환 : 변성 : 94℃에서 30초
각 순환마다 어닐링 온도를 0.7℃ 씩 낮춤.
64.3℃, 63.6℃, 62.9℃, 62.2℃, 61.5℃,
60.8℃, 60.1℃, 59.4℃, 58.7℃, 58.0℃, 57.3℃.
각각의 온도에서 30초 동안씩 항온처리한다.
연장 : 72℃에서 60초
23회 순환 : 변성 : 94℃에서 30초
어닐링 : 56℃에서 30초
연장 : 72℃에서 60초
증폭 단편의 겔 분석
상기 반응 생성물을 4.5%의 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하였다. 50 x 38cm의 겔을 만들기위해 바이오라드(Biorad)로부터 겔 카세트(cassette)를 구입하였다. 4.5% w/v 아크릴아미드, 0.225% w/v 비스아크릴아미드, 7.5 M 우레아, 50 mM 트리스, 50 mM 붕산, 1 mM EDTA - pH 8.3를 함유하는 100 ml 겔 용액을 사용하였다. 겔을 만들기 직전에 500 μl 10% 과황산암모늄과 100 μl 티메드(TEMED)를 상기 100 ml 겔 용액에 섞었다. 트리스/붕산/EDTA-완충액을 전기영동 완충액으로 사용하였으며 그 조성은 100 mM 트리스/100 mM 붕산/2 mM EDTA, pH 8.3 이었다. 그 반응 혼합물을 동부피(20 μl)의 98% 포름아미드 10 mM EDTA/0.01% w/v 브로모 페놀 블루/ 0.01% w/v 크실렌 시아놀과 혼합하였다. 그 혼합물을 95℃에서 3분간 가열하고 신속히 얼음상에서 냉각하였다. 각 샘플을 2 μl 씩 겔위에 적하하였다. 그 겔을 110 와트의 일정한 전력에서 전기 영동시켜 전기 영동 동안 열발생을 일정하게 유지하였다. 상기 조건하에서 그 겔의 장의 세기는 40 내지 50 볼트/cm로 하였다.
SRFA 반응 결과는 제14도에 나타낸다. 레인에 1부터 28 까지의 번호를 매기고, 그 각각은 7 개의 프라이머 조합물 중 하나와 4 개의 토마토주를 포함하였다. 겔상의 토마토주의 순서는 다음과 같다 :
1. GCR 26, 2. GCR 151, 3, GemR, 4. GemS.
1 번에서 4 번까지의 레인은 MseI-프라이머-1 및 PstI-프라이머-1로 증폭된 DNA 들을 포함하고, 레인 5부터 8 까지는 MseI-프라이머-1 및 PstI-프라이머-2로 증폭된 DNA를 포함하고, 레인 9부터 12까지는 MseI-프라이머-1 및 PstI-프라이머-3으로 증폭된 DNA를 포함하고, 레인 13부터 16 까지는 MseI-프라이머-1 및 PstI-프라이머-4로 증폭된 DNA를 포함하며, 레인 17부터 20 까지는 MseI-프라이머-1 및 PstI-프라이머-5로 증폭된 DNA를 포함하고 레인 21부터 24까지는 MseI-프라이머-1 및 PstI-프라이머-6으로 증폭된 DNA를 포함하고, 레인 25부터 28 까지는 MseI-프라이머-1 및 PstI-프라이머-7로 증폭된 DNA를 포함한다. 상기 겔은 어떠한 크기 마커(size marker)도 갖고 있지 않으나, 상기 가시화된 DNA 단편들은 그림의 하단에는 ±200 개의 뉴클레오티드 내지 상단에는 ±500 개의 뉴클레오티드에 해당한다.
실시예 3 : 두가지 제한 효소에 의한 다양한 락투카(LACTUCA)종 DNA의 선택 제한 단편 증폭
실시예 2에서는 두가지 제한 효소를 사용하는 선택 제한 단편 증폭(SRFA)의 원리를 토마토 DNA로 예증하였다. 본 실시예에서는 그와 동일한 제한 효소인 PstI과 MseI을 사용하여 다양한 락투카 종의 DNA에서도 유사한 결과가 얻어진다는 것을설명할 것이다.
DNA의 분리 및 변형
다양한 락투카 종들의 어린 잎을 사용하여 실시예 1에 기술한 바대로 DNA를 분리하였다. 후술한 바대로 이 식물에는 시판되는 양상치(엘. 사티바(L. Sativa)) 변종 및 두종류의 야생 락투카 종인 엘. 살리그나(L. Saligna)와 엘. 비로사(L. Virosa)의 몇몇 개체를 포함한다. 이 식물들을 임의로 다음 이름으로 표시하였다 :
1. 엘. 살리그나, nr. 21, 식물 1
2. 엘. 살리그나, nr. 21, 식물 2
3. 엘. 살리그나, nr, 22, 식물 1
4. 엘. 살리그나, nr. 22, 식물 2
5. 엘. 비로사, nr. 01, 식물 1
6. 엘. 비로사, nr. 01, 식물 2
7. 엘. 비로사, nr, 02,
8. 엘. 비로사, nr. 03, 식물 1
9. 엘. 비로사, nr. 03, 식물 2
10. 엘. 사티바, 시판 버터헤드 변종
상기 유전 물질을 분석하여 6가지 다른 식물 유형으로 나타내었는데 이 식물들 4 가지는 두개의 상이한 개체들을 포함하고 있다.
SRFA에 대한 주형을 만들기 위해 락투카 DNA의 변형을 실시예 2에 기술된 방법대로 수행하였다.
PstI-MseI 단편의 증폭
전술한 바대로 제조된 DNA를 SRFA 반응을 위한 주형으로 사용하였다. 단일의 MseI-프라이머와 두개의 다른 PstI-프라이머들을 이용하여 두가지 프라이머 조합물을 사용하였다. 이 프라이머들(선택용 뉴클레오티드는 소문자로 표시됨)은 다음과 같다 :
MseI-프라이머 : 5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3
PstI-프라이머-1: 5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
PstI-프라이머-2: 5-GACTGCGTACATGCAGca-3
위에 표기된 프라이머들을 사용하여 실시예 2와 같은 방법으로 PstI-MseI 단편들을 증폭시키고, 그 증폭된 단편들을 실시예 2와 같이 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 가시화하였다. 수득한 밴드 패턴들을 제15도에 나타내었다. 레인 1부터 10 까지는 PstI-프라이머-1와 함께 MseI-프라이머로 DNA 1 내지 10을 증폭시킨 것을 보여주며, 레인 11 내지 20은 PstI-프라이머-2와 함께 MseI-프라이머로 DNA 1 내지 10을 증폭시킨 것을 보여준다. 뉴클레오티드의 크기 마커는 (본 겔에서는 볼 수 없음) 상기 겔의 오른쪽에 나타내고 있다. 밴드 패턴의 차이는 여러종류의 식물에 있어서의 상관성의 차이를 반영하는 것이다.
실시예 4 : 여러가지 제한 효소 조합물에 의한 옥수수 근교주들의 선택 제한 단편 증폭
실시예 2 및 3에서는 2가지 제한 효소를 사용하는 선택 제한 단편 증폭(SRFA)의 원리를 각각 토마토 DNA 및 양상치(Lettuce)(락투카 종) DNA를 사용하여 예증하고 있다. 본 실시예에서는 옥수수(제아 마이스(Zea mais))주에 대해서도 유사한 결과가 얻어진다는 것을 보여줄 것이다. 또한, 옥수수 주의 경우에 있어서, DNA 핑거프린트를 제공하기 위해 다양한 제한 효소 조합물이 사용될 수 있다는 것도 설명될 것이다.
DNA의 분리 및 변형
1과 2로 명명된 두개의 옥수수 근교주를 사용하였다. 이 주들의 공급원은 상관성이 없으며, 이것은 경험상 어떤주를 선택하더라도 SRFA를 사용하여 우수한 DNA 핑거프린트를 얻을 수 있기 때문이다. 이 주들의 DNA를 어린잎에서부터 분리하였다(참고 : Saghai-Mahoof et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 8014-8018). 주형-DNA를 만들기 위해 다음의 제한 효소 조합물(EKs)들을 사용하였다 : PstI/TaqI. EcoRI/TaqI. AseI/TaqI. Sse8387-I/TaqI.
뉴잉글랜드 바이오랩으로부터 구입한 AseI 및 아메르샴(Amersham)으로부터 구입한 Sse8387-I를 제외하고는 모든 효소들을 파마시아로부터 구입하였다. 주형 DNA를 다음의 예외를 제외하고는 실시예 2 및 3에 기술된 대로 제조하였다: 우선, DNA를 65℃에서 1 시간 동안 TaqI과 함께 항온처리하고, 계속하여 37℃에서 추가로 1 시간 동안 제2 효소, PstI, AseI, EcoRI 또는 Sse8387-I로 항온처리함으로서 제한 분해했다.
