ES2543425T3 - Planta de Brassica que comprende un alelo INDEHISCENT mutante - Google Patents
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Abstract
Una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND en dos loci, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, caracterizada por que comprende al menos dos alelos IND mutantes en un locus en su genoma, en la que dichos alelos IND mutantes son alelos mutantes de un gen que codifica una proteína IND funcional, en la que el gen IND funcional comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: a. una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 desde el nucleótido en la posición 46 hasta el nucleótido en la posición 633, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 7; y b. una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 hasta el aminoácido en la posición 210 o SEC ID NO: 4, en la que dichos alelos IND mutantes comprenden una región de ADN mutada que consiste en uno o más nucleótidos insertados, suprimidos o sustituidos en comparación con una región de ADN de tipo salvaje correspondiente en el gen IND funcional, y en la que dichos alelos IND mutantes no codifican una proteína IND funcional.
Description
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cromosomas homólogos en la célula. Por el contrario, como se usa aquí, el término “homocigótico” significa una condición genética que existe cuando dos alelos idénticos residen en un locus específico, pero están situados individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula.
Como se usa aquí, el término “locus” (loci en plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma en el que por ejemplo se encuentra un gen o marcador genético. , por ejemplo, el “locus IND-A1” se refiere a la posición en un cromosoma del genoma A en la que se puede encontrar el gen IND-A1 (y dos alelos IND-A1), mientras que el “locus IND-C1” se refiere a la posición en un cromosoma del genoma C en la que se puede encontrar el gen IND-C1 (y dos alelos IND-C1).
Siempre que se haga referencia a una “planta” o “plantas” según la invención, se entiende que están englobadas aquí, excepto que se indique de otro modo, partes de la planta (células, tejidos u órganos, vainas de semillas, semillas, partes cortadas tales como raíces, hojas, flores, polen, etc.), progenie de las plantas que retiene las características distintivas de los progenitores (especialmente las propiedades de dehiscencia del fruto), tal como la semilla obtenida mediante autofertilización o cruce, por ejemplo, semilla híbrida (obtenida cruzando dos líneas parentales endogámicas), plantas híbridas y partes de plantas derivadas de ellas.
Un “ensayo molecular” (o ensayo) se refiere aquí a un ensayo que indica (directa o indirectamente) la presencia o ausencia de uno o más alelos IND particulares en uno o ambos loci IND (, por ejemplo, en uno o ambos de los loci IND-A1 o IND-C1). Puede permitir determinar si un alelo particular (tipo salvaje o mutante) es homocigótico o heterocigótico en el locus en cualquier planta individual.
“Tipo salvaje” (también escrito “tiposalvaje” o “tipo-salvaje” en los términos en inglés), como se usa aquí, se refiere a una forma típica de una planta o un gen como aparece más habitualmente en la naturaleza. Una “planta de tipo salvaje” se refiere a una planta con el fenotipo más habitual de tal planta en la población natural. Un “alelo de tipo salvaje” se refiere a un alelo de un gen requerido para producir el fenotipo de tipo salvaje. Por el contrario, una “planta mutante” se refiere a una planta con un fenotipo raro diferente de tal planta en la población natural, o producido por intervención humana, por ejemplo, mediante mutagénesis, y un “alelo mutante” se refiere a un alelo de un gen requerido para producir el fenotipo mutante.
Como se usa aquí, la expresión “IND de tipo salvaje” (, por ejemplo, IND-A1 o IND-C1 de tipo salvaje) significa un alelo IND de origen natural encontrado en plantas, en particular plantas Brassicaceae, especialmente plantas de Brassica, que codifica una proteína IND funcional (, por ejemplo, una IND-A1 o IND-C1 funcional, respectivamente). Por el contrario, el término “IND mutante” (por ejemplo IND-A1 o IND-C1 mutante), como se usa aquí, se refiere a un alelo IND que no codifica una proteína IND funcional, es decir, un alelo IND que codifica una proteína IND no funcional (, por ejemplo, una IND-A1 o IND-C1 no funcional, respectivamente), que, como se usa aquí, se refiere a una proteína IND que no tiene actividad biológica o que tiene una actividad biológica significativamente reducida en comparación con la proteína IND funcional de tipo salvaje correspondiente, o que no codifica ninguna proteína IND en absoluto. Tal “alelo IND mutante” (también denominado alelo “genosuprimido completamente” o “nulo”) es un alelo IND de tipo salvaje que comprende una o más mutaciones en su secuencia de ácido nucleico, por lo cual la mutación o mutaciones dan preferiblemente como resultado una cantidad (absoluta o relativa) significativamente reducida de proteína IND funcional en la célula in vivo. Como se usa aquí, un “alelo IND completamente genosuprimido” es un alelo IND mutante cuya presencia en estado homocigótico en cada locus IND en la planta (, por ejemplo, una planta de Brassica napus con dos alelos IND-A1 completamente genosuprimidos y dos alelos IND-C1 completamente genosuprimidos) da como resultado un incremento de la resistencia al desgranado de las vainas en esa planta, que es demasiado alto para ser todavía agronómicamente relevante. Los alelos mutantes de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína IND se designan aquí como “ind” (por ejemplo ind-a1 o indc1, respectivamente). Los alelos mutantes pueden ser alelos “mutantes naturales”, que son alelos mutantes encontrados en la naturaleza (, por ejemplo, producidos espontáneamente sin la aplicación humana de mutágenos),
- o alelos “mutantes inducidos”, que son inducidos por intervención humana, por ejemplo, mediante mutagénesis.
Una “cantidad significativamente reducida de proteína IND funcional” (por ejemplo proteína IND-A1 o IND-C1 funcional) se refiere a una reducción en la cantidad de una proteína IND funcional producida por la célula que comprende un alelo IND mutante en al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% (es decir, no se produce proteína IND funcional por la célula) en comparación con la cantidad de la proteína IND funcional producida por la célula que no comprende el alelo IND mutante. Esta definición engloba la producción de una proteína IND “no funcional” (, por ejemplo, proteína IND truncada) que no tiene actividad biológica in vivo, la reducción en la cantidad absoluta de la proteína IND funcional (, por ejemplo, no obteniéndose proteína IND funcional debido a la mutación en el gen IND), y/o la producción de una proteína IND con actividad biológica significativamente reducida en comparación con la actividad de una proteína IND de tipo salvaje funcional (tal como una proteína IND en la que uno
- o más restos de aminoácidos que son cruciales para la actividad biológica de la proteína IND codificada, como se ejemplifica más abajo, se sustituyen por otro resto de aminoácido). La expresión “proteína IND mutante”, como se usa aquí, se refiere a una proteína IND codificada por una secuencia de ácido nucleico IND mutante (“alelo ind”), por lo que la mutación da como resultado una actividad IND significativamente reducida y/o ninguna actividad IND in vivo, en comparación con la actividad de la proteína IND codificada por una secuencia IND de tipo salvaje no mutante (“alelo IND”).
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Se entiende que cuando se hace referencia a una palabra en singular (por ejemplo planta o raíz), el plural también está incluido aquí (, por ejemplo, una pluralidad de plantas, una pluralidad de raíces). De este modo, la referencia a un elemento mediante el artículo indefinido “un” o “una” no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno del elemento, excepto que el contexto requiera claramente que tiene que haber uno y solamente uno de los elementos. El artículo indefinido “un” o “una” significa así habitualmente “al menos uno”.
Para los fines de esta invención, la “identidad de secuencia” de dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias óptimamente alineadas que tienen restos idénticos (x100) dividido entre el número de posiciones comparadas. Un espacio, es decir, una posición en un alineamiento en el que un resto está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera como una posición con restos no idénticos. El “alineamiento óptimo” de dos secuencias se encuentra alineando las dos secuencias a lo largo de toda la longitud según el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53) en The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277; véase, por ejemplo, http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) usando ajustes por defecto (penalización de apertura de espacio = 10 (para nucleótidos)/10 (para proteínas) y penalización de extensión del espacio = 0,5 (para nucleótidos)/0,5 (para proteínas)). Para nucleótidos, la matriz de puntuación por defecto usada es EDNAFULL, y para proteínas, la matriz de puntuación por defecto es EBLOSUM62.
“Sustancialmente idéntica” o “esencialmente similar”, como se usa aquí, se refiere a secuencias, que, cuando se alinean óptimamente como se define anteriormente, comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define adicionalmente más abajo).
“Condiciones de hibridación restrictivas” se puede usar para identificar secuencias nucleotídicas, que son sustancialmente idénticas a una secuencia nucleotídica dada. Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia, y serán diferentes en diferentes circunstancias. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean 5ºC menores que el punto de fusión térmico (Tm) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (la fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente coincidente. Típicamente, se escogerán condiciones restrictivas en las que la concentración de sal es alrededor de 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es al menos 60ºC. La reducción de la concentración de sal y/o el incremento de la temperatura aumentan la restricción. Las condiciones restrictivas para hibridaciones ARN-ADN (transferencias Northern usando la sonda de por ejemplo 100 nt) son por ejemplo aquellas que incluyen al menos un lavado en 0,2X SSC a 63ºC durante 20 min., o condiciones equivalentes.
“Condiciones muy restrictivas” se pueden proporcionar, por ejemplo, mediante hibridación a 65ºC en una disolución acuosa que contiene 6x SSC (20x SSC contiene 3,0 M de NaCl, 0,3 M de citrato de sodio, pH 7,0), 5x Denhardt (100X Denhardt contiene 2% de Ficoll, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de seroalbúmina bovina), 0,5% de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 20 g/ml de ADN portador desnaturalizado (ADN de esperma de pescado monocatenario, con una longitud media de 120-3000 nucleótidos) como competidor no específico. Tras la hibridación, el lavado de restricción elevada se puede realizar en varias etapas, con un lavado final (alrededor de 30 min.) a la temperatura de hibridación en 0,2-0,1 x SSC, 0,1% de SDS.
“Condiciones de restricción moderada” se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la disolución descrita anteriormente, pero a alrededor de 60-62ºC. El lavado de restricción moderada se puede realizar a una temperatura de hibridación en 1x SSC, 0,1% de SDS.
“Baja restricción” se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la disolución descrita anteriormente a alrededor de 50-52ºC. El lavado de baja restricción se puede realizar a la temperatura de hibridación en 2x SSC, 0,1% de SDS. Véanse también Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001).