다음 어뎁터들을 사용하여 실시예 2에 기술한바 대로 어뎁터의 라이게이션을실시 하였다 :
제한 단편의 증폭
실시예 2와 같은 방법으로 제한 단편의 증폭을 수행하였다. 증폭 생성물을 표지시키기 위해 선택된 프라이머는 3 개의 선택용 뉴클레오티드 (소문자로 표시됨)를 갖는 하기의 TaqI-프라이머들이다:
이 4 개의 프라이머들은 모두 4개의 효소 조합물에 의한 증폭 생성물을 검색하는데 사용되었다. 각각의 효소 조합물에 있어서, 다른 효소에 대해 4 개의 프라이머들을 선택하여 각 효소에 대해 총 16 개의 조합물을 얻었다. 이 프라이머들을 아래에 나타내었다(선택용 뉴클레오티드는 소문자로 표시됨) EcoRI 및 AseI에 대해서는 3개의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머들이 선택되고, PstI에 대해서는 2 개의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머들이 선택되며, SseI에 대해서는 하나의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 프라이머들이 선택되었다. 옥수수 게놈 DNA내의 절단부가 적은 효소에 대해서는 보다 적은 수의 선택용 뉴클레오티드를 갖는 연장부를 포함한 프라이머들을 선택하였다.
실시예 2에 준하여 총 128가지의 PCR(2 DNA x 4 개의 효소 조합물 x 16개의 프라이머 조합물)을 수행하였다. 상기 PCR의 반응 생성물들을 실시예 2에 기술된 바와 같이 3개의 겔(젤당 48 레인 포함)상에서 분석하였다. SseI/TaqI 조합만이 레인당 10 내지 15 밴드만을 나타내는 것을 제외하고는 모든 프라이머 조합물은 50 내지 100(밴드/레인)의 DNA 핑거프린트를 나타낸다. 겔중의 한예를 제16도에 나타내었다. 이 그림은 효소 조합물 PstI/TaqI 및 EcoRI/TaqI에 의해 얻은 DNA 핑거프린트물을 분석한 겔의 일부분을 보여준다. 레인 1 내지 8은 각각, TaqI-프라이머-3과 PstI-프라이머-1, -2, -3 및 -4로 SRFA에 의해 얻어진 두종류의 옥수수 DNA의 DNA-핑거프린트를 보여주며, 레인 9 내지 16은 각각 TaqI-프라이머-4와 PstI-프라이머-1, -2, -3 및 -4로 SRFA에 의해 얻어진 2종류의 옥수수 DNA의 DNA-핑거프린트를 보여주며, 레인 17은 PstI로 제한 분해된 크기 마커 람다-DNA를 보여주는데, 뉴클레오티드 내의 몇몇 단편들의 크기는 오른쪽에 표시되어 있으며, 레인 18 내지 25는 각각 TaqI-프라이머-1 및 EcoRI-프라이머-1, -2, -3 및 -4로 SRFA에 의해 얻어진 두종류의 옥수수 DNA의 DNA-핑거프린트를 보여준다.
실시예 5 : 박테리아 DNA의 선택 제한 단편
실시예 2, 3 및 4에서는 2가지 제한 효소를 사용한 선택 제한 단편 증폭(SRFA)의 원리를 토마토, 양상치(락투카 종) 및 옥수수 DNA 각각에 대하여 예시한바 있다. 본 실시예에서는 상기 기법을 박테리아 DNA의 특성규명에도 사용할 수 있음을 설명하고자 한다. 상기 기법의 박테리아에 대한 유용성을 예증하기 위해, 다수의 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) 균주를 벨기에,젠트 소재의 레보러토리 오브 마이크로 바이올로지로부터 입수하였다.
DNA의 분리 및 변형
모든 DNA는 각종의 근원, 대개는 감염된 식물로부터 분리된 크산토모나스 캄페스트리스 균주로부터 조제하였다. 이 균주들은 하기에 번호 1~26으로 표기하였고, 벨기에, 젠트 소재의 레보러토리 오브 마이크로 바이올로지로부터 입수할 수 있다.
상기 박테리아 균주의 DNA는 문헌 〔Marmur, J. Mol. Biol. 3. 208-218〕에 기술된 바와 같이 분리시켰다. 그 DNA 들은 제한 효소로서 TaqI 및 ApaI을 선택한 것을 제외하고는, 실시예 4에 기술된 바와 같이 거의 제한 분해시켰다. 하기 어뎁터를 사용하여 실시예 4에 기술된 바와 같이 어뎁터들을 라이게이션시켰다 :
제한 단편의 증폭
제한 단편의 증폭은 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. SRFA에 대해 선택된 프라이머는 TaqI - 프라이머 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3(소문자로 표시한 하나의 선택용 뉴클레오티드를 가짐), 및 ApaI - 프라이머 5-GACTGCGTACAGGCCC g-3(소문자로 표시한 하나의 선택용 뉴클레오티드를 가짐) 이었다. 상기 ApaI-프라이머는 실시예 2에 기술된 바와 같이 증폭된 단편의 검출을 위해 5' 말단을 표지화하였다.
26가지 DNA를 각각 전술한 프라이머 세트를 사용해서 증폭시켰다. 증폭 조건은, 실시예 2, 3 및 4에 기술된 식물에 비해 DNA의 복잡도가 낮기 때문에 PCR의 마지막 9 순환은 생략한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기술된 바와 같다.
본 실시예에 기술된 바와 같은 박테리아 DNA를 사용해서 얻은 DNA 핑거프린트를 제17도에 나타내었다. 레인 1-26은 박테리아 DNA 1-26을 나타낸다. 뉴클레오티드내의 마커 DNA의 크기(겔상에 가시화되지 않음)는 겔의 우측으로 표시된다. 제17도는 박테리아 균주들의 상관성이 밴드 패턴의 유사성에 의해 반영됨을 명백히 보여준다.
실시예 6
2가지 제한 효소에 의한 각종 동물의 DNA의 선택 제한 단편 증폭
전술한 실시예들에서는 선택 제한 단편 증폭(SRFA)을 각종 원천에서 유래한 식물 DNA에 대해서 예시하였다. 본 실시예에서는 여러 가축으로부터 얻은 DNA의 무작위 샘플을 사용하여 상기 절차의 효능을 설명하고자 한다. 테스트한 동물종은 다음과 같다 : 갈루스 도메스티쿠스 (Gallus domesticus)(병아리); 수스크로파 도메스티카 엘. (Susscrofa domestica L.) (돼지) ; 보스 타우루스 (Bos taurus)(소) ; 에쿠우스 카발루스 (Equus caballus)(말). 사용된 제한 효소는 Sse 8387I 및 MseI이다.
DNA의 분리 및 변형
매니아티스(Maniatis) 등 (1982)의 문헌에 기술된 절차에 따라 혈액 샘플로부터 DNA를 분리시켰다. DNA 샘플 1-3(병아리), 4-7(돼지), 8-11(소) 및 12-15(말)을 제한 효소 Sse8387I 및 MseI로 분해시켰다. 그 DNA 단편을 실시예 2에 기술된 바와 같이 어뎁터에 결합시켰다. 제한 효소 Sse 8387I 및 PstI은 화합성 3' 측쇄를 생성시키기 때문에, 실시예 2에 기술된 PstI- 및 MseI-어뎁터를 사용할 수 있었다.
제한 단편의 증폭
실시예 2에 기술된 바와 같이 제조되고, 상기 명명된 주형 DNA 들을 SRFA 반응에서 주형으로 사용했다. 사용된 프라이머 조합물은 단일의 MseI-프라이머와 상이한 SseI-프라이머들로 이루어진다 :
전술한 프라이머 쌍을 사용한 Sse8387I-MseI 단편의 증폭은 실시예 2에 기술된 절차에 따라 수행했다. 반응 생성물을 실시예 2에 기술된 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전개시켰다. 상기 샘플들의 핑거프린트를 보여주는 자동방사성사진을 제18도에 나타내었다. 레인 1∼15는 Sse8387I-프라이머-1과 쌍을 이룬 MseI-프라이머로 증폭시킨 DNA 1 내지 15의 핑거프린트를 나타내며, 레인 16~30은 Sse8387I-프라이머-2와 결합된 MseI-프라이머를 사용해서 얻은 유사한 패턴을 나타낸다. 1 종의 동물들간의 핑거프린트에 있어서의 차이는 동물 개체들간의 이종성을 반영하며 ; 전반적인 패턴이 특이적인 종에 대해서 특징적이다.