“Productividad cosechada incrementada” o “productividad incrementada de semillas o granos” se refiere a la mayor cantidad de semilla o grano cosechada de una pluralidad de plantas, que comprenden cada una alelos IND mutantes según la invención, cuando se compara con la cantidad de semilla o grano cosechada de un número similar de plantas isogénicas sin los alelos IND mutantes. La productividad se expresa típicamente en unidades de volumen de semilla cosechada por unidades de superficie, tal como bushels/acre o kg/ha. El incremento de la productividad se expresa típicamente en porcentaje, por lo que la productividad de la planta de referencia o de control se refiere como 100% y la productividad de las plantas según las invenciones se expresa en % con respecto a la productividad de la planta de control. Los incrementos de productividad observados en plantas de Brassica según la invención oscilaron desde al menos 101% hasta al menos 124%, y se espera que sean factibles mayores incrementos de la productividad. El incremento de la productividad también puede oscilar desde 104% hasta 108%, o 105% hasta 110%.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Brassica napus (genoma AACC, 2n=4x=38), que es una especie alotetraploide (anfidiploide) que contiene esencialmente dos genomas diploides (el genoma A y el genoma C) debido a su origen de ancestros diploides, comprende dos genes IND en su genoma. Los inventores descubrieron que un gen IND está situado en el genoma A
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(denominado aquí como “IND-A1”) y uno en el genoma C (denominado aquí como “IND-C1”). Se afirma que el gen IND-A1 es “homeólogo” al gen IND-C1, es decir, el “gen A” se encuentra en el genoma A y se origina a partir del ancestro diploide B. rapa (AA), mientras que el “gen C” se encuentra en el genoma C de B. napus y se origina a partir del ancestro diploide B. oleracea (CC).
Al igual que en cualquier genoma diploide, puede haber dos “alelos” in vivo para cada gen IND en cada locus IND en el genoma (siendo un alelo la secuencia génica encontrada en un cromosoma, y el otro en el cromosoma homólogo). La secuencia nucleotídica de estos dos alelos puede ser idéntica (planta homocigótica) o diferente (planta heterocigótica) en cualquier planta dada, aunque el número de alelos posibles diferentes que existen para cada gen IND puede ser mucho más grande que dos en la población de la especie como un todo.
Se descubrió además que plantas de Brassica napus, que son homocigóticas para un alelo ind completamente genosuprimido en solamente uno de los dos genes IND, es decir, en IND-A1 o IND-C1, no muestran un incremento significativo en la resistencia al desgranado de las vainas en comparación con plantas de Brassica napus que no comprenden alelos IND mutantes, mientras que en plantas de Brassica napus, que son homocigóticas para un alelo ind completamente genosuprimido en ambos genes IND, la resistencia al desgranado de las vainas está significativamente incrementada, pero el nivel de resistencia al desgranado de las vainas es demasiado elevado para mantener una capacidad de trilla agronómicamente relevante. Por el contrario, la resistencia al desgranado de las vainas está significativamente incrementada en plantas de Brassica napus que comprenden tres alelos ind completamente genosuprimidos de los dos genes IND de Brassica napus, hasta un nivel mediante el cual las plantas mantienen una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas. Se piensa que la presencia de tres alelos ind completamente genosuprimidos en una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular en una planta de Brassica napus que comprende un gen IND-A1 y un gen IND-C1, puede ser necesaria a fin de obtener una planta que muestre una mayor resistencia al desgranado de las vainas mientras mantiene una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas.
De este modo, en una realización de la invención, se proporciona aquí una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular una planta de Brassica napus que comprende un gen IND-A1 y un gen IND-C1, que comprende 3 alelos ind, mediante lo cual los alelos ind dan como resultado una cantidad significativamente reducida de proteína IND funcional del tipo codificado por el equivalente de tipo salvaje de estos alelos mutantes, y de este modo una cantidad significativamente reducida global de las proteínas IND funcionales producidas en las células de la planta, específicamente en las vainas de semillas en desarrollo, in vivo.
Se piensa además que combinando suficientes copias de alelos ind (mutantes) específicos con suficientes copias de alelos IND (tipo salvaje) específicos en una planta, en particular una planta de Brassica, es posible afinar la cantidad y/o tipo de proteínas IND funcionales obtenidas, lo que a su vez influye en las propiedades de dehiscencia del fruto de la planta. La cantidad absoluta y relativa de las proteínas IND se puede afinar así de tal manera para proporcionar plantas que producen suficiente proteína o proteínas IND para permitir una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas de las semillas, a la vez que se reduce el desgranado de las semillas antes o durante la cosecha.
De este modo, en una realización de la invención, se proporciona una planta, en particular una planta de Brassica, que comprende al menos un alelo IND expresado funcionalmente, que codifica una proteína IND completamente funcional, mientras que los alelos restantes pueden ser alelos ind (mutantes).
En un aspecto de la invención, se proporciona una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular una planta de Brassica napus, que comprende n-tuplos alelos ind de al menos 2 genes IND diferentes en esa planta de Brassica, en particular de los genes IND-A1 y IND-C1, por lo cual n 3 (por ejemplo n = 1, 2, o 3), de manera que al menos un alelo produce una proteína IND funcional.
Es adecuada para la invención una planta de un solo mutante IND homocigótica (n = 2, es decir, homocigótica para un alelo mutante de un gen IND) y/o una planta mutante doble IND homocigótica (n = 4, es decir, homocigótica para un alelo mutante de dos genes IND) de una especie de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular de Brassica napus, mediante lo cual los alelos mutantes son alelos mutantes de 2 genes IND diferentes en esa planta de Brassica, en particular de los genes IND-A1 y/o IND-C1. Tales plantas mutantes se pueden usar con fines reproductivos. De este modo, en una realización de la invención, se proporciona aquí una planta de Brassica napus mutante única IND homocigótica, en la que el genotipo de la planta puede ser descrito como ind-a1/ind-a1, IND-C1/IND-C1, o IND-A1/IND-A1, ind-c1/ind-c1. También es adecuada una planta de Brassica napus mutante doble IND homocigótica, en la que el genotipo de la planta se puede describir como ind-a1/ind-a1, ind-c1/ind-c1.
En un aspecto adicional de la invención, la planta mutante individual (n = 2) IND homocigótica de la especie de Brassica que comprende al menos dos genes IND, en particular de Brassica napus, comprende un alelo IND mutante adicional, en el que la planta mutante es heterocigótica para el alelo IND mutante adicional (es decir, n = 3), y en el que el alelo mutante es un alelo mutante del gen IND de tipo salvaje que queda en esa planta de Brassica, en particular del gen IND-A1 o IND-C1. De este modo, en una realización adicional de la invención, se proporciona aquí una planta de Brassica napus mutante individual IND homocigótica que comprende un alelo IND mutante adicional,
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en la que el genotipo de la planta se puede describir como ind-a1/ind-a1, IND-C1/ind-c1, o IND-A1/ind-a1, ind-c1/indc1.
Se describen además aquí secuencias de ácidos nucleicos de genes/alelos IND de tipo salvaje y mutantes procedentes de la especie de Brassica, así como las proteínas IND de tipo salvaje y mutantes. También se describen métodos para generar y combinar alelos IND mutantes y de tipo salvaje en plantas de Brassica, así como plantas de Brassica y partes de plantas que comprenden combinaciones específicas de alelos IND de tipo salvaje y mutantes en su genoma, mediante lo cual se reduce el desgranado de las semillas en estas plantas. El uso de estas plantas para transferir alelos IND mutantes a otras plantas es también adecuado para la invención, como lo son los productos vegetales de cualquiera de las plantas descritas. Además, se proporcionan kits y métodos para la selección asistida por marcadores (MAS) para detectar genes y/o alelos IND en las plantas según la invención. Cada una de las realizaciones de la invención se describe con detalle aquí más abajo.
Las plantas de Brassica descritas aquí, que muestran desgranado reducido o retrasado de las semillas, tienen un incremento en la productividad de semilla cosechada. Sin embargo, se observó, inesperadamente, que la productividad de semilla cosechada de plantas de Brassica que comprenden solamente dos alelos IND mutantes en estado homocigótico, es decir, en las que el genotipo de la planta se puede describir como ind-a1/ind-a1, IND-C1/IND-C1, o IND-A1/IND-A1, ind-c1/ind-c1, también aumentó significativamente, cuando se compara con plantas de Brassica isogénicas que no comprenden los alelos IND mutantes, a pesar de la ausencia de un fenotipo de desgranado de semillas reducido o retrasado observable en las plantas de Brassica que comprenden los alelos IND mutantes. La invención proporciona también de este modo plantas de Brassica que comprenden al menos dos genes IND, en las que al menos dos alelos producen una proteína IND funcional, plantas las cuales tienen una mayor productividad de semillas. Estará claro que los dos alelos mutantes en el locus IND-A o en el locus IND-C pueden ser el mismo alelo mutante o un alelo mutante diferente.
Secuencias de ácidos nucleicos
Se describen aquí tanto secuencias de ácidos nucleicos IND de tipo salvaje que codifican proteínas IND funcionales como secuencias de ácidos nucleicos ind mutantes (que comprenden una o más mutaciones, preferiblemente mutaciones que dan como resultado ninguna o una actividad biológica significativamente reducida de la proteína IND codificada, o que no se produzca proteína IND) de genes IND de Brassicaceae, particularmente de la especie de Brassica, especialmente de Brassica napus, pero también de otras especies de cultivo de Brassica. , por ejemplo, la especie de Brassica que comprende un genoma A y/o C puede comprender diferentes alelos de los genes IND-A o IND-C, que se pueden identificar y combinar en una única planta según la invención. Además, se pueden usar métodos de mutagénesis para generar mutaciones en los alelos IND de tipo salvaje, generando de ese modo alelos ind mutantes para uso según la invención. Debido a que los alelos IND específicos se combinan preferiblemente en una planta mediante cruce y selección, las secuencias de ácidos nucleicos IND y/o ind se pueden proporcionar en una planta (es decir, endógenamente), por ejemplo, una planta de Brassica, preferiblemente una planta de Brassica que se puede cruzar con Brassica napus o que se puede usar para obtener una planta de Brassica napus “sintética”. La hibridación entre diferentes especies de Brassica se describe en la técnica, por ejemplo, como se cita en Snowdon (2007, Chromosome research 15: 85-95). La hibridación interespecífica se puede usar, por ejemplo, para transferir genes desde, por ejemplo, el genoma C en B. napus (AACC) al genoma C en B. carinata (BBCC), o incluso, por ejemplo, desde el genoma C en B. napus (AACC) al genoma B en B. juncea (AABB) (mediante el suceso esporádico de recombinación ilegítima entre sus genomas C y B). Las líneas de Brassica napus “resintetizadas” o “sintéticas” se pueden producir cruzando los ancestros originales, B. oleracea (CC) y B. rapa (AA). Las barreras de incompatibilidad interespecífica, y también intergenérica, se pueden superar con éxito en cruces entre especies de cultivo de Brassica y sus parientes, por ejemplo, mediante técnicas de rescate de embriones o mediante fusión de protoplastos (véase, por ejemplo, Snowdon, anteriormente).
Sin embargo, también se describen aquí secuencias de ácidos nucleicos IND e ind aisladas (, por ejemplo, aisladas de la planta mediante clonación u obtenidas sintéticamente mediante síntesis de ADN), así como sus variantes y fragmentos de cualquiera de estas, ya que estas se pueden usar para determinar qué secuencia está presente endógenamente en una planta o parte de la planta, si la secuencia codifica una proteína funcional, una proteína no funcional, o ninguna proteína (, por ejemplo, mediante expresión en una célula hospedante recombinante como se describe más abajo), y para la selección y transferencia de alelos específicos de una planta a la otra, a fin de generar una planta que tiene la combinación deseada de alelos funcionales y mutantes.
Las secuencias de ácidos nucleicos de IND-A1 e IND-C1 se han aislado de Brassica napus como se dan en el listado de secuencias. Se dan las secuencias IND de tipo salvaje, mientras que las secuencias ind mutantes de estas secuencias, y de secuencias esencialmente similares a estas, se describen aquí más abajo y en los Ejemplos, con referencia a las secuencias IND de tipo salvaje. El ADN genómico que codifica la proteína IND de Brassica napus no comprende ningún intrón.
“Secuencias de ácidos nucleicos IND-A1” o “secuencias de ácidos nucleicos variantes IND-A1”, según la invención, son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2, secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%,
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97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 5. Estas secuencias de ácidos nucleicos también se pueden citar aquí como “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias IND proporcionadas en el listado de secuencias.
“Secuencias de ácidos nucleicos IND-C1” o “secuencias de ácidos nucleicos variantes IND-C1”, según la invención, son secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 4 (IND-C1-larga) o con SEC ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 al aminoácido en la posición 210 (INDC1-corta), o secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 3 (IND-C1-larga), con SEC ID NO:3 desde el nucleótido en la posición 46 hasta el nucleótido en la posición 633 (IND-C1-corta) o con SEC ID NO: 7. Estas secuencias de ácidos nucleicos también se pueden citar como “esencialmente similares” o “esencialmente idénticas” a las secuencias IND proporcionadas en el listado de secuencias.
De este modo, se describen tanto secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas IND-A1 e IND-C1 funcionales, de tipo salvaje, incluyendo variantes y fragmentos de las mismas (como se definen adicionalmente más abajo), así como secuencias de ácidos nucleicos de cualquiera de estas, mediante lo cual la mutación en la secuencia de ácido nucleico da como resultado preferiblemente que se inserte, suprima o sustituya uno o más aminoácidos, en comparación con la proteína IND de tipo salvaje. Preferiblemente, la mutación o mutaciones en la secuencia de ácido nucleico da como resultado uno o más cambios de aminoácidos (es decir, en relación con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje, se inserta, suprime y/o sustituye uno o más aminoácidos), con lo que la actividad biológica de la proteína IND se reduce significativamente o se suprime completamente. Una reducción significativa o una supresión completa de la actividad biológica de la proteína IND se refiere aquí a una reducción o supresión de la actividad de unión a ADN, la capacidad de dimerización y/o la actividad reguladora transcripcional de la proteína IND, de manera que se incrementa la resistencia al desgranado de las vainas de una planta que expresa la proteína IND mutante en comparación con una planta que expresa la proteína IND de tipo salvaje correspondiente.
Para determinar la funcionalidad de un alelo/proteína IND específico en plantas, particularmente en plantas de Brassica, se puede determinar el nivel de resistencia al desgranado de las vainas en las plantas llevando a cabo ensayos macroscópicos, microscópicos e histológicos sobre frutos y flores de las plantas que comprenden el alelo/proteína IND específicos y de plantas de tipo salvaje correspondientes, análogos a los ensayos llevados a cabo sobre frutos y flores de Arabidopsis como describen Liljegren et al. (2004, más arriba), o como se describe en los Ejemplos más abajo. De forma breve, los cambios en la resistencia al desgranado de las vainas se pueden evaluar y/o medir, por ejemplo, mediante ensayos macroscópicos, tal como inspección de las vainas de semillas a simple vista para evaluar, por ejemplo, la presencia o ausencia de los márgenes de la valva, la longitud del pico de las vainas, etc.; un ensayo de impacto manual (MIT) para comparar el nivel de resistencia al desgranado de las vainas entre diferentes líneas IND mutantes y las líneas de tipo salvaje correspondientes evaluando la facilidad de apertura de las vainas al retorcer suavemente las vainas; un ensayo de impactos aleatorios (RIT) para comparar la capacidad de trilla de las vainas de semillas de plantas de diferentes líneas IND mutantes y las líneas de tipo salvaje correspondientes, respectivamente, midiendo la semivida de las muestras de vainas de estas líneas; y/o mediante ensayos microscópicos para examinar, por ejemplo, si y cómo las células en el margen de la valva y en la zona de dehiscencia de vainas de semillas se ven afectadas por mutaciones en IND. Una vez que se identifica y caracteriza la pareja de dimerización de la proteína IND (, por ejemplo, la propia proteína IND en caso de que su funcionamiento dependa de la formación de un homodímero, u otra proteína en caso de que su funcionamiento dependa de la formación de un heterodímero) y/o el gen o genes cuya transcripción está regulada por la proteína IND, la funcionalidad de un alelo/proteína IND específicos se puede evaluar como alternativa mediante técnicas de ADN recombinante como se conocen en la técnica, por ejemplo, coexpresando ambas parejas del dímero en una célula hospedante (, por ejemplo, una bacteria, tal como E. coli) y evaluando si todavía se pueden formar dímeros, si los dímeros todavía se pueden unir al sitio de unión a bHLH del gen o genes regulados, y/o si la transcripción de este gen o genes todavía está regulada por esta unión.
Se describen aquí secuencias de ácidos nucleicos tanto endógenas como aisladas. También se describen fragmentos de las secuencias IND y secuencias de ácidos nucleicos variantes IND definidas anteriormente, para uso como cebadores o sondas y como componentes de kits como se describe aquí (véase adicionalmente más abajo). Un “fragmento” de una secuencia de ácido nucleico IND o ind, o variante de la misma (como se define), puede ser de diversas longitudes, tal como al menos 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 200, 500, 600 nucleótidos contiguos de la secuencia IND o ind (o de la secuencia variante).
Secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas IND funcionales
Las secuencias de ácidos nucleicos dadas en el listado de secuencias codifican proteínas IND funcionales, de tipo salvaje, de Brassica napus. De este modo, estas secuencias son endógenas a las plantas de Brassica napus de las que se aislaron. Se pueden identificar otras especies de cultivo, variedades, líneas de reproducción o accesos salvajes de Brassica en busca de otros alelos IND, que codifican las mismas proteínas IND o sus variantes. , por ejemplo, se pueden usar técnicas de hibridación de ácidos nucleicos (, por ejemplo, análisis de transferencia Southern, usando por ejemplo condiciones de hibridación restrictivas) o técnicas a base de PCR para identificar
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ninguna actividad biológica. Sin embargo, se entiende que las mutaciones en ciertas partes de la proteína den como resultado más probablemente una función reducida de la proteína IND mutante, tales como mutaciones que conducen a proteínas truncadas, con lo cual faltan porciones significativas de los dominios funcionales, tales como el dominio de unión a ADN (“b”), el dominio de dimerización (“HLH”) y/o dominios reguladores de la transcripción.
Según la base de datos de The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org/), la proteína INDEHISCENT de Arabidopsis (locus At4g00120.1; SEC ID NO: 10) tiene una longitud de 198 aminoácidos y comprende un dominio de “dimerización de hélice-bucle-hélice básica (bHLH)” situado entre los aminoácidos en la posición 121 y 168 (dominio pfam PF00010), entre los aminoácidos en la posición 124 y 173 (dominio smart SM00353), o entre los aminoácidos en la posición 112 y 168 (dominio prosite PS50888), y un dominio de “unión a ADN de hélice-bucle-hélice (HLH)” entre los aminoácidos en la posición 114 y 196 o 198 (dominio superfam G3D.4.10.280.10 o SSF47459, respectivamente) de SEC ID NO: 10.
La proteína IND-A1 de Brassica descrita aquí tiene alrededor de 185 aminoácidos de longitud (SEC ID NO:2), y la proteína IND-C1 alrededor de 195 (SEC ID NO:4 desde el aminoácido en la posición 16 hasta 210) o 210 (SEC ID NO:4) aminoácidos, y comprenden el dominio de “dimerización de bHLH básica” situado entre los aminoácidos en la posición 120 y 167 en SEC ID NO: 2 y la posición 133 y 180 en SEC ID NO: 4 (dominio pfam PF00010), entre los aminoácidos en la posición 123 y 172 en SEC ID NO: 2 y posición 136 y 185 en SEC ID NO: 4 (dominio smart SM00353), o entre los aminoácidos en la posición 111 y 167 en SEC ID NO: 2 y la posición 124 y 180 en SEC ID NO: 4 (dominio prosite PS50888), y el dominio de “unión a ADN HLH” entre los aminoácidos en la posición 127 y 208 o 210 en SEC ID NO: 4 (dominio superfam G3D.4.10.280.10 o SSF47459, respectivamente), según se determina alineando óptimamente las proteínas IND de Brassica y de Arabidopsis y en base a la información de anotación en la base de datos de TAIR.
Como describen Heim et al. (2003, Mol Biol Evol 20, 735-747), la secuencia del dominio de bHLH de consenso de 133 genes del factor de transcripción bHLH de Arabidopsis consiste en aproximadamente 56 aminoácidos (Heim et al., Fig. 1; que corresponden a la posición 119-174 en SEC ID NO: 10). Este dominio bipartito comprende (1) la región básica, situada en el extremo N-terminal del dominio, que está implicada en la unión a ADN y que consiste en alrededor de 13 aminoácidos con un número elevado de restos básicos (“b”; que corresponden a la posición 119-131 en SEC ID NO: 10), y (2) la región de hélice-bucle-hélice, situada en el extremo C-terminal, que funciona como un dominio de dimerización y está constituida por alrededor de 43 restos de aminoácidos principalmente hidrófobos (que corresponden a la posición 132-174 en SEC ID NO: 10) que forman dos hélices alfa anfipáticas de alrededor de 15 aminoácidos (“H1”; que corresponden a la posición 132-146 en SEC ID NO: 10) y 22 aminoácidos (“H2”; que corresponden a la posición 153-174 en SEC ID NO: 10), respectivamente, separadas por una región de bucle de alrededor de 6 y hasta alrededor de 14 aminoácidos (“L”; que corresponden a la posición 147-152 en SEC ID NO: 10), que es la región más divergente del dominio de bHLH en términos de tamaño y composición de aminoácidos. Las dos hélices alfa promueven la dimerización, permitiendo la formación de homo-y/o heterodímeros entre diferentes miembros de la familia (Toledo-Ortiz et al., 2003, Plant Cell 15: 1749-1770). Mientras que el dominio de bHLH está evolutivamente conservado (Atchley y Fitch, 1997, PNAS 94: 5172-5176), hay poca similitud de secuencia entre diferentes miembros de la familia de bHLH más allá de este dominio (Morgenstern y Atchley, 1999, Mol Biol Evol 16: 1654-1663).