구체적인 실시 양태에 있어서, 본 발명은 소정의 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다수의 제한 부위를 함유하고 그 핵산 서열의 최소한 일부분이 미공지 상태인, 출발 DNA의 최소한 일부분을 조절 증폭시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 (a)∼(h) 단계를 포함한다 :
(a) 상기 출발 DNA를 상기 특정 제한 엔도뉴클레아제로 분해시켜 각각 5' 말단과 3' 말단을 포함하는 상응하는 서열의 제한 단편으로 단편화시키는 단계 ;
(b) 후술되는 바와 같은 5' 및 3' 어뎁터가 사전에 분리된 형태로 존재하지않을 경우, 상기 특정 엔도뉴클레아제를 사용하여, 자체의 뉴클레오티드 서열내에 상기 특정 엔도뉴클레아제에 대한 단일 부위를 포함하는 소정의 2본쇄 올리고뉴클레오티드 링커를 분해시키므로써 그 링커를 각각 5' 및 3' 어뎁터로 절단시키는 단계;
(c) 상기 출발 DNA 로부터 얻은 제한 단편을 이들의 5' 및 3' 말단에서 각각 상기 3' 및 5' 어뎁터와 결합시키므로써, 그 출발 DNA의 표지된 제한 단편(이때, 이 단편은 각각의 5' 및 3' 말단에 표지를 포함하고, 이 표지의 뉴클레오티드 서열은 특정 제한 부위내에 함유된 뉴클레오티드를 비롯하여 3' 및 5' 어뎁터의 뉴클레오티드를 포함함)을 형성시키는 단계 ;
(d) 프라이머에 대한 적합한 주형을 제공하는 것이 적절한 경우, 전술한 라이게이션 반응전에 소정의 불변 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 분절을 상기 5' 및 3' 어뎁터에 첨가하여도 그들의 각 5' 및 3'말단에서 연장되지 않는다면, 동일한 목적을 위해 적절한 경우에는 상기 표지된 제한 단편의 상응하는 말단을 상기 올리고뉴클레오티드 분절로 연장시키므로써, 양 말단이 상기 불변 서열에 의해 연장된 표지된 제한 단편을 수득하는 단계;
(e) 상기 표지된 제한 단편, 또는 적절한 경우에는, 상기 연장된 제한 단편을 하이브리드 조건하에서 2 가지 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 단계;
(f) 상기 단계(e)에서, 상기 프라이머는 이에 대한 주형으로서 작용하는 가닥에 대해 상보적인 상기 표지된, 또는 적절한 경우에는 연장된 제한 단편들의 5'및 3' 말단을 지닌 가닥의 말단 부와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열을 포함하고, 또한 상기 프라이머는 각각 주형 가닥내의 소정의 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 부위의 형성에 관련된 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 갖고 있고 ;
(g) 상기 프라이머와 하이브리드된 상기 연장된 제한 단편을 필요로 되는 뉴클레오티드 및 폴리머라제의 존재하에 PCR 또는 그와 유사한 기법에 의해 증폭시켜 상기 프라이머가 그 전체 길이 위에 먼저 하이브리드되어 있는, 출발 DNA의 제한 단편을 따라 상기 하이브리드된 프라이머를 추가로 연장시키는 단계, 및
(h) 상기 최종적인 제한 단편을 식별 또는 회수하는 단계.
상기 방법의 특정 구체예에 있어서, 상기 연장 진행 방향에 있는 상기 프라이머중 최소한 하나의 말단 뉴클레오티드는 상기 특정 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 내에 함유된 뉴클레오티드들 중 마지막 뉴클레오티드에 상응하며, 상기 방법은 증폭된바 있는 상기 출발 DNA의 제한 단편을 식별 또는 회수하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 다른 특정 구체예에 있어서, 상기 프라이머중 최소한 하나는 증폭 단계중에 상응하는 제한 단편내의 연장 방향에 존재하는 상기 특정 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위와 관련된 뉴클레오티드중에 최후의 뉴클레오티드 이상으로 연장하는 소정의 수(1개 또는 수개의 뉴클레오티드)로 이루어진 선택용 서열을 포함한다.
전술한 방법의 특정 구체예에 있어서, 2본쇄 DNA-링커는 상호간에 전부 떨어져 있는 상이한 특정 엔도뉴클레아제에 대한 여러 부위를 함유하며, 이러한 경우에는 동일한 출발 DNA 상에서 상기 제한 엔도뉴클레아제중 하나를 가지고 전술한 방법의 단계들을 반복하고, 또한 상기 별개의 특정 엔도뉴클레아제를 가지고 전술한 방법의 단계를 반복하며, 상기 정의된 바와 같이 선택된 뉴클레오티드서열을 갖는 프라이머를 사용할 때에는 또한 상술한 다른 특정 엔도뉴클레아제에 대하여 상술한 방법의 단계를 반복한다.
상기 설명된 바와 같은 방법 또는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 방법은 동일한 생물 종에서 유래한 결정된 DNA 들, 예컨데 미생물, 식물 또는 동물(사람 포함)의 게놈 DNA 또는 그 단편들 중의 다형성을 상응하는 결정된 표준 DNA에 대하여, 또는 그들중에서 식별하는데 적당하며, 이 방법의 사용법은 연구중인 DNA를 증폭 또는 연장 반응을 허용하는 조건하에서 상기 올리고뉴클레오티드와 접촉시키거나 또는 상기 올리고뉴클레오티드의 방법으로 처리하고, 상기 각각의 DNA, 및 임의로 상기 표준 DNA로부터 얻어진 제한 패턴들을 비교한 후, 상이한 DNA들의 제한 단편 크기간에 관찰된 차이와 DNA 다형성의 존재, 및 적절한 경우에는 그 위치를 결부시키는 것으로 이루어진다.
본 발명은 또한 동일한 소정의 특정 엔도뉴클레아제를 사용할때 생성되는 단편화되지 않은 출발 DNA의 초기 분해물에 전부 상응하는 서열을 지닌 여러 단편들로 구성된 단편화된 DNA에 관한 것으로서, 이때 상기 모든 단편들은 이들의 5' 및 3'말단들이 각각 상기 특정 엔도뉴클레아제에 대한 단일 제한 부위를 처음에 포함하고 있는 동일한 출발 DNA 링커의 절단된 부분에 상응하는 결정된 3' 및 5' 어뎁터에 의해 표지되며, 임의적으로는 결정된 불변 서열에 의해 연장됨을 특징으로 한다. 상기 단편화된 DNA는 적당한 지지체, 예컨데 겔 지지체상에 이동 밴드 패턴의 형태로 존재할 수 있고, 이때 그 단편들은 처음에는 전기장의 영향하에 이동된다.
상기 단편화된 DNA는 또한 5' 말단에서부터 하기 조성을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드를 비롯하여 말단 부분을 포함할 수 있다 :
(i) 10개 이상 내지 30개 이하의 염기로 구성되며 어뎁터로서 사용된 소정의 DNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 (불변 서열), 그 다음
(ii) 상기 단계 (a)에 사용된 특정 제한 엔도뉴클레아제의 표적 부위에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 이 서열 또는 이 서열의 일부가 (ii)에 포함되지 않는 경우에 한하여, 그 다음
(iii) 1개 이상 내지 10개 이하의 뉴클레오티드(예 : 1~5개 뉴클레오티드 길이)로 이루어진 선택된 뉴클레오티드 서열.
또한, 본 발명은 1종 이상의 특정 제한 엔도뉴클레아제로 소정의 DNA를 단편으로 단편화시키고 그 단편을 분석하기 위한 킷트에 관한 것으로서, 상기 킷트는 하기 구성 성분들을 포함한다 :
- 특정 제한 엔도뉴클레아제 :
- 상응하는 5' 및 3' 어뎁터로 절단하기 위한, 상기 특정 엔도뉴클레아제에 대한 단일 부위를 자체 뉴클레오티드 서열내에 포함하는 2본쇄 DNA 올리고뉴클레오티드 링커, 이때 상기 2본쇄 DNA 링커는 차후에 본 킷트의 PCR 프라이머에 대한 주형을 제공할 수 있는 5' 및 3'부를 제공하기 위해 충분한 크기를 가져야 함;
- 상기 프라이머에 대한 주형으로서 차후에 작용하는 가닥에 상보적인 상기 5' 및 3' 어뎁터 가닥과 동일한 서열을 한쪽에 각각 포함하며, 또한 상기 주형 가닥내에 있는 상기 소정의 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 부위의 형성과 관련이 있는 뉴클레오티드에 대해 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 PCR 프라이머 ;
- 적절한 경우에는, 상기 특정 제한 엔도뉴클레아제로 상기 링커를 분해시켜 5' 및 3' 어뎁터를 각각 생성시키기에 앞서, 상기 5' 어뎁터의 5' 말단을 연장시키거나 또는 3' 어뎁터의 3' 말단을 연장시키거나 또는 이들 양쪽 말단을 모두 연장시키기 위해 사용되거나, 또는 출발 DNA 단편의 말단들에 상기 5' 및 3' 어뎁터를 라이게이션시켜 얻어진 표지된 단편을 연장시키기 위해 사용되는 상기 프라이머와 하이브리드하기에 충분한 길이를 지닌 부위를 제공하기 위한 소정(불변)의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 분절 :
- 임의로 단편화 연구의 대상인 소정의 DNA에 상응하는 단편화된 표준 DNA(이때, 상기 표준 DNA의 단편들은 상기 특정 엔도뉴클레아제로 분해시키므로써 얻어짐).
상기 킷트의 특정 구체예에 있어서, 상기 표지된 DNA 단편의 5' 및 3' 어뎁터 또는 5' 및 3' 말단을 연장시키기 위한 상기 올리고뉴클레오티드 분절들은 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 킷트의 링커는 서로 모두 다른 특정 엔도뉴클레아제에 대해 각각의 고유한 여러 부위를 함유하고 있고, 상기 킷트는 또한 상기 상이한 특정 엔도뉴클레아제 각각에 의해 상기 링커를 절단시키므로써 형성된3' 및 5' 어뎁터에 각기 상응하는 프라이머를 포함하는데, 이 프라이머는 상기 특정 엔도뉴클레아제 각각에 의한 분해로 말미암아 상기 링커에서 생성되는 3' 및 5' 어뎁터와 관련하여 청구범위에 정의한 바와 같다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 킷트는 상응하는 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대해 상기 정의된 바와 같은 단편화된 표준 DNA를 포함할 수 있고, 이때 이 단편화된 표준 DNA 각각은 소정의 특정 제한 효소와 각각 상관 관계가 있다.