Dentro de esas proteínas bHLH con habilidad demostrada para unirse a ADN, los aminoácidos en la posición 5, 9, y 13 de la secuencia del dominio de bHLH de consenso definida por Heim et al. (más arriba) son los más críticos. Para proteínas bHLH no vegetales, se mostró que un resto His (H) en la posición 5, un resto Glu (E) en la posición 9 y un resto Arg (R) en la posición 13 (todos dentro de la región básica) fueron críticos para la unión a ADN (Brownlie et al., 1997, Structure 5, 509-520; Atchley et al., 1999, J Mol Evol 48, 501-516; Ledent y Vervoort, 2001, Genome Res 11, 754-770). Sin embargo, algunas proteínas vegetales tienen una variación de la configuración H-E-R. , por ejemplo, según Heim et al. (más arriba), el motivo 5-9-13 del dominio de bHLH codificado por el gen de Arabidopsis At4g00120 (que corresponde al gen IND de Arabidopsis representado en SEC ID NO: 9) consiste en los restos de aminoácidos Gln (Q), Ala (A) y Arg (R), respectivamente (que corresponden a las posiciones 123, 127 y 131, respectivamente, en SEC ID NO: 10) (Figura 4 de Heim et al. (más arriba). Tales proteínas vegetales, que tienen una variación de la configuración H-E-R, pueden contener además prolinas que rompen la hélice en la región básica, por ejemplo, miembros del Grupo VIII y X, características que pueden interferir con la afinidad por ADN. Estas variaciones pueden permitir que estas proteínas actúen como reguladores negativos, reteniendo la capacidad para dimerizarse con otras proteínas bHLH pero careciendo de la capacidad para unirse a ADN. Aunque el motivo 5-9-13 es importante para la unión a ADN, la cadena de ADN está en contacto con los restos básicos en las posiciones 10 y 12 (ambos Arg (R) en la secuencia del dominio de bHLH de consenso), que también se conservan en la mayoría de las proteínas vegetales (que corresponden a las posiciones 128 y 130 en SEC ID NO: 10).
Además, Heim et al. (más arriba) describen que los restos hidrófobos muy conservados en la posición 16, 20, 23, 27 en la hélice 1 (que corresponden a la posición 134, 138, 141, 145 en SEC ID NO: 10) y en la posición 36, 39, 43, 49, 53, y 56 en la hélice 2 (que corresponden a la posición 154, 157, 161, 167, 171, 174 en SEC ID NO: 10), por ejemplo, el resto de leucina en la posición 23 en el dominio de la hélice 1 (que corresponde a la posición 141 en SEC ID NO: 10) y los restos hidrófobos conservados en la hélice 2 que están situados a un lado de la hélice, son necesarios para la dimerización o estabilización de la formación del dímero.
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Finalmente, Heim et al. (más arriba; Fig. 4) indican secuencias de aminoácidos conservadas fuera del dominio de unión a ADN, algunas de las cuales se piensa que actúan como dominio de activación o son importantes para la interacción con otros módulos del complejo de transcripción, o son dianas para cadenas de transducción de señales.
Tabla 1 Proteínas IND – regiones y posiciones de aminoácidos (AA)
- AtIND1 (SEC ID
- AtIND1 (SEC ID
- BnIND-A1 (SEC BnIND-C1a/b
- NO: 10)
- NO: 9) ID NO: 2/6) (SEC ID 4/8 de
- 16-210 / SEC ID
- 4/8)
- Región
- TAIR: 1-198 1-594 1-185 16-210 / 1-210
- codificante
- (198 AA)
- (185 AA) (195 / 210 AA)
- PF00010
- 121-168 361-504 120-167 133-180
- SM00353
- 124-173 370-519 123-172 136-185
- PS50888
- 112-168 334-504 111-167 124-180
- G3D.4.10.280.10
- 114-196 340-588 - 127-208
- SSF47459
- 114-198 340-594 - 127-210
- Liljegren et al.
- 30-198 88-594
- (169 AA)
- bHLH:
- Heim et al. 119-174 355-523 118-173 131-186
- Toledo-Ortiz et al.
- 115-167 343-501 114-166 127-179
- Liljegren et al.
- 119-167 355-501 118-166 131-179
- b
- Heim et al. 119-131 355-393 118-132 131-145
- Toledo-Ortiz et al.
- 115-131 343-393 114-132 127-145
- Liljegren et al.
- 119-131 355-393 118-132 131-145
- H1
- Heim et al. 132-146 394-438 133-145 146-158
- Toledo-Ortiz et al.
- 132-146 394-438 133-145 146-158
- Liljegren et al.
- 132-145 394-435 133-144 146-157
- L
- Heim et al. 147-152 439-456 146-151 159-164
- Toledo-Ortiz et al.
- 147-152 439-456 146-151 159-164
- Liljegren et al.
- 146-152 436-456 145-151 158-164
- H2
- Heim et al. 153-174 457-523 152-173 165-186
- Toledo-Ortiz et al.
- 153-167 457-501 152-166 165-179
- Liljegren et al.
- 153-167 457-501 152-166 165-179
- AA conservados
- N (1T) V (2T) Q (5H) 115 116 123 343-345 346-348 367-379 114 115 122 127 128 135
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- AtIND1 (SEC ID
- AtIND1 (SEC ID
- BnIND-A1 (SEC BnIND-C1a/b
- NO: 10)
- NO: 9) ID NO: 2/6) (SEC ID 4/8 de
- 16-210 / SEC ID
- 4/8)
- A (9H-13T)
- 127 379-381 126 139
- R (10H-14T)
- 128 382-384 127 140
- R (12H-16T)
- 130 388-390 129 142
- R (13H)
- 131 391-393 130 143
- I (16H-20T)
- 134 400-403 133 146
- S (21T)
- 135 404-406 134 147
- I (20H-24T)
- 138 412-414 137 150
- L (23H-27T)
- 141 421-423 140 153
- K (28T)
- 142 424-426 141 154
- V (27H)
- 145 433-435 144 157
- K (39T)
- 150 448-450 149 162
- T (42T)
- 153 460-463 152 165
- A (36H)
- 154 460-462 153 166
- M (45T)
- 156 466-468 155 168
- L (39H -46T)
- 157 469-471 156 169
- A (49T)
- 160 478-480 159 172
- I (43H-50T)
- 161 481-483 160 173
- Y (52T)
- 163 487-489 162 175
- T (53T)
- 164 490-492 163 176
- L (49H-56T)
- 167 499-501 166 179
- V (53H)
- 171 511-513 170 183
- L (56H)
- 174 580-582 173 (A) 186
- En ind
- ind-5 (W13>STOp)L ind-2 (A26>FS)L ind-6 W ind-4 (Q63>STOP)L ind-3 (R99>H)L ind-1 (L112>F)L 42 55 Inserción después de 61 92 128 141 124-126 163-165 Inserción después de 185 274-276 382-384 421-423 25 --91 127 140 41 --104 140 153
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truncada de menos de alrededor de 170 aminoácidos (que carece de Leu conservado), menos de alrededor de 150 aminoácidos (que carece del dominio H2), menos de alrededor de 145 aminoácidos (que carece de los dominios L y H2), menos de alrededor de 130 aminoácidos (que carece del dominio HLH), menos de alrededor de 115 aminoácidos (que carece del dominio bHLH), o incluso menos aminoácidos de longitud, tales como alelos IND mutantes que corresponden a los alelos ind-4 o ind-5 de Arabidopsis (Liljegren et al., 2004, más arriba).
Las Tablas aquí más abajo describen un intervalo de posibles mutaciones sin sentido en las secuencias IND de Brassica napus descritas aquí:
Tabla 2a Mutaciones de codones de PARADA potenciales en IND-A1 (SEC ID NO: 1)
- Posición de aminoácidos
- Posición de nucleótido Tipo salvaje → codón mutante Tipo salvaje → aminoácido mutante
- 25
- 74 tgg → tag TRP → STOP
- 75
- tgg → tga TRP → STOP
- 74+75
- tgg → taa TRP → STOP
- 57
- 169 cag → tag GLN → STOP
- 169+171
- cag → taa GLN → STOP
- 91
- 271 caa → taa GLN → STOP
- 98
- 292 cag → tag GLN → STOP
- 292+294
- cag → taa GLN → STOP
- 122
- 364 cag → tag GLN → STOP (1)
- 364+366
- cag → taa GLN → STOP
- 128
- 382+383 cgg → tag ARG → STOP
- 382+384
- cgg → tga ARG → STOP
- 382+383+384
- cgg → taa ARG → STOP
- 138
- 412+413 cgg → tag ARG → STOP
- 412+414
- cgg → tga ARG → STOP
- 412+413+414
- cgg → taa ARG → STOP
- 168
- 502+503 cgg → tag ARG → STOP
- 502+504
- cgg → tga ARG → STOP
- 502+503+504
- cgg → taa ARG → STOP
- 169
- 505 cag → tag GLN → STOP
- 505+507
- cag → taa GLN → STOP
- 181
- 542 tgg → tag TRP → STOP
- 543
- tgg → tga TRP → STOP
- 542+543
- tgg → taa TRP → STOP
(1) Las semillas que comprenden un alelo IND-A1 mutante que comprende esta mutación sin sentido (denominadas
10 en lo sucesivo ind-a1-EMS01) se han depositado en la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, US) el 20 de noviembre de 2007, con el número de acceso PTA-8796
Tabla 2b Mutaciones de codones de PARADA potenciales en IND-C1 (SEC ID NO: 3)
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- Posición de aminoácidos
- Posición de nucleótido Tipo salvaje → codón mutante Tipo salvaje → aminoácido mutante
- 41
- 122 tgg → tag TRP → STOP
- 123
- tgg → tga TRP → STOP
- 122+123
- tgg → taa TRP → STOP
- 50
- 148 caa → taa GLN → STOP (2)
- 73
- 271 cag → tag GLN → STOP
- 271+272
- cag → taa GLN → STOP
- 104
- 310 caa → taa GLN → STOP
- 111
- 331 cag → tag GLN → STOP
- 331+333
- cag → taa GLN → STOP
- 135
- 403 cag → tag GLN → STOP (3)
- 403+405
- cag → taa GLN → STOP
- 141
- 421+422 cgg → tag ARG → STOP
- 421+423
- cgg → tga ARG → STOP
- 421+422+423
- cgg → taa ARG → STOP
- 151
- 451+452 cgg → tag ARG → STOP
- 451+453
- cgg → tga ARG → STOP
- 451+452+453
- cgg → taa ARG → STOP
- 181
- 541+542 cgg → tag ARG → STOP
- 541+543
- cgg → tga ARG → STOP
- 541+542+543
- cgg → taa ARG → STOP
- 182
- 544 cag → tag GLN → STOP
- 544+546
- cag → taa GLN → STOP
- 187
- 559 cag → tag GLN → STOP
- 559+561
- cag → taa GLN → STOP
- 191
- 571 cag → tag GLN → STOP
- 571+573
- cag → taa GLN → STOP
- (2)
- Las semillas que comprenden un alelo IND-C1 mutante que comprende esta mutación sin sentido (denominadas en lo sucesivo ind-c1-EMS01) se han depositado en la ATCC el 20 de noviembre de 2007, con el número de acceso PTA-8796
- (3)
- Las semillas que comprenden un alelo IND-C1 mutante que comprende esta mutación sin sentido (denominadas
5 en lo sucesivo ind-c1-EMS03) se han depositado en la ATCC el 20 de noviembre de 2007, con el número de acceso PTA-8795
Obviamente, las mutaciones no están limitadas a las mostradas en las tablas anteriores, y se entiende que pueden estar presentes mutaciones de PARADA análogas en alelos ind distintas de las presentadas en el listado de secuencias y citadas en las tablas anteriores.
10 Una mutación de sentido erróneo en un alelo IND, como se usa aquí, es cualquier mutación (supresión, inserción o sustitución) en un alelo IND mediante la cual se cambian uno o más codones en el ADN codificante y la secuencia de ARNm correspondiente del alelo IND de tipo salvaje correspondiente, dando como resultado la sustitución de uno
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secuencia del dominio de bHLH de consenso como describen Heim et al., 2003, véase anteriormente). Cuanto más truncada está la proteína mutante en comparación con la proteína de tipo salvaje, más puede el truncamiento dar como resultado una actividad significativamente reducida o ninguna actividad de la proteína IND. De este modo, se describe (véase la Tabla anterior) una proteína IND truncada que comprende la parte N-terminal de la proteína IND de tipo salvaje correspondiente que carece de parte o de todo el dominio de la segunda H, y/o que carece de parte o de todo el dominio de L, y/o que carece de parte o de todo el dominio de la primera H, y/o que carece de parte o de todo el dominio básico (como se describe anteriormente), o incluso más aminoácidos.
Además, se describen proteínas IND mutantes que comprenden una o más mutaciones de sustitución, mediante las cuales la sustitución o sustituciones dan como resultado una proteína mutante que tiene actividad significativamente reducida o ninguna actividad in vivo. Tales proteínas IND mutantes son proteínas IND por cuyo medio se sustituyen restos de aminoácidos conservados que tienen una función específica, tal como una función en la unión a ADN, dimerización o regulación de la transcripción. De este modo, se describe una proteína IND mutante que comprende una sustitución de un resto de aminoácido conservado que tiene una función biológica, tales como los aminoácidos conservados del dominio básico, o del dominio H1, L o H2 como se indica en la Tabla 1 anterior.
Métodos
Los alelos ind mutantes se pueden generar (por ejemplo se pueden inducir mediante mutagénesis) y/o identificar usando un intervalo de métodos, que son convencionales en la técnica, por ejemplo, usando métodos a base de PCR para amplificar parte o todo el genómico o ADNc ind.
Tras la mutagénesis, las plantas se hacen crecer a partir de las semillas tratadas, o se regeneran a partir de las células tratadas usando técnicas conocidas. , por ejemplo, las semillas mutagenizadas se pueden sembrar según procedimientos de cultivo convencionales y, tras la autopolinización, se forma la semilla en las plantas. Como alternativa, se pueden extraer plántulas doblemente haploides a partir de células de microsporas o de polen tratadas para formar inmediatamente plantas homocigóticas, por ejemplo, como describen Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canadá). La semilla adicional que se forma como resultado de tal autopolinización en la presente o en una generación subsiguiente se puede cosechar e identificar en busca de la presencia de alelos IND mutantes, usando técnicas que son convencionales en la técnica, por ejemplo, técnicas a base de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (amplificación de los alelos ind) o técnicas a base de hibridación, , por ejemplo, análisis de transferencia Southern, identificación de genotecas BAC, y similares, y/o secuenciación directa de alelos ind. Para identificar la presencia de mutaciones de punto (denominadas polimorfismos de un solo nucleótido o SNPs) en alelos IND mutantes, se pueden usar métodos de detección de SNP convencionales en la técnica, por ejemplo, técnicas basadas en oligoligación, técnicas basadas en extensión de una sola base, o técnicas basadas en diferencias en sitios de restricción, tales como TILLING.
Como se describe anteriormente, la mutagenización (espontánea así como también inducida) de un alelo IND de tipo salvaje específico da como resultado la presencia de uno o más nucleótidos suprimidos, insertados, o sustituidos (en lo sucesivo denominada “región de mutación”) en el alelo IND mutante resultante. El alelo IND mutante se puede caracterizar así por la localización y la configuración del uno o más nucleótidos suprimidos, insertados, o sustituidos en el alelo IND de tipo salvaje. El sitio en el alelo IND de tipo salvaje, en el que se han insertado, suprimido, o sustituido el uno o más nucleótidos, respectivamente, se denomina también aquí como la “región o secuencia de mutación”. Una “región o secuencia de flanqueo en 5’ o en 3’”, como se usa aquí, se refiere a una región de ADN o secuencia en el alelo IND mutante (o el tipo salvaje correspondiente) de al menos 20 pb, preferiblemente al menos 50 pb, al menos 750 pb, al menos 1500 pb, y hasta 5000 pb de ADN diferente del ADN que contiene el uno o más nucleótidos suprimidos, insertados, o sustituidos, preferiblemente ADN del alelo IND mutante (o el tipo salvaje correspondiente) que está situado inmediatamente en dirección 5’ de o contiguo a (región o secuencia de flanqueo en 5’”) o inmediatamente en dirección 3’ de y contiguo a (región o secuencia de flanqueo en 3’”) la región de mutación en el alelo IND mutante (o en el alelo IND de tipo salvaje correspondiente). Una “región de unión”, como se usa aquí, se refiere a una región de ADN en el alelo IND mutante (o el tipo salvaje correspondiente) en el que la región de mutación y la región de flanqueo en 5’ o en 3’ están enlazadas entre sí. Una “secuencia que abarca la región de unión entre la región de mutación y la región de flanqueo en 5’ o en 3’ comprende de este modo una secuencia de mutación así como la secuencia de flanqueo contigua con ella.
Las herramientas desarrolladas para identificar un alelo IND mutante específico o la planta o el material vegetal que comprende un alelo IND mutante específico, o productos que comprenden material vegetal que comprende un alelo IND mutante específico, se basan en las características genómicas específicas del alelo IND mutante específico en comparación con las características genómicas del alelo IND de tipo salvaje correspondiente, tales como un mapa de restricción específico de la región genómica que comprende la región de mutación, marcadores moleculares o la secuencia de las regiones de flanqueo y/o de mutación.
Una vez que se ha secuenciado un alelo IND mutante específico, se pueden desarrollar cebadores y sondas que reconocen específicamente una secuencia con las regiones de flanqueo en 5’, de flanqueo 3’ y/o de mutación del alelo IND mutante en el ácido nucleico (ADN o ARN) de una muestra por medio de una técnica de biología molecular. , por ejemplo, se puede desarrollar un método de PCR para identificar el alelo IND mutante en muestras
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nucleótidos insertados o sustituidos en los genes IND de la invención, o su complemento), o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con ella (sondas que reconocen secuencias de mutación).
Las sondas pueden consistir totalmente en una secuencia nucleotídica seleccionada de las secuencias nucleotídicas mencionadas de secuencias de flanqueo y de mutación. Sin embargo, la secuencia nucleotídica de las sondas en sus extremos 5’ o 3’ es menos crítica. De este modo, las secuencias en 5’ o en 3’ de las sondas pueden consistir en una secuencia nucleotídica seleccionada de las secuencias de flanqueo o de mutación, según sea apropiado, pero pueden consistir en una secuencia nucleotídica no relacionada con las secuencias de flanqueo o de mutación. Tales secuencias no relacionadas preferiblemente no deberían ser más largas que 50, más preferiblemente no más largas que 25, o incluso no más largas que 20 o 15 nucleótidos.
Además, las sondas adecuadas pueden comprender o consistir en una secuencia nucleotídica que abarca la región de unión entre secuencias de flanqueo y de mutación (es decir, por ejemplo, la región de unión entre una secuencia que flanquea en 5’ o en 3’ uno o más nucleótidos suprimidos, insertados o sustituidos en los alelos IND mutantes de la invención y la secuencia de uno o más nucleótidos insertados o sustituidos o la secuencia que flanquea en 3’ o en 5’, respectivamente, el uno o más nucleótidos suprimidos, tal como la región de unión entre una secuencia que flanquea en 5’ o en 3’ mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento del marco de lectura en los genes IND de la invención descrita anteriormente y la secuencia de las mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento del marco de lectura, o la región de unión entre una secuencia que flanquea en 5’ o en 3’ una mutación de codón de PARADA potencial como se indica en las Tablas anteriores o las mutaciones de sustitución indicadas anteriormente y la secuencia de la mutación de codón de PARADA potencial o de sustitución, respectivamente), con la condición de que la secuencia nucleotídica mencionada no derive exclusivamente de la región de mutación o de las regiones de flanqueo.
En los Ejemplos se describen ejemplos de sondas específicas adecuadas para identificar alelos IND mutantes específicos.
La detección y/o identificación de una “región específica IND mutante” que se hibrida a una sonda específica se puede producir de diversas maneras, por ejemplo, vía estimación del tamaño tras electroforesis en gel o vía métodos de detección basados en fluorescencia. Otros métodos específicos de secuencias para la detección de una “región específica IND mutante” que se hibrida a una sonda específica son también conocidos en la técnica.
Como alternativa, las plantas o partes vegetales que comprenden uno o más alelos ind mutantes se pueden generar e identificar usando otros métodos, tal como el método “Delete-a-gene™” que usa PCR para identificar mutantes de supresión generados mediante mutagénesis por neutrones rápidos (revisado por Li y Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258), mediante el método de TILLING (lesiones locales inducidas dirigidas en genomas) que identifica mutaciones de punto inducidas por EMS usando cromatografía de líquidos de altas prestaciones desnaturalizante (DHPLC) para detectar cambios de pares de bases mediante análisis de heterodúplex (McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455, y McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442), etc. Como se mencionó, TILLING usa una identificación de alto rendimiento para mutaciones (, por ejemplo, usando la escisión Cel 1 de heterodúplex de ADN mutantes-tipo salvaje, y la detección usando un sistema de gel de secuenciación). De este modo, se engloba aquí el uso de TILLING para identificar plantas o partes vegetales que comprenden uno o más alelos ind mutantes y métodos para generar e identificar tales plantas, órganos, tejidos y semillas de plantas. De este modo, el método como se describe aquí puede comprender las etapas de mutagenizar semillas de plantas (, por ejemplo, mutagénesis mediante EMS), reunir los individuos vegetales o ADN, amplificar mediante PCR una región de interés, formar los heterodúplex y realizar la detección de alto rendimiento, identificar la planta mutante, secuenciar el producto de la PCR mutante. Se entiende que igualmente se pueden usar otros métodos de mutagénesis y selección para generar tales plantas mutantes.