Claims (31)

  1. 출발 DNA로부터 수득된 하나 이상의 제한 단편을 증폭시키는 방법으로서,
    (a) 상기 출발 DNA를 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 분해시켜 그 출발 DNA를 제한 단편들로 단편화시키는 단계;
    (b) 상기 수득된 제한 단편을 제한 단편의 한쪽 말단이나 양쪽 말단에 연결될 수 있는 하나의 말단을 지닌 하나 이상의 2본쇄 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터(adaptor)와 연결시켜 표지된 제한 단편을 생성하는 단계;
    (c) 상기 표지된 제한 단편을 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 하이브리드화 조건하에서 접촉시키는 단계(여기서, 상기 프라이머 또는 프라이머들은 표지된 제한 단편에 존재하는 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열 부분과 염기쌍을 형성하고 어뎁터 서열 부분과 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 프라이머의 하나 이상은 상기 표적 서열의 형성에 관련된 뉴클레오티드에 바로 인접하여 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유한 선택 서열을 3' 말단에 포함한다);
    (d) DNA 폴리머라제 및 필요한 뉴클레오티드의 존재하에 상기 프라이머 또는 프라이머들과 하이브리드화되는 상기 표지된 제한 단편을 증폭시키거나, 또는 상기 하이브리드화된 프라이머를 표지된 제한 단편을 따라서 신장시키는 단계; 및
    (e) 단계 (d)에서 생성된 증폭되거나 신장된 DNA 단편을 확인하거나 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 (c)에서 프라이머 또는 프라이머들은 상기 표지된 제한 단편의 말단에서 가닥들의 말단부와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 상기 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열의 형성에 관련된 뉴클레오티드를 포함하고 적어도 결합된 어뎁터에 존재하는 뉴클레오티드 부분을 포함하는 서열을 함유하며, 상기 하나 이상의 프라이머는 상기 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열의 형성에 관련된 뉴클레오티드에 바로 인접하여 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 선택 서열을 3' 말단에 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단계 (c)에서 프라이머 또는 프라이머들은 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열 부분 및 어뎁터 서열로 구성되는 불변 DNA 서열과 완전히 염기쌍을 형성하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하나 이상의 프라이머가 1 내지 10 뉴클레오티드의 선택 서열을 포함하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    프라이머가 10 내지 50 뉴클레오티드를 포함하며, 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열이 4 내지 8 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    어뎁터와 염기쌍을 형성하는 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 10 내지 30 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    어뎁터가 표지된 제한 단편과 하이브리드화하는 경우 엔도뉴클레아제의 대응하는 표적 서열이 회복되지 않도록 어뎁터가 고안되며, 프라이머 또는 프라이머들은 혼합물의 하나 이상의 표지된 제한 단편 서열의 적어도 하나의 말단과 완전히 염기쌍을 형성하는 불변 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 상기 불변 서열은 상기 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열 부분과 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 프라이머 중 하나 이상은 상기 표적 서열의 형성에 관련된 뉴클레오티드의 3' 말단에 인접하여 1 내지 10개의 추가 선택 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    출발 DNA의 핵산 서열이 적어도 부분적으로 알려지지 않은 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    2가지의 다른 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    모든 프라이머가 동일한 불변 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서로 다른 프라이머들의 혼합물을 사용하는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하나 이상의 프라이머가 3' 말단에 1, 2, 또는 3, 선택 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    2가지의 다른 제한 엔도뉴클레아제가 단계 (a)에서 사용되며, 엔도뉴클레아제 중 하나에 대한 하나 이상의 2본쇄 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터가 바이오티닐화된 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하나 이상의 프라이머가 표지된 것인 방법.
  15. 증폭된 제한 단편들의 세트를 제조하는 방법으로서,
    (a) 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 이용하여 출발 DNA로부터 수득된 생성 제한 단편의 혼합물로부터 제한 단편의 세트를 증폭시키는 단계;
    (b) 증폭된 표지된 제한 단편을 분리하는 단계;
    (c) 증폭된 제한 단편을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    증폭되는 상기 출발 DNA는 인간 또는 동물의 생물학적 샘플, 특히 조직 또는 혈액 샘플의 게놈 DNA인 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    증폭되는 상기 출발 DNA는 식물 또는 식물 조직의 게놈 DNA인 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    증폭되는 상기 출발 DNA는 미생물의 DNA인 방법.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    동일한 생물 종으로부터 유래하는 서로 다른 출발 DNA 사이의 다형성의 확인을 위해서, 서로 다른 출발 DNA의 증폭된 제한 단편 사이에서 관찰되는 차이를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    미생물, 식물 또는 인간을 포함하는 동물의 게놈 DNA에 있어서, 그들 사이의 다형성 또는 대응하는 측정된 DNA 표준물과의 상대적인 다형성의 확인을 위한 방법.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    인간의 유전학적으로 유전되는 형질과 관련된 DNA 다형성의 확인, 동물의 유전학적으로 유전되는 형질과 관련된 DNA 다형성의 확인, 또는 식물의 유전학적으로 유전되는 형질과 관련된 DNA 다형성의 확인, 그리고 그러한 DNA 다형성에 기초한 DNA 마커의 확인을 위한 방법.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    식물 또는 동물 변종, 종, 재배변종, 미생물 사이의 유사성을 검출하기 위해서, 또는 유전적 거리를 평가하고 그러한 식물 또는 동물 변종, 종, 재배변종, 미생물을 특정화하기 위해서, 상기 방법의 단계 (e)에서 확인 또는 회수된 2 이상의 증폭 또는 신장된 DNA 단편을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단계 (e)에서 생성된 증폭되거나 신장된 DNA 단편을 DNA 핑거프린트로서 확인 또는 회수하는 방법.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (f) 단계 (e)에서 확인 또는 회수된 하나 이상의 DNA 단편을 분리하는 단계;
    (g) 상기 DNA 단편의 양쪽 말단에서 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열의 안쪽에 인접한 처음 8-10 뉴클레오티드 잔기의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계;
    (h) 선택된 뉴클레오티드 서열이 상기 DNA 단편의 양쪽 말단에서 제한 부위의 안쪽에 인접한 처음 8-12 뉴클레오티드 잔기에 대응하는 5 내지 10 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 제 1 항의 단계 (c)의 프라이머에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 하나 이상의 특이적인 제한 엔도뉴클레아제로 분해시킨 후 출발 DNA로부터 하나 이상의 제한 단편을 증폭시키기 위한 키트로서,
    제한 단편의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 결합될 수 있는 한쪽 말단을 가져서 출발 DNA의 표지된 제한 단편을 생성할 수 있는 하나 이상의 2본쇄 합성 올리고뉴클레오티드(어뎁터);
    어뎁터 서열 및 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열 부분, 및 표적 서열의 3' 말단에 바로 인접하여 1 내지 10 선택 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열과 염기쌍을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 키트.
  26. 하나 이상의 특이적인 제한 엔도뉴클레아제로 분해시킨 후 출발 DNA로부터 하나 이상의 제한 단편을 증폭시키기 위한 키트로서,
    특이적인 제한 엔도뉴클레아제 또는 제한 엔도뉴클레아제들;
    제한 단편의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 결합될 수 있는 한쪽 말단을 가져서 출발 DNA의 표지된 제한 단편을 생성할 수 있는 하나 이상의 2본쇄 합성 올리고뉴클레오티드(어뎁터);
    어뎁터 서열 및 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열 부분, 및 표적 서열의 3' 말단에 바로 인접하여 1 내지 10 선택 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열과 염기쌍을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 키트.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    Taq 폴리머라제와 같은 DNA 폴리머라제, dNTP, 완충용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 키트.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    인간의 법정상의 타이핑(forensic typing)과 같은 유전자 분석용 진단 키트.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    동물의 결정 형질 또는 식물의 형질의 유전을 검출하는 것과 같은 유전자 분석용 키트.
  30. (a) 출발 DNA를 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 분해시켜 그 출발 DNA를 제한 단편들로 단편화시키는 단계;
    (b) 상기 수득된 제한 단편을 제한 단편의 한쪽 말단이나 양쪽 말단에 연결될 수 있는 하나의 말단을 지닌 하나 이상의 2본쇄 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터와 연결시켜 표지된 제한 단편을 생성하는 단계;
    (c) 상기 표지된 제한 단편을 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 하이브리드화 조건하에서 접촉시키는 단계(여기서, 상기 프라이머 또는 프라이머들은 표지된 제한 단편에 존재하는 제한 엔도뉴클레아제의 표적 서열 부분과 염기쌍을 형성하고 어뎁터 서열 부분과 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 프라이머의 하나 이상은 상기 표적 서열의 형성에 관련된 뉴클레오티드에 바로 인접하여 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유한 선택 서열을 3' 말단에 포함한다);
    (d) DNA 폴리머라제 및 필요한 뉴클레오티드의 존재하에 상기 프라이머 또는 프라이머들과 하이브리드화되는 상기 표지된 제한 단편을 증폭시키거나, 또는 상기 하이브리드화된 프라이머를 표지된 제한 단편을 따라서 신장시키는 단계; 및
    (e) 단계 (d)에서 생성된 증폭되거나 신장된 DNA 단편을 확인하거나 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 증폭된 제한 단편 세트.
  31. 겔, 막(membrane) 또는 필름상에 존재하는 증폭된 제한 단편 세트.