En lugar de inducir mutaciones en alelos IND, los alelos mutantes naturales (espontáneos) se pueden identificar mediante métodos conocidos en la técnica. , por ejemplo, se puede usar ECOTILLING (Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135(2):630-6) para identificar una pluralidad de plantas o partes vegetales en busca de la presencia de alelos ind mutantes naturales. Al igual que para las técnicas de mutagénesis anteriores, preferiblemente se identifican especies de Brassica que comprenden un genoma A y/o C, de manera que el alelo ind identificado se puede introducir subsiguientemente en otra especie de Brassica, tal como Brassica napus, mediante cruce (cruces inter-o intraespecíficos) y selección. En ECOTILLING, se identifican polimorfismos naturales en líneas de reproducción o especies relacionadas mediante la metodología de TILLING descrita anteriormente, en la que se usan individuos o conjuntos de plantas para la amplificación mediante PCR de la diana ind, la formación de los heterodúplex y el análisis de alto rendimiento. A esto le puede seguir la selección de plantas individuales que tienen una mutación requerida que se pueden usar subsiguientemente en un programa de reproducción para incorporar el alelo mutante deseado.
Los alelos mutantes identificados se pueden secuenciar entonces, y la secuencia se puede comparar con el alelo de tipo salvaje para identificar la mutación o mutaciones. Opcionalmente, la funcionalidad se puede evaluar como se indica anteriormente. Usando este enfoque, se puede identificar una pluralidad de alelos ind mutantes (y plantas de Brassica que comprenden uno o más de estos). Los alelos mutantes deseados se pueden combinar entonces con los alelos de tipo salvaje deseados mediante métodos de cruce y selección como se describe adicionalmente más
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tampón hibridante, marcador) para la identificación de un alelo IND mutante específico en muestras biológicas, usando la sonda específica.
El kit de la invención se puede usar, y sus componentes se pueden ajustar específicamente, para los fines de control de calidad (, por ejemplo, pureza de lotes de semillas), detección de la presencia o ausencia de un alelo IND mutante específico en material vegetal o material que comprende o deriva de material vegetal, tales como, pero sin limitarse a, productos alimentarios o de piensos.
El término “cebador”, como se usa aquí, engloba cualquier ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente del molde, tal como PCR. Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos, pero se pueden emplear secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma bicatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria. Las sondas se pueden usar como cebadores, pero se diseñan para unirse al ADN o ARN diana y no necesitan ser usadas en un proceso de amplificación.
La expresión “que reconocen”, como se usa aquí cuando se refiere a cebadores específicos, se refiere al hecho de que los cebadores específicos se hibridan específicamente a una secuencia de ácido nucleico en un alelo IND mutante específico en las condiciones expuestas en el método (tales como las condiciones del protocolo de identificación de PCR), mediante lo cual la especificidad se determina por la presencia de controles positivos y negativos.
El término “que se hibridan”, como se usa aquí cuando se refiere a sondas específicas, se refiere al hecho de que la sonda se une a una región específica en la secuencia de ácido nucleico de un alelo IND mutante específico en condiciones de restricción estándar. “Condiciones” de restricción estándar, como se usa aquí, se refiere a las condiciones para la hibridación descritas aquí, o a las condiciones hibridantes convencionales como describen Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por ejemplo, pueden comprender las siguientes etapas: 1) inmovilizar fragmentos de ADN genómico vegetal o ADN de genoteca BAC sobre un filtro, 2) prehibridar el filtro durante 1 a 2 horas a 65ºC en 6 X SSC, 5 X reactivo de Denhardt, 0,5% de SDS y 20 g/ml de ADN portador desnaturalizado, 3) añadir la sonda de hibridación que se ha marcado, 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro una vez durante 30 min. a 68ºC en 6X SSC, 0,1% de SDS, 6) lavar el filtro tres veces (dos veces durante 30 min. en 30 ml y una vez durante 10 min. en 500 ml) a 68ºC en 2 X SSC, 0,1% de SDS, y 7) exponer el filtro durante 4 a 48 horas a película de rayos X a -70ºC.
Como se usa aquí, una “muestra biológica” es una muestra de una planta, material vegetal o producto que comprende material vegetal. El término “planta” pretende englobar tejidos vegetales, en cualquier etapa de madurez, así como cualesquiera células, tejidos, u órganos tomados o derivados de cualquier planta de este tipo, incluyendo, sin limitación, cualesquiera semillas, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametos, cultivos celulares, cultivos tisulares, o protoplastos. “Material vegetal”, como se usa aquí, se refiere a material que se obtiene o deriva de una planta. Los productos que comprenden material vegetal se refieren a productos alimentarios, de piensos u otros productos que se producen usando material vegetal o pueden estar contaminados por material vegetal. Se entiende que, en el contexto de la presente invención, tales muestras biológicas se evalúan para determinar la presencia de ácidos nucleicos específicos para un alelo IND mutante específico, que implica la presencia de ácidos nucleicos en las muestras. De este modo, los métodos citados aquí para identificar un alelo IND mutante específico en muestras biológicas se refieren a la identificación en muestras biológicas de ácidos nucleicos que comprenden el alelo IND mutante específico.
También se describe aquí la combinación de alelos IND específicos en una planta, a la transferencia de uno o más alelos IND mutantes específicos desde una planta a otra planta, a las plantas que comprenden uno o más alelos IND mutantes específicos, la progenie obtenida a partir de estas plantas, y a células vegetales, partes vegetales, y semillas vegetales derivadas de estas plantas.
De este modo, adecuado para la invención es un método para combinar dos o más alelos IND mutantes seleccionados en una planta, que comprende las etapas de
- (a)
- generar y/o identificar dos o más plantas que comprenden cada una uno o más alelos IND mutantes seleccionados, como se describe anteriormente,
- (b)
- cruzar una primera planta que comprende uno o más alelos IND mutantes seleccionados con una segunda planta que comprende uno o más alelos IND mutantes seleccionados distintos, recoger semillas F1 del cruce, y, opcionalmente, identificar una planta F1 que comprende uno o más alelos IND mutantes seleccionados de la primera planta con uno o más alelos IND mutantes seleccionados de la segunda planta, como se describe anteriormente,
- (c)
- opcionalmente, repetir la etapa (b) hasta que se obtiene una planta F1 que comprende todos los alelos IND mutantes seleccionados,
- (d)
- opcionalmente,
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SEC ID NO 21: Oligonucleótido directo para detección de IND-C1-EMS01 y -WT
SEC ID NO 22: Oligonucleótido inverso para detección de IND-C1-EMS03
SEC ID NO 23: Oligonucleótido inverso para detección de IND-C1-WT
SEC ID NO 24: Oligonucleótido directo para detección de IND-C1-EMS03 y -WT
SEC ID NO 25: Oligonucleótido para detección de IND-A1-EMS01 y -WT
SEC ID NO 26: Oligonucleótido para detección de IND-A1-EMS01
SEC ID NO 27: Oligonucleótido para detección de IND-A1-WT
SEC ID NO 28: Oligonucleótido para detección de IND-A1-EMS05 y -WT
SEC ID NO 29: Oligonucleótido para detección de IND-A1-EMS05
SEC ID NO 30: Oligonucleótido para detección de IND-A1-WT
SEC ID NO 31: Oligonucleótido para detección de IND-C1-EMS01 y -WT
SEC ID NO 32: Oligonucleótido para detección de IND-C1-EMS01
SEC ID NO 33: Oligonucleótido para detección de IND-C1-WT
SEC ID NO 34: Oligonucleótido para detección de IND-C1-EMS03 y -WT
SEC ID NO 35: Oligonucleótido para detección de IND-C1-EMS03
SEC ID NO 36: Oligonucleótido para detección de IND-C1-WT
SEC ID NO 37: Oligonucleótido directo para detección de IND-A1
SEC ID NO 38: Oligonucleótido inverso para detección de IND-A1
SEC ID NO 39: Oligonucleótido directo para detección de IND-C1
SEC ID NO 40: Oligonucleótido inverso para detección de IND-C1 Excepto que se señale de otro modo en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo según técnicas de biología molecular estándar como se describe en Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA y en los Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edición, Academic Press (UK). Los materiales y métodos estándar para el trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications, UK. Los materiales y métodos estándar para reacciones en cadena de la polimerasa se pueden encontrar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson at al. (2000) PCR -Basics: From Background to Bench, Primera Edición, Springer Verlag, Alemania. Los procedimientos estándar para el análisis AFLP se describen en Vos et al. (1995, NAR 23:4407-4414) y en la solicitud de patente EP publicada EP 534858.
EJEMPLOS Ejemplo 1 – Aislamiento de las secuencias de ADN de los genes IND
Para determinar las secuencias de los genes IND de una línea de reproducción de colza de primavera élite, se identificó una genoteca de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de la línea según lo siguiente:
1.1. Aislamiento de clones de BAC que comprenden una secuencia IND
Para identificar colonias de Escherichia coli que contienen un clon de BAC que comprende una secuencia IND de la línea de reproducción de colza de primavera élite, se identificó mediante procedimientos de hibridación Southern estándar una genoteca de BAC de la línea (tamaño medio de los clones de más de 120 kb) dispuesta como clones duplicados individuales sobre filtros de nailon de alta densidad:
- Una mezcla de dos sondas con la secuencia de SEC ID NO: 2 del documento WO04/113542 (“Bn1-IND”) y SEC ID NO: 3 del documento WO04/113542 (“BN2-IND”) (SEC ID NO: 11 y 12, respectivamente) y marcada según procedimientos estándar se usó para la hibridación al ADN sobre la membrana de nailon.
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-La prehibridación se llevó a cabo durante 2 horas a 65ºC en 30 ml del siguiente tampón de hibridación: 6X SSC (20X SSC contiene 3,0 M de NaCl, 0,3 M de citrato de sodio, pH 7,0), 5X Denhardt (100X Denhardt contiene 2% de Ficoll, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de seroalbúmina bovina), 0,5% de SDS y 20 g/ml de ADN portador desnaturalizado (ADN de esperma de pescado monocatenario, con una longitud media de 120
5 3000 nucleótidos)
- La hibridación se llevó a cabo en las siguientes condiciones:
-La sonda marcada (20 ng de cada secuencia) se desnaturalizó calentando durante 5 minutos a 95ºC y enfriando en hielo durante 5 minutos, y se añadió a 15 ml de tampón de hibridación (mismo tampón que para la prehibridación)
10 -La hibridación se llevó a cabo toda la noche a 65ºC.
-Las transferencias se lavaron tres veces durante 30 minutos a 65ºC en los tubos de hibridación (una vez con 30 ml de 6x SSC con 0,1% de SDS y dos veces con 30 ml de 2x SSC con 0,1% de SDS) y una vez durante 10 minutos a 65ºC con 500 ml de 2x SSC con 0,1% de SDS en una caja.
- Películas Kodak X-OMAT AR se expusieron a las transferencias radiactivas durante 4 horas a -70ºC.
15 -En base a las señales positivas, se recogieron 14 colonias de E. coli que contienen un clon de BAC que comprende una secuencia IND mediante identificación de la genoteca de BAC de la línea de reproducción de colza de primavera élite (nº total de positivos: 65) (aquí en lo sucesivo denominadas “colonias positivas”).
1.2. Aislamiento de clones de BAC que comprenden una secuencia IND de longitud completa
Para identificar colonias positivas que comprenden un clon de BAC con una secuencia de ADN genómico de
20 longitud completa de uno de los genes IND, se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern en ADN del clon de BAC aislado de las colonias positivas y en ADN genómico aislado de Brassica napus:
-Se aisló ADN del clon de BAC a través de lisis alcalina, como se describe en la técnica, a partir de las colonias positivas que se hicieron crecer en 25 ml de medio de Caldo Luria que contiene 25 g/ml de cloranfenicol.
25 -Se aisló ADN genómico de tejido foliar de B. napus según el método de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (Doyle y Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15).
-La concentración de ADN de cada preparación se estimó comparando la intensidad de la banda de 1 l de cada muestra con la intensidad de la banda de 1, 2, 4, 8 y 20 l de una disolución que contiene 25 ng/l de ADN lambda (Life Technologies®) en 1% de gel de agarosa (Roche®) con TBE (Invitrogen®) que contiene
30 bromuro de etidio (ICN Biochemicals®).
-Se digirieron 100-200 ng de ADN del clon de BAC y 1,7 g de ADN genómico con la enzima de restricción EcoRI en un volumen de reacción final de 20 l, aplicando condiciones propuestas por el fabricante (New England Biolabs). El tiempo de digestión y/o la cantidad de enzima de restricción se ajustaron para asegurar la digestión total de las muestras de ADN genómico sin degradación no específica.
35 -Tras la digestión, se añadieron a las muestras de ADN digeridas 2 l de colorante de carga que contiene ARNasa (12,5 ml de 1% de xileno cianol FF; 12,5 ml de 1% de indicador de azul de bromofenol soluble en agua; 25 ml de glicerol; 100 l de 0,5 M de EDTA pH 8; 1 l de ARNasa (10 mg/ml)), y las muestras se incubaron durante 30 min. a 37ºC.
- Las muestras se cargaron en un gel de agarosa con TAE al 1%.
40 -Se digirió ADN del fago lambda (Fermentas®) con PstI, o se incluyó Escalera de ADN de 1 kpb (Life Technologies) como patrón de tamaño.
-Tras la electroforesis, las muestras de ADN (ADN digerido del clon de BAC y genómico) se transfirieron a una membrana de nailon (Hybond-N+ Amersham Pharmacia Biotech®) mediante transferencia capilar alcalina seca.
45 -Las membranas de nailon con ADN digerido del clon de BAC y genómico se identificaron mediante procedimientos de hibridación Southern estándar como se describe anteriormente para las identificaciones de genotecas de BAC, excepto que para el ADN genómico las películas Kodak XOMAT AR se expusieron a transferencias radiactivas durante 2 días a -70ºC.
-En base a una comparación entre los patrones de hibridación obtenidos tras la digestión de ADN del clon de 50 BAC de las colonias positivas identificadas y de ADN genómico aislado de Brassica napus con enzima de restricción EcoRI e hibridación con las sondas, los clones de BAC se agruparon en 2 grupos y, para cada uno
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-La Tabla 5a muestra las puntuaciones de vainas visuales atribuidas al fenotipo de las vainas de plantas que se hicieron crecer en el campo como se describe anteriormente:
Tabla 5a
- Genotipo
- Línea nº Puntuación de vainas visuales (1-5)
- IND-A1/IND-A1, IND-C1/IND-C1
- 51 1
- 45
- 1
- 176
- 1
- 48
- 1
- ind-a1/ind-a1,IND-C1/ind-c1
- 51 3
- 45
- 3
- 176
- 2
- 48
- 3
- IND-A1/ind-a1, ind-c1/ind-c1
- 51 3
- 45
- 3
- 176
- 2
- 48
- 3
- ind-a1/ind-a1, ind-c1/ind-c1
- 51 5
- 45
- 5
- 176
- 4
- 48
- 5
5 b) Ensayo de impacto manual (MIT):
-Las vainas procedentes de plantas que comprenden dos alelos IND mutantes en estado homocigótico (genotipo: ind-a1/ind-a1, ind-c1/ind-c1) derivadas de las líneas 51, 45, 176 y 48 fueron completamente resistentes al desgranado de las vainas (las vainas no se abrieron a lo largo de la zona de dehiscencia incluso después de aplicar una fuerte torsión).
10 -La resistencia al desgranado de las vainas de vainas procedentes de plantas que comprenden un alelo ind en estado homocigótico y un alelo ind en estado heterocigótico (genotipo: ind-a1/ind-a1, IND-C1/ind-c1 o INDA1/ind-a1, ind-c1/ind-c1) se incrementó en comparación con la resistencia al desgranado de las vainas de vainas procedentes de sus plantas hermanas de tipo salvaje, pero las vainas todavía se pudieron abrir a lo largo de la zona de dehiscencia tras aplicar fuerzas físicas limitadas.
15 -La Tabla 5b muestra las puntuaciones atribuidas a las vainas de plantas que se hicieron crecer en el campo en base a la fuerza física necesaria para abrir vainas maduras cerradas aplicando manualmente torsión en las vainas como se describe anteriormente:
Tabla 5b
- Genotipo
- Línea nº Puntuación basada en la fuerza física necesaria para abrir vainas maduras cerradas (1-5)
- IND-A1/IND-A1, IND-C1/IND-C1
- 51 1
- 45
- 1
- 176
- 1
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- Genotipo
- Línea nº Puntuación basada en la fuerza física necesaria para abrir vainas maduras cerradas (1-5)
- 48
- 1
- ind-a1/ind-a1,IND-C1/ind-c1
- 51 3
- 45
- 3
- 176
- 1
- 48
- 2
- IND-A1/ind-a1, ind-c1/ind-c1
- 51 3
- 45
- 2
- 176
- 1
- 48
- 3
- ind-a1/ind-a1, ind-c1/ind-c1
- 51 ND
- 45
- ND
- 176
- ND
- 48
- ND
ND: no determinada
c) Ensayo de impactos aleatorios:
-Como se muestra en la Tabla 5c, la semivida de muestras de vainas (“LD50”) fue significativamente mayor para vainas procedentes de mutantes dobles homocigóticos (genotipo ind-a1/ind-a1, ind-c1/ind-c1) derivados
5 de la línea 51 que para vainas de mutantes dobles homocigóticos derivados de la línea 45, indicando que las plantas mutantes dobles homocigóticas que comprenden el alelo IND-C1-EMS01 (línea 51) fueron más resistentes al desgranado de las vainas que las plantas mutantes dobles homocigóticas que comprenden el alelo IND-C1-EMS03 (línea 45).
-La Tabla 5c muestra además que el valor LD50 fue en general mayor para vainas procedentes de plantas
10 que comprenden un alelo ind-c1 en estado homocigótico y un alelo ind-a1 en estado heterocigótico (genotipo: IND-A1/ind-a1, ind-c1/ind-c1) que para vainas procedentes de plantas que comprenden un alelo ind-a1 en estado homocigótico y un alelo ind-c1 en estado heterocigótico (genotipo: ind-a1/ind-a1, IND-C1/ind-c1), indicando que las mutaciones en el alelo IND-C1 podrían tener un efecto más potente sobre la resistencia al desgranado de las vainas que las mutaciones en el alelo IND-A1.
15 Tabla 5c
- Genotipo
- Línea nº LD50-invernadero LD50-campo1 LD50-campo2
- Inferior a 95%
- Superior a 95%
- IND-A1/IND-A1, IND-C1/IND-C1
- 51 8,61 6,56 11,08 8,9 6,8
- 45
- 8,07 6,08 10,45 7,8 5,7
- 176
- ND 5,3 5,3
- 48
- 11,42 7,42 14,9 9 5,3
- 48
- 8,86 * *
- ind-a1/ind-a1, IND-C1/IND-C1
- 48 9,86 5,89 13,3 ND ND
- IND-A1/IND-A1, ind-c1/ind-c1
- 48 5,98 2,87 8,6 ND ND
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23-07-2015
- Genotipo
- Línea nº LD50-invernadero LD50-campo1 LD50-campo2
- Inferior a 95%
- Superior a 95%
- ind-a1/ind-a1, IND-C1/ind-c1
- 51 14,22 11,33 17,79 21,1 21,4
- 51
- 22,78 18,68 27,8
- 45
- 14,97 11,95 18,74 22,9 24,6
- 45
- 10,32 8,05 13,05
- 176
- ND 7,3 8,6
- 48
- 7,21 3,04 9,7 10,1 9,4
- IND-A1/ind-a1, ind-c1/ind-c1
- 51 48,31 39,94 58,73 16,9 22,6
- 51
- 46,46 38,44 56,41
- 45
- 26,89 22,03 32,95 20,6 14,6
- 45
- 17,5 13,96 22,01
- 176
- ND 10,9 8,0
- 48
- 30,14 25,49 36,8 18,3 16,5
- ind-a1/ind-a1, ind-c1/ind-c1
- 51 163,28 116,12 237,62 ND ND
- 45
- 73,57 53,85 103,54 ND ND
- 176
- ND ND ND
- 48
- 115,99 66,35 523,4 ND ND
* No hay datos suficientes para estimar los límites superior e inferior para LD50
d) Ensayos de campo
La Tabla 5d muestra el nivel de desgranado de semillas (SHAT), capacidad de cosecha por la cosechadora (CHA1), capacidad de trilla (CHA2), productividad de semillas por parcela tras aplicar la cosechadora (YLDP) y productividad de semillas tras la trilla de la paja (YLDS), determinado como se describe anteriormente para parcelas de campo con plantas ind y plantas de tipo salvaje según se indicó. El valor YieldWTSeg% representa la YLDP como un porcentaje del segregante de tipo salvaje en una línea, es decir, en la línea 51, 45, 176 o 48, respectivamente.