KR1019940700959A 1991-09-24 1992-09-24 선택적인 제한단편의 증폭:디엔에이(dna) 핑거프린트법 KR100321510B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91402542.4 1991-09-24
EP91402542 1991-09-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100321510B1 true KR100321510B1 (ko) 2005-01-10

Family

ID=8208616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019940700959A KR100321510B1 (ko) 1991-09-24 1992-09-24 선택적인 제한단편의 증폭:디엔에이(dna) 핑거프린트법

Country Status (20)

Country Link
US (1) US6045994A (ko)
EP (2) EP0534858B2 (ko)
JP (3) JP3236295B2 (ko)
KR (1) KR100321510B1 (ko)
AT (2) ATE191510T1 (ko)
AU (1) AU672760B2 (ko)
CA (1) CA2119557C (ko)
CZ (2) CZ298187B6 (ko)
DE (2) DE69230873T3 (ko)
DK (2) DK0969102T3 (ko)
ES (2) ES2147550T5 (ko)
FI (2) FI113184B (ko)
GR (1) GR3033895T3 (ko)
HU (1) HU223760B1 (ko)
IL (1) IL103267A (ko)
NO (1) NO318016B1 (ko)
PT (2) PT969102E (ko)
RU (1) RU2182176C2 (ko)
WO (1) WO1993006239A1 (ko)
ZA (1) ZA927323B (ko)

Families Citing this family (282)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6074818A (en) * 1990-08-24 2000-06-13 The University Of Tennessee Research Corporation Fingerprinting of nucleic acids, products and methods
US20100267023A1 (en) * 1992-09-24 2010-10-21 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
US7026115B1 (en) * 1991-09-24 2006-04-11 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
ZA929319B (en) * 1991-12-11 1993-05-24 Igen Inc Method for exponential amplification of nucleic acid by a single unpaired primer.
WO1993017126A1 (en) * 1992-02-19 1993-09-02 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
GB9301776D0 (en) * 1993-01-29 1993-03-17 Univ Alberta Method for detecting genomic variation
US5470723A (en) * 1993-05-05 1995-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification
US5422252A (en) * 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
US5650274A (en) * 1993-06-25 1997-07-22 Hitachi, Ltd. DNA analyzing method
GB2283568B (en) * 1993-10-13 1997-12-24 Mini Agriculture & Fisheries Identification of fruit juice components
RU2111254C1 (ru) * 1994-07-11 1998-05-20 Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ МАТРИЧНЫХ РНК И КЛОНИРОВАНИЯ СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ ФРАГМЕНТОВ кДНК
US5710000A (en) * 1994-09-16 1998-01-20 Affymetrix, Inc. Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping
GB2295228A (en) * 1994-11-10 1996-05-22 Unilever Plc Selective amplification of DNA having a plurality of sites for a specific endonuclease
GB2295011A (en) * 1994-11-10 1996-05-15 Unilever Plc Selection of DNA markers using adaptor molecules
JPH10509594A (ja) * 1994-11-28 1998-09-22 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 遺伝的多型の検出のための複合ミクロサテライトプライマー
EP0718409A3 (en) * 1994-12-22 1999-02-03 Hitachi, Ltd. DNA preparation method
EP0721987A1 (en) * 1995-01-16 1996-07-17 Keygene N.V. Amplification of simple sequence repeats
US6031153A (en) * 1995-01-23 2000-02-29 Novartis Ag Method for protecting plants
US5565340A (en) * 1995-01-27 1996-10-15 Clontech Laboratories, Inc. Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR
US5707807A (en) * 1995-03-28 1998-01-13 Research Development Corporation Of Japan Molecular indexing for expressed gene analysis
US6395887B1 (en) 1995-08-01 2002-05-28 Yale University Analysis of gene expression by display of 3'-end fragments of CDNAS
US5712126A (en) * 1995-08-01 1998-01-27 Yale University Analysis of gene expression by display of 3-end restriction fragments of CDNA
AU722863B2 (en) * 1995-08-07 2000-08-10 Keygene N.V. Resistance against wilt inducing fungi
US5871697A (en) 1995-10-24 1999-02-16 Curagen Corporation Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing
US6418382B2 (en) 1995-10-24 2002-07-09 Curagen Corporation Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing
US5972693A (en) * 1995-10-24 1999-10-26 Curagen Corporation Apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing
US6218119B1 (en) 1996-01-16 2001-04-17 Keygene, N. V. Amplification of simple sequence repeats
WO1997029211A1 (en) * 1996-02-09 1997-08-14 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services RESTRICTION DISPLAY (RD-PCR) OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED mRNAs
US6091004A (en) * 1996-06-21 2000-07-18 Novartis Finance Corporation Gene encoding a protein involved in the signal transduction cascade leading to systemic acquired resistance in plants
EP0823481A1 (en) 1996-08-09 1998-02-11 Keygene N.V. Resistance against nematodes
DK0937155T3 (da) 1996-08-09 2005-01-31 Keygene Nv Resistens over for nematoder og/eller bladlus
AU4065397A (en) 1996-08-14 1998-03-06 Life Technologies, Inc. Stable compositions for nucleic acid amplification and sequencing
AU4174397A (en) * 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna
US20040142327A1 (en) * 1996-11-22 2004-07-22 Jhy-Jhu Lin Methods for identifying and isolating DNA polymorphisms or genetic markers
US5986082A (en) * 1996-12-13 1999-11-16 Novartis Ag Altered forms of the NIM1 gene conferring disease resistance in plants
US5861295A (en) 1997-01-02 1999-01-19 Life Technologies, Inc. Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof
US6100030A (en) * 1997-01-10 2000-08-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of selective DNA fragment amplification products for hybridization-based genetic fingerprinting, marker assisted selection, and high-throughput screening
US6306588B1 (en) 1997-02-07 2001-10-23 Invitrogen Corporation Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
ES2563643T3 (es) 1997-04-01 2016-03-15 Illumina Cambridge Limited Método de secuenciación de ácido nucleico
US6090556A (en) * 1997-04-07 2000-07-18 Japan Science & Technology Corporation Method for quantitatively determining the expression of a gene
WO1998047912A1 (en) 1997-04-22 1998-10-29 Life Technologies, Inc. Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits
US6673577B1 (en) * 1997-08-07 2004-01-06 Curagen Corporation Detection and confirmation of nucleic acid sequences by use of poisoning oligonucleotides
US6190868B1 (en) 1997-08-07 2001-02-20 Curagen Corporation Method for identifying a nucleic acid sequence
US6833242B2 (en) * 1997-09-23 2004-12-21 California Institute Of Technology Methods for detecting and sorting polynucleotides based on size
ATE537270T1 (de) * 1997-10-30 2011-12-15 Cold Spring Harbor Lab Sondenanordnungen und deren verwendungen für verfahren zur dns-unterscheidung
JP2002501760A (ja) * 1998-02-02 2002-01-22 アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ 核酸解析方法
AU3747099A (en) 1998-04-16 1999-11-01 Case Western Reserve University Method for finding genetic markers of somaclonal variation
US6324479B1 (en) 1998-05-08 2001-11-27 Rosetta Impharmatics, Inc. Methods of determining protein activity levels using gene expression profiles
US6218122B1 (en) 1998-06-19 2001-04-17 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods of monitoring disease states and therapies using gene expression profiles
EP0974672B1 (en) * 1998-07-21 2003-04-09 Keygene N.V. Improved primers for AFLP amplification
DE69816286T2 (de) 1998-07-29 2004-05-27 Keygene N.V. Verfahren zur Erkennung von Nukleinsäuremethylierungen durch AFLP
US6306593B1 (en) * 1998-09-17 2001-10-23 Union Camp Corporation Selective AFLP primers for reduction of complexity of maker genotyping and DNA markers for loblolly pine identified using the AFLP primers
US6146830A (en) * 1998-09-23 2000-11-14 Rosetta Inpharmatics, Inc. Method for determining the presence of a number of primary targets of a drug
US6703228B1 (en) * 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
JP3855492B2 (ja) * 1998-10-08 2006-12-13 株式会社日立製作所 混合核酸断片分析法
AU6074999A (en) 1998-10-14 2000-05-01 Agriculture And Agrifood Canada Hybrid alfalfa ((medicago sativa))
US6361947B1 (en) 1998-10-27 2002-03-26 Affymetrix, Inc. Complexity management and analysis of genomic DNA
US6468476B1 (en) 1998-10-27 2002-10-22 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods for using-co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns
US6203987B1 (en) 1998-10-27 2001-03-20 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods for using co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns
US6950752B1 (en) 1998-10-27 2005-09-27 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for removing artifact from biological profiles
ATE274069T1 (de) * 1998-11-09 2004-09-15 Methexis Genomics N V ANALYSE VON ßAMPLIKONSß ERHALTEN DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
US6801859B1 (en) 1998-12-23 2004-10-05 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of characterizing drug activities using consensus profiles
US6222093B1 (en) 1998-12-28 2001-04-24 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods for determining therapeutic index from gene expression profiles
US6370478B1 (en) 1998-12-28 2002-04-09 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods for drug interaction prediction using biological response profiles
US6605432B1 (en) * 1999-02-05 2003-08-12 Curators Of The University Of Missouri High-throughput methods for detecting DNA methylation
US6630333B1 (en) 1999-03-23 2003-10-07 Invitrogen Corporation Substantially pure reverse transriptases and methods of production thereof
WO2000061800A2 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Keygene N.V. Method for the analysis of aflp® reaction mixtures using primer extension techniques
US6994969B1 (en) 1999-04-30 2006-02-07 Methexis Genomics, N.V. Diagnostic sequencing by a combination of specific cleavage and mass spectrometry
US20020119448A1 (en) 1999-06-23 2002-08-29 Joseph A. Sorge Methods of enriching for and identifying polymorphisms
WO2000078464A1 (fr) 1999-06-23 2000-12-28 Hitachi, Ltd. Separateur centrifuge et dispositif de preparation d'echantillons mettant en oeuvre ce separateur
US6420117B1 (en) 1999-09-14 2002-07-16 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Miniature inverted repeat transposable elements and methods of use
US6221600B1 (en) * 1999-10-08 2001-04-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial oligonucleotide PCR: a method for rapid, global expression analysis
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