Tabla 5d
- Genotipo
- Línea nº SHAT (19) CHA1 (15) CHA2 (15) YLDP (en g/parcela) YieldWTS eg% YLDS (en % en peso de la paja)
- IND-A1/IND-A1, IND-C1/IND-C1
- 51 8,1 4,9 5,0 2154,7 100 0,6
- 45
- 8,4 4,2 4,8 1868,7 100 0,8
- 176
- 8,1 4,6 5,0 1710,2 100 0,3
- 48
- 7,9 4,7 5,0 1844,2 100 0,5
- ind-a1/ind-a1, INDC1/ind-c1
- 51 8,9 2,9 3,8 2450,7 114 4,5
- 45
- 8,8 2,3 3,3 2304,2 123 7,6
- 176
- 8,7 3,9 4,9 2189,6 128 0,6
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23-07-2015
- Genotipo
- Línea nº SHAT (19) CHA1 (15) CHA2 (15) YLDP (en g/parcela) YieldWTS eg% YLDS (en % en peso de la paja)
- 48
- 8,8 4,1 4,9 2419,1 131 1,4
- IND-A1/ind-a1, indc1/ind-c1
- 51 8,9 3,3 4,3 2739,6 127 1,9
- 45
- 8,8 2,6 3,4 2441,6 131 3,4
- 176
- 8,7 4,1 4,9 2071,6 121 0,7
- 48
- 8,8 3,6 4,1 2379,8 129 2,4
- ind-a1/ind-a1, indc1/ind-c1
- 51 9,1 1,2 2,0 515,3 24 27,4
- 45
- 9,0 1,0 2,0 424,4 23 27,4
- 176
- 9,0 1,1 2,6 702,4 41 21,0
- 48
- 9,0 1,0 1,9 447,3 24 27,7
Evaluación microscópica
-Las vainas procedentes de plantas que comprenden dos alelos ind en estado homocigótico derivadas de la línea 45 (genotipo ind-a1/ind-a1, ind-c1/ind-c1) que se hicieron crecer en condiciones de invernadero 5 mostraron una lignificación a lo largo de toda la zona de dehiscencia y una mala diferenciación de las células que pertenecen a la zona de dehiscencia de los tipos celulares vecinos, tales como las células del tejido vascular y la capa lignificada de células que se encuentra normalmente en la pared interior de las vainas (es decir, las células enb) (“fenotipo morfológico fuerte”). Se observó un fenotipo de vainas similar para estas plantas que se hicieron crecer en condiciones de campo. Por el contrario, las zonas de dehiscencia todavía 10 estaban bien diferenciadas y casi nada lignificadas en vainas procedentes de plantas que comprenden dos alelos ind en estado homocigótico derivadas de la línea 51 (genotipo ind-a1/ind-a1, ind-c1/ind-c1) que se hicieron crecer en condiciones de invernadero, pero las zonas de dehiscencia sí mostraron lignificación extra allí donde las paredes de las vainas se juntan (“fenotipo morfológico más débil”). Las vainas procedentes de estas plantas que se hicieron crecer en condiciones de campo mostraron un patrón de lignificación similar al
15 de las vainas procedentes de plantas con genotipo IND-A1/ind-a1, ind-c1/ind-c1 derivadas de la línea 45 descrita más abajo. Cuando se combinan con los datos obtenidos del RIT, estos datos podrían indicar que estas plantas combinan un “fenotipo morfológico más débil” con una mayor resistencia al desgranado de las vainas.
- Vainas procedentes de plantas que comprenden un alelo ind en estado homocigótico y un alelo ind en estado
20 heterocigótico derivadas de las líneas 45 y 51 (genotipo: ind-a1/ind-a1, IND-C1/ind-c1 o IND-A1/ind-a1, indc1/ind-c1) que se hicieron crecer en condiciones de invernadero no mostraron un fenotipo obvio. En condiciones de campo, las vainas procedentes de plantas con genotipo IND-A1/ind-a1, ind-c1/ind-c1 derivadas de las líneas 45 presentaron un fenotipo morfológico más sutil que las vainas procedentes de otras plantas de sus hermanas mutantes dobles homocigóticas (véase anteriormente). Más específicamente, la
25 lignificación no se produjo a lo largo de la zona de dehiscencia completa, pero las vainas de estas plantas solo presentaron unas pocas capas extras de células lignificadas donde la pared interna de las vainas se une con el tabique, ya sea simétricamente en ambos lados del tabique o solamente de forma unilateral. Se observó un fenotipo de vainas similar para vainas procedentes de plantas con genotipo IND-A1/ind-a1, indc1/ind-c1 derivadas de las líneas 51 que se hicieron crecer en condiciones de campo. Las vainas procedentes
30 de plantas con genotipo ind-a1/ind-a1, IND-C1/ind-c1 derivadas de las líneas 45 y 51 no mostraron un fenotipo obvio en condiciones de campo.
Ejemplo 7 – Detección y/o transferencia de genes IND mutantes en líneas de Brassica (élite)
Los genes IND mutantes se transfirieron a líneas de reproducción de Brassica (élite) mediante el siguiente método: una planta que contiene un gen IND mutante (planta donante) se cruza con una línea de Brassica (élite)
35 (progenitor élite/progenitor recurrente) o una variedad que carece del gen IND mutante. Se usa el siguiente esquema de introgresión (el gen IND mutante se abrevia como ind, mientras que el del tipo salvaje se representa como IND):
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- Alelo nº
- Cebadores Ta de hibridación (ºC) Tamaño del fragmento de PCR (pb)
- IND-A1-EMS05 IND-A1-WT
- 5’ CCTCAGACGGTGGTGGCTCA 3’ (POSH105MF1 -SEC ID NO: 16) 5’ AGGGTCAGACATAGGAGCTC 3’ (POSH 101R1 -SEC ID NO: 18) 5’ CCTCAGACGGTGGTGGCTCG 3’ (POSH105WF1 -SEC ID NO: 17) 5’ AGGGTCAGACATAGGAGCTC 3’ (POSH 101R1 -SEC ID NO: 18) 70 72 201 201
- IND-C1-EMS01 IND-C1-WT
- 5’ GTGGTTAAAAGAGTTTTCTTA 3’ (POSH106MR1 -SEC ID NO: 19) 5’ ATTAGCATGTAAAACACTAG 3’ (POSH106F1 -SEC ID NO: 21) 5’ GTGGTTAAAAGAGTTTTCTTG 3’ (POSH106WR1 -SEC ID NO: 20) 5’ ATTAGCATGTAAAACACTAG 3’ (POSH106F1 -SEC ID NO: 21) 60,6 62,8 436 436
- IND-C1-EMS03 IND-C1-WT
- 5’ ACGAGCCACCACCGTCTAG 3’ (POSH 108MR1’ -SEC ID NO: 22) 5’ GTTCAAAAGCAGATGCAGCAG 3’ (POSH106F2 -SEC ID NO: 24) 5’ ACGAGCCACCACCGTCTG 3’ (POSH 108WR1’ -SEC ID NO: 23) 5’ GTTCAAAAGCAGATGCAGCAG 3’ (POSH106F2 -SEC ID NO: 24) 70 68,9 369 369
Como alternativa, se puede usar la tecnología Invader™ (Third Wave Agbio) para discriminar plantas que comprenden una mutación de punto específica en un alelo IND de plantas que no comprenden esa mutación de punto específica. De este modo, se desarrollaron las siguientes sondas Invader™ discriminantes para detectar la
5 presencia o ausencia y el estado de cigosidad de los alelos mutantes identificados en el Ejemplo 4 (véase la Tabla 7):
-En la Tabla 7 se indican sondas específicas para el gen IND diana mutante o de tipo salvaje correspondiente (indicado como “5’ flap1-x” y “5’ flap2-x”, respectivamente) y sondas “invasoras” que se pueden usar en combinación con ellas. Generalmente, cada conjunto de sondas consiste en una sonda específica para el gen
10 diana mutante o el de tipo salvaje del cual el primer nucleótido tras la secuencia de aleta en 5’ coincide con la diferencia nucleotídica (nucleótido subrayado en la Tabla 7) (la denominada “sonda primaria”; , por ejemplo, la sonda con SEC ID NO: 26 es específica para IND-A1-EMS01 y la sonda con SEC ID NO: 27 es específica para IND-A1-WT), y una sonda específica para los nucleótidos en dirección 5’ de la diferencia nucleotídica (el denominado “oligo invader®”; , por ejemplo, la sonda con SEC ID NO: 25 es específica para los nucleótidos
15 en dirección 5’ de la diferencia nucleotídica entre IND-A1-EMS01 e IND-A1-WT). El último nucleótido del último cebador puede coincidir con la diferencia nucleotídica en el mutante (como se indica mediante los nucleótidos en negrita en la Tabla 6), pero igualmente se pueden usar otros nucleótidos para este último nucleótido en tanto que la sonda primaria y el oligo invader® sean todavía capaces de formar un solapamiento de una sola base cuando se hibridan al ADN diana para generar la estructura invasiva
20 específica reconocida por las enzimas Cleavase® (Third Wave Agbio).
-El procedimiento de ensayo Invader™ y la interpretación de los datos se llevan a cabo como se prescribe por el fabricante (Third Wave Agbio). De forma breve, las secuencias nucleotídicas indicadas como “flap1” y “flap2” en la Tabla 7 representan las secuencias de las “aletas” en 5’ que se escinden de las sondas primarias en la fase primaria del ensayo Invader™ y que son complementarias a las secuencias en el casete 1 y 2 25 FRET™, respectivamente, y no complementarias a las secuencias mutantes o de tipo salvaje diana. Si las sondas primarias se escinden en la fase primaria y la sonda flap1 y/o la sonda flap2 se hibrida al casete 1 y 2
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de FRET™, respectivamente, en la fase secundaria, se genera una señal indicativa de la presencia del gen IND diana mutante o de tipo salvaje correspondiente en la muestra, respectivamente.
Tabla 7
- Alelo nº
- Sondas
- IND-A1-EMS01 IND-A1-WT
- 5’ GCCGACGAGCCACCACCGTCTT 3’ 5’ flap1-AAGGGTCGTCGCTT 3’ 5’ GCCGACGAGCCACCACCGTCTT 3’ 5’ flap2-GAGGGTCGTCGCT 3’ (SEC ID NO: 25) (SEC ID NO: 26) (SEC ID NO: 25) (SEC ID NO: 27)
- IND-A 1-EMS05 IND-A1-WT
- 5’ CGGATCTTCTCGCTTATCCTTTCTCTACGCCGAA 3’ 5’ flap1-TGAGCCACCACCG 3’ 5’ CGGATCTTCTCGCTTATCCTTTCTCTACGCCGAA 3’ 5’ flap2-CGAGCCACCACCG 3’ (SEC ID NO: 28) (SEC ID NO: 29) (SEC ID NO: 28) (SEC ID NO: 30)
- IND-C1-EMS01 IND-C1-WT
- 5’ AGGTGGATCTACCATGAAATGAGGATTGTGGTT AAAAGAGTTTTCTTT 3’ 5’ flap1-ATGTAATGAGATCAATAGGTTTG 3’. 5’ AGGTGGATCTACCATGAAATGAGGATTGTGGTT AAAAGAGTTTTCTTT 3’ 5’ flap2-GTGTAATGAGATCAATAGGTTTG 3’ (SEC ID NO: 31) (SEC ID NO: 32) (SEC ID NO: 31) (SEC ID NO: 33)
- IND-C1-EMS03 IND-C1-WT
- 5’ CCGTAACGTAAGGGTAAGCGAGGACCCCA 3’ 5’ flap1-TAGACGGTGGTGGC 3’ 5’ CCGTAACGTAAGGGTAAGCGAGGACCCCA 3’ 5’ flap2-CAGACGGTGGTGGC 3’ (SEC ID NO: 34) (SEC ID NO: 35) (SEC ID NO: 34) (SEC ID NO: 36)
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