AUPQ439699A0 (en) * 1999-12-01 1999-12-23 University Of Sydney, The Detection of nucleic acid fragments
ATE317024T1 (de) 1999-12-29 2006-02-15 Keygene Nv Verfahren zur erzeugung von oligonukleotiden, im besonderen zur detektion amplifizierter restriktionsfragmente, die durch aflp erhalten wurden
WO2001064959A1 (en) * 2000-03-02 2001-09-07 Akzo Nobel N.V. Detection of hepatitis b virus rna
AU6052001A (en) 2000-03-29 2001-10-08 Ct For The Applic Of Molecular Methods for genotyping by hybridization analysis
WO2001088189A2 (en) * 2000-05-15 2001-11-22 Keygene N.V. Microsatellite-aflp®
US20040209276A1 (en) 2002-09-13 2004-10-21 Smith Michael D. Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US7078208B2 (en) 2000-05-26 2006-07-18 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
WO2001092500A1 (en) 2000-05-26 2001-12-06 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
WO2002002740A2 (en) 2000-07-05 2002-01-10 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods and compositions for determining gene function
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
AR031640A1 (es) * 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
US20030143554A1 (en) * 2001-03-31 2003-07-31 Berres Mark E. Method of genotyping by determination of allele copy number
EP1384022A4 (en) 2001-04-06 2004-08-04 California Inst Of Techn AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID USING MICROFLUIDIC DEVICES
CA2443999A1 (en) 2001-04-16 2002-10-24 Applera Corporation Methods and compositions for nucleotide analysis
WO2002086169A1 (en) * 2001-04-23 2002-10-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for rapid screening of polymorphisms, mutations and methylation
US20030044785A1 (en) * 2001-05-01 2003-03-06 American Type Culture Collection Method for identifying and genotyping microorganisms
CA2449782C (en) 2001-06-07 2011-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Qtl controlling sclerotinia stem rot resistance in soybean
GB0114853D0 (en) * 2001-06-18 2001-08-08 Medical Res Council Happier Mapping
WO2003002716A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer stabilized proteinases
WO2003010516A1 (en) * 2001-07-23 2003-02-06 Curagen Corporation Method for identifying a nucleic acid sequence
US6872529B2 (en) * 2001-07-25 2005-03-29 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US20110151438A9 (en) 2001-11-19 2011-06-23 Affymetrix, Inc. Methods of Analysis of Methylation
CN1697882A (zh) 2001-11-19 2005-11-16 帕拉里勒生物科学公司 多重pcr
PT1458888E (pt) * 2001-12-10 2011-06-01 Novartis Ag Métodos para tratar a psicose e a esquizofrenia baseados em polimorfismos no gene do cntf
US7418351B2 (en) 2002-01-31 2008-08-26 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for analysis of measurement errors in measured signals
JP2005516310A (ja) 2002-02-01 2005-06-02 ロゼッタ インファーマティクス エルエルシー 遺伝子を特定し、形質に関連する経路を明らかにするコンピュータ・システムおよび方法
JP2005518811A (ja) * 2002-03-05 2005-06-30 ソレックサ リミテッド 表現型に関連するゲノム全域での配列変化を決定するための方法
US20040110166A1 (en) * 2002-03-07 2004-06-10 Macevicz Stephen C. Genome-wide scanning of genetic polymorphisms
EP2666849A3 (en) 2002-04-01 2014-05-28 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
EP1497447A4 (en) 2002-04-12 2006-09-20 Univ Missouri US ECIST MICROARRAYSES FOR DUAL SCREENING OF DNA HYPERMETHYLATION AND GENE INACTIVATION, AND FOR USE IN AN INTEGRATED SYSTEM FOR EVALUATING GENE EXPRESSION, DNA METHYLATION AND ACETYLATION OF HISTONE
US7115370B2 (en) * 2002-06-05 2006-10-03 Capital Genomix, Inc. Combinatorial oligonucleotide PCR
US9388459B2 (en) 2002-06-17 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
US20040072217A1 (en) * 2002-06-17 2004-04-15 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of linkage disequilibrium
AU2003258648A1 (en) 2002-08-22 2004-03-11 Novartis Ag Diagnosis of chronic rejection
EP1551753A2 (en) 2002-09-25 2005-07-13 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
EP1546412B1 (en) 2002-10-02 2014-05-21 California Institute Of Technology Microfluidic nucleic acid analysis
US7459273B2 (en) * 2002-10-04 2008-12-02 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping selected polymorphism
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
US7970548B2 (en) * 2003-01-10 2011-06-28 Keygene N.V. AFLP-based method for integrating physical and genetic maps
US7996155B2 (en) 2003-01-22 2011-08-09 Microsoft Corporation ANOVA method for data analysis
EP1590477B1 (en) * 2003-01-29 2009-07-29 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US8105771B2 (en) * 2003-02-26 2012-01-31 Callida Genomics, Inc. Random array DNA analysis by hybridization
DE602004029560D1 (de) * 2003-03-07 2010-11-25 Rubicon Genomics Inc Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden
US8206913B1 (en) 2003-03-07 2012-06-26 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process
EP1628993A4 (en) 2003-05-16 2010-04-07 Rosetta Inpharmatics Llc METHOD AND COMPOSITIONS FOR RNA INTERFERENCE
NZ544235A (en) 2003-05-23 2009-12-24 Cold Spring Harbor Lab Virtual representations of nucleotide sequences
US20040259100A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20050181394A1 (en) * 2003-06-20 2005-08-18 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
WO2005003304A2 (en) * 2003-06-20 2005-01-13 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20060246457A1 (en) * 2003-07-02 2006-11-02 Keygene N.V. Splice site aflp
US20050032102A1 (en) * 2003-07-22 2005-02-10 Affymetrix, Inc. Mapping genomic rearrangements
US8114978B2 (en) 2003-08-05 2012-02-14 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping selected polymorphism
US9394565B2 (en) 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
US7269517B2 (en) 2003-09-05 2007-09-11 Rosetta Inpharmatics Llc Computer systems and methods for analyzing experiment design
EP1671121A4 (en) 2003-09-29 2007-12-19 Pathwork Diagnostics Inc SYSTEMS AND METHODS FOR DETECTING BIOLOGICAL CHARACTERISTICS
US8440404B2 (en) * 2004-03-08 2013-05-14 Rubicon Genomics Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation
EP1574585A1 (en) * 2004-03-12 2005-09-14 Plant Research International B.V. Method for selective amplification of DNA fragments for genetic fingerprinting
WO2005098050A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Sequenom, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
US8192937B2 (en) * 2004-04-07 2012-06-05 Exiqon A/S Methods for quantification of microRNAs and small interfering RNAs
US8135595B2 (en) 2004-05-14 2012-03-13 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Computer systems and methods for providing health care
WO2005118877A2 (en) * 2004-06-02 2005-12-15 Vicus Bioscience, Llc Producing, cataloging and classifying sequence tags
EP1623996A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved method of selecting a desired protein from a library
FR2876378B1 (fr) * 2004-10-08 2007-01-05 Univ Joseph Fourier Etablissem Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et l'identification de vegetaux dans des melanges complexes
WO2007089610A1 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Ceres, Inc. Modulating plant oil levels
US7335760B2 (en) 2004-12-22 2008-02-26 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins
US9505846B2 (en) 2005-01-28 2016-11-29 Life Technologies Corporation Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases
ES2422215T3 (es) 2005-03-03 2013-09-09 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel Bv Reproducción casi inversa
AU2006222151B2 (en) 2005-03-03 2011-05-19 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Reverse progeny mapping
US20060223066A1 (en) 2005-03-29 2006-10-05 Applera Corporation Methods for normalizing and for identifying small nucleic acids
US7452671B2 (en) 2005-04-29 2008-11-18 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping with selective adaptor ligation
CA2612145A1 (en) * 2005-05-10 2006-11-16 Eric A. Johnson Methods of mapping polymorphisms and polymorphism microarrays
EP1907571B1 (en) 2005-06-15 2017-04-26 Complete Genomics Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
CA2613248A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Keygene N.V. Improved strategies for sequencing complex genomes using high throughput sequencing technologies
CN105039313B (zh) 2005-06-23 2018-10-23 科因股份有限公司 用于多态性的高通量鉴定和检测的策略
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
GB0514910D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
WO2007018602A1 (en) 2005-08-02 2007-02-15 Rubicon Genomics, Inc. Isolation of cpg islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method
US20070031857A1 (en) 2005-08-02 2007-02-08 Rubicon Genomics, Inc. Compositions and methods for processing and amplification of DNA, including using multiple enzymes in a single reaction
US7622121B2 (en) 2005-09-21 2009-11-24 New York University Heat shock proteins from Mycobacterium leprae and uses thereof
US10316364B2 (en) 2005-09-29 2019-06-11 Keygene N.V. Method for identifying the source of an amplicon
JP5237099B2 (ja) 2005-09-29 2013-07-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 変異させた集団のハイスループットスクリーニング
WO2007044245A2 (en) 2005-10-07 2007-04-19 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
US7960104B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
GB0522310D0 (en) * 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
EP2299267A3 (en) 2005-11-16 2011-05-04 Novartis AG Biomarkers for anti-NogoA antibody treatment in spinal cord injury
GB0524069D0 (en) * 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
US8137936B2 (en) * 2005-11-29 2012-03-20 Macevicz Stephen C Selected amplification of polynucleotides
US11306351B2 (en) 2005-12-21 2022-04-19 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
US8481257B2 (en) 2005-12-22 2013-07-09 Keygene N.V. Method for high-throughput AFLP-based polymorphism detection
CN101415839B (zh) 2006-02-08 2012-06-27 亿明达剑桥有限公司 对多核苷酸模板进行测序的方法
SG10201405158QA (en) * 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
EP2495337A1 (en) 2006-02-24 2012-09-05 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
ES2301342B1 (es) * 2006-03-14 2009-05-01 Oryzon Genomics, S.A. "metodo de analisis de acidos nucleicos".
EP2021503A1 (en) * 2006-03-17 2009-02-11 Solexa Ltd. Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
PT2963127T (pt) * 2006-04-04 2017-10-06 Keygene Nv Detecção de alto rendimento de marcadores moleculares com base em fragmentos de restrição
US20130191941A1 (en) 2006-07-05 2013-07-25 Shing Kwok Modulating light response pathways in plants, increasing light-related tolerances in plants, and increasing biomass in plants
EP2038425B1 (en) 2006-07-12 2010-09-15 Keygene N.V. High throughput physical mapping using aflp
WO2008015396A2 (en) * 2006-07-31 2008-02-07 Solexa Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
NZ575660A (en) 2006-10-18 2011-09-30 Seminis Vegetable Seeds Inc Carrots having increased lycopene content
WO2008070352A2 (en) * 2006-10-27 2008-06-12 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090105961A1 (en) * 2006-11-09 2009-04-23 Complete Genomics, Inc. Methods of nucleic acid identification in large-scale sequencing
US20090111706A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by amplification
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
EP2130927A4 (en) * 2007-03-07 2010-08-04 Univ Tokyo METHOD FOR AMPLIFYING A DNA FRAGMENT
US20080293589A1 (en) * 2007-05-24 2008-11-27 Affymetrix, Inc. Multiplex locus specific amplification
AR066922A1 (es) 2007-06-08 2009-09-23 Monsanto Technology Llc Metodos de mejoramiento molecular del germoplasma de una planta por secuenciamiento dirigido
DK2167667T3 (en) 2007-07-09 2015-07-27 Bayer Cropscience Nv Brassica plant comprising the mutant fatty acyl-ACP thioesterase alleles
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
US8951731B2 (en) * 2007-10-15 2015-02-10 Complete Genomics, Inc. Sequence analysis using decorated nucleic acids
US8415099B2 (en) 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
US7897344B2 (en) * 2007-11-06 2011-03-01 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs
US8617811B2 (en) 2008-01-28 2013-12-31 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
US7901890B2 (en) * 2007-11-05 2011-03-08 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation
US8518640B2 (en) * 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US8489340B2 (en) 2007-11-02 2013-07-16 Ceres, Inc. Method for predicting the amount of accessible carbohydrate in a feedstock sample using a near-infrared model
NL2000992C2 (nl) 2007-11-09 2009-05-12 Nunhems Bv Nieuwe komkommerplanten met compacte groeiwijze.
ES2543425T3 (es) 2007-11-28 2015-08-19 Bayer Cropscience Nv Planta de Brassica que comprende un alelo INDEHISCENT mutante
WO2009073629A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
WO2009094583A1 (en) * 2008-01-23 2009-07-30 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for preventing bias in amplification and sequencing reactions
BRPI0908140B1 (pt) 2008-02-15 2023-05-16 Ceres, Inc Métodos para a produção de uma planta, para a modulação da tolerância à seca e ao calor em uma planta, para a obtenção de uma planta transgênica e ácido nucleico isolado
US9074244B2 (en) 2008-03-11 2015-07-07 Affymetrix, Inc. Array-based translocation and rearrangement assays
WO2009132028A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-29 Complete Genomics, Inc. Array structures for nucleic acid detection
MX349774B (es) 2008-05-26 2017-08-10 Bayer Cropscience Nv Metodos y medios para modificar la resistencia de las fibras en plantas que producen fibras.
CA2730859C (en) 2008-07-17 2023-01-24 Bayer Bioscience N.V. Brassica plant comprising a mutant indehiscent allele
EP2172565A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-07 Cyano Biotech GmbH Method of identifying and/or differentiating cyanophyta
JP2012510810A (ja) * 2008-12-04 2012-05-17 キージーン・エン・フェー アダプター連結制限断片における反復配列を減少させる方法
ES2403312T3 (es) 2009-01-13 2013-05-17 Keygene N.V. Nuevas estrategias para la secuenciación del genoma
CN103003442B (zh) 2009-03-13 2018-10-09 康奈尔大学 一种通过微小rna表达水平评估人同种异体移植物状况的方法
US8362332B2 (en) 2009-04-15 2013-01-29 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV165560
US8071864B2 (en) 2009-04-15 2011-12-06 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV897903
US8071865B2 (en) 2009-04-15 2011-12-06 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV589782
EP2248914A1 (en) 2009-05-05 2010-11-10 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
CA2766190A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Enza Zaden Beheer B.V. Cucumber vein yellowing virus (cvyv) resistant cucumber plants (cucumis sativus l.)
CN102573451A (zh) 2009-07-20 2012-07-11 希尔雷斯股份有限公司 具有增加的生物质的转基因植物
US20110059453A1 (en) * 2009-08-23 2011-03-10 Affymetrix, Inc. Poly(A) Tail Length Measurement by PCR
EP2470669B1 (en) 2009-08-25 2014-06-18 Illumina, Inc. Methods for selecting and amplifying polynucleotides
WO2011071382A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Keygene N.V. Polymorfphic whole genome profiling
EP2333104A1 (en) 2009-12-11 2011-06-15 Lexogen GmbH RNA analytics method
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US8932812B2 (en) 2009-12-17 2015-01-13 Keygene N.V. Restriction enzyme based whole genome sequencing
EP2354243A1 (en) 2010-02-03 2011-08-10 Lexogen GmbH Complexity reduction method
WO2011112719A1 (en) 2010-03-09 2011-09-15 Cornell University Methods and compositions to predict and detect acute rejection
NL2004412C2 (en) 2010-03-16 2011-09-20 Nickerson Zwaan B V Male sterile leek plants.
WO2011133679A1 (en) 2010-04-20 2011-10-27 Seminis Vegetables Seeds, Inc. White-stem trait containing plants
WO2011140329A1 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Ceres, Inc. Transgenic plants having increased biomass
EP4242327A3 (en) 2010-06-09 2023-11-29 Keygene N.V. Combinatorial sequence barcodes for high throughput screening
BR112013010278B1 (pt) 2010-10-27 2020-12-29 Ceres, Inc método para produzir uma planta, método para modular a composição de biomassa em uma planta, ácido nucleico isolado e método para alterar a composição de biomassa em uma planta
US8766054B2 (en) 2010-12-08 2014-07-01 Hm.Clause Phytophthora resistance in sweet peppers
CA2822720C (en) 2010-12-24 2020-05-12 Bayer Cropscience Nv Brassica plant comprising a mutant alcatraz allele
WO2012096579A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Keygene N.V. Paired end random sequence based genotyping
TWI465572B (zh) * 2011-05-19 2014-12-21 Univ Chang Gung Method, composition and system of amplification and detection of target microbial DNA
DK2729580T3 (en) 2011-07-08 2015-12-14 Keygene Nv SEQUENCE BASED genotyping BASED ON OLIGONUKLEOTIDLIGERINGSASSAYS
AU2012304328B2 (en) 2011-09-09 2017-07-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for obtaining a sequence
BR122020026837B1 (pt) 2011-11-02 2021-04-13 Ceres, Inc Método de aumento do rendimento de planta em solo contendo níveis elevados de al3+, método de aumento da tolerância de uma planta
WO2013086499A2 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Ceres, Inc. Transgenic plants having altered biomass composition
CN108611398A (zh) 2012-01-13 2018-10-02 Data生物有限公司 通过新一代测序进行基因分型
LT3363901T (lt) * 2012-02-17 2021-04-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Kompozicijos ir būdai, skirti tiksliam mutacijų nustatymui
ES2776673T3 (es) 2012-02-27 2020-07-31 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y usos para etiquetas moleculares
US9873886B2 (en) 2012-07-06 2018-01-23 Bayer Cropscience Nv Brassica ROD1 gene sequences and uses thereof
WO2014006159A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Bayer Cropscience Nv Soybean rod1 gene sequences and uses thereof
EA201590164A1 (ru) 2012-07-06 2015-05-29 Байер Кропсайенс Нв Растения brassica с модифицированным составом масла семян
EP2728013A1 (en) * 2012-10-31 2014-05-07 Universitätsspital Basel Method for the simultaneous amplification of a plurality of different nucleic acid target sequences
US9758828B2 (en) 2013-01-31 2017-09-12 Cornell University Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts
WO2014170387A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Bayer Cropscience Nv Hybrid brassica plants and methods for producing same
RU2549453C2 (ru) * 2013-04-26 2015-04-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВЕРЕСКА ОБЫКНОВЕННОГО (Calluna vulgaris (L.) Hull.)
CN103233072B (zh) * 2013-05-06 2014-07-02 中国海洋大学 一种高通量全基因组dna甲基化检测技术
RU2535064C1 (ru) * 2013-05-30 2014-12-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СВОБОДНОЯГОДНИКА КОЛЮЧЕГО, ЭЛЕУТЕРОКОККА (Eleutherococcus senticocus (Rupr. et Maxim.) Maxim.)
RU2535060C1 (ru) * 2013-05-30 2014-12-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ АРАЛИИ ВЫСОКОЙ (Aralia elata (Miq.) Seem.)
RU2535063C1 (ru) * 2013-05-30 2014-12-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" НАБОР СИНТЕТИЧЕCКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СУШЕНИЦЫ БОЛОТНОЙ (Filaginella uliginosa (L.) Opiz)
US9982301B2 (en) 2014-01-07 2018-05-29 Cornell University Urine mRNA profile and acute dysfunction of kidney allograft
WO2015112767A2 (en) 2014-01-22 2015-07-30 Life Technologies Corporation Novel reverse transcriptases for use in high temperature nucleic acid synthesis
US9107356B2 (en) 2014-05-02 2015-08-18 Nunhems B.V. Hybrid carrot variety NUN 85931
US20140245471A1 (en) 2014-05-02 2014-08-28 Nunhems B.V. Carrot plants with a high anthocyanin level
CA3226788A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Ceres, Inc. Methods of increasing crop yield under abiotic stress
RU2573937C1 (ru) * 2014-10-20 2016-01-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВОЛОДУШКИ МНОГОЖИЛЬЧАТОЙ (Bupleurum multinerve DC.)
RU2731639C2 (ru) 2014-10-30 2020-09-07 Нунхемс Б.В. Растения салат-латук, имеющие резистентность против nasonovia ribisnigri биотипа 1
WO2016174119A1 (en) 2015-04-28 2016-11-03 Bayer Cropscience Nv Brassica plants with modified seed oil composition
CA2996806A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Keygene N.V. Diplospory gene
US10226015B2 (en) 2015-11-10 2019-03-12 Pop Vriend Research B.V. Peronospora resistance in Spinacia sp
US11277983B2 (en) 2015-11-10 2022-03-22 Pop Vriend Seeds Bv Peronospora resistance in spinacia sp
WO2018091438A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Nunhems B.V. Multibranching artichoke plant
US11584958B2 (en) 2017-03-31 2023-02-21 Grail, Llc Library preparation and use thereof for sequencing based error correction and/or variant identification
WO2019068647A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Hild Samen Gmbh TOTAL RESISTANCE TO THE MILDIOU IN THE BASIL
AU2019207409B2 (en) 2018-01-12 2023-02-23 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
WO2019145447A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Nunhems B.V. Spinach plants resistant to at least peronospora farinosa races 8, 9, 11, 13 and 16
JP2022511633A (ja) 2018-11-28 2022-02-01 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ エンドヌクレアーゼ保護による標的化濃縮
EP3893631A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 Nunhems B.V. Solanaceous plant capable of stenospermocarpic fruit formation
AU2020225760A1 (en) 2019-02-21 2021-08-19 Keygene N.V. Genotyping of polyploids
CN113874388A (zh) 2019-05-29 2021-12-31 主基因有限公司 孤雌生殖基因
WO2020249593A1 (en) 2019-06-13 2020-12-17 Nunhems B.V. Tomato plant producing fruit having improved ripening characteristics
CN114787388A (zh) 2019-11-26 2022-07-22 纽海姆有限公司 用于洋葱中降低的丙酮酸水平性状的分子标记物
WO2021116371A1 (en) 2019-12-12 2021-06-17 Keygene N.V. Semi-solid state nucleic acid manipulation
CA3161280A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Rene Cornelis Josephus Hogers Next-generation sequencing library preparation using covalently closed nucleic acid molecule ends
CA3176023A1 (en) 2020-04-23 2021-10-28 Nunhems B.V. Solanum lycopersicum plants having improved tobamovirus resistance
CA3178083A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Wim VRIEZEN Tomato plants having suppressed meiotic recombination
CA3181463A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Paolo RICCARDI Capsicum annuum plants having improved thrips resistance
WO2022074058A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Keygene N.V. Targeted sequence addition
AU2021363100A1 (en) 2020-10-13 2023-05-25 Keygene N.V. Modified promoter of a parthenogenesis gene
EP4251761A1 (en) 2020-11-24 2023-10-04 Keygene N.V. Targeted enrichment using nanopore selective sequencing
AU2021410073A1 (en) 2020-12-21 2023-07-06 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer
US20240076653A1 (en) * 2020-12-31 2024-03-07 Mokobio Life Science Corporation Beijing Method for constructing multiplex pcr library for high-throughput targeted sequencing
WO2022265965A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance
CA3225922A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Blackleg resistant plants and methods for the identification of blackleg resistant plants
US12004476B2 (en) 2022-01-26 2024-06-11 Monsanto Technology Llc. Cotton variety 20R750B3XF
WO2024121354A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Keygene N.V. Duplex sequencing with covalently closed dna ends

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990008821A1 (en) * 1989-01-31 1990-08-09 University Of Miami Microdissection and amplification of chromosomal dna

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4321365A (en) * 1977-10-19 1982-03-23 Research Corporation Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules
US5093245A (en) * 1988-01-26 1992-03-03 Applied Biosystems Labeling by simultaneous ligation and restriction
WO1990012115A1 (en) * 1989-03-21 1990-10-18 Collaborative Research, Inc. A dna diagnostic test using an exonuclease activity
CA2067363A1 (en) * 1989-10-16 1991-04-17 Michael Lovett Non-specific dna amplification
WO1991014003A2 (en) * 1990-03-09 1991-09-19 Ig Laboratories, Inc. Characterization and analysis of polymorphic vntr loci
US5126239A (en) * 1990-03-14 1992-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences
WO1992007095A1 (en) * 1990-10-15 1992-04-30 Stratagene Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
WO1992013104A1 (en) * 1991-01-22 1992-08-06 Board Of Regents, The University Of Texas System 5' and 3' polymerase chain reaction walking from known dna sequences

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990008821A1 (en) * 1989-01-31 1990-08-09 University Of Miami Microdissection and amplification of chromosomal dna

Also Published As

Publication number Publication date
DE69233719D1 (de) 2008-02-07
CA2119557C (en) 2004-02-24
IL103267A0 (en) 1993-02-21
HU9400809D0 (en) 1994-06-28
DE69230873T3 (de) 2006-04-06
EP0969102A2 (en) 2000-01-05
CA2119557A1 (en) 1993-04-01
AU672760B2 (en) 1996-10-17
EP0534858B2 (en) 2005-04-27
JP4385072B2 (ja) 2009-12-16
ES2147550T3 (es) 2000-09-16
NO941064D0 (no) 1994-03-23
DE69230873T2 (de) 2000-11-09
DE69233719T2 (de) 2009-01-02
PT534858E (pt) 2000-09-29
FI113184B (fi) 2004-03-15
ATE382094T1 (de) 2008-01-15
CZ291877B6 (cs) 2003-06-18
ES2299229T3 (es) 2008-05-16
GR3033895T3 (en) 2000-11-30
US6045994A (en) 2000-04-04
FI20031526A (fi) 2003-10-17
CZ298187B6 (cs) 2007-07-18
ZA927323B (en) 1993-08-30
DK0534858T3 (da) 2000-09-11
JP2008131947A (ja) 2008-06-12
DK0534858T4 (da) 2005-08-08
DE69230873D1 (de) 2000-05-11
HUT68504A (en) 1995-06-28
FI941360A0 (fi) 1994-03-24
FI115402B (fi) 2005-04-29
EP0534858B1 (en) 2000-04-05
ATE191510T1 (de) 2000-04-15
ES2147550T5 (es) 2005-11-01
JP4088403B2 (ja) 2008-05-21
RU94033149A (ru) 1996-07-27
WO1993006239A1 (en) 1993-04-01
FI941360A (fi) 1994-05-24
CZ66994A3 (en) 1994-12-15
JP3236295B2 (ja) 2001-12-10
NO318016B1 (no) 2005-01-24
EP0969102A3 (en) 2000-02-23
HU223760B1 (hu) 2005-01-28
AU2662992A (en) 1993-04-27
PT969102E (pt) 2008-03-25
RU2182176C2 (ru) 2002-05-10
IL103267A (en) 2004-07-25
EP0969102B1 (en) 2007-12-26
NO941064L (no) 1994-05-20
JP2001061486A (ja) 2001-03-13
EP0534858A1 (en) 1993-03-31
JPH06510668A (ja) 1994-12-01
DK0969102T3 (da) 2008-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100321510B1 (ko) 선택적인 제한단편의 증폭:디엔에이(dna) 핑거프린트법
US7935488B2 (en) Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
JP3535159B2 (ja) Ｄｎａ分析への選択的アプローチ
RU2603082C2 (ru) Способы секвенирования трехмерной структуры исследуемой области генома
US20110229884A1 (en) Method of genome-wide nucleic acid fingerprinting of functional regions
US6887666B1 (en) Methods for identification of identical nucleic acid fragments from different nucleic acid populations
US7572583B2 (en) Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
JPH05505311A (ja) ゲノム変異を分析するための組成物及び方法
US20210155972A1 (en) Targeted rare allele crispr enrichment
KR100842429B1 (ko) 잔디에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
US20030044785A1 (en) Method for identifying and genotyping microorganisms
GB2295011A (en) Selection of DNA markers using adaptor molecules
KR20110079012A (ko) 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커 및 이를 이용한 검정방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20091230

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